WO2018052182A1 - 중간엽 줄기세포 또는 ＡｇＲＰ를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가를 통한 퇴행성 뇌질환 치료제 - Google Patents

중간엽 줄기세포 또는 ＡｇＲＰ를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가를 통한 퇴행성 뇌질환 치료제 Download PDF

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mesenchymal stem
stem cells
ubiquitin proteasome
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장종욱
나덕렬
이나경
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for degenerative brain disease through increased ubiquitin proteasome activity, including mesenchymal stem cells or AgRP.
  • Degenerative brain disease is a disease that occurs in the brain among degenerative diseases that occur with age, and can be classified in consideration of major symptoms and invasive brain areas, including Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
  • Degenerative brain disease is known to be caused by neuronal degeneration and neuronal death due to genetic and environmental factors due to aging, but the exact cause is not known yet. It is a situation.
  • UPS Ubiquitin-proteasome system
  • the ubiquitin proteasome system is involved in biological processes such as defective protein removal, cell division, and damaged DNA repair in eukaryotic cells.
  • diseases such as degenerative brain diseases, abnormalities in the ubiquitin proteasome system can cause toxic proteins to accumulate in vivo.
  • degenerative brain disease In Alzheimer's disease, it has been reported that amyloid protein inhibits activity in the ubiquitin proteasome system and reduced brain proteasome activity in Alzheimer's disease animal models (see Non-Patent Documents 1-6).
  • the present inventors have tried to find a substance that modulates the ubiquitin proteasome activity of the brain, and found that mesenchymal stem cells increase the proteasome activity of neurons.
  • the present invention was completed by identifying that Agouti related peptide was secreted.
  • One aspect is to provide an ubiquitin proteasome activity increasing agent comprising mesenchymal stem cells or Aggo-related peptide (AgRP).
  • AgRP Aggo-related peptide
  • Another aspect relates to a method for increasing ubiquitin proteasome activity comprising administering a mesenchymal stem cell or an Aguti-related peptide (AgRP) to a subject or contacting the cell.
  • AgRP Aguti-related peptide
  • Another aspect relates to a reagent composition for increasing ubiquitin proteasome activity comprising mesenchymal stem cells or Aggo-related peptide (AgRP).
  • AgRP Aggo-related peptide
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diseases associated with reduced ubiquitin proteasome activity, including mesenchymal stem cells or Aggo-related peptide (AgRP), for example, degenerative brain diseases.
  • diseases associated with reduced ubiquitin proteasome activity including mesenchymal stem cells or Aggo-related peptide (AgRP), for example, degenerative brain diseases.
  • AgRP Aggo-related peptide
  • Another aspect is to provide a dietary supplement for the improvement or prevention of diseases associated with decreased proteasome activity, including AgRP (Agouti-related peptide), eg, degenerative brain disease.
  • AgRP Agouti-related peptide
  • Another aspect is the ubiquitin pro, pharmaceutical composition for treating or preventing mesenchymal stem cells or Aggo-related peptide (Aguti) -related peptides or active fragments thereof, for the treatment or prevention of diseases associated with ubiquitin proteasome activity increasing agents, ubiquitin proteasome activity reduction.
  • a reagent composition for increasing theasome activity, or for use in the manufacture of a dietary supplement for the prevention or amelioration of a disease associated with a decrease in ubiquitin proteasome activity is provided.
  • One aspect is the treatment of ubiquitin proteasome activity increasing agents, including mesenchymal stem cells or Aggoti-related peptide (AGRP) or active fragments thereof, diseases associated with decreased ubiquitin proteasome activity, eg, degenerative brain diseases, or Provided are pharmaceutical compositions for prevention.
  • ubiquitin proteasome activity increasing agents including mesenchymal stem cells or Aggoti-related peptide (AGRP) or active fragments thereof, diseases associated with decreased ubiquitin proteasome activity, eg, degenerative brain diseases.
  • Another aspect includes administering a pharmaceutically effective amount of a mesenchymal stem cell or AgRP (Agouti-related peptide) or an active fragment thereof to an individual in need thereof, contacting the cells in vitro , or in vivo. in vivo) on the experimental animals increased step little ubiquitin proteasome activity comprising the administration of the method, the ubiquitin proteasome diseases which are associated with reduced activity, for example, provides a method for prevention or treatment of degenerative diseases.
  • a pharmaceutically effective amount of a mesenchymal stem cell or AgRP (Agouti-related peptide) or an active fragment thereof to an individual in need thereof, contacting the cells in vitro , or in vivo. in vivo
  • the ubiquitin proteasome diseases which are associated with reduced activity, for example, provides a method for prevention or treatment of degenerative diseases.
  • Another aspect provides a reagent composition for increasing ubiquitin proteasome activity comprising mesenchymal stem cells, AgRP or active fragments thereof.
  • Another aspect is the treatment or prevention of mesenchymal stem cells or Aggoti-related peptide (AGRP) or active fragments thereof for diseases associated with decreased ubiquitin proteasome activity, decreased ubiquitin proteasome activity, eg, degenerative brain disease.
  • Pharmaceutical compositions for use, or for use in the preparation of reagent compositions for increasing ubiquitin proteasome activity are provided.
  • ubiquitin proteasome regulating agents may refer to substances that modulate the ubiquitin proteasome system.
  • the regulation may include substances that increase or decrease the activity of the ubiquitin proteasome.
  • the ubiquitin proteasome activity increasing agent that increases the activity of the ubiquitin proteasome may be a treatment for degenerative brain disease.
  • neurodegenerative disease may refer to a disease caused by deterioration of the structure or function of brain tissue or brain cells as aging progresses.
  • Examples of the degenerative brain disease may include Alzheimer's disease (senile dementia), dementia, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, Pick's disease, Huntington's disease or tau disease.
  • Alzheimer's disease is used interchangeably with senile dementia and refers to a disease involving mental degeneration associated with certain degenerative brain diseases characterized by senile plaques, neuroinflammatory tangles, and progressive nerve loss. can do.
  • Parkinson's disease can refer to chronic and progressive degenerative diseases of the central nervous system, which often impair motor function and speech.
  • Huntington's disease may mean a neurodegenerative disease caused by three-base repeated expansion in a gene encoding Huntington's protein, accompanied by chorea, psychosis, dementia and the like.
  • the term “Lou Gehrig's disease” refers to a disease in which only motor neuron cells are selectively killed, and the upper motor neuron cells of the cerebral cortex and the motor motor cells of the brain stem and spinal cord are gradually destroyed.
  • pick's disease may refer to a disease that indicates progressive destruction of nerve cells in the brain.
  • tauopathy of the present invention may refer to a neurodegenerative disorder in which the brain nerve is damaged by abnormal accumulation of tau protein (family closely related to intracellular microtubule-related protein) in brain tissue.
  • treatment refers to or includes the alleviation, inhibition or prevention of a disease, disorder or condition, or one or more symptoms thereof, wherein “active ingredient” or “pharmaceutically effective amount” means a disease, disorder or condition, or By any amount of the composition used in the practice of the invention provided herein sufficient to alleviate, inhibit or prevent the progression of one or more symptoms.
  • administering means the arrangement of the composition according to.
  • it can be administered by any suitable route to deliver at least a portion of the cells or cellular components of the composition to a desired location in the surviving individual.
  • the survival time of cells after subject administration can be as short as several hours, for example between 24 hours and several days to many years.
  • MSCs Mesenchymal Stem Cells
  • the mesenchymal stem cells may be umbilical cord-derived, bone marrow-derived, placental-derived, or adipose-derived mesenchymal stem cells.
  • the umbilical cord may refer to a line connecting the mother and the abdomen to enable the mammalian fetus to grow in the placenta, and generally, three vessels surrounded by Wharton's Jelly, that is, two umbilical arteries and one umbilical vein Therefore, in the present specification, the mesenchymal stem cells may be umbilical cord or cord blood-derived mesenchymal stem cells. It may be carried out in a method obvious to those skilled in the art, and is described, for example, in Pittenger et al. (Science 284: 143, 1997) and van et al. (J. Clin. Invest., 58: 699, 1976).
  • the mesenchymal stem cells may be genetically engineered to secrete AgRP (Agouti-related peptide) or active fragments thereof, or to secrete AgRP or active fragments thereof.
  • the term "Agouti-related peptide (AgRP)” may mean a neuropeptide produced in the brain by AgRP / NPY neurons.
  • the AgRP may include AgRP from vertebrates, including humans, eg, mammals, fish, amphibians, birds, or reptiles.
  • the AgRP may be meant to include a precursor of AgRP (eg, in humans, a signal peptide domain that is 20 amino acid residues from the N-terminus in the AgRP gene product of 132 amino acid sequences (precursor of AgRP)). Is removed to produce AgRP consisting of 112 amino acid residues).
  • the AgRP or active fragment thereof can also be used as a genetically engineered host cell comprising a nucleotide sequence encoding the AgRP or active fragment thereof. That is, it may be included in a host cell containing a nucleotide sequence encoding the AgRP or an active fragment thereof.
  • delivery systems include (i) naked recombinant DNA molecules, (ii) plasmids, (iii) viral vectors, and (iv) liposomes or niosomes containing said naked recombinant DNA molecules or plasmids. can do.
  • the term "genetic engineering” or “genetically engineered” as used herein refers to the act of introducing one or more genetic modifications to a cell or to a cell made thereby.
  • the mesenchymal stem cell or host cell may be genetically engineered to increase the expression or activity of AgRP or an active fragment thereof, for example, an exogenous gene encoding AgRP or an active fragment thereof. have.
  • the increase in activity may mean that the activity of the same type of protein or enzyme has a higher activity as compared to the activity of an endogenous protein or enzyme that is not or has a given genetically unengineered parental cell (eg, wild type). .
  • the exogenous gene may be expressed in an amount sufficient to increase the activity of the protein mentioned in the mesenchymal stem cell or host cell compared to its parent cell.
  • the exogenous gene may be introduced into the parent cell through an expression vector.
  • the exogenous gene may be introduced into the parent cell in the form of a linear polynucleotide.
  • the exogenous gene may be expressed from an expression vector (eg, plasmid) in a cell.
  • the exogenous gene may be inserted into the genetic material (eg, chromosome) in the cell for stable expression.
  • Proteins or peptides can also be synthesized by known genetic engineering methods. For example, a vector inserted with DNA encoding AgRP or an active fragment thereof is introduced into a suitable host cell to produce transformed cells, and produced in such transformed cells. By collecting the resulting peptides.
  • the peptides of the present invention can also be made as fusion proteins that are first cut using a suitable protease to obtain the peptide. They may also be used in pharmaceutical compositions as such.
  • a polynucleotide encoding AgRP or an active fragment thereof can be linked to a frame with a polynucleotide encoding another protein or peptide, which is in the host May be inserted into an expression vector for expression of. Techniques known in the art can be used for this purpose.
  • peptides fused with AgRP FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6x His residues consisting of six histidines (His), 10x His, influenza hemagglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, p18HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, lck tag, alpha-tubulin
  • peptides can be used, such as) fragments, B-tags, and Protein C fragments.
  • AgRP or an active fragment thereof may be used to prepare glutathione-S-transferase (GST), influenza hemagglutinin (HA), immunoglobulin constant regions, beta-galactosidase ), Maltose-binding protein (MBP), or the like.
  • GST glutathione-S-transferase
  • HA influenza hemagglutinin
  • HA immunoglobulin constant regions
  • beta-galactosidase beta-galactosidase
  • MBP Maltose-binding protein
  • a polynucleotide encoding the AgRP or an active fragment thereof, a recombinant vector comprising the polynucleotide, and a recombinant cell comprising the recombinant vector may be provided.
  • vector means a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, and adeno-associated virus vectors are included.
  • Vectors that can be used as the recombinant vector are plasmids often used in the art (eg, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14).
  • phages eg, ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1 and M13, etc.
  • viruses eg, SV40, etc.
  • the polynucleotides encoding the protein complex in the recombinant vector may be operably linked to a promoter.
  • operatively linked refers to a functional bond between a nucleotide expression control sequence (eg, a promoter sequence) and another nucleotide sequence.
  • Such regulatory sequences may be “operatively linked” to regulate transcription and / or translation of other nucleotide sequences.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression.
  • the expression vector may be a conventional one used in the art to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms.
  • the recombinant vector may be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector may be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter for example, a pL ⁇ promoter, a CMV promoter, a trp promoter, a lac promoter, a tac promoter, and a T7
  • ribosome binding sites for initiation of translation and transcription / detox termination sequences.
  • replication origins that operate in eukaryotic cells included in the vector include f1 origin, SV40 origin, pMB1 origin, adeno origin, AAV origin and BBV origin.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells eg, metallothionine promoters
  • promoters derived from mammalian viruses eg, adenovirus late promoters, vaccinia virus 7.5K promoters, SV40 promoters, Cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV
  • adenovirus late promoters e.g., vaccinia virus 7.5K promoters, SV40 promoters, Cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV
  • the recombinant cell may be obtained by introducing the recombinant vector into a suitable host cell.
  • the host cell may be any host cell known in the art as a cell capable of continuously cloning or expressing the recombinant vector, and as a prokaryotic cell, for example, E. coliJM109, E. coliBL21, Bacillus genus strains such as E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.
  • coli W3110 Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia marse Enterobacteria and strains such as SONs and various Pseudomonas species, and when transforming eukaryotic cells, host cells, such as yeast (Saccharomyce cerevisiae), insect cells, plant cells and animal cells, such as Sp2 / 0, CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK cell lines and the like can be used.
  • yeast Sacharomyce cerevisiae
  • insect cells such as Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium
  • plant cells such as Sp2 / 0, CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, CO
  • the AgRP may be secreted from mesenchymal stem cells.
  • the pharmaceutical composition may include the administration of mesenchymal stem cells to the subject, such that AgRP secreted therefrom acts on the subject.
  • the mesenchymal stem cells, AgRP or active fragments thereof may be to increase the ubiquitin proteasome activity of neurons.
  • the increase in ubiquitin proteasome activity is as described above.
  • the contact may refer to a step of treating or contacting mesenchymal stem cells, AgRP, or an active fragment thereof with nerve cells.
  • the treatment or contacting may include co-culturing the mesenchymal stem cells with nerve cells, or administering the mesenchymal stem cells, AgRP or an active fragment thereof to an experimental animal, such as the brain of an animal, such as the hippocampus. Can be.
  • the treatment or contact may bring the host cell into contact with, for example, coculture, or host cell comprising a nucleotide sequence encoding AgRP or an active fragment thereof, or connect the host cell to an experimental animal, eg, Administration to an animal's brain, such as the hippocampus.
  • the coculture and administration can be carried out for a method and period of time such that those skilled in the art can achieve the desired effect, for example, mesenchymal stem cells or AgRP or active fragments thereof.
  • the pharmaceutical composition comprising the AgRP or an active fragment thereof may further comprise mesenchymal stem cells. Therefore, the AgRP and mesenchymal stem cells may be administered in combination.
  • the mesenchymal stem cells can be modified by insertion or injection of DNA in cell culture, through methods of altering, enhancing or supplementing cell function, as described above for induction for structural or therapeutic purposes.
  • the composition according to one embodiment may comprise from 0.001% to 80% by weight of AgRP or active fragment thereof, based on the total weight of the composition.
  • the dosage of AgRP or an active fragment thereof may be 0.01 mg to 10,000 mg, 0.1 mg to 1000 mg, 1 mg to 100 mg, 0.01 mg to 1000 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.01 mg to 10 mg, or 0.01 mg to 1 mg.
  • the dose of mesenchymal stem cells may be 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 8 cells / kg (body weight).
  • the dosage may be variously prescribed by such factors as the formulation method, the mode of administration, the age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and reaction sensitivity of the patient. These factors can be taken into account to properly adjust the dosage.
  • the number of administrations may be one or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered to one or two or more sites of administration. In the case of animals other than humans, the same dosages as humans per kg or the above dosages are converted into volume ratios (for example, average values) of organs (heart, etc.) between the target animal and humans. One dose may be administered.
  • Possible routes of administration include oral, sublingual, parenteral (eg, subcutaneous, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intradural, or intravenous), rectal, topical (including transdermal), inhalation, and injection, or implantable devices Or insertion of material.
  • parenteral eg, subcutaneous, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intradural, or intravenous
  • rectal topical (including transdermal), inhalation, and injection, or implantable devices Or insertion of material.
  • topical including transdermal
  • injection or implantable devices Or insertion of material.
  • implantable devices Or insertion of material.
  • target animal for the treatment include humans and mammals for other purposes, and specifically, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cattle, dogs, horses, pigs, and the like. Included.
  • compositions according to one embodiment may comprise a pharmaceutically acceptable carrier and / or additive.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include sterile water, physiological saline, conventional buffers (phosphate, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants (ascorbic acid, etc.), surfactants, suspending agents, isotonic agents, or preservatives.
  • this may include combining organic materials such as biopolymers, inorganic materials such as hydroxyapatite, specifically collagen matrix, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers, and chemical derivatives thereof.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment is formulated in a formulation suitable for injection, the mesenchymal stem cells or AgRP may be dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier or frozen in a dissolved solution.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment may be a suspension, dissolution aid, stabilizer, tonicity agent, preservative, adsorption agent, surfactant, diluent, excipient, pH adjuster, painless agent, Buffers, reducing agents, antioxidants and the like may be included as appropriate.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995.
  • a pharmaceutical composition according to one embodiment is in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient, according to methods which may be readily implemented by one of ordinary skill in the art. It can be prepared by or incorporated into a multi-dose container. The formulations can then be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oil or aqueous media or in the form of powders, granules, tablets or capsules.
  • Another aspect provides a dietary supplement for the improvement or prevention of diseases associated with reduced ubiquitin proteasome activity, such as degenerative brain disease, containing AgRP (Agouti-related peptide) or an active fragment thereof as an active ingredient.
  • diseases associated with reduced ubiquitin proteasome activity such as degenerative brain disease, containing AgRP (Agouti-related peptide) or an active fragment thereof as an active ingredient.
  • AgRP Agouti-related peptide
  • the health food composition may be used with other food or food ingredients in addition to AgRP or an active fragment thereof, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the mixed amount of the active ingredient can be determined suitably according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the composition of the present disclosure may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw material.
  • composition there is an effect that can be useful for preventing, treating, or improving degenerative brain disease by increasing the activity of ubiquitin proteasome.
  • FIG. 1 confirms that human umbilical cord mesenchymal stem cells increase the activity of proteasome of nerve cells; 1A: Determination of chymotrypsin-like fluorescent substrate activation, FIG. 1B: Determination of amount of ubiquitin conjugate protein.
  • FIG. 2 confirms that human umbilical cord mesenchymal stem cells secrete AgRP protein; 2A: Raybio cytokine assay results, FIG. 2B: Quantitative real time PCR results.
  • FIG. 3 shows that AgRP secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells increases the proteasome activity of neurons;
  • Figure 3a Determination of chymotrypsin-like fluorescent substrate activation,
  • Figure 3b Determination of the amount of ubiquitin conjugate protein.
  • FIG. 4 is a diagram confirming that the AgRP protein secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells increases proteasome activity of hippocampal derived cells of an animal model;
  • Figure 4a Western blotting measurement of Ub conjugate,
  • Figure 4b Relative expression values of Ub conjugate.
  • FIG. 5 shows that AgRP protein secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells increases proteasome activity in an animal model
  • FIG. Figure 5a measurement of chymotrypsin-like fluorescent substrate activation
  • Figure 5b experimental protocol
  • Figure 5c measurement of chymotrypsin-like fluorescent substrate activation
  • Figure 5d determination of the amount of ubiquitin conjugate protein.
  • Figure 6 is a graph confirming the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells or AgRP protein on the passive avoidance behavior test in Tau mice.
  • FIG. 7 is a diagram confirming the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells or AgRP protein on tau protein in Tau mice; 7A: Western blotting measurement of tau protein, FIG. 7B: Relative expression value of tau protein.
  • the umbilical cord is cut 3-4 cm long, then the tissue is chopped and treated with collagenase solution (Gibco, USA) for 60-90 minutes to break down the extracellular matrix, followed by 0.25% trypsin (Gibco , USA) was added to further induce degradation at 37 ° C. for 30 minutes.
  • collagenase solution Gibco, USA
  • trypsin Gibco , USA
  • fetal bovine serum FBS; Biowest, USA
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium
  • Nerve cells used SH-SY5Y (ATCC, USA).
  • SH-SY5Y (ATCC, USA) cells were 90% confluency in a 6 well plate (BD Falcon, USA), a transwell insert (BD Falcon, USA) was inserted into each well, and a human umbilical cord was inserted into the insert chamber.
  • stem cells (1X10 5 / 1mL) are not dispensed to serum is added to Minimal Essential Medium alpha 1X; in for 24 hours at (MEM ⁇ 1x Gibco-Invitrogen, USA) , 37 °C, 5% cO 2 environment, were the co-culture .
  • the collected cells were subjected to ultra-sonication using a retic buffer (30 mM Tris (pH 7.8), 5 mM MgCl 2, 5 mM KCl, 0.5 mM DTT, 2 mM ATP).
  • a retic buffer (30 mM Tris (pH 7.8), 5 mM MgCl 2, 5 mM KCl, 0.5 mM DTT, 2 mM ATP).
  • 96 ⁇ l black / clear plate 5 ⁇ g protein and chymotrypsin-like fluorescent substrate, 200 ⁇ M (final concentration: 100 ⁇ M), Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Enzo, Republic of Korea) clear plate) (BD Falcon, USA) and incubated for 4 hours at 37 °C.
  • the reaction was timed by adding ethanol. Chymotrypsin-like fluorescent substrate activation was measured using a fluorometer (Glomax, Promega, USA) and the results
  • ubiquitin conjugates Ub, 1: 1000; Santa Cruz, USA
  • beta actin (1: 5000; Santa Cruz, USA) antibodies
  • the secondary antibody (goat anti-mouse IgG-HRP; Ab frontier, USA) was then treated at room temperature for one hour, and the blots were developed using ECL (Advansta, USA) and the results are shown in FIG. 1B.
  • the chymotrypsin-like activity which is a major degradation activity of the proteasome
  • the amount of the ubiquitin conjugate protein was increased in co-culture.
  • the decrease in one neuron, and the fluorescence intensity was reduced in the co-cultured neurons compared to the non-co-cultured neurons.
  • the medium was removed after co-culture for the Raybio cytokine assay and concentrated using centricon (Millipore, USA). Concentrated media samples were analyzed using RayBio® Human Cytokine Antibody Arrays-Biotin-Label Based G Series (Raybiotech, USA) capable of 509 secretion protein analysis. Proteins with increased 10-fold secretion through WJ-MSC co-culture were analyzed by Equation 1 below, and the results are shown in FIG. 2A.
  • Quantitative real-time PCR was first performed RNA extraction using TRIzol (Life Technologies, USA) in cultured cells, and cDNA synthesis using SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA). The following primers were prepared and used to proceed with PCR;
  • GAPDH REV CCT TCT CCA TGG TGG TGA A (SEQ ID NO: 4).
  • PCR was performed using a Step ONE Plus system (AB, USA) and 2X Power SYBR Green Master Mix (AB, USA) and the conditions were as follows: 95 ° C. 10 minutes, 95 ° C. 15 seconds, 59 ° C. 30 seconds. (40 cycles).
  • Example 1.2 In order to analyze the effect of AgRP, the protein identified in Example 1.2, on ubiquitin proteasome activity in neurons, experiments were performed as follows.
  • the activity of the proteasome was confirmed by chymotrypsin-like activity in the same manner as in Example 1.1, the results are shown in Figure 3a.
  • the amount of ubiquitin conjugate protein was confirmed in the same manner as in Example 1.1, and the results are shown in FIGS. 3B and 3C.
  • mouse hippocampal-derived cells (HT22; Professor Paik, Kyunghee University) were treated with proteasome activity inhibitor MG-132 (Calbiochem, USA) at a concentration of 1 ⁇ M in serum-free DMEM (Biowest, USA) medium, AgRP was treated with each concentration (1, 10, 20, 50 ng / mL) and incubated for 24 hours, 37 °C, 5% CO 2 environment. Thereafter, the amount of ubiquitin conjugate protein was confirmed in the same manner as in Example 1.1. The results are shown in FIG. 4.
  • mice C57BL6 / J; 10-13 months; Jackson Laboratories, USA
  • 10-13 months of age Alzheimer's disease animal model 5XFAD Jackson Laboratories, USA
  • mice administered with PBS alone were used.
  • mice administered with PBS alone were used.
  • mice were euthanized by coronary perfusion and the hippocampus was removed.
  • the removed hippocampus was ground with a medicine bowl, and the protein was extracted in the same manner as in Example 1.1.
  • Proteasome activity was measured in the same manner as in Example 1.1, and the results are shown in Figure 5a.
  • the groups treated with human umbilical cord mesenchymal stem cells and AgRP increased SUC activity compared to the control group, and the amount of ubiquitin conjugate protein in the groups administered with both human umbilical cord mesenchymal stem cells and AgRP decreased compared to the control group. It was confirmed. In addition, it was observed that the SUC activity was lower and the amount of ubiquitin conjugate protein was higher in 6 months 5XFAD hippocampus than in 6 months normal rat hippocampus.
  • Tau mouse human umbilical cord mesenchymal stem cells and identified proteins in regulating ubiquitin proteasome activity in P301S (hereinafter referred to as “Tau” mouse) mouse, another Alzheimer's disease animal mouse model in addition to the 5XFAD mouse model. Proceeded. Ten-month-old Tau mice, a total of four groups, were administered to the hippocampus with human umbilical cord mesenchymal stem cells and AgRP in the same manner as described above. The four groups were:
  • Example 1.1 Tau mice were euthanized by coronary perfusion and the hippocampus was removed. The removed hippocampus was ground with a medicine bowl, and the protein was extracted in the same manner as in Example 1.1. The amount of ubiquitin conjugate protein was measured in the same manner as in Example 1.1. Further antibodies were used to determine the amount of phosphorylated tau proteins via western blotting: Tau 5, AT8, T231, and 3p-tau, the results are shown in FIG.
  • the levels of hyperphosphorylated tau (measured with Tau 5, AT8, T231) and ubiquitin conjugate protein, which are expected to be the etiology of Alzheimer's disease, are higher in Tau mice than in normal mice, while AgRP Western blotting was observed to reduce abnormal protein aggregate in the / MSC-administered group. AgRP / MSC was confirmed to have the effect of removing the Ub conjugate and abnormal tau.
  • a method for controlling the activity of the ubiquitin proteasome in the brain can be screened using the method according to one embodiment, and the screened material thereby increases the activity of the ubiquitin proteasome in the brain. It can be usefully used in the treatment of degenerative brain diseases.

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Abstract

일 양상에 따른 중간엽줄기세포, AgRP 또는 그의 활성 단편을 포함하는 조성물은 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시켜 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환, 예를 들면, 퇴행성 뇌질환의 예방, 치료, 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

중간엽 줄기세포 또는 ＡｇＲＰ를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가를 통한 퇴행성 뇌질환 치료제
중간엽 줄기세포 또는 ＡｇＲＰ를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가를 통한 퇴행성 뇌질환 치료제에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서도 뇌에서 발생하는 질환을 의미하며, 주요 증상과 침범되는 뇌부위를 고려해 구분할 수 있는데, 알츠하이머 질환이나 파킨슨 질환 등이 포함된다. 퇴행성 뇌질환은 노화에 따른 신경퇴화와 유전적 및 환경적 요인들로 인해 단백질이 응집돼 신경세포가 사멸해 야기되는 것으로 알려져 있지만, 아직 정확한 원인은 밝혀지지 않아 원인 규명을 위한 기초 연구가 활발히 진행되고 있는 상황이다.
한편, 미국의 어윈 로즈와 이스라엘의 아론 치카노베르, 아브람 헤르슈코 박사는 유비퀴틴(ubiquitin)이라는 분자가 붙어있는 단백질을 유비퀴틴 프로테아좀 시스템 (Ubiquitin-proteasome system; UPS)이 선택적으로 분해하는 과정을 밝혀내 2004년 노벨 화학상을 수상 하였다. 유비퀴틴 프로테아좀 시스템은 진핵 세포에서 불량 단백질 제거, 세포 분열, 손상된 DNA 수리와 같은 생체 과정에 관여한다. 퇴행성 뇌질환과 같은 질병에서 유비퀴틴 프로테아좀 시스템이 이상이 생기게 되면 독성 단백질이 생체 내 축적이 되는 현상을 일으키게 된다. 특히, 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머병에서, 아밀로이드 단백질이 유비퀴틴 프로테아좀 시스템에 활성을 억제하고, 알츠하이머병 동물 모델에서 뇌의 프로테아좀 활성이 감소된다는 것이 보고된바 있다(비특허 문헌 1 내지 6 참조).
이에 본 발명자들은, 뇌의 유비퀴틴 프로테아좀 활성을 조절하는 물질을 찾기 위해 노력한 결과, 중간엽줄기세포가 신경 세포의 프로테아좀 활성을 증가시킨다는 것을 확인하였고, 프로테아좀 활성 조절 단백질인 AgRP(Agouti related peptide)을 분비한다는 것을 동정함으로써, 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 중간엽줄기세포 또는 AgRP(Agouti-related peptide)를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가제를 제공하는 것이다.
다른 양상은 중간엽줄기세포 또는 AgRP(Agouti-related peptide)를 개체에 투여하거나 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가 방법에 관한 것이다.
다른 양상은 중간엽줄기세포 또는 AgRP(Agouti-related peptide)를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가용 시약 조성물에 관한 것이다.
다른 양상은 중간엽줄기세포 또는 AgRP(Agouti-related peptide)를 포함하는유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환, 예를 들면, 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 AgRP(Agouti-related peptide)를 포함하는 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환, 예를 들면, 퇴행성 뇌질환의 개선 또는 예방을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 중간엽줄기세포 또는 AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가제, 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물, 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가용 시약 조성물, 또는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
일 양상은 중간엽줄기세포 또는 AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가제, 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환, 예를 들면, 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상을 중간엽줄기세포 또는 AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편의 약제학적 유효량을 그를 필요로 하는 개체에 투여하거나, 인 비트로(in vitro) 상에서 세포에 접촉시키거나, 인 비보(in vivo) 상에서 실험동물에 투여하는 단계를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가 방법, 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환, 예를 들면, 퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 중간엽줄기세포, AgRP 또는 그의 활성 단편을 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가용 시약 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 중간엽줄기세포 또는 AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가제, 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환, 예를 들면, 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물, 또는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가용 시약 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "유비퀴틴 프로테아좀 조절제(ubiquitin proteasome regulating agents)"는 유비퀴틴 프로테아좀 시스템을 조절하는 물질을 의미할 수 있다. 예를 들면, 상기 조절은 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시키거나 감소시키는 물질을 포함할 수 있다. 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시키는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가제는 퇴행성 뇌질환 치료제일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "퇴행성 뇌질환(neurodegenerative disease)"은 노화가 진행됨에 따라 뇌조직 또는 뇌세포의 구조 또는 기능이 퇴화되어 발생하는 질병을 의미할 수 있다. 상기 퇴행성 뇌질환의 예로는 알츠하이머병(노인성 치매), 치매, 파킨슨병, 루게릭병, 픽병, 헌팅턴병 또는 타우병증을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "알츠하이머병"이란 노인성 치매와 호환적으로 사용되고, 노인성 플라크, 신경염증 엉킴(tangles), 및 진행성 신경 손실로 특징되는 특정 퇴행성 뇌질환과 관련된 정신적인 퇴화를 수반하는 질병을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "파킨슨병"이란 종종 운동 기능 및 언어능력을 손상시키는 중추 신경계의 만성 및 진행성 퇴행성 질환을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "헌팅턴병"이란 헌팅턴 단백질을 암호화하는 유전자 내 3 염기 반복 팽창에 의해 야기되어, 무도증, 정신이상, 치매 등이 수반되는 신경퇴행성 질환을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "루게릭병"이란 운동신경세포만 선택적으로 사멸되는 질환으로 대뇌 피질의 상위운동신경세포와 뇌간 및 척수의 아래운동신경세포 모두가 점차적으로 파괴되는 질환을 의미할 수 있다.
본 명에서에서 용어 "픽병(pick's disease)"은 뇌의 신경세포의 진행성 파괴를 나타내는 질환을 의미할 수 있다.
본 발명의 용어 "타우병증"이란 타우 단백질(세포 내 마이크로튜불-관련 단백질과 밀접하게 관련된 패밀리)이 뇌조직에 비정상적으로 축적됨에 의하여 뇌신경이 손상되는 신경퇴행성 질환을 의미할 수 있다.
용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
용어, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cells:MSCs)는 자기재생능력(self-renewal)과 줄기세포능(stemness maintenance)을 유지하고 다양한 간엽 조직으로 분화할 수 있는 세포를 의미할 수 있고, 포유류, 예를 들면 인간을 포함한 동물의 중간엽줄기세포를 포함할 수 있다. 또한, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄 유래, 골수 유래, 태반 유래, 또는 지방 유래 중간엽줄기세포인 것일 수 있다. 상기 탯줄은 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있으며, 일반적으로 와튼 젤리(Wharton's Jelly)로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 상기 중간엽줄기세포는 제대 또는 제대혈 유래 중간엽줄기세포일 수 있다. 중간엽줄기세포의 분리는 통상의 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)와 van 등(J. Clin. Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시되어 있다. 상기 중간엽줄기세포는 AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 분비하거나, AgRP 또는 그의 활성 단편을 분비하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "AgRP(Agouti-related peptide)"는 AgRP/NPY 뉴런에 의해 뇌에서 생산되는 신경 펩티드를 의미할 수 있다. 상기 AgRP는 인간을 포함한 척추동물, 예를 들면, 포유류, 어류, 양서류, 조류, 또는 파충류 유래의 AgRP를 포함할 수 있다. 또한, 상기 AgRP는 AgRP의 전구체도 포함하는 의미일 수 있다(예를 들면, 인간의 경우, 132개의 아미노산 서열의 AgRP 유전자 산물(AgRP의 전구체)에서 N-말단으로부터 20개 아미노산 잔기인 신호 펩티드 도메인이 제거되어 112개의 아미노산 잔기로 구성된 AgRP가 생산된다). 또한 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편은 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로 사용될 수 있다. 즉, 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포 중 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 전달 시스템의 예로는 (i) 네이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ii) 플라스미드, (iii) 바이러스 벡터, 그리고 (iv) 상기 네이키드 재조합 DNA분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀을 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다. 예를 들면, 상기 중간엽줄기세포 또는 숙주 세포는 AgRP 또는 그의 활성 단편의 발현 또는 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 것, 예를 들면, AgRP 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 활성 증가는 주어진 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예, 야생형)가 갖지 않는 또는 갖는 내재적 단백질 또는 효소의 활성에 비해, 동일한 타입의 단백질 또는 효소의 활성이 보다 더 높은 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다. 상기 외인성 유전자는, 상기 중간엽줄기세포 또는 숙주 세포에서 그 모세포에 비하여 언급된 단백질의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 발현 벡터를 통하여 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 선형 폴리뉴클레오티드 형태로 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터 (예, 플라스미드)로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전물질 (예, 염색체)에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다.
AgRP 또는 그의 활성 단편의 합성은 펩타이드 화학(peptide chemistry)에서 일반적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있다. 일반적인 합성 방법은 "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; "The Proteins", Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; "Peptide Synthesis(Peptide Gosei)", Maruzen, 1975; "Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis(Peptide Gosei no Kiso to Jikken)", Maruzen, 1985; 및 "The sequel of Development of Pharmaceuticals(Zoku Iyakuhin no Kaihatsu)", Vol. 14, Peptide Synthesis(Peptide Gosei), Hirokawa Shoten, 1991과 같은 문헌, 및 국제공개 번호 WO 99/67288와 같은 국제공개특허에 기재되었다. 또한 단백질 또는 펩티드는 알려진 유전 공학 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, AgRP 또는 그의 활성 단편을 암호화하고 있는 DNA가 삽입된 벡터는 형질전환된 세포(transformed cells)를 생산하기 위해 적합한 숙주 세포에 도입(introduced into)하고, 이렇게 형질전환된 세포들에서 생산되는 펩타이드들을 수집함으로써 얻어질 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드는 처음에 펩타이드를 얻기 위해 그 다음에 적절한 프로테아제(protease)를 이용해 잘리는 융합 단백질(fusion protein)로서 만들어질 수 있다. 이들은 그 자체로서 약학적 조성물에 사용될 수도 있다.
융합 단백질을 제조하기 위한 방법에서, AgRP 또는 그의 활성 단편을 암호화하고 있는 폴리뉴클레오티드는 다른 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 프레임(frame)에 연결(ligate)될 수 있으며, 이것은 숙주(host)에서의 발현(expression)을 위해 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 당업계에 알려진 기술들은 이런 목적을 위해 이용될 수 있다. AgRP와 융합된 펩타이드들을 위해, FLAG(Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6개의 히스티딘(His)으로 이루어진 6x His 잔기들(residues), 10x His, influenza hemagglutinin(HA), 인간 c-myc 단편, VSV-GP 단편, p18HIV 단편(fragments), T7-태그(tag), HSV-태그, E-태그, SV40T 항원 단편, lck 태크, 알파-튜블린(alpha-tubulin) 단편, B-태그, 및 Protein C 단편과 같이 알려진 펩타이드를 사용할 수 있다. 또한, 융합 단백질을 만들기 위해 AgRP 또는 그의 활성 단편을 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(glutathione-S-transferase, GST), influenza hemagglutinin(HA), immunoglobulin constant regions, 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 말토즈-결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 또는 등등을 연결하는 것이 가능하다.
따라서, 다른 구체예에 있어서, 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공될 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coliJM109, E. coliBL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 AgRP는 중간엽줄기세포로부터 분비되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 약학적 조성물은 중간엽줄기세포를 개체에 투여함으로써, 이로부터 분비된 AgRP가 개체에 작용하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 상기 중간엽줄기세포, AgRP 또는 그의 활성 단편은 신경 세포의 유비퀴틴 프로테아좀 활성을 증가시키는 것일 수 있다. 유비퀴틴 프로테아좀 활성의 증가에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가 방법에 있어서, 상기 접촉은 중간엽줄기세포, AgRP 또는 그의 활성 단편을 신경 세포에 처리, 또는 접촉시키는 단계를 의미할 수 있다. 상기 처리 또는 접촉은 중간엽줄기세포를 신경 세포와 공배양하거나, 또는 중간엽줄기세포, AgRP 또는 그의 활성 단편을 실험 동물, 예를 들면 동물의 뇌, 예를 들면, 해마에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 처리 또는 접촉은 AgRP 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포와 신경 세포와 접촉시키거나, 예를 들면, 공배양하거나, 또는 상기 숙주 세포를 실험 동물, 예를 들면, 동물의 뇌, 예를 들면, 해마에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 공배양 및 투여는 통상의 당업자가 목적하는 효과, 예를 들면, 중간엽줄기세포 또는 AgRP 또는 그의 활성 단편이 신경 세포에 영향을 미칠 수 있도록 하는 방법 및 기간 동안 수행될 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편을 포함하는 약학적 조성물은 중간엽줄기세포를 더 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 AgRP와 중간엽줄기세포가 병용 투여 되는 것일 수 있다. 상기 중간엽줄기세포는 구조적 또는 치료적 목적으로의 유도를 위해 상기한 바와 같이, 세포 기능을 변화, 강화 또는 보충하는 방법을 통한, 세포 배양에서의 DNA의 삽입 또는 주입에 의해 변형될 수 있다.
일 구체예 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%의 AgRP 또는 그의 활성 단편을 포함할 수 있다. 또한, AgRP 또는 그의 활성 단편의 투여 용량은 0.01mg 내지 10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다. 또한, 중간엽줄기세포의 투여 용량은 1.0× 105 내지 1.0× 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 경구, 설하, 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 직장, 국소 (경피 포함), 흡입, 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 중간엽줄기세포 또는 AgRP가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
또 다른 양상은 AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 유효성분으로 함유하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환, 예를 들면, 퇴행성 뇌질환의 개선 또는 예방용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강식품 조성물은 AgRP 또는 그의 활성 단편 이외에 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.
일 양상에 따른 약학적 조성물에 의하면, 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시켜 퇴행성 뇌질환의 예방, 치료, 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 인간 제대 중간엽줄기세포가 신경 세포의 프로테아좀을 활성을 증가시킨다는 것을 확인한 도면이다; 도 1a: 키모트립신 유사 형광기질 활성화 측정, 도 1b: 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양 측정.
도 2는 인간 제대 중간엽줄기세포가 AgRP 단백질을 분비하는 것을 확인한 도면이다; 도 2a: 레이바이오 사이토킨 어세이 결과, 도 2b: 정량적 실시간 PCR 결과.
도 3은 인간 제대 중간엽줄기세포가 분비하는 AgRP가 신경 세포의 프로테아좀 활성을 증가시키는 것을 확인한 도면이다; 도 3a: 키모트립신 유사 형광기질 활성화 측정, 도 3b: 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양 측정.
도 4는 인간 제대 중간엽줄기세포가 분비하는 AgRP 단백질이 동물 모델의 해마 유래 세포의 프로테아좀 활성을 증가시키는 것을 확인한 도면이다; 도 4a: Ub 컨쥬게이트의 웨스턴 블랏팅 측정, 도 4b: Ub conjugate의 상대적 발현 값.
도 5는 인간 제대 중간엽줄기세포가 분비하는 AgRP 단백질이 동물 모델에서 프로테아좀 활성을 증가시키는 것을 확인한 도면이다; 도 5a: 키모트립신 유사 형광기질 활성화 측정, 도 5b: 실험 프로토콜, 도 5c: 키모트립신 유사 형광기질 활성화 측정, 도 5d: 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양 측정.
도 6은 인간 제대 중간엽줄기세포 또는 AgRP 단백질이 Tau 마우스에서 수동적 회피 행동 테스트에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 7은 인간 제대 중간엽줄기세포 또는 AgRP 단백질이 Tau 마우스에서 타우 단백질에 미치는 영향을 확인한 도면이다; 도 7a: 타우 단백질의 웨스턴 블랏팅 측정, 도 7b: 타우 단백질의 상대적 발현 값.
이하 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 . 인간 중간엽줄기세포를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료 효능을 갖는 단백질의 스크리닝 및 그에 의해 동정된 단백질의 활성 분석
1. 인간 중간엽줄기세포를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료 효능을 갖는 단백질 스크리닝
1.1. 인간 제대 중간엽줄기세포의 신경 세포에 대한 활성 확인
인간 제대 중간엽줄기세포(Wharton's Jelly-MSC: WJ-MSCs)가 신경 세포의 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시킨다는 것을 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
인간 제대 중간엽줄기세포는 본원에서 승인한 IRB (IRB# 2015-09-023-003)의 기준에 따라 삼성서울병원 산부인과와의 협업 연구를 통하여 탯줄을 확보한 후 기존에 보고된 프로토콜에 따라 중간엽줄기세포 분리 진행을 하였다(Choi, M, Lee, HS, Naidansaren, P, Kim, HK, O, E, Cha, JH, et al. (2013). Proangiogenic features of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal/stem cells and their ability to form functional vessels. Int J Biochem Cell Biol 45: 560-570). 구체적으로, 탯줄을 3-4 cm 길이 자른 다음, 조직을 잘게 자르고 콜라게나아제 용액(Gibco, USA)을 이용하여 세포외기질을 분해하기 위해 60-90 분 동안 처리 해준 다음, 0.25% 트립신 (Gibco, USA)을 추가하여 30분 동안, 37°C에서 분해를 더 유도하였다. 이후에, 소태아혈청(FBS; Biowest, USA)을 첨가하여, 1000g에서 10분 동안 원심분리를 이용하여 세포를 얻고, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium) (DMEM; Biowest, USA) 에 20% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco,USA)이 첨가된 배지를 이용하여 37 ℃, 5% CO2 환경에서 세포를 배양하였고, passage 5 에서 6 이된 WJ-MSC를 실험에 사용하였다.
신경 세포는 SH-SY5Y(ATCC, USA)를 사용하였다. 먼저, 6 웰 플레이트(BD Falcon, USA)에서 SH-SY5Y (ATCC, USA)세포가 90% confluency가 되었을 때, transwell insert (BD Falcon, USA)를 각 웰에 삽입하여, insert chamber에 인간 제대 중간엽줄기세포(1X105/1mL)를 분주하여 혈청이 첨가 되지 않은 Minimal Essential Medium alpha 1X (MEMα1x; Gibco-Invitrogen, USA)에서 24시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 환경에서, 공동 배양을 하였다.
이후에, 인간 제대 중간엽줄기세포가 신경 세포의 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시키는지 확인하기 위해, 세포에서의 프로테아좀의 주요 분해 활성인 키모트립신 유사 활성, 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양, 및 형광 기질이 도입된 신경세포에서의 형광 세기를 측정하였다. 대조군으로는 중간엽줄기세포와 공동배양하지 않은 신경세포를 사용하였다.
구체적으로, 수집된 세포를 레틱 버퍼(retic buffer) (30 mM Tris (pH 7.8), 5mM MgCl2, 5mM KCl, 0.5mM DTT, 2 mM ATP)를 이용하여 초음파 처리(ultra-sonication)를 한 이후에, 5 μg의 단백질과 키모트립신 유사 형광기질인 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Enzo, Republic of Korea)을 200 μM (최종 농도: 100 μM)으로 96 웰 블랙/클리어 플레이트(black/clear plate) (BD Falcon, USA)에 넣고, 37 ℃에서 4시간까지 배양하였다. 반응은 에탄올을 첨가하여 정시시켰다. 키모트립신 유사 형광기질 활성화는 플루오로미터(fluorometer) (Glomax, Promega, USA)를 사용하여 측정을 수행하였고, 그 결과를 도 1a에 나타내었다.
프로테아좀 시스템으로 분해되는 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양의 측정은 웨스턴 블랏팅을 통해 확인하였다. 웨스턴 블랏팅은 먼저, 레틱 버퍼(retic buffer)로 초음파 처리한 단백질을 우레아 버퍼(urea buffer) 와 1:1로 혼합하였다. 이후에, 원심분리를 하여, 상층액을 모아서 Bradford assay (Bio-rad, USA)를 이용하여 단백질 정량을 하였다. 각 샘플에서 10 μg에 단백질을 겔에 로딩한 후, SDS를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 트랜스퍼시킨 이후에, 5% 탈지유(BD Difco, USA)에 1% TBST (Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20) 이 첨가된 용액에 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 이후에, 유비퀴틴 컨쥬게이트 (Ub, 1:1000; Santa Cruz, USA) 와 베타 액틴(1:5000; Santa Cruz, USA) 항체를 처리하였고, 4 ℃°C에서 하룻밤동안 배양하였다. 이후, 이차 항체(goat anti-mouse IgG-HRP; Ab frontier, USA)를 한 시간 동안 상온에서 처리하고, 블랏들은 ECL (Advansta, USA) 를 이용하여 발달시켰고, 그 결과를 도 1b에 나타내었다.
형광기질이 도입된 신경세포에서의 형광 세기의 측정은 GFP가 붙어 있는 프로테아좀의 기질은 GFP-degron을 신경 세포에 리포펙타민 2000 (Life Technologies, USA) 형질전환 방법으로 과발현하고, 공초좀 현미경 (LSM 700; Carl Zeiss AG, Jena, Germany)으로 관찰한 후 형광 세기를 Image-J (NIH, USA) 분석 프로그램을 이용하여, 측정하였고 그 결과를 도 1c에 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 공동 배양을 한 신경 세포에서 프로테아좀의 주요 분해 활성인 키모트립신 유사 활성이 공동 배양을 하지 않은 신경 세포 보다 높고, 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양이 공동 배양을 한 신경 세포에서 감소하였으며, 공동 배양을 한 신경 세포에서 공동 배양을 하지 않은 신경 세포 대비 형광 세기가 줄어드는 것을 확인하였다. 상기의 결과로, 인간 제대 중간엽줄기세포를 신경 세포와 공동 배양시, 신경 세포의 프로테아좀 활성이 높아지는 것을 알 수 있다.
1.2. 인간 제대 중간엽줄기세포로부터 분비되는 단백질의 동정
인간 제대 중간엽줄기세포를 신경 세포와 공동 배양하였을 시, 분비되는 단백질을 동정하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로 인간 제대 중간엽줄기세포로부터 분비되는 단백질을 확인하기 위해 레이바이오 사이토킨 어세이(Raybio cytokine assay) 및 정량적 실시간 PCR(real time quantitative reverse transcription PCR)을 수행하였다.
레이바이오 사이토킨 어세이를 하기 위해 공동배양을 한 후 배지를 제거하고, 센트리콘(centricon) (Millipore, USA)을 사용하여 농축하였다. 농축한 배지 샘플들은 509 분비단백질 분석이 가능한 RayBio® Human Cytokine Antibody Arrays - Biotin-Label Based G Series (Raybiotech, USA)를 이용하여 분석을 수행하였다. WJ-MSC 공동배양을 통해 10배 분비가 증가된 단백질들을 하기 수학식 1로 분석을 하였고, 그 결과를 도 2a에 나타내었다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2017007174-appb-I000001
정량적 실시간 PCR은 먼저 배양한 세포에서 TRIzol (Life Technologies, USA) 를 이용하여 RNA 추출을 하였고, SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)를 사용하여 cDNA 합성을 하였다. PCR를 진행하기 위해 다음과 같은 프라이머들을 제작 및 사용을 하였다;
AGRP Forward (FOR): AGT CAC GTG TGG CCC TTC AT(서열번호 1)
AGRP Reverse (REV): TCC GGG ATT CTT GCC TAG AG(서열번호 2)
GAPDH FOR: CGA GAT CCC TCC AAA ATC AA(서열번호 3)
GAPDH REV: CCT TCT CCA TGG TGG TGA A(서열번호 4).
Step ONE Plus system (AB, USA) 과 2X Power SYBR Green Master Mix (AB, USA)를 사용하여 PCR을 수행하였고, 그 조건은 다음과 같았다: 95 ℃ 10 분, 95 ℃ 15초, 59℃ 30초(40 cycles). AGRP 발현 분석은 Livak 과 Schmittgen의 2-△△CT 방법(Leitch, AE, Lucas, CD, Marwick, JA, Duffin, R, Haslett, C, and Rossi, AG (2012). Cyclin-dependent kinases 7 and 9 specifically regulate neutrophil transcription and their inhibition drives apoptosis to promote resolution of inflammation. Cell Death Differ 19: 1950-1961.)으로 수행하였고, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 인간 제대 중간엽줄기세포를 신경 세포와 공동 배양을 하였을 때, AgRP라는 단백질을 분비한다는 것을 확인하였다.
2. 동정된 단백질의 활성 분석
2.1. 동정된 단백질이 신경 세포에서 유비퀴틴 프로테아좀 활성에 미치는 영향 분석
상기 실시예 1.2.에서 동정된 단백질인 AgRP가 신경 세포에서 유비퀴틴 프로테아좀 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, 신경 세포 SH-SY5Y (ATCC, USA)세포가 90% confluency가 되었을 때, 혈청이 첨가되지 않은 Minimal Essential Medium alpha 1X (MEMα1x; Gibco-Invitrogen, USA)에 1, 10, 20, 50ng/mL AgRP (R&D, USA) 를 처리하고, 24시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 환경에서 배양을 하였다. 대조군으로는 1, 10, 20, 50ng/mL의 PBS 중 0.1% BSA를 사용하였다.
프로테아좀의 활성은 상기 실시예 1.1과 동일한 방법으로 키모트립신 유사 활성을 확인하였고, 그 결과를 도 3a에 나타내었다. 또한, 상기 실시예 1.1과 동일한 방법으로 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양을 확인하였고, 그 결과를 도 3b 및 3c에 나타내었다.
신경 세포 SH-SY5Y (ATCC, USA)세포가 90% confluency가 되었을 때, serum이 첨가 되지 않은 Minimal Essential Medium alpha 1X (MEMα1x; Gibco-Invitrogen, USA)에 농도별 (0-50 ng/mL)로 AgRP를 처리하고, 24시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 환경에서 배양을 하였다. 대조군으로는 PBS 중 0.1% 소태아 혈청(BSA)을 동일한 농도로 SH-SY5Y에 처리 하였다.
추가적으로, 무혈청 DMEM (Biowest, USA)배지에서 생쥐 해마 유래 세포(HT22; 백남인 교수님, 경희대학교)에 프로테아좀 활성 저해제인 MG-132(Calbiochem, USA)를 1 μM의 농도로 처리하였고, AgRP를 농도 별로 (1,10,20,50 ng/mL) 같이 처리하고 24시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 환경에서 배양을 하였다. 이후에, 상기 실시예 1.1.과 동일한 방법으로 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, AgRP를 처리한 신경세포가 대조군인 정상 세포에 비해 키모트립신 유사 활성(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC:SUC)이 증가하였고, 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 발현 양이 AgRP 농도 의존적으로 감소된 것을 확인하였다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 프로테아좀 저해제인 MG-132를 AgRP와 같이 처리하여 주었을 때, AgRP가 농도 의존적으로 유비퀴킨 컨쥬게이트 단백질의 발현 양이 감소시키는 것을 확인하였다.
상기의 결과로, AgRP가 신경 세포에서 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
2.2. 동정된 단백질이 동물 모델에서 프로테아좀 활성에 미치는 영향 분석
AgRP가 동물 모델에서 프로테아좀 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 하기의 실험을 수행하였다. 동물 모델로서는 정상 마우스(C57BL6/J; 10-13개월; Jackson Laboratories, USA) 및 10-13 개월령의 알츠하이머병 동물 모델 5XFAD (Jackson Laboratories, USA)를 사용하였다.
먼저, 정상 마우스의 해마에 2 X 105 세포수(2 X 105/3μl)의 인간 제대 중간엽줄기세포를, 그리고 AgRP (1000ng/kg)을 stereotaxic기계 (Harvard apparatus, USA) 를 이용하여, bregma 좌표를 잡은 후 0.5 μl/min 속도로 해마에 투여 하였다 (A/P -2.3mm, M/L -1.3mm, and D/V -2.0 mm). 대조군으로는 PBS만 투여한 마우스를 사용하였다. 투여 1주일 후에, 정상 마우스를 관동맥 관류로 안락사 시킨 후, 해마를 제거하였다. 제거된 해마를 약사발로 갈은 다음, 상기 실시예 1.1과 동일한 방법으로 단백질을 추출하였다. 프로테아좀 활성은 상기 실시예 1.1.과 동일한 방법으로 측정하였고, 그 결과를 도 5a에 나타내었다.
그 결과, 인간 제대 중간엽줄기세포 와 AgRP를 투여한 군들이 PBS만 투여를 한 군에 비해 프로테아좀 활성이 증가한 것을 확인하였다.
이러한 정상 마우스에서의 실험 결과를 바탕으로 알츠하이머병 동물 모델인 5XFAD에서의 실험을 진행하였다. 실험은 도 5b에 나타낸 바와 같은 좌표를 이용하여 대조군으로 인산완충식염수를 3μl의 용량을 투여하였고, 실험군으로서는 인간 제대 중간엽줄기세포 및/또는 AgRP를 각각 2X105/3μl, 1000ng/kg의 용량으로 상기와 동일한 방법으로 동물 모델의 해마에 투여하였다. 투여 1주일 후에, 상기 정상 마우스에서의 실험과 동일한 방법으로 단백질을 추출하였다. 프로테아좀 활성은 상기 실시예 1.1.과 동일한 방법으로 키모트립신 유사 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 5c에 나타내었다.
기존에 보고된 실험들과 동일하게 같은 개월 수 정상 쥐에 비해, 알츠하이머병 동물 마우스 모델 (5XFAD)에서 프로테아좀 활성이 줄어든 것을 확인하고자 예비 실험을 진행 하였다. 6개월 된 정상과 5XFAD 쥐를 안락사 시킨후, 해마를 적출하여 상기와 동일한 방법으로 단백질을 추출하여 프로테아좀 활성은 상기 실시예 1.1.과 동일한 방법으로 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양을 측정하였고, 그 결과를 도 5d에 나타내었다.
그 결과, 인간 제대 중간엽줄기세포 와 AgRP를 투여한 군들은 대조군에 비하여 SUC 활성이 증가하였고, 인간 제대 중간엽줄기세포 및 AgRP를 모두 투여해준 군들의 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양이 대조군에 비해 감소한 것을 확인하였다. 또한 6개월 정상쥐 해마의 비해, 6개월 5XFAD 해마에서 SUC 활성이 낮고 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양이 높다는 것을 관찰하였다.
또한, 5XFAD 마우스 모델 외에 다른 알츠하이머병 동물 마우스 모델인 P301S (이하 “Tau” 마우스 라고 함) 마우스에서 인간 제대 중간엽 줄기세포 그리고 동정된 단백질이 유비퀴틴 프로테아좀 활성을 조절하는 효능을 확인하고자 추가 실험을 진행 하였다. 10개월된 Tau 마우스, 총 4 그룹에, 상기와 동일한 방법으로 인간 제대 중간엽줄기세포와 AgRP를 해마에 투여하였다. 4가지 그룹은 다음과 같았다:
(1) 인간 제대 중간엽줄기세포 (2 X 105/3μl)
(2) AgRP (Low): 20 ng / 3μl
(3) AgRP (High) : 50 ng / 3μl
(4) Vehicle : PBS
투여 1주일 후에, 단기 그리고 장기 기억 변화를 확인하고자 수동적 회피 행동 테스트(passive avoidance behavior test)를 시행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, 비어클 대조군 마우스군에 비해 AgRP/MSC 투여 군에서 트레이닝 및 테스트 시도(training and test trial) 에서 모두 인지기능이 향상된 것을 확인하였다.
행동 실험을 진행 한 다음, Tau 마우스를 관동맥 관류로 안락사 시킨 후, 해마를 제거하였다. 제거된 해마를 약사발로 갈은 다음, 상기 실시예 1.1 과 동일한 방법으로 단백질을 추출하였다. 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양의 측정은 상기 실시예 1.1.과 동일한 방법으로 측정하였다. 추가로 인산화된 tau 단백질들의 양을 웨스턴 블랏팅을 통해 측정하고자 다음과 같은 항체들을 사용하였고: Tau 5, AT8, T231, 및 3p-tau, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 알츠하이머병의 병인으로 예상되는 고인산화(hyperphosphorylated) tau (Tau 5, AT8, T231로 측정) 그리고 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양이 정상 마우스 와 비교하였을 때 Tau 마우스에서 더 높게 발현되는 반면, AgRP/MSC 투여 군에서는 비정상적인 단백질 응집(abnormal protein aggregate)이 줄어드는 것을 웨스턴 블랏팅을 통해 관찰하였다. 이에 AgRP/MSC가 Ub 컨쥬게이트와 비정상적인 타우를 제거하는 효능이 있음을 확인하였다.
상기의 결과로, 일 구체예에 따른 방법을 사용하여 뇌의 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 조절하는 물질을 스크리닝 할 수 있으며, 또한 이에 의해 스크리닝된 물질은 뇌의 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시켜 퇴행성 뇌질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 할 수 있다.

Claims (20)

  1. 중간엽줄기세포, AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가제.
  2. 중간엽줄기세포를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 AgRP(Agouti-related peptide)를 분비하거나 모세포에 비하여 AgRP 또는 그의 활성 단편을 과발현하도록 유전적으로 조작된 것인 약학적 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 제대 유래, 제대혈 유래, 골수 유래, 태반 유래, 또는 지방 유래 중간엽줄기세포인 것인 약학적 조성물.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환은 퇴행성 뇌질환인 것인 약학적 조성물.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 치매, 파킨슨병, 루게릭병, 픽병, 헌팅턴병 및 타우병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시키는 것인 약학적 조성물.
  8. AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 중간엽줄기세포를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 AgRP는 중간엽줄기세포로부터 분비되는 것인 약학적 조성물.
  11. 청구항 9 또는 10에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 제대 유래, 제대혈 유래, 골수 유래, 태반 유래, 또는 지방 유래 중간엽줄기세포인 것인 약학적 조성물.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편은 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시키는 것인 약학적 조성물.
  13. 청구항 8에 있어서, 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편은 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포 중 포함되어 있는 것인 약학적 조성물.
  14. 청구항 8에 있어서, 상기 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환은 퇴행성 뇌질환인 것인 약학적 조성물.
  15. 청구항 8에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 치매, 파킨슨병, 루게릭병, 픽병, 헌팅턴병 및 타우병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  16. AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 유효성분으로 함유하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환의 개선 또는 예방을 위한 건강기능식품.
  17. 중간엽줄기세포, 또는 AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 그를 필요로 하는 개체에 투여하거나, 또는 인 비트로(in vitro) 상에서 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성을 증가시키는 방법.
  18. AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가용 시약 조성물.
  19. 중간엽줄기세포 또는 AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편의 약제학적 유효량을 그를 필요로 하는 개체에 투여하거나 인 비트로(in vitro) 상에서 세포에 접촉시키거나, 또는 인 비보(in vivo) 상에서 실험동물에 투여하는 단계를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가 방법.
  20. 중간엽줄기세포 또는 AgRP(Agouti-related peptide) 또는 그의 활성 단편을 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가제, 유비퀴틴 프로테아좀 활성 감소와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물, 또는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가용 시약 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도.
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