KR102530161B1 - 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 면역억제 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 면역억제 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 상기 제대혈 혈장 유래 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 엑소좀 모방체를 다양한 자가면역질환의 개선, 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
Description
본 발명은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 면역억제 용도에 관한 것이다.
인간 제대혈은 이식을 위한 조혈줄기세포의 소스로 사용되어 왔으나 면역세포, 중간엽 기질 세포 및 내피 전구체 세포 등의 다수의 세포들을 함께 포함하고 있다. 모체의 면역 시스템을 통한 태아의 면역 내성은 임신 유지에 중요한 역할을 담당한다. 태아와 모체 간의 면역학적 상호작용은 태아 항원의 제시 및/또는 모체 면역 시스템에 의한 이들 항원의 인지 및 이에 대한 반응에 의해 조절되는 양방향 커뮤니케이션 시스템을 나타낸다. 인간 제대혈 유래의 세포는 임신 유지에 기여하는 특정한 면역조절 특성들을 가지고 있다. 더욱이, 인간 제대혈은 또한 조절성 T 세포(Tregs) 및 단핵구-유래의 억제세포(MDSCs)와 같은 면역억제세포의 풍부한 소스이다.
엑소좀은 기능성 단백질의 독특한 서브세트를 탑재하여 그들의 세포 혈통을 반영하는 작은 세포막 베지클이다. 인간 제대혈 유래의 세포는 엑스 비보에서 선별 및 확장되므로, 이들 세포 유래의 엑소좀은 세포 배양 상등액에서 효율적으로 분리될 수 있다. 인간 제대혈 유래의 세포에서 방출된 엑소좀은 그들은 Tregs 및 MDSCs와 같은 순환성 면역억제세포의 분화를 유도할 수 있어 면역억제 효과를 가질 수 있다. 그러나, 인간 제대혈 유래의 세포 및 엑소좀에 대한 연구에서의 발전에도 불구하고, 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀(CBPexo)에 대한 연구는 빈약하다. CBPexo에 대한 프로테오믹스 연구 결과 엑소좀의 단백질은 T-세포 증식, 분화 및 음성적 조절; 막 투과성; 상처-치료; 아르기나아제 활성; 및 효소 조절 활성과 연관이 있었다. 인간 제대혈 유래의 세포외에도, 인간 제대혈 혈장 역시 다양한 면역조절 인자들을 포함하고 있어 IL-2 신호전달을 억제하여 T-세포 증식을 억제함에 있어 역할을 담당하고 있다. IL-2 및 이의 수용체인 IL-2R은 T 세포의 증식 및 생존 및 나이브 T 세포의 분화를 지원하는데 역할을 담당하고 있다. IL-2R 알파 체인(IL-2Rα/CD25)은 IL-2R의 필수 성분이다. 더욱이, CD4+T 세포에서의 IL-2Rα의 표면 발현 및 활성화 T 세포에서의 IL-2의 수준은 MMP-9에 의해 유의적으로 감소된다. 화학적 억제제에 의한 MMP 활성 억제는 IL-2 생산을 회복시키고, T 세포 증식을 부분적으로 회복시킨다. MMP-9 뿐만 아니라 CBP 면역조절인자들이 CBPexo에서 발견되며, 이들 엑소좀은 집중된 면역억제력을 나타낼 것이다.
1. Ballen, K.K. et al., Blood, 2013. 122(4): p. 491-8.
2. Brunstein, C.G., et al., Blood, 2016. 127(8): p. 1044-51.
3. van Niel, G., et al., J Biochem, 2006. 140(1): p. 13-21.
4. Erices, A. et al., Br J Haematol, 2000. 109(1): p. 235-42.
5. Lin, S.J., et al., Immunol Res, 2014. 60(1): p. 105-11.
6. Zhang, B., et al., Stem Cells Dev, 2014. 23(11): p. 1233-44.
7. Jia, R., et al., Cell Physiol Biochem, 2015. 36(6): p. 2299-306.
8. Garanina, E.E., et al., Blood, 2017. 130.
9. Jia, R., et al., Cell Physiol Biochem. 36(6): p. 2299-306.
본 발명의 목적은 성인 혈장 유래의 엑소좀과 비교하여 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 규명함으로써 이의 약학적 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 엑소좀 모방체 및 이의 약학적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀과 나이브 CD4+T 세포를 인 비트로 배양하는 단계를 포함하는 인 비트로에서 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에서 유래하고, 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군에서 선택된 하나 이상을 발현하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 포함하는 면역억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 다양한 자가면역질환의 개선, 예방 또는 치료에 사용하며, 상기 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 엑소좀 모방체는 효과적인 면역억제 효과를 제공한다.
도 1a-d는 인간 제대혈 혈장에서 정제된 엑소좀 막 베지클의 특성 규명 결과를 나타내는 도면이다.
(a) 다양한 엑소좀 특이 마커 항체가 코팅된 라텍스 비드에 결합된 CBPexo를 플로우 사이토메트리로 분석한 결과이다. 비교를 위해 완전 엑소좀 제제로 코팅된 라텍스 비드를 포함한다. 플롯은 상응하는 비드 단독 대조군에 대한 엑소좀 특이 항체들(CD9, CD63, CD82 및 HSP72)로부터 유래된 강도를 나타낸다.
(b)는 CBPexo 용해물의 도트 블롯 분석 결과이다. 대응하는 도트는 엑소좀 항체 어레이 키트를 사용하여 평가되었다. 엑소좀 특이 항체 스팟은 다양한 강도의 신호를 제공한다. 제시된 값은 3회의 독립적인 실험에서 얻은 값의 평균을 나타낸다. 오차 막대 = 평균의 표준 오차 (SEM). "블랭크"는 음성 대조군을 나타내며, φ로 나타내고, GM130은 세포 부스러기를 나타낸다. 평균 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석된다.
(c)는 CBPexo의 형태적 특성 분석 결과이다. 전자현미경을 이용하여 CBPexo는 지질 이중층 구조로 구성되어있고 크기는 (50-130 nm)인 형태적 특성을 확인하였다. 스케일 바는 100 nm를 나타낸다.
(d)는 CBPexo의 크기와 파티클 수 분석 결과이다. 엑소좀의 크기는 81 ± 1.4 nm 이고 파티클 수는 1.64Х1012 ± 2.37Х1010 particles/mL 이다.
도 2a-c는 차등적으로 발현된 단백질과 관련된 분자적 기능 및 생물학적 과정을 나타내는 도면이다.
(a) 질량 분석법으로 스크리닝된 엑소좀에서 혈장 유래의 엑소좀 및 다양한 면역억제분자의 프로테오믹스 분석 결과이다(ExoCarta 및 Mascot v2.3.01로 질량 분석 데이터 검사).
(b) ExoCarta 데이터베이스와 SBC 분석 시스템을 사용한 인간 CBPexo 및 ABPexo의 다양한 생물학적 기능의 프로테오믹스 분석 결과이다. (c) ExoCarta 데이터베이스 및 SBC 분석 시스템을 사용하여 스크리닝된 인간 CBPexo 및 ABPexo의 프로테오믹스 분석 결과 및 면역억제분자의 다양한 분자적 기능을 나타낸다. 레드 박스는 기능적 분류 결과로서 CBPexo의 더 높은 연관성을 나타낸다.
도 3a-d는 CD3/CD28 DYNABEAD-자극된 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CBPexo 매개된 면역억제 메카니즘을 도시한 것이다.
(a) CBPexo가 CD4+ 및 CD8+ T 세포 자극을 억제함을 입증하는 대표 실험 데이터이다. CFSE-표지된 T 세포의 강도는 플로우 사이토메트리에 의해 얻고, ModFit LT 3.0 소프트웨어로 추가 분석한다.
(b) 인간 PBMC를 CBPexo 또는 ABPexo 하에서 CD3/CD28 DYNABEAD를 이용하여 농도 의존적으로 활성화시킨다. 라파마이신 및 시클로스포린은 면역억제제로 잘 알려져 있어 표준 양성 대조군으로 사용한다. CFSE-표지된 T 세포의 강도는 플로우 사이토메트리에 의해 얻고, ModFit LT 3.0 소프트웨어로 추가 분석한다. 모든 실험은 CBPexo의 5종의 상이한 배취를 이용하여 5회 이상 반복한다(혈장 엑소좀의 1 배취=제대혈 10 유닛의 합). 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01. 활성화된 PBMC는 양성 대조군=φ를 나타낸다.
(c) 아넥신 V-FITC 및 7AAD의 대표 실험 데이터는 인간 PBMC가 CBPexo 또는 ABPexo 하에서 CD3/CD28 DYNABEAD로 활성화됨을 도시한다.
(d) CBPexo는 CD3/CD28 DYNABEAD에 의해 활성화된 CD4+T 세포의 세포사멸을 유도한다. CD4+ 및 CD+8 T 세포는 156시간 후에 채취하고 아넥신 V-FITC, 7AAD, 항-CD4-APC 및 항-CD8-V450 항체로 염색한다. CD4상에 게이트된 세포를 도시한다. 분석 데이터는 FlowJo v10을 사용하여 분석한다. 이 실험은 5회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
도 4는 CBPexo에 의해 유도된 CD4+T 세포에서의 G0/G1 세포주기 정지 효과를 나타낸 것이다. 실험은 독립적으로 3번 반복되며, 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 유의성을 계산한다 : * p <0.1 ** p <0.05 *** p <0.01.
도 5a-e는 CBPexo에 의한 Treg 세포의 분화 유도 및 T 세포 억제의 기능적 상향조절에 대한 효과를 나타낸다.
(a) CBPexo 하에서 PBMC의 CD4+CD25+ 및 FOXP3+의 발현을 나타낸 것이다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복되며, 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험)는 *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01이다.
(b) 제대혈 CD25+ 세포로부터 조절성 T 세포 확장 또는 분화를 도시한다.
(c) CBPexo가 있거나 없이 사이토카인, aAPC 및 항체 조합에 의해한 동일한 1 유닛 제대혈 CD25+ 세포의 배수 확장을 나타낸다.
(d) 항-CD3/CD28, IL-2 칵테일에 따라 소팅된 제대혈 CD25+ 세포의 확장 및 CBPexo가 있거나 없이 Treg의 분화를 나타낸다. 제대혈 단핵세포(CB-MNC)는 음성 대조군으로 사용한다.
(e) DYNABEAD 자극 후 PBMC에서 CBPexo-유도된 Treg 및 nTreg의 억제 기능의 비교를 나타낸다. 억제 기능은 CFSE 희석에 의해 평가한다. 3회 독립 실험으로부터 얻은 플로우 사이토메트리 데이터는 PBMC에서 CBPexo에 의해 유도된 Treg 및 nTreg에 의해 매개된 T 세포 증식의 비율로서 직선으로 요약된다. 데이터는 평균±표준편차로 나타낸다. 통계적으로 유의한 차이(Two-way ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01(n=4).
도 6a-b는 MDSC 분화 유도에 대한 CBPexo의 효과를 나타낸다.
(a) 비-자극 PBMCs는 CBPexo의 부재(CTRL) 또는 존재 하에서 배양된다. 게이팅 전략 : 단핵구(CD14+)를 선택하기 위해 물리적 매개 변수, 즉 전방 산란(FSC) 및 측방 산란(SSC)을 사용한다. CD11b/CD33의 발현을 평가하여 MDSC를 구분한다.
(b) PBMC 집단에서 CBPexos는 MDSC의 면역 억제 표현형을 촉진하고 아르기나제 1, NOS2 및 IDO의 생성을 자극한다. 아르기나제 1, NOS2 및 IDO의 세포 내 염색 및 CD14+/CD11b/CD33+ 세포의 염색에 대한 대표적인 FACS 히스토그램이 제시되어있다.
도 7a-b는 특정 MMP에 의한 T 세포 면역억제 유도에 대한 CBPexo의 효과를 나타낸다.
(a) 300㎍의 CBPexo 또는 ABPexo 용해물의 MMP 및 TIMP 항체 분석 결과를 나타낸다. 상등하는 도트는 엑소좀 항체 분석 키트를 사용하여 평가한다. 다양한 강도의 신호를 제공하는 MMP 및 TIMP 항체 스팟은 ImageJ 소프트웨어로 계산한다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복한다.
(b) MMP 억제를 통한 CBPexo-매개된 억제는 T 세포 증식의 부분적인 회복을 유도한다. T 세포는 CBPexo 하에서 DYNABEAD로 자극되고 나서 156시간째에 CFSE 분석을 통한 비교 전에 GM6001이 처리되거나 그렇지 않는다. CFSE-표지된 세포는 FACSCanto에 의해 얻으며, 세포는 CD4+ 이벤트에서 게이팅된다. 각 제너레이션에서 세포의 비율은 ModFit LT4.0 소프트웨어를 사용하여 계산한다. 이 실험은 6회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
도 8은 MMP 억제제인 GM6001 처리된 CBPexo에 의한 CD4+T 세포에서의 활성화 마커 CD25 및 CD69의 발현 효과를 나타낸 것이다.
도 9a-e는 인간 CBPexo에 의한 T 세포 억제 및 IL-2 하향조절의 마우스 교차-반응성을 나타낸다.
(a) CBPexo의 면역억제효과는 DYNABEAD-자극된 마우스 CD4+T 세포 증식에 의해 시험된다. 이 실험은 5회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
(b) CBPexo의 면역억제효과는 DYNABEAD-자극된 마우스 CD8+T 세포 증식에 의해 시험된다. 이 실험은 5회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
(c) IL-2, IFN-γ 및 IL-17 분비 T 세포의 수준을 정량하기 위해 6일째에 ELISPOT 분석을 수행한다. 마우스 비장세포는 CBPexo 또는 ABPexo로 자극하고, IL-2, IFN-γ 및 IL-17 분비 T 세포 패턴을 관찰한다.
(d) CBPexo는 IL-2, IFN-γ 및 IL-6의 생산을 통해 인간 T 세포 증식을 유의적으로 감소시킨다. CBPexo는 인간 T 세포에서 IL-2Rα를 절단할뿐만 아니라 Th17 및 Th1 세포의 분화와 연관된 IL-2, IFN-γ 및 IL-6 분비를 하향조절한다. 이들 데이터는 사이토카인 생산이 CBPexo에 의해 억제되어 T 세포 분화능을 폐지한다. 채취된 배양 상등애게서 156시간째에 사이토카인 수준을 인간 사이토메트릭 비드 어레이를 이용하여 분석한다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복한다.
(e) 사이토카인 수준에서의 변화는 마우스 사이토메트릭 비드 어레이를 이용하여 관찰한다. 그 결과, CBPexo는 인간 T 세포에서 IL-2의 분비를 하향조절할뿐만 아니라 마우스에서 IL-2를 감소시킨다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복한다.
도 10a-c는 엑소좀 처리된 EAE 마우스에서 Treg 및 IL-2 수준의 변화 패턴을 나타낸다.
(a) EAE 발달은 CBPexo 처리된 EAE 마우스에 감소한다. EAE는 면역화를 위해 MOG/CFA 및 PTx가 함께 처리된 총 15마리의 C57BL/6 마우스에서 유도된다. CBPexo와 ABPexo를 0일 및 7일에 2회씩 EAE 마우스 5마리에 100㎍ 용량(검은색 화살표)으로 정맥주사한다. EAE의 임상 점수는 다음 기준에 따라 30일 동안 관찰되었다. 병에 걸린 쥐의 임상 점수: 0, 질병의 징후 없음; 1, 축쳐진 꼬리; 2, 축쳐진 꼬리 및 부분적인 뒷다리 약함; 3, 완전한 뒷다리 마비; 4, 완전한 뒷다리 및 부분적인 앞다리 마비; 5, 사망. 마우스는 EAE 유도 후 임상 점수를 분석하기 위해 상이한 그룹으로 배당한다: EAE 마우스(n=5) 대 CBPexo 또는 ABPexo 주사된 EAE 마우스(n=5). EAE는 양성 대조군=φ을 나타낸다.
(b) 급성 EAE 동안 전체 비장세포에서 MOG35-55 유도된 사이토카인 리콜 반응의 검출 결과를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 CFA에서 MOG33-55로 면역화하고 면역화 22일 후에 시험하였다. 시험한 모든 마우스는 EAE의 임상 증상을 나타낸다. MOG 펩타이드 특이적인 IFN-γ, IL-2 및 IL-17 분비 세포의 빈도를 EAE 대조군, CBPexo 처리 EAE 군 및 ABPexo 처리 EAE군과 비교하기 위해 ELISPOT 분석을 이용하여 측정한다. MOG 펩타이드(25㎍/mL)로 재자극하는 동안 MOG 펩타이드-특이적인 T 세포를 분석한다.
(c) MOG33-55 펩타이드의 존재 또는 부재 하에서 Th1, Th2 및 Th17 특이 사이토카인 게이팅된 CD4+T 세포를 세포내 사이토카인 염색을 이용하여 측정하고 EAE 대조군, CBPexo 주사된 EAE 군 및 ABPexo 주사된 EAE 군과 비교한 결과를 나타낸다(n=4).
도 11은 EAE 모델의 비장세포에서 MOG35-55-유도된 사이토카인 재반응의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 12a-b는 엑소좀 처리 EAE 마우스의 비장(도 12a)과 흉선(도 12b)에서의 Treg 변화 양상을 나타낸다. CD4+T 게이팅된 MOG 펩타이드-특이적 FOXP3+ 세포의 빈도를 세포 내 사이토카인 염색 방법을 이용하여 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 및 ABPexo-처리 EAE 군을 비교한다.
도 13은 엑소좀으로 치료한 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스의 MDSC 집단을 나타낸다. CD11b + Gr1 + 세포 및 CD11b + NOS2 + 게이트 세포의 빈도를 건강한 대조군, EAE 대조군, CBPexo 주사 EAE 및 ABPexo 주사 EAE 군에서의 MDSC 집단의 빈도와 비교하여 결정한다.
도 14는 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스의 뇌와 비장으로의 엑소좀의 이동능력을 나타낸다. DAPI로 염색된 조직에 PKH-67 형광염색을 한 엑소좀이 전달되었는지 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 및 ABPexo-처리 EAE 군에서 비교한다.
도 15는 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스의 뇌에서의 CBPexo에 의한 병리학적 치료효과를 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 및 ABPexo-처리 EAE 군에서 비교한다.
도 16a-f는 CBPexo 모방체 및 이의 면역억제효과를 나타내는 도면이다.
(a) 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 HLA 클래스 I/MIC null HEK 293T(H1ME-5) 세포주의 확립을 나타낸다. H1ME-5 세포는 MICA/B 및 HLA 클래스 I의 발현을 나타내지 않는다.
(b) H1ME-5에서 방출된 엑소좀의 크기 분포를 나타낸다. CBPexo는 145.61 ± 75.89 nm의 크기를 갖는다.
(c) H1ME-5 세포에 형질도입된 CBPexo에 포함된 GAL-3, MMP-8, MMP-9, PIP, S100A7, GAL-7 및 HSP72의 발현을 나타낸다. 형질도입 후 6일째에, 각 분자에 대해 양성인 세포를 MoFlo XDP Cell Sorter를 사용하여 소팅한다.
(d) GAL-3, MMP-8, MMP-9, PIP, S100A7, GAL-7 및 HSP72 항체로 코팅된 라텍스 비드에 결합된 CBPexo 또는 CBPexo 모방체를 플로우 사이토메트리에 의해 분석한다. 상응하는 비드 단독 대조군과 GAL-3, MMP-8, MMP-9, PIP, S100A7, GAL-7 및 HSP72 항체에서 유래한 강도를 비교한다.
(e) CBPexo 및 MMP-9이 강화된 CBPexo 모방체가 T 세포 자극을 억제함을 입증하는 대표 실험 데이터를 나타낸다. CFSE-표지된 T 세포의 강도는 플로우 사이토메트리에 의해 얻고, ModFit LT4.0 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석한다. CBPexo, CBPexo 모방체 및 H1ME-5 엑소좀의 농도는 10㎍/well이다.
(f) CBPexo, CBPexo 모방체 및 H1ME-5 엑소좀의 통계치는 CFSE 증식 분석에서 얻은 결과를 이용하여 분석된다.
(a) 다양한 엑소좀 특이 마커 항체가 코팅된 라텍스 비드에 결합된 CBPexo를 플로우 사이토메트리로 분석한 결과이다. 비교를 위해 완전 엑소좀 제제로 코팅된 라텍스 비드를 포함한다. 플롯은 상응하는 비드 단독 대조군에 대한 엑소좀 특이 항체들(CD9, CD63, CD82 및 HSP72)로부터 유래된 강도를 나타낸다.
(b)는 CBPexo 용해물의 도트 블롯 분석 결과이다. 대응하는 도트는 엑소좀 항체 어레이 키트를 사용하여 평가되었다. 엑소좀 특이 항체 스팟은 다양한 강도의 신호를 제공한다. 제시된 값은 3회의 독립적인 실험에서 얻은 값의 평균을 나타낸다. 오차 막대 = 평균의 표준 오차 (SEM). "블랭크"는 음성 대조군을 나타내며, φ로 나타내고, GM130은 세포 부스러기를 나타낸다. 평균 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석된다.
(c)는 CBPexo의 형태적 특성 분석 결과이다. 전자현미경을 이용하여 CBPexo는 지질 이중층 구조로 구성되어있고 크기는 (50-130 nm)인 형태적 특성을 확인하였다. 스케일 바는 100 nm를 나타낸다.
(d)는 CBPexo의 크기와 파티클 수 분석 결과이다. 엑소좀의 크기는 81 ± 1.4 nm 이고 파티클 수는 1.64Х1012 ± 2.37Х1010 particles/mL 이다.
도 2a-c는 차등적으로 발현된 단백질과 관련된 분자적 기능 및 생물학적 과정을 나타내는 도면이다.
(a) 질량 분석법으로 스크리닝된 엑소좀에서 혈장 유래의 엑소좀 및 다양한 면역억제분자의 프로테오믹스 분석 결과이다(ExoCarta 및 Mascot v2.3.01로 질량 분석 데이터 검사).
(b) ExoCarta 데이터베이스와 SBC 분석 시스템을 사용한 인간 CBPexo 및 ABPexo의 다양한 생물학적 기능의 프로테오믹스 분석 결과이다. (c) ExoCarta 데이터베이스 및 SBC 분석 시스템을 사용하여 스크리닝된 인간 CBPexo 및 ABPexo의 프로테오믹스 분석 결과 및 면역억제분자의 다양한 분자적 기능을 나타낸다. 레드 박스는 기능적 분류 결과로서 CBPexo의 더 높은 연관성을 나타낸다.
도 3a-d는 CD3/CD28 DYNABEAD-자극된 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CBPexo 매개된 면역억제 메카니즘을 도시한 것이다.
(a) CBPexo가 CD4+ 및 CD8+ T 세포 자극을 억제함을 입증하는 대표 실험 데이터이다. CFSE-표지된 T 세포의 강도는 플로우 사이토메트리에 의해 얻고, ModFit LT 3.0 소프트웨어로 추가 분석한다.
(b) 인간 PBMC를 CBPexo 또는 ABPexo 하에서 CD3/CD28 DYNABEAD를 이용하여 농도 의존적으로 활성화시킨다. 라파마이신 및 시클로스포린은 면역억제제로 잘 알려져 있어 표준 양성 대조군으로 사용한다. CFSE-표지된 T 세포의 강도는 플로우 사이토메트리에 의해 얻고, ModFit LT 3.0 소프트웨어로 추가 분석한다. 모든 실험은 CBPexo의 5종의 상이한 배취를 이용하여 5회 이상 반복한다(혈장 엑소좀의 1 배취=제대혈 10 유닛의 합). 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01. 활성화된 PBMC는 양성 대조군=φ를 나타낸다.
(c) 아넥신 V-FITC 및 7AAD의 대표 실험 데이터는 인간 PBMC가 CBPexo 또는 ABPexo 하에서 CD3/CD28 DYNABEAD로 활성화됨을 도시한다.
(d) CBPexo는 CD3/CD28 DYNABEAD에 의해 활성화된 CD4+T 세포의 세포사멸을 유도한다. CD4+ 및 CD+8 T 세포는 156시간 후에 채취하고 아넥신 V-FITC, 7AAD, 항-CD4-APC 및 항-CD8-V450 항체로 염색한다. CD4상에 게이트된 세포를 도시한다. 분석 데이터는 FlowJo v10을 사용하여 분석한다. 이 실험은 5회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
도 4는 CBPexo에 의해 유도된 CD4+T 세포에서의 G0/G1 세포주기 정지 효과를 나타낸 것이다. 실험은 독립적으로 3번 반복되며, 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 유의성을 계산한다 : * p <0.1 ** p <0.05 *** p <0.01.
도 5a-e는 CBPexo에 의한 Treg 세포의 분화 유도 및 T 세포 억제의 기능적 상향조절에 대한 효과를 나타낸다.
(a) CBPexo 하에서 PBMC의 CD4+CD25+ 및 FOXP3+의 발현을 나타낸 것이다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복되며, 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험)는 *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01이다.
(b) 제대혈 CD25+ 세포로부터 조절성 T 세포 확장 또는 분화를 도시한다.
(c) CBPexo가 있거나 없이 사이토카인, aAPC 및 항체 조합에 의해한 동일한 1 유닛 제대혈 CD25+ 세포의 배수 확장을 나타낸다.
(d) 항-CD3/CD28, IL-2 칵테일에 따라 소팅된 제대혈 CD25+ 세포의 확장 및 CBPexo가 있거나 없이 Treg의 분화를 나타낸다. 제대혈 단핵세포(CB-MNC)는 음성 대조군으로 사용한다.
(e) DYNABEAD 자극 후 PBMC에서 CBPexo-유도된 Treg 및 nTreg의 억제 기능의 비교를 나타낸다. 억제 기능은 CFSE 희석에 의해 평가한다. 3회 독립 실험으로부터 얻은 플로우 사이토메트리 데이터는 PBMC에서 CBPexo에 의해 유도된 Treg 및 nTreg에 의해 매개된 T 세포 증식의 비율로서 직선으로 요약된다. 데이터는 평균±표준편차로 나타낸다. 통계적으로 유의한 차이(Two-way ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01(n=4).
도 6a-b는 MDSC 분화 유도에 대한 CBPexo의 효과를 나타낸다.
(a) 비-자극 PBMCs는 CBPexo의 부재(CTRL) 또는 존재 하에서 배양된다. 게이팅 전략 : 단핵구(CD14+)를 선택하기 위해 물리적 매개 변수, 즉 전방 산란(FSC) 및 측방 산란(SSC)을 사용한다. CD11b/CD33의 발현을 평가하여 MDSC를 구분한다.
(b) PBMC 집단에서 CBPexos는 MDSC의 면역 억제 표현형을 촉진하고 아르기나제 1, NOS2 및 IDO의 생성을 자극한다. 아르기나제 1, NOS2 및 IDO의 세포 내 염색 및 CD14+/CD11b/CD33+ 세포의 염색에 대한 대표적인 FACS 히스토그램이 제시되어있다.
도 7a-b는 특정 MMP에 의한 T 세포 면역억제 유도에 대한 CBPexo의 효과를 나타낸다.
(a) 300㎍의 CBPexo 또는 ABPexo 용해물의 MMP 및 TIMP 항체 분석 결과를 나타낸다. 상등하는 도트는 엑소좀 항체 분석 키트를 사용하여 평가한다. 다양한 강도의 신호를 제공하는 MMP 및 TIMP 항체 스팟은 ImageJ 소프트웨어로 계산한다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복한다.
(b) MMP 억제를 통한 CBPexo-매개된 억제는 T 세포 증식의 부분적인 회복을 유도한다. T 세포는 CBPexo 하에서 DYNABEAD로 자극되고 나서 156시간째에 CFSE 분석을 통한 비교 전에 GM6001이 처리되거나 그렇지 않는다. CFSE-표지된 세포는 FACSCanto에 의해 얻으며, 세포는 CD4+ 이벤트에서 게이팅된다. 각 제너레이션에서 세포의 비율은 ModFit LT4.0 소프트웨어를 사용하여 계산한다. 이 실험은 6회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
도 8은 MMP 억제제인 GM6001 처리된 CBPexo에 의한 CD4+T 세포에서의 활성화 마커 CD25 및 CD69의 발현 효과를 나타낸 것이다.
도 9a-e는 인간 CBPexo에 의한 T 세포 억제 및 IL-2 하향조절의 마우스 교차-반응성을 나타낸다.
(a) CBPexo의 면역억제효과는 DYNABEAD-자극된 마우스 CD4+T 세포 증식에 의해 시험된다. 이 실험은 5회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
(b) CBPexo의 면역억제효과는 DYNABEAD-자극된 마우스 CD8+T 세포 증식에 의해 시험된다. 이 실험은 5회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
(c) IL-2, IFN-γ 및 IL-17 분비 T 세포의 수준을 정량하기 위해 6일째에 ELISPOT 분석을 수행한다. 마우스 비장세포는 CBPexo 또는 ABPexo로 자극하고, IL-2, IFN-γ 및 IL-17 분비 T 세포 패턴을 관찰한다.
(d) CBPexo는 IL-2, IFN-γ 및 IL-6의 생산을 통해 인간 T 세포 증식을 유의적으로 감소시킨다. CBPexo는 인간 T 세포에서 IL-2Rα를 절단할뿐만 아니라 Th17 및 Th1 세포의 분화와 연관된 IL-2, IFN-γ 및 IL-6 분비를 하향조절한다. 이들 데이터는 사이토카인 생산이 CBPexo에 의해 억제되어 T 세포 분화능을 폐지한다. 채취된 배양 상등애게서 156시간째에 사이토카인 수준을 인간 사이토메트릭 비드 어레이를 이용하여 분석한다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복한다.
(e) 사이토카인 수준에서의 변화는 마우스 사이토메트릭 비드 어레이를 이용하여 관찰한다. 그 결과, CBPexo는 인간 T 세포에서 IL-2의 분비를 하향조절할뿐만 아니라 마우스에서 IL-2를 감소시킨다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복한다.
도 10a-c는 엑소좀 처리된 EAE 마우스에서 Treg 및 IL-2 수준의 변화 패턴을 나타낸다.
(a) EAE 발달은 CBPexo 처리된 EAE 마우스에 감소한다. EAE는 면역화를 위해 MOG/CFA 및 PTx가 함께 처리된 총 15마리의 C57BL/6 마우스에서 유도된다. CBPexo와 ABPexo를 0일 및 7일에 2회씩 EAE 마우스 5마리에 100㎍ 용량(검은색 화살표)으로 정맥주사한다. EAE의 임상 점수는 다음 기준에 따라 30일 동안 관찰되었다. 병에 걸린 쥐의 임상 점수: 0, 질병의 징후 없음; 1, 축쳐진 꼬리; 2, 축쳐진 꼬리 및 부분적인 뒷다리 약함; 3, 완전한 뒷다리 마비; 4, 완전한 뒷다리 및 부분적인 앞다리 마비; 5, 사망. 마우스는 EAE 유도 후 임상 점수를 분석하기 위해 상이한 그룹으로 배당한다: EAE 마우스(n=5) 대 CBPexo 또는 ABPexo 주사된 EAE 마우스(n=5). EAE는 양성 대조군=φ을 나타낸다.
(b) 급성 EAE 동안 전체 비장세포에서 MOG35-55 유도된 사이토카인 리콜 반응의 검출 결과를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 CFA에서 MOG33-55로 면역화하고 면역화 22일 후에 시험하였다. 시험한 모든 마우스는 EAE의 임상 증상을 나타낸다. MOG 펩타이드 특이적인 IFN-γ, IL-2 및 IL-17 분비 세포의 빈도를 EAE 대조군, CBPexo 처리 EAE 군 및 ABPexo 처리 EAE군과 비교하기 위해 ELISPOT 분석을 이용하여 측정한다. MOG 펩타이드(25㎍/mL)로 재자극하는 동안 MOG 펩타이드-특이적인 T 세포를 분석한다.
(c) MOG33-55 펩타이드의 존재 또는 부재 하에서 Th1, Th2 및 Th17 특이 사이토카인 게이팅된 CD4+T 세포를 세포내 사이토카인 염색을 이용하여 측정하고 EAE 대조군, CBPexo 주사된 EAE 군 및 ABPexo 주사된 EAE 군과 비교한 결과를 나타낸다(n=4).
도 11은 EAE 모델의 비장세포에서 MOG35-55-유도된 사이토카인 재반응의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 12a-b는 엑소좀 처리 EAE 마우스의 비장(도 12a)과 흉선(도 12b)에서의 Treg 변화 양상을 나타낸다. CD4+T 게이팅된 MOG 펩타이드-특이적 FOXP3+ 세포의 빈도를 세포 내 사이토카인 염색 방법을 이용하여 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 및 ABPexo-처리 EAE 군을 비교한다.
도 13은 엑소좀으로 치료한 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스의 MDSC 집단을 나타낸다. CD11b + Gr1 + 세포 및 CD11b + NOS2 + 게이트 세포의 빈도를 건강한 대조군, EAE 대조군, CBPexo 주사 EAE 및 ABPexo 주사 EAE 군에서의 MDSC 집단의 빈도와 비교하여 결정한다.
도 14는 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스의 뇌와 비장으로의 엑소좀의 이동능력을 나타낸다. DAPI로 염색된 조직에 PKH-67 형광염색을 한 엑소좀이 전달되었는지 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 및 ABPexo-처리 EAE 군에서 비교한다.
도 15는 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스의 뇌에서의 CBPexo에 의한 병리학적 치료효과를 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 및 ABPexo-처리 EAE 군에서 비교한다.
도 16a-f는 CBPexo 모방체 및 이의 면역억제효과를 나타내는 도면이다.
(a) 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 HLA 클래스 I/MIC null HEK 293T(H1ME-5) 세포주의 확립을 나타낸다. H1ME-5 세포는 MICA/B 및 HLA 클래스 I의 발현을 나타내지 않는다.
(b) H1ME-5에서 방출된 엑소좀의 크기 분포를 나타낸다. CBPexo는 145.61 ± 75.89 nm의 크기를 갖는다.
(c) H1ME-5 세포에 형질도입된 CBPexo에 포함된 GAL-3, MMP-8, MMP-9, PIP, S100A7, GAL-7 및 HSP72의 발현을 나타낸다. 형질도입 후 6일째에, 각 분자에 대해 양성인 세포를 MoFlo XDP Cell Sorter를 사용하여 소팅한다.
(d) GAL-3, MMP-8, MMP-9, PIP, S100A7, GAL-7 및 HSP72 항체로 코팅된 라텍스 비드에 결합된 CBPexo 또는 CBPexo 모방체를 플로우 사이토메트리에 의해 분석한다. 상응하는 비드 단독 대조군과 GAL-3, MMP-8, MMP-9, PIP, S100A7, GAL-7 및 HSP72 항체에서 유래한 강도를 비교한다.
(e) CBPexo 및 MMP-9이 강화된 CBPexo 모방체가 T 세포 자극을 억제함을 입증하는 대표 실험 데이터를 나타낸다. CFSE-표지된 T 세포의 강도는 플로우 사이토메트리에 의해 얻고, ModFit LT4.0 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석한다. CBPexo, CBPexo 모방체 및 H1ME-5 엑소좀의 농도는 10㎍/well이다.
(f) CBPexo, CBPexo 모방체 및 H1ME-5 엑소좀의 통계치는 CFSE 증식 분석에서 얻은 결과를 이용하여 분석된다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제대혈 혈장 유래의 엑소좀(CBPexo)은 성인 혈장 유래의 엑소좀(ABPexo)에 비해 면역억제-관련 단백질을 더 많이 포함하는데, CBPexo에서 인자들에 의한 T 세포 증식 억제는 세포사멸 및 세포주기 어레스트에서 기인한다. 또한, CBPexo 처리 시 CD4+CD25+FOXP3+ Treg 세포 집단이 증가하며 다클론성 확장된 Treg의 기능을 상향조절한다. CBPexo는 mTOR 신호전달의 다운스트림을 억제하는 CD25를 절단하여 세포주기를 어레스트시키는 것으로 추측된다. 실제로, CBPexo 처리된 활성화 T 세포에서 IL-2의 분비 및 IL-2Rα의 표면 발현은 CD4+T 세포에서 유의적으로 감소되었다. CBPexo에 의한 IL-2 신호전달의 차단은 CD4+ 및 CD8+T 세포의 증식 억제에 중추적인 역할을 담당한다. IL-2 신호전달 경로의 차단은 면역시스템의 억제를 유도하고, 치료 효과를 나타낸다. IL-2/IL-2R 상호작용은 세포내 Ras/Raf/MARP, JAK/STAT 및 PI3K/AKT 신호전달 경로를 활성화시켜 T 세포의 성장, 분화 및 생존을 촉진한다.
또한, CBPexo의 MMP-9는 암세포와 만날 때 T 세포에서 발현되는 CD25의 절단에 관여하고, MMP-8 역시 세포외 도메인의 붕괴를 유도하여 면역 반응과 연관된 표면 분자의 절단을 초래하여 면역조절 효과를 나타낸다. IL-2Rα의 절단은 MMP-9에 의존한다.
인간 CBPexo를 마우스 모델에 적용한 경우, 인 비트로에서 마우스 T 세포에서 면역억제효과가 관찰되어 인간 CBPexo의 마우스 교차-반응성을 확인할 수 있다.
또한, EAE 마우스 모델은 질환 발달 시 Th 세포의 역할을 조사하는데 포괄적으로 이용된다. 예를 들어, 마이엘린 특이적인 CD4+Th1 세포를 미성숙 수혜자 마우스에 이식하면 EAE의 유도가 촉진됨을 보여준다. 유사하게, Th17 세포로 알려진 IL-17 분비 T 세포 역시 EAE 발달에 추진력이 된다고 보고된바 있다. 또한, EAE는 Treg의 빈도를 낮추고 그들의 억제 기능을 손상시켜 질병의 개시를 촉진한다. 본 발명의 CBPexo는 인 비보에서 Treg 분화를 증가시키고 Th1 및 Th17 분화를 감소시켜 EAE 발달 과정을 바꾸고 항원 특이적인 CD4+T 세포의 분화를 조절할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 엑소좀은 1) 엑소좀에서 발현되는 MMP-9이 활성화 T 세포 표면의 IL-2 수용체 α(CD25)를 분해하여 IL-2 생산을 감소시킴으로써 T 세포 증식을 억제하고, 2) 조절성 T 세포(Treg 세포) 및 단핵구-유래 억제 세포(MDSC) 분화를 유도하며, 및 3) Th1 및 Th17 세포의 분화를 억제하는 특징을 가진다.
본 명세서에서, 용어 "제대혈 혈장 유래의 엑소좀 (exosome)" 또는 "CBPexo"은 제대혈 혈장에서 유래된 세포막 입자이다. 상기 엑소좀(exosome)은 당업계에서, 미세소포체, 순환 미세소포체 또는 미세소낭과 동일한 의미를 갖으며, 세포로부터 탈락된 50 ㎚ 내지 100 ㎚의 원형질막을 갖는 프래그먼트를 말한다. 미세소포체는 세포 간의 mRNA, miRNA 및 단백질을 운송을 매개하고 세포 내의 상호 작용에 중요한 역할을 한다. 미세소포체는 유래한 세포, 세포의 수, 세포의 크기 및 항원의 구성에 따라 비균질한 집단을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 엑소좀은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또한, 본 명세서에서, "면역억제"란 과면역 반응 또는 비정상적 면역 반응으로 인한 면역질환의 개선(증상의 경감), 치료, 그러한 질환의 예방, 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다. 상기 "면역질환"이란 이식편대숙주질환, 자가면역질환(류마티스 관절염 등), 과증식성 피부질환(아토피성 피부염, 접촉성 피부염 등), 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염, 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis)을 포함하는 의미이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제용 배지 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀과 나이브 CD4+T 세포를 인 비트로 배양하는 단계를 포함하는 인 비트로에서 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제 방법을 제공한다.
본 명세서에서 "배지"는 인 비트로에서 나이브 CD4+T 세포의 Th1 및 Th17 세포로의 분화를 억제할 수 있는 배지를 의미하고, 세포 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
또한, 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 단독으로 또는 다른 물질들과 조합하여 Th1 및 Th17 세포의 배양 및 분화 억제를 위한 미세환경 조성에 이용될 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 상기 다른 물질로서 분화 억제 물질을 추가적으로 첨가할 수 있으며, 상기 분화 억제 물질은 당업계에 공지된 어떠한 분화 억제 물질도 이용될 수 있으며, 분화를 억제하고자 하는 Th1 및 Th17 세포의 상태에 따라 다양하게 단독 또는 조합하여 첨가될 수 있다.
배양 조건은 CO2 배양기에서, 5 내지 15%의 이산화탄소의 통기량으로 35 내지 37℃에서 수행할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)를 과발현하는 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 포함하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또한 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에서 유래하고, 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군에서 선택된 하나 이상을 발현하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체에 관한 것이다.
본 발명자들은 CBPexo의 프로테오믹스 프로파일에서 약학적 용도, 예컨대, 면역억제, 상처치료 등과 연관된 GAL-3, MMP-9, HSP72, PIP, S100A7, GAL-7, LAMP1, SERPINB12, LTF, ORM1, CD5L, C4B, MASP1, PSMA6, PRDX1, DEFA3, CD44 antigen, ARG1 등이 포함되어 있음을 확인하였다. 그러나, 제대혈 혈장으로부터 충분한 엑소좀을 분리하기 어려우므로 면역억제효과가 없는 H1ME-5(HLA 클래스 I 및 MIC 편집 클론-5 세포주) 세포주에 면역억제와 연관된 단백질을 코딩하는 핵산을 단독 또는 2종 이상 도입하고, 이로부터 엑소좀을 분리 정제하였다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 그러한 단백질로 GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7를 선정하여 엑소좀 모방체, 예컨대, GAL-3 exo, GAL-7 exo, PIP exo, HSP72 exo, S100-A7 exo, HSP72 & PIP dual exo를 분리 정제하였다.
따라서, 본 명세서에서, 용어 "제대혈 혈장 엑소좀 모방체"는 제대혈 혈장에서 분리한 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 엑소좀을 지칭하며, 특히 특정한 목적으로 상기 엑소좀에서 과발현되는 단독 또는 복수의 단백질을 유전자 재조합 기술을 이용하여 과발현되도록 제조된 면역억제효과가 없는 세포주 유래의 엑소좀을 지칭한다. 따라서, 상기 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 엑소좀 단백질을 코딩하는 핵산을 면역억제효과가 없는 세포주에 도입하여 이로부터 분리하여 제조될 수 있다. 상기 핵산은 가장 광의적인 의미로 사용되며, 단일가닥(ss) DNA, 이중가닥(ds) DNA, cDNA, (-)-RNA, (+)-RNA, dsRNA 등을 포괄한다.
상기 엑소좀 모방체의 크기는 60 nm 내지 250 nm, 또는 70 nm 내지 230 nm의 직경을 가질 수 있다.
상기 면역억제효과가 없는 세포주로 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주를 사용한다. 예컨대, CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 HLAA-A, HLA-B, HLA-C 및 MICA/B 각각의 엑손 2와 3 사이를 결실시켜 HLAA-A, HLA-B, HLA-C 및 MICA/B 유전자가 유전체 상에서 완전히 제거된 HLA 및 MICA/B 결핍 293T 세포주인 H1ME-5(기탁번호: KCTC 13602BP)를 사용할 수 있다.
상기 H1ME-5 세포주에 GAL-3, MMP-9, HSP72, PIP, S100A7, GAL-7, LAMP1, SERPINB12, LTF, ORM1, CD5L, C4B, MASP1, PSMA6, PRDX1, DEFA3, CD44 antigen 및 ARG1 유전자를 발현하는 벡터로 트랜스펙션시키고, GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP 유전자를 단독 또는 2종 이상 발현하는 H1ME-5 세포주를 선별한 후 엑소좀(CBPexo 모방체)을 분리한다.
따라서, 바람직하게는, 본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 LAMP1, SERPINB12, LTF, ORM1, CD5L, C4B, MASP1, PSMA6, PRDX1, DEFA3, CD44 antigen 및 ARG1를 발현하는 것일 수 있다.
또는, 본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 HSP72 및 PIP를 단독 또는 둘 다 발현하는 것일 수 있다.
상기 트랜스펙션은 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란 처리(DEAE-dextran treatment), 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 원생동물에서 PEG-매개 트랜스펙션 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 자신에게 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 플라스미드란 추가의 DNA 분절을 결찰시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈으로 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 일부 벡터는 숙주세포로 도입될 때 이 숙주세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주세포로 도입될 때 숙주세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA IVT mRNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태로 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터)와 IVT mRNA와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다. 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 상술한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 상기의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 포함하는 면역억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, CBPexo 모방체 중 MMP-9이 강화된 엑소좀이 T 세포 면역억제를 위한 전도유망한 치료 분자임을 나타낸다. 이들 결과는 MMP에 의한 CD25의 절단, IL-2 생산 억제, 사이토카인 분비 패턴에서의 변화, Treg 세포의 증식과 같은 몇몇 복합 효과들이 T 세포 분화 및 증식과 동시에 연관됨을 나타낸다. 또한, HSP72를 발현하는 엑소좀은 T 세포 증식을 억제하고, HSP72는 MMP-9를 상향조절하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 면역억제용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기 면역억제는 상술한 면역질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 것으로, 면역질환과 관련된 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
한편, 본 발명의 면역억제용 조성물은 인 비트로, 인 비보 또는 엑스 비보에서 진단적 또는 치료적 용도에 적합한 조성물을 이루는 활성성분 및 활성 또는 무활성 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충화된 염수 용액, 인간 혈청 알부민(HSA) 등의 혈청 알부민, 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인 등을 포함하는 단백질 부형제와 같이, 엑소좀 모방체와 혼용가능한 임의의 약학적 담체를 포함한다. 담체, 안정화제 및 보강제의 예는, Martin REMINGTON'S PHARM. SCI, 18th Ed.(Mack Publ. Co., Easton (1995)) 및 the "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 58nd Ed., Medical Economics, Montvale, NJ. (2004)를 참조한다. 용어 "담체"는 완충액 또는 pH 조정제를 포함할 수 있으며, 전형적으로 완충액은 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충액으로는 시트르산의 염, 아스코르브산의 염, 글루콘산의 염, 카본산의 염, 타르타르산의 염, 숙신산의 염, 아세트산의 염 또는 프탈산의 염 등의 유기산 염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드 또는 포스페이트 완충액을 포함한다. 추가적인 담체로, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(폴리머 당), 덱스트레이트(예, 사이클로덱스트린, 예컨대 2-하이드록시프로필-쿼드러셔(quadrature), -사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 항산화제, 항-대전제, 계면활성제(예, "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80" 등의 폴리소르베이트), 지질(예, 인지질, 지방산), 스테로이드(예, 콜레스테롤) 및 킬레이트제(예, EDTA) 등의 폴리머성 부형제/첨가제를 포함한다. 빙결 방지제 또는 강하제도 포함될 수 있다.
본 발명의 면역억제용 조성물은 다양한 적정 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 종양내, 동맥내(관절에서), 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 결절내(intranodal) 및 피하 경로와 같은 비경구 투여에 적합한 제형과 담체는 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제형을 목적하는 수용자의 혈액과 등장으로 만들어 줄 용질, 및 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성의 멸균 현탁액을 포함한다. 정맥내 또는 복강 투여가 바람직한 방법이다. 개체에게 투여된 세포의 투여량은 시간의 경과에 따라 개체에서 목적하는 유익한 치료적 반응을 달성하기에 유효한 양, 또는 세포의 성장 억제에 유효한 양 또는 감염의 억제에 유효한 양이다. 예컨대, 주입 전에 개체로부터 혈액시료를 수득한 후 보관하여 후속적인 분석 및 비교에 사용하는 방식으로 실시될 수 있다. 일반적으로, 적어도 약 104 내지 106 및 전형적으로 1×108 내지 1×1010개의 세포를 70 kg의 환자에게 대략 60분 내지 120분에 걸쳐 정맥내 또는 복강내로 주입할 수 있다. 투여의 경우, 개체의 전반적 건강상태 및 체중을 고려하면서, 본 발명의 엑소좀을 세포의 유형에 따른 LD-50(또는 기타 독성 측정 방법) 및 다양한 농도에서의 세포의 유형에 따른 부작용에 의해 결정된 비율로 투여한다. 투여는 한번에 또는 여러 회 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 엑소좀은 세포독성제, 뉴클레오타이드 유사체 및 생물학적 반응 변형제를 포함하는 공지된 통상의 치료법을 사용하여 다른 특정 증상에 대한 치료를 보충할 수 있다. 유사하게, 생물학적 반응 변형제는 본 발명의 엑소좀에 의한 치료에 선택적으로 추가될 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 제대혈 혈장 유래 엑소좀의 제조 및 특성 규명
1. 샘플 제조
인간 말초혈액단핵구와 인간 제대혈(UCB)은 건강한 기증자 또는 정상적인 만삭의 임산부에게서 서면 동의서를 받은 후 카톨릭 조혈줄기세포은행(Catholic Hematopoietic Stem Cell Bank)에서 제공받았다. 모든 인간 피험자에 관한 실험은 헬싱키 선언의 권고에 따라 수행하였다. 프로토콜은 가톨릭대학교의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인되었다. 모든 피험자는 헬싱키 선언에 따라 샘플 기증에 대한 서면 동의를 받았다.
2. 마우스
OrientBio, Inc.(Seoul, Korea)에서 C57BL/6 마우스를 구입하여 한국 가톨릭대학교 실험 동물 자원 연구소의 지침에 따라 특정 병원균이 없는 상태로 유지하였다. 모든 동물 실험은 한국 가톨릭대학교의 동물 실험 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 모든 동물 실험은 한국 카톨릭대학교 의과 대학 기관 동물 관리 및 이용 위원회(허가 번호 CUMC-2017-0273-05)가 사전에 승인한 연구자의 프로토콜에 따라 수행되었다.
3. 엑소좀 분리
인간 제대혈 혈장을 순차적으로 400g에서 5분간, 2,000g에서 10분간 원심분리하여 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 그런 다음 제대혈 혈장을 0.45-㎛ 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Nalgene™ Rochester, NY)으로 여과하였다. 단백질 용출은 나노드롭 분광기(Thermo Scientific, San Diego, CA)을 사용하여 280nm에서 각 분획의 흡광도를 판독하여 검사하였다. CBP를 100,000g에서 2시간 동안 초원심분리하고, 제대혈 혈장 펠렛을 비교 실험에 사용하였다. 대조군으로 성인 혈액의 혈장을 분리하고 동일한 엑소좀 분리 절차를 따랐다. 모든 분획물은 4℃에서 보관하고 인 비트로 실험을 위해 24시간 이내에 사용하거나 -80℃에서 동결시켰다. CBPexos는 배치(batch) 당 총 10명의 건강한 기증자로부터 CBP 샘플을 지속적으로 수집하여 얻었다. Exo-Check Exosome Antibody Array(System Biosciences, Palo Alto, CA) 또는 PE-컨쥬게이트 된 항-인간 CD9(e-Bioscience, San Diego, CA), 항-인간 CD63(BD Biosciences, San Jowe, CA), 또는 항-인간 CD82(Biolegend, San Diego, CA), 또는 항-인간 HSP70/HSP72(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) FACS 항체를 이용하여 가 배치에 대해 엑소좀의 특성 분석을 수행하였다. 배치 간 엑소좀의 특성 차이는 없었다.
4. 인간 제대혈 Treg 확장
Tregs는 항-CD25가 직접적으로 컨쥬게이트 된 자성 마이크로비드 및 매뉴얼 컬럼(Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Germany)을 이용하여 포지티브 선별을 통해 1 UCB 유닛(The Catholic Hematopoietic Stem Cell Bank)으로부터 정제되었다. CD25+ 세포를 CD80, CD83, 4-1BBL 및 CD32를 발현하는 렌티바이러스-형질도입된 K562 세포주(aAPC)와 2:1의 비율로 배양하였다. aAPC에 10000cGY를 조사하고, 0.5㎍/mL의 항-CD3(OKT3) 및 항-CD28(CD28.2; 둘 다 BD Pharmingen, San Diego, CA)과 인큐베이션 하였다. 재조합 IL-2(300 IU/mL; Chiron, Emeryville, CA)를 3일 마다 첨가하고 배양 기간 동안 유지하였다. 세포를 14일 동안 배양하고 3-4일마다 나누었다.
5. LC-MS/MS 분석
분해된 샘플 절반에 대해 ThermoFisher Q Exactive HF 질량 분석기에 연결된 Waters NanoAcquity HPLC 시스템을 사용하여 나노 LC-MS/MS를 통해 분석하였다. 트랩핑 컬럼에 펩타이드를 로딩하고, 75㎛ 분석 컬럼에서 2-h 역상 구배를 이용하여 350nL/min로 용출하였다: 두 컬럼은 Luna C18 resin(Phenomenex)으로 패킹되었다. 질량 분석기는 MS 및 MS/MS 각각에 대해 60,000 FWHM 및 17,500 FWHM에서 작동하는 Orbitrap을 사용하여 데이터-의존 방식으로 작동되었다. MS/MS을 위해 15종의 가장 풍부한 이온들을 선별하였다. Mascot DAT 파일은 Scaffold(Proteome Software)로 분석되어 샘플당 미상 리스트를 검증, 필터링 및 생성하였다. 데이터는 1% 단백질 및 펩타이드 FDR에서 필터링되었으며, 단백질당 적어도 2개의 특정 단백질이 필요하였다.
6.
CBPexo 모방체 제조
H1ME-5 세포(Null-293T(H1ME-5, 기탁번호: KCTC 13602BP)를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지(Lonza)에서 배양하였다. T2 세포를 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지(Lonza)에서 배양하였다.
H1ME-5 세포를 항생제가 없는 DMEM(Lonza)에서 2×106 cells/10 mL로 씨딩하였다. 24시간 후, 4개의 타겟 GAL-3(SEQ ID NO: 5), MMP-9(SEQ ID NO: 1), HSP72(SEQ ID NO: 4) S100A7(SEQ ID NO: 6), GAL-7(SEQ ID NO: 2), 및 PIP(SEQ ID NO: 3)(NCBI reference sequence; pCDH 벡터를 이용하여 자체 제작) 각각에 대해 특이적인 6종의 개별 올-인-원 플라스미드의 혼합물을 Lipofectamine 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 293T 세포에 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션 48시간 후, 플로우 사이토메트리로 세포를 분석하였다. 트랜스펙션 6일 후에 GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP에 대해 양성인 세포를 Moflo XDP Cell Sorter(Beckman)를 사용하여 소팅하고, 클론을 확립하였다.
7. 증식 분석
배양 배지 중 말초혈액단핵구(PBMC) 또는 비장 세포(5Х105)를 항-CD3/CD28 DYNABEAD(Invitrogen, Oslo, Norway)가 첨가된 96-웰 조직 배양 플레이트에 씨딩하였다. CBPexo 또는 ABPexo를 적당한 웰에 동시에 첨가하였다. 세포 증식은 5,6-carboxyfluorescein diacetate-succinimidyl ester(CFSE) 염색법과 플로우 사이토메트리를 통해 측정하였다. 간단히 말해서 5Х105 비장 세포 또는 PBMC를 37℃에서 10분간 PBS 1mL에 포함된 5μM의 CFSE(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 함께 인큐베이션한 후 얼음처럼 차가운 10% FBS 함유 배양배지로 2회 세척하였다. 염색된 세포를 CBPexo 또는 ABPexo의 존재 하에서 상기 기술한 대로 DYNABEAD로 자극하였다. 표시된 시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 FACSCanto(Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg, Germany)로 습득하고 Modfit LT 3.0 소프트웨어(Verity Software House, Topsham, ME)로 데이터를 분석하였다. 적어도 3회 독립 실험을 수행하여 10명의 건강한 기증자로부터 활성화 PBMC 또는 비장세포에서 CBPexo의 면역억제 효과를 검증하였다.
8. 세포사멸 분석 및 세포주기 분석
세포사멸 세포를 아넥신 V로 염색하고 제조업체의 설명서에 따라 분석하였다. 간략하게, 1Х106 세포를 아넥신 결합 버퍼 1mL에 재현탁시켰다. APC-아넥신 V 또는 FITC-아넥신 V(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 7AAD(BD Biosciences, Catalog # 551076, 미국 캘리포니아 산호세 소재)의 워킹 용액 5㎕를 100㎕ 중의 5Х105 세포에 넣고 37℃, 5% CO2에서 15분간 배양하였다. 분석 데이터는 FlowJo v10를 사용하여 분석하였다.
PBMC는 DNYNABEAD로 자극하고, 96-웰의 편평한 바닥의 플레이트에서 12-48시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 수확하고, 70% 에탄올에서 고정하고, 세포 펠렛은 PBS 중의 RNase A가 보충된 프로피디움 아이오다이드(PI; Sigma) 용액으로 염색하였다. DNA 함량은 FACS Canto(Becton Dickinson)으로 측정하고 ModFITLT 4.0 소프트웨어를 이용하여 분석하여 세포주기의 sub-G1, G1, S 및 G2기를 측정하였다.
9.
프로테아제
억제
프로테아제 활성을 억제하기 위해, 10㎍/mL의 MMP 저해제 GM6001(Calbiochem, San Diego, USA)을 CBPexo에 첨가하고 21℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. GM6001 전처리된 CBPexo는 지시된 대로 추가 실험을 위해 사용되었다.
10. ELISPOT 분석
제조업체의 프로토콜에 따라 ELISPOT 분석을 수행하였다. 간단히 말해, 인간 IL-2(Catalog # 551076, BD Biosciences), IFN-γ(Catalog # 551083, BD Biosciences), IL-17(Catalog # SEL421, R&D Systems)에 특이적인 단클론 항체를 마이크로플레이트(Millipore, Billerica, MA) 에 코팅하였다. 인 비트로 실험을 위해, 6일 동안 배양된 세포를 배지로 3번 세척하고 ELISPOT 분석을 진행하기 전에 1mL의 배지로 재현탁하고 밤새도록 인큐베이션 하였다. 엑스 비보 실험을 위해, MOG33-55를 배지 중 1Х106 세포/웰의 농도로 96-웰 마이크로플레이트에 첨가하였다. 마이크로플레이트를 37℃, CO2 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 마이크로플레이트를 세척 버퍼로 4회 세척하였다. 이어서, 웰을 100㎕/웰의 비오티닐화 다클론 항-마우스 IL-2, IFN-γ 및 IL-17로 채웠다. 플레이트를 21℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하고, 버퍼로 세척한 다음, 100㎕/웰의 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP)의 존재하에 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 결합되지 않은 효소를 세척을 통해 제거하고 효소 기질 용액을 첨가하였다. 스폿이 전개된 후, 증류수를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 거꾸로 뒤집어 밤새 빛으로부터 보호한채 건조시켰다. IL-2, IFN-γ, IL-17 분비 세포에 상응하는 스팟의 수를 자동 AID-ELISPOT 판독기(AID Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany)를 사용하여 측정하였다.
11. 사이토메트릭 비드 어레이(CBA) 인간 및 마우스
Th1/Th2/Th17
사이토카인 키트
를 이용한 Th1, Th2 및 Th17 사이토카인의 평가
인간 및 마우스 사이토메트릭 비드 어레이(CBA) Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트는 BD Biosciences(Catalog #560484 및 #560485)에서 구입하였다. 50㎕의 분석 비드, 50㎕의 검출 시약 및 50㎕의 연구 샘플 또는 표준물질을 연속적으로 각 샘플 튜브에 첨가하고 21℃에서 3시간 동안 어둠 속에서 인큐베이션하였다. 다음으로, 샘플을 1mL의 세척 버퍼로 세척하고, 500Хg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후, 펠렛을 300㎕의 버퍼에 재현탁하고 같은 날 플로우 사이토메트리로 분석하였다.
12. EAE 유도 및 엑소좀 투여
뇌수막염은 이전에 설명한 대로(McCarthy, D.P. et al. Methods Mol Biol, 2012. 900: p.381-401) 백일해 독소(PTx)를 가진 완전 Freund's adjuvant(CFA)에서 MOG35-55 펩타이드를 사용하여 마우스에서 유도되었다(조건 당 n=5). EAE 증상이 나타난 후, 실험 간섭 이전에 동등하게 가중치가 적용된 평균 질병 점수를 얻기 위해 두명의 독립적인 연구자가 마우스를 매일 채점하고, 층화하고, 별도의 시험 그룹에 배정하였다(0, 질병의 징후 없음; 1, 축쳐진 꼬리; 2, 축쳐진 꼬리 및 부분적인 뒷다리 약함; 3, 완전한 뒷다리 마비; 4, 완전한 뒷다리 및 부분적인 앞다리 마비; 5, 사망). 엑소좀은 마우스 당 100㎍/100㎕로 "도전 상태"에서 매주 간격으로 주입되었다.
13
. 통계 분석
모든 실험은 그룹당 적어도 3반복으로 수행하였고, 인 비트로 실험은 최소 3회 반복하였다. 데이터는 이들 실험의 대표값이며, 평균 ± 표준편차(SEM)로 도시하였다. 데이터는 Prism 버전 7.0(GraphPad, San Diego, CA)을 사용하여 통계적 유의성을 분석하였다. 복수의 그룹의 평균은 일원 분산 분석(ANOVA)로 비교되었다. 독립-샘플 t-test는 두 개의 상이한 그룹의 평균을 비교하는데 사용되었다. 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였고, P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
(1) 제대혈 혈장 유래 엑소좀의 분자적 특성
플로우 사이토메트리를 이용하여 CBPexo는 전형적인 엑소좀 마커 단백질 CD9, CD63, CD82 및 HSP72를 포함함을 확인하였다. 이들 마커는 비드-단독 대조군에는 없었다(도 1a). 또한, 이들 엑소좀의 순도는 잘 특성화 된 엑소좀 단백질 마커 CD81, ICAM, CD63, ALIX, TSG101, EpCAM 및 FLOT-1뿐만 아니라 세포 오염을 모니터링하기 위한 cis-Golgi 마커 GM130을 포함하는 엑소좀 항체 분석 키트를 사용하여 확인되었다. Exo Anibody Array Kit는 양성(+) 대조군으로 표준 엑소좀 단백질 및 음성(-) 대조군은 블랭크로 구성된다. ImageJ 소프트웨어로 Exo Anibody Array Kit를 사용하여 농도 측정 분석에서 얻은 결과를 그래픽으로 표현하여 특정 엑소좀 마커의 양성 발현을 나타내었다. CBPexo는 FLOT1, ICAM, ALIX, CD81, TSG101, EpCAM 및 ANXA5에 대해 매우 양성이었지만 CD63의 발현은 낮았다. 분리된 엑소좀에는 GM130에 대한 음성 염색으로 입증된 바와 같이 세포 파편 및 다른 오염물이 없었다(도 1b).
(2) 인간 CBPexo 및 ABPexo의 프로테오믹스 프로파일 비교
액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량분석(LC-MS/MS) 분석 결과 CBPexo에서 150개의 단백질, ABPexo에서 214개의 단백질이 동정되었으며, 서열당 적어도 2개의 매핑 펩타이드를 가지고 있다. CBPexo의 150개 단백질 중 11개의 단백질은 2개의 하위 그룹(4개는 면역 조절 단백질 또는 7개는 면역 조절 단백질과 관련이 없음)으로 나뉘는 반면, 19개의 면역 조절 단백질이 차등적으로 발현되었다(도 2a). ExoCarta databse를 사용하여 ABPexo 및 CBPexo의 기능적 분류를 수행하였다(도 2a의 우측 표). ABPexo 및 CBPexo의 기능적 분류와 그들 간의 추가적인 비교로 5개의 상이한 생물학적 과정 및 분자적 기능을 강조하였다. 그들 중 일부는 IL-6의 음성 조절, 세포 분화, 세포 증식의 음성 조절, 트랜스멤브레인 트랜스포트 및 상처 치유와 같이 특정 경로 내에서만 전적으로 발견된다(도 2b). ABPexo 및 CBPexo의 분자 기능에 초점을 맞추어, 메탈로엔도펩티다아제 활성과 관련된 흥미로운 기능을 발견하였다. CBPexo는 ABPexo보다 더 높은 정도로 아르기나아제 활성, 열 충격 단백질 결합, S100 단백질 결합 및 히알루론산 결합과 연관된 것으로 보인다(도 2c). 그리하여, CBPexo의 프로테오믹스 분석은 엑소좀 단백질이 면역억제 및 상처 치유와 연관됨을 나타낸다. 표 1은 CBPexo 중의 면역 조절 관련 단백질 목록을 나열한 것이다.
(3) 인간 T-세포 증식 반응에 대한 CBPexo의 억제 효과
양성 대조군으로서 라파마이신 및 시클로스포린은 농도 의존적으로 면역억제를 억제하였다(도 3a 및 도 3b). 본 실험예에서는 주로 CBPexo 및 면역세포 간의 직접 접촉에 의해 매개된 면역억제 메커니즘에 초점을 맞추었다. 이를 해결하기 위해, DYNABEAD 항-CD3/CD28 활성화된 PBMC를 CBPexo 또는 ABPexo와 함께 배양하여 CBPexo가 활성화된 면역세포에 대해 강력한 면역억제 효과를 갖는지 여부를 측정하였다. CBPexo의 면역억제 효과는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식에 의해 조사되었다.
CFSE 희석 분석에 의해 분석된 바와 같이, ABPexo는 그렇지 않지만 CBPexo는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 억제하지 않았다(도 3a 및 도 3b).
억제 효과의 근본적인 메커니즘을 기술하기 위해 아넥신 V 및 7AAD로 CBPexo 또는 ABPexo 처리된 군에서 세포사멸 세포의 비율과 플로우 사이토메트리 분석을 조사하였다. 또한, CBPexo가 활성화 T 세포의 세포사멸에 영향을 줄 수 있는지를 확인하였다.
그 결과, PBMC는 엑소좀의 존재에서 DYNABEAD에 의해 활성화되었다. T 세포의 세포사멸은 플로우 사이토메트리에 의해 156시간째에 측정되었다. 아넥신 V 및 7AAD 이중 네거티브 염색은 살아있는 세포를 나타내고, 7AAD 및 아넥신 V 포지티브 염색은 각각 죽은 세포 및 세포사멸 세포를 나타낸다. 결과적으로, CBPexo 처리군에서 세포사멸 비율은 ABPexo 처리군과 비교하여 증가하였다. 그러나, 양성 대조군과 비교하여, 초기 세포사멸 시기에서 엑소좀 처리군은 어떠한 차이도 보이지 않았다. 게다가, CD8+ T 세포 세포사멸을 비교하였을 때, CBPexo 처리군과 대조군 간의 차이는 없었다. 이들 결과는 CBPexo가 처리된 PBMC 내에서 CD4+ T 세포의 세포사멸이 증가하나, CD8+ T 세포에 대한 유의한 효과는 없음을 보여준다(도 3c 및 도 3d).
상기 결과로부터, 증식 반응의 감소는 세포주기 어레스트의 유도로 인한 것일 수 있다고 가정하였다. 따라서, PI 염색 후 플로우 사이토메트리에 의해 각 세포군의 DNA 함량을 측정하여 세포주기 분석을 수행하였다. CBPexo 또는 ABPexo의 존재하에서 PBMC를 DYNABEAD로 자극하고, 156시간 동안 인큐베이션한 후, PI로 염색하였다.
세포사멸을 보이는 G0/G1기의 세포 비율이 대조군보다 CBPexo 처리군에서 더 높았으나, 이 차이는 유의적이지 않았다. 더욱이, sub-G2/M 및 S기의 세포의 빈도는 156시간에서 대조군보다 CBPexo 처리군에서 더 높았다(도 4). 이들 결과는 CBPexo는 세포사멸과 함께 G0/G1 세포주기 어레스트를 유도하여 T 세포 증식을 감소시킴을 시사한다.
(4) CBPexo에 의한 인 비트로에서 면역억제성 세포 분화의 유도 효과
상기 결과로부터, 전체 PBMC 집단 내의 T 세포에서 관찰된 CBPexo의 억제 효과가 면역억제세포의 유도로 인한 것일 수 있다고 가정하였다. 실험 결과, CBPexo와의 인큐베이션은 2일째에 자극된 PBMC 내 CD4+/CD25+/FoxP3+ 세포의 비율을 증가시켰다(도 5a). 그러나, CD4+ T 세포의 비율을 기초로 게이팅된 CD25+ 세포는 6일째에 CBPexo의 존재에서 유의적으로 하향조절되어, IL-2 수용체 알파 체인, CD25를 하향조절하는 인자가 CBPexo에 존재함을 나타낸다; 본 발명자들은 MMP9 또는 MMP2가 이러한 역할을 담당함을 이전 레퍼런스를 통해 보여준 바 있다.
조절성 T 세포와 연관된 CBPexo의 효과를 더 시험하기 위해, CBPexo를 제대혈 유래의 CD25+ 세포와 공배양하고, 세포는 CD4+/CD25+/FoxP3+ 및 CD127low 세포의 검출 전에 21일 동안 인큐베이션 하였다. 세포는 인공항원제시세포와 항-CD3/CD28 및 IL-2의 조합에 의해 효과적으로 확장되었다(도 5b). Treg 및 CBPexo-Treg 세포는 제대혈의 동일한 1 유닛에서 생성되며, 배양 후 17일에 CBPexo-Treg에서 16.32배 증가하였다(도 5c). Foxp3 발현은 nTregs에서의 그것의 발현과 비교하여 CBPexo-유도된 Treg에서 확장된 제대혈 CD25+ 세포를 증가시켰다. 그러나, CBPexo와 Treg 배양 후 21일째에 CD25 및 CD127의 발현에서의 차이는 없었다. 그리하여, CBPexo는 Treg 분화 후 21일째에 Foxp3 상향조절을 유도한다(도 5d). CBPexo를 통한 신호전달이 nTregs의 억제 특성들을 향상시키는지를 조사하기 위해, CFSE 염색을 이용하여 nTregs 및 CBPexo 유도된 Tregs 간의 면역억제 차이를 시험하였다. 게다가, CBPexo 유도된 Tregs는 시험된 거의 모든 Treg:PBMC 비율에서 강력하였다. >50%의 억제가 1:4의 Tregs:PBMC 비율에서 관찰되어, CBPexo-유도된 Tregs의 강한 억제능력을 입증한다(도 5e). 그러므로, CBPexo는 직접적으로 T 세포의 면역을 억제할 수 있으나, 초기 단계에서 Tregs의 분화 역시 유도하고 제대혈 Treg 세포의 기능성 개선에 참여할 수 있다.
PBMC 집단 내 이들 억제성 단핵구의 표현형의 특성규명을 위해, CBPexo로 24시간 처리한 세포를 염색하여 CD33, CD11b 및 CD14를 평가하였다(도 6a). 그 결과, CBPexo는 MDSC의 집단인 CD33+CD11b+CD14+ 세포에서 아르기나아제-1, NOS2 및 IDO의 발현을 촉진하였다(도 6b). 이들 결과는, CBPexo가 직접적으로 면역억제에 참여할뿐만 아니라 면역억제세포를 유도함을 나타낸다.
(5) CBPexo에서 발현된 MMP의 억제에 의한 T 세포 증식의 회복
T 세포 증식을 억제할 수 있는 CBPexo 내 인자들을 동정하고자 하였다. CD25는 MMP-9에 의해 단백질분해로 절단되며, T 세포에 대한 면역억제효과를 보여준다. 이들 징크-의존적 엔도펩티데이즈는 세포외 기질을 통한 세포 침입을 위한 필수 인자들이다. CBPexo에서 MMP의 존재를 측정하기 위해, 인간 MMP 항체 분석을 이용하여 CBPexo에서 다양한 MMP 및 TIMP를 분석하였다.
도 7a에 도시된 바와 같이, MMP 억제 분자인 TIMP1 및 TIMP2의 발현에도 불구하고, CBPexo는 고농도의 MMP9 및 MMP8을 유의적으로 포함하였다. 그리하여, CBPexo는 MMP9에 의해 막-결합 IL-2Rα(CD25)를 절단하고, 활성화 T 림프구의 증식을 억제함을 추측하였다. MMP가 면역억제에 관여하는지를 추가적으로 확인하기 위해, 인간 T 세포와 인큐베이션 하기 전에 CBPexo와 MMP-1, -2, -3, -8 및 -9를 포함하여 다양한 MMP의 억제제인 GM6001과 2시간 동안 인큐베이션 하였다. GM6001-처리된 CBPexo와 배양된 인간 CD4+T 세포는 세포의 증식을 회복하였다(도 7b).
또한, MMP 억제제인 GM6001(10㎍/mL)-처리된 CBPexo와 배양된 CD4+ 및 CD8+T 세포는 CD25 발현의 회복을 보였으나, 활성화 마커인 CD69에서의 차이는 없었다(도 8). 이들 결과는 MMP-9이 주로 MMP-9에 의한 CD25의 억제에 의해 유발되는 CBPexo의 면역억제와 연관이 있음을 나타낸다.
(6) 마우스 시스템에서 CBPexo의 면역억제 기능 확인
CBPexo는 마우스 비장세포 및 인간 PBMC에 대한 강력한 면역억제효과를 나타냈다. CBPexo의 면역억제효과는 DYNABEAD-자극된 마우스 CD4+ 및 CD8+T 세포 증식에 의해 시험되었다. CFSE 희석 분석에 의해 분석된 바와 같이 CBPexo는 CD4+ 및 CD8+T 세포 증식을 억제하나, ABPexo는 그렇지 않았다(도 9a-b). 인간 CBPexo는 증식성 T 세포 억제의 마우스 교차-반응성을 나타냈다. 따라서, 이들 결과는 CBPexo가 자가면역질환의 동물 모델인 EAE에 적용가능함을 나타낸다.
(7) IL-2 신호전달 및 Th1 및 Th2 세포-관련 사이토카인 조절에 대한 CBPexo의 효과
CBPexo에 대해 T 세포가 확장 및 반응하도록 항-CD3/CD28과 함께 세포(96-웰 배양 플레이트에서 1Х105 cells/well)를 6일 동안 배양하였다. 각 웰 내 세포를 세척하고 그대로 둔 후 ELISPOT 분석에 사용하였다.
그 결과, CBPexo와 공배양하였을 때, IL-2 및 IFN-γ-분비 세포의 집단이 현저히 감소하였으나, L-17 분비 세포는 대조군, CBPexo 처리군 및 ABPexo 처리군 간에 차이가 없었다(도 9c). CBPexo는 IL-2 및 IFN-γ 분비 세포를 억제하여 면역억제 기능을 나타냈다.
사이토카인 분비를 평가하기 위해, 사이토메트릭 비드 분석을 사용하여 IL-2, IFN-γ 및 IL-6의 수준을 평가하였다. 그 결과, CBPexo는 Th1 및 Th17 세포의 분화 및 자가면역질환의 발생과 연관된 인간 IL-2, IFN-γ 및 IL-6을 하향조절하였다(도 9d). 그러나, 배양 상등액의 평가 결과, 마우스 T 세포에서 CBPexo와 배양될 때 IL-2의 농도 만 유의적으로 감소하였다(도 9e). 이들 데이터는 CBPexo에 의한 IL-2 생산의 억제가 인간 및 마우스 둘 다에서 T 세포 억제의 중요한 메커니즘임을 나타낸다.
(8) IL-2 사이토카인 수준 조절 및 EAE 증상을 완화하기 위한 Th1 및 Th17 세포 분화의 상호 조절 유도에 대한 CBPexo의 효과
도 10a에 도시된 바와 같이, CBPexo-처리된 EAE 군의 임상 점수는 ABPexo-처리된 EAE 군 및 EAE 대조군 보다 유의적으로 더 낮았다. 이들 결과는 CBPexo가 자가면역 증상을 완화할 수 있음을 보여준다. CBPexo가 헬퍼 T 세포에서 면역조절 기능을 가지는 지를 확인하기 위해 ELISPOT 분석에 의해 비장세포에서 사이토카인의 발현 수준을 측정하였다. MOG 펩타이드-특이 IFN-γ, IL-2 및 IL-17를 분비하는 세포의 빈도는 ELISPOT 분석에 의해 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 군 및 ABPexo-처리 EAE 군 중에서 비교하여 측정하였다.
그 결과, MOG 펩타이드-특이 IL-2 세포는 CBPeox-처리 EAE 군에서 유의적으로 감소되었으나, IFN-γ 및 IL-17를 분비하는 세포에서의 차이는 없었고, 인 비트로 분석 결과와 유사하였다(도 10b).
도너 CD4+T 세포는 T 세포 면역 반응을 조절하는데 중요한 역할을 담당하면서 EAE 및 Th 서브세트의 균형을 매개하는 Th1, Th2 및 Th17 세포로 서로 분화한다. 따라서, CBPexo에 의해 Th1, Th2 및 Th17 세포 관련 사이토카인을 감소시키는 그들의 능력을 추가로 조사하였다. 이를 확인하기 위해, Th1, Th2 및 Th17 사이토메트릭 비드 분석을 이용하여 사이토카인 수준을 평가하였다. 분비된 단백질의 농도 평가 결과, CBPexo 투여는 EAE 군과 비교하여 IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-17 및 IL-4의 수준에서의 감소를 유발하였다(도 10c).
EAE 모델에서 Th1, Th2, Th17 및 IL-2의 사이토카인 프로파일을 비교하기 위해 세포내 염색을 수행하였다. 그 결과, IL-2의 비율은 2배 감소하였고, IFN-γ 및 IL-17은 ABPexo-처리군과 비교하여 CBPexo 처리군에서 1-4% 감소하였다(도 11). 이들 결과는 CBPexo 투여가 IL-2 신호전달을 조절하고, Th1 및 Th17 세포 분화의 상호 조절을 유도하여 EAE에 대해 보호 효과를 가짐을 입증하는 것이다.
(9) EAE 모델에서 면역 조절 세포 분화 유도에 대한 CBPexo의 효과
CD4+CD25+FOXP3+ Treg 세포의 빈도를 측정하고, 미처리 대조군(음성 대조군), EAE 대조군(양성 대조군), CBPexo-처리 EAE 군 및 ABPexo-처리 EAE 군을 비교하였다.
그 결과, Treg 집단이 대조군과 비교하여 CBPexo-처리 EAE 군에서 증가하였다(도 12a-b). 이들 결과는 CBPexo가 IL-2 신호전달을 억제할뿐만 아니라 인 비보에서 CD4+CD25+FOXP3+ Treg 집단을 증가시켜 그들의 면역억제 효과를 나타냄을 입증하는 것이다. CD11b+Gr-1+ 세포(마우스 MDSC)의 표현형은 CBPexo-주사된 마우스에서 EAE 질병 진행 동안 확장되었다(도 13). CBPexo 주사된 EAE 마우스의 비장세포에서 강화 및 축적된 MDSC는 조절 역할을 담당한다.
(10) EAE 모델에서 국소 및 전신적으로 작용하는 CBPexo의 효과
국소 또는 전신적으로 작용하는 CBPexo의 효과를 확인하기 위해 PKH67로 표지된 CBPexo 또는 ABPexo를 EAE 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. EAE 모델은 뇌에 국소적으로 또는 전신에 동시다발적으로 발병할 수 있다. 따라서, 질환 발생에 있어 가장 중요한 기관인 뇌와 전신에 작용하는 가장 중요한 림프기관인 비장 조직의 세포 핵을 DAPI로 염색하였고 PKH67 표지된 CBPexo는 비장과 뇌 조직 모두에서 검출되었다 (도 14).
조직 병리학 검사를 검사를 통해 CBPexo 또는 ABPexo를 처리한 EAE 마우스와 EAE 마우스, 그리고 정상 마우스의 뇌에서 세포 침윤 수와 염증세포 면적을 비교한 결과, CBPexo 투여군에서 세포침윤과 염증세포의 면적이 감소되었다 (도 15).
<실시예 2> 인공 엑소좀(엑소좀 모방체)의 제조 및 면역억제효과
본 발명자들은 CBPexo의 분자 기능에 초점을 맞춤으로써 면역 조절과 연관된 MMP-9, GAL-3, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP와 연관된 흥미로운 기능을 발견하였다(도 2 및 도 7). MICA는 자연 살해 세포 증식을 유도하고, MHC-I 결핍은 면역 활성화를 위태롭게한다. 그러므로, H1ME-5 세포는 CRISPR/cas9 시스템을 이용하여 침묵시킴으로써 면역-활성화 효과가 없는 세포를 만들 수 있다. HEK 293T 세포는 높은 트랜스펙션 효율 및 HLA 클래스 I(A*02:01, B*07:02 및 C*07:02) 및 MICA/B의 상동의 반수체를 포함하여 몇 가지 장점을 가지고 있다. HLA 클래스 I 및 MICA/B 유전자의 완전 제거를 위해, HLAA-A, HLA-B, HLA-C 및 MICA/B 유전자의 엑손 2 및 3을 표적으로 하는 Cas9 단백질 및 gRNA를 인코딩하는 7종의 플라스미드를 사용하였다(Hong, C.H., et al., J Immunother, 2017. 40(6): p. 201-210 참조). HLA 클래스 I 및 MICA/B의 발현 결핍을 나타내는 이들 H1ME-5 세포는 플로우 사이토메트리에 의해 분석되며(도 16a), GAL-3, MMP-9, HS672, S100A7, GAL-7 및 PIP 유전자를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입되었다. 형질도입 6일 후, GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP-양성 세포를 소팅하였다.
H1ME-5에서 방출된 엑소좀의 크기 분포는 DLS를 이용하여 특성규명하였고, 관찰된 엑소좀의 입자 크기는 145.61±75.89 nm 였다(도 16b).
플로우 사이토메트리 분석 결과, 90% 이상의 H1ME-5 세포가 GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP를 발현하였다(도 16c). 또한, 이 세포주에서 유래된 엑소좀은 목적 분자인 GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP를 발현하였다(도 16d).
다양한 CBPexo 모방체 중, MMP-9 및 HSP72를 발현하는 엑소좀이 유의한 면역억제효과를 보였으며 MMP-9과 HSP72를 발현하는 엑소좀을 각각 절반의 농도로 섞어서 넣어 줬을 때 면역억제의 상승효과를 나타냈다(도 16e-f). HSP72는 MMP-9의 생산을 증가시킨다. 따라서, 이들 데이터는 MMP-9이 CBPexo에서 존재하는 다양한 면역억제 분자 중 중요한 역할을 담당함을 나타낸다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Exosomes derived from umbilical cord blood plasma or their mimics
and imunosuppression use of thereof
<130> P21U11C0247
<150> KR 10-2020-0033254
<151> 2020-03-18
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 2387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homo sapiens matrix metallopeptidase 9 (MMP9)
<400> 1
agacacctct gccctcacca tgagcctctg gcagcccctg gtcctggtgc tcctggtgct 60
gggctgctgc tttgctgccc ccagacagcg ccagtccacc cttgtgctct tccctggaga 120
cctgagaacc aatctcaccg acaggcagct ggcagaggaa tacctgtacc gctatggtta 180
cactcgggtg gcagagatgc gtggagagtc gaaatctctg gggcctgcgc tgctgcttct 240
ccagaagcaa ctgtccctgc ccgagaccgg tgagctggat agcgccacgc tgaaggccat 300
gcgaacccca cggtgcgggg tcccagacct gggcagattc caaacctttg agggcgacct 360
caagtggcac caccacaaca tcacctattg gatccaaaac tactcggaag acttgccgcg 420
ggcggtgatt gacgacgcct ttgcccgcgc cttcgcactg tggagcgcgg tgacgccgct 480
caccttcact cgcgtgtaca gccgggacgc agacatcgtc atccagtttg gtgtcgcgga 540
gcacggagac gggtatccct tcgacgggaa ggacgggctc ctggcacacg cctttcctcc 600
tggccccggc attcagggag acgcccattt cgacgatgac gagttgtggt ccctgggcaa 660
gggcgtcgtg gttccaactc ggtttggaaa cgcagatggc gcggcctgcc acttcccctt 720
catcttcgag ggccgctcct actctgcctg caccaccgac ggtcgctccg acggcttgcc 780
ctggtgcagt accacggcca actacgacac cgacgaccgg tttggcttct gccccagcga 840
gagactctac acccaggacg gcaatgctga tgggaaaccc tgccagtttc cattcatctt 900
ccaaggccaa tcctactccg cctgcaccac ggacggtcgc tccgacggct accgctggtg 960
cgccaccacc gccaactacg accgggacaa gctcttcggc ttctgcccga cccgagctga 1020
ctcgacggtg atggggggca actcggcggg ggagctgtgc gtcttcccct tcactttcct 1080
gggtaaggag tactcgacct gtaccagcga gggccgcgga gatgggcgcc tctggtgcgc 1140
taccacctcg aactttgaca gcgacaagaa gtggggcttc tgcccggacc aaggatacag 1200
tttgttcctc gtggcggcgc atgagttcgg ccacgcgctg ggcttagatc attcctcagt 1260
gccggaggcg ctcatgtacc ctatgtaccg cttcactgag gggcccccct tgcataagga 1320
cgacgtgaat ggcatccggc acctctatgg tcctcgccct gaacctgagc cacggcctcc 1380
aaccaccacc acaccgcagc ccacggctcc cccgacggtc tgccccaccg gaccccccac 1440
tgtccacccc tcagagcgcc ccacagctgg ccccacaggt cccccctcag ctggccccac 1500
aggtcccccc actgctggcc cttctacggc cactactgtg cctttgagtc cggtggacga 1560
tgcctgcaac gtgaacatct tcgacgccat cgcggagatt gggaaccagc tgtatttgtt 1620
caaggatggg aagtactggc gattctctga gggcaggggg agccggccgc agggcccctt 1680
ccttatcgcc gacaagtggc ccgcgctgcc ccgcaagctg gactcggtct ttgaggagcg 1740
gctctccaag aagcttttct tcttctctgg gcgccaggtg tgggtgtaca caggcgcgtc 1800
ggtgctgggc ccgaggcgtc tggacaagct gggcctggga gccgacgtgg cccaggtgac 1860
cggggccctc cggagtggca gggggaagat gctgctgttc agcgggcggc gcctctggag 1920
gttcgacgtg aaggcgcaga tggtggatcc ccggagcgcc agcgaggtgg accggatgtt 1980
ccccggggtg cctttggaca cgcacgacgt cttccagtac cgagagaaag cctatttctg 2040
ccaggaccgc ttctactggc gcgtgagttc ccggagtgag ttgaaccagg tggaccaagt 2100
gggctacgtg acctatgaca tcctgcagtg ccctgaggac tagggctccc gtcctgcttt 2160
ggcagtgcca tgtaaatccc cactgggacc aaccctgggg aaggagccag tttgccggat 2220
acaaactggt attctgttct ggaggaaagg gaggagtgga ggtgggctgg gccctctctt 2280
ctcacctttg ttttttgttg gagtgtttct aataaacttg gattctctaa cctttaaaaa 2340
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2387
<210> 2
<211> 515
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homo sapiens galectin 7 (LGALS7)
<400> 2
acggctgccc aacccggtcc cagccatgtc caacgtcccc cacaagtcct cactgcccga 60
gggcatccgc cctggcacgg tgctgagaat tcgcggcttg gttcctccca atgccagcag 120
gttccatgta aacctgctgt gcggggagga gcagggctcc gatgccgcgc tgcatttcaa 180
cccccggctg gacacgtcgg aggtggtctt caacagcaag gagcaaggct cctggggccg 240
cgaggagcgc gggccgggcg ttcctttcca gcgcgggcag cccttcgagg tgctcatcat 300
cgcgtcagac gacggcttca aggccgtggt tggggacgcc cagtaccacc acttccgcca 360
ccgcctgccg ctggcgcgcg tgcgcctggt ggaggtgggc ggggacgtgc agctggactc 420
cgtgaggatc ttctgagcag aagcccaggc gggcccgggg ccttggctgg caaataaagc 480
gttagcccgc agcgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 515
<210> 3
<211> 618
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homo sapiens prolactin-induced protein(PIP)
<400> 3
ggggaccact tctctgggac acattgcctt ctgttttctc cagcatgcgc ttgctccagc 60
tcctgttcag ggccagccct gccaccctgc tcctggttct ctgcctgcag ttgggggcca 120
acaaagctca ggacaacact cggaagatca taataaagaa ttttgacatt cccaagtcag 180
tacgtccaaa tgacgaagtc actgcagtgc ttgcagttca aacagaattg aaagaatgca 240
tggtggttaa aacttacctc attagcagca tccctctaca aggtgcattt aactataagt 300
atactgcctg cctatgtgac gacaatccaa aaaccttcta ctgggacttt tacaccaaca 360
gaactgtgca aattgcagcc gtcgttgatg ttattcggga attaggcatc tgccctgatg 420
atgctgctgt aatccccatc aaaaacaacc ggttttatac tattgaaatc ctaaaggtag 480
aataatggaa gccctgtctg tttgccacac ccaggtgatt tcctctaaag aaacttggct 540
ggaatttctg ctgtggtcta taaaataaac ttcttaacat gcttctacaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaa 618
<210> 4
<211> 2802
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homo sapiens heat shock protein family A
<400> 4
ccagcagcag gaggcgcgcg aggcaccacg gcctggcggc cgagagtcag ggaggaacct 60
catttacata acggccgccc ctctgtctcc tggcgggggc cggagtcccg cccctcgtcc 120
aacttgaaat ctgttgggtc acgggccagt cactccgacc taggcaagcc tgtggtggag 180
ctggaagagt ttgtgagggc ggtcccggga gcggattggg tctgggagtt cccagaggcg 240
gctataagaa ccgggaactg ggcgcgggga gctgagttgc tggtagtgcc cgtggtgctt 300
ggttcgaggt ggccgttagt tgactccgcg gagttcatct ccctggtttt cccgtcctaa 360
cgtcgctcgc ctttcagtca ggatgtctgc ccgtggcccg gctatcggca tcgacctggg 420
caccacctat tcgtgcgtcg gggtcttcca acatggcaag gtggagatca tcgccaacga 480
ccagggcaat cgcaccaccc ccagctacgt ggccttcacg gacaccgagc gcctcatcgg 540
cgacgccgcc aagaaccagg tggccatgaa ccccaccaac accatcttcg acgccaagag 600
gctgattgga cggaaattcg aggatgccac agtgcagtcg gatatgaaac actggccgtt 660
ccgggtggtg agcgagggag gcaagcccaa agtgcaagta gagtacaagg gggagaccaa 720
gaccttcttc ccagaggaga tatcctccat ggtcctcacg aagatgaagg agatcgcgga 780
agcctacctg gggggcaagg tgcacagcgc ggtcataacg gtcccggcct atttcaacga 840
ctcgcagcgc caggccacca aggacgcagg caccatcacg gggctcaatg tgctgcgcat 900
catcaacgag cccacggcgg cggccatcgc ctacggcctg gacaagaagg gctgcgcggg 960
cggcgagaag aacgtgctca tctttgacct gggcggtggc actttcgacg tgtccatcct 1020
gaccatcgag gatggcatct tcgaggtgaa gtccacggcc ggcgacaccc acctgggcgg 1080
tgaggacttc gacaaccgca tggtgagcca cctggcggag gagttcaagc gcaagcacaa 1140
gaaggacatt gggcccaaca agcgcgccgt gaggcggctg cgcaccgctt gcgagcgcgc 1200
caagcgcacc ctgagctcgt ccacgcaggc gagcatcgag atcgactcgc tctacgaggg 1260
cgtggacttc tatacgtcca tcacgcgcgc ccgcttcgag gagctcaatg ccgacctctt 1320
tcgcgggacc ctggagccgg tggagaaggc gctgcgcgac gccaagctgg acaagggcca 1380
gatccaggag atcgtgctgg tgggcggctc cactcgtatc cccaagatcc agaagctgct 1440
gcaggatttc ttcaacggca aggagctgaa caagagcatc aaccccgacg aggcggtggc 1500
ctatggcgcc gcggtgcagg cggccatcct catcggcgac aaatcagaga atgtgcagga 1560
cctgctgcta ctcgacgtga ccccgttgtc gctgggcatc gagacagctg gcggtgtcat 1620
gaccccactc atcaagagga acaccacgat ccccaccaag cagacgcaga ccttcaccac 1680
ctactcggac aaccagagca gcgtactggt gcaggtatac gagggcgaac gggccatgac 1740
caaggacaat aacctgctgg gcaagttcga cctgaccggg attccccctg cgcctcgcgg 1800
ggtcccccaa atcgaggtta ccttcgacat tgacgccaat ggcatcctta acgttaccgc 1860
cgccgacaag agcaccggta aggaaaacaa aatcaccatc accaatgaca aaggtcgtct 1920
gagcaaggac gacattgacc ggatggtgca ggaggcggag cggtacaaat cggaagatga 1980
ggcgaatcgc gaccgagtcg cggccaaaaa cgccctggag tcctatacct acaacatcaa 2040
gcagacggtg gaagacgaga aactgagggg caagattagc gagcaggaca aaaacaagat 2100
cctcgacaag tgtcaggagg tgatcaactg gctcgaccga aaccagatgg cagagaaaga 2160
tgagtatgaa cacaagcaga aagagctcga aagagtttgc aaccccatca tcagcaaact 2220
ttaccaaggt ggtcctggcg gcggcagcgg cggcggcggt tcaggagcct ccgggggacc 2280
caccatcgaa gaagtggact aagcttgcac tcaagtcagc gtaaacctct ttgcctttct 2340
ctctctctct ttttttttgt ttgtttcttt gaaatgtcct tgtgccaagt acgagatcta 2400
ttgttggaag tctttggtat atgcaaatga aaggagaggt gcaacaactt agtttaatta 2460
taaaagttcc aaagtttgtt ttttaaaaac attattcgag gtttctcttt aatgcatttt 2520
gcgtgtttgc tgacttgagc atttttgatt agttcgtgca tggagatttg tttgagatga 2580
gaaaccttaa gtttgcacac ctgttctgta gaagcttgga aacagtaaaa tatataggag 2640
cttaaattgt ttatttttat gtactacttt aaaactaaac tgaacattgc agtaatgtta 2700
aggacaggta tactttttgc aaacaaatgc ataaatgcaa atgtaaagta aagctgaaat 2760
tgatctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2802
<210> 5
<211> 1017
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> galectin 3 (LGALS3)
<400> 5
gagtatttga ggctcggagc caccgccccg ccggcgcccg cagcacctcc tcgccagcag 60
ccgtccggag ccagccaacg agcggaaaat ggcagacaat ttttcgctcc atgatgcgtt 120
atctgggtct ggaaacccaa accctcaagg atggcctggc gcatggggga accagcctgc 180
tggggcaggg ggctacccag gggcttccta tcctggggcc taccccgggc aggcaccccc 240
aggggcttat cctggacagg cacctccagg cgcctaccct ggagcacctg gagcttatcc 300
cggagcacct gcacctggag tctacccagg gccacccagc ggccctgggg cctacccatc 360
ttctggacag ccaagtgcca ccggagccta ccctgccact ggcccctatg gcgcccctgc 420
tgggccactg attgtgcctt ataacctgcc tttgcctggg ggagtggtgc ctcgcatgct 480
gataacaatt ctgggcacgg tgaagcccaa tgcaaacaga attgctttag atttccaaag 540
agggaatgat gttgccttcc actttaaccc acgcttcaat gagaacaaca ggagagtcat 600
tgtttgcaat acaaagctgg ataataactg gggaagggaa gaaagacagt cggttttccc 660
atttgaaagt gggaaaccat tcaaaataca agtactggtt gaacctgacc acttcaaggt 720
tgcagtgaat gatgctcact tgttgcagta caatcatcgg gttaaaaaac tcaatgaaat 780
cagcaaactg ggaatttctg gtgacataga cctcaccagt gcttcatata ccatgatata 840
atctgaaagg ggcagattaa aaaaaaaaaa agaatctaaa ccttacatgt gtaaaggttt 900
catgttcact gtgagtgaaa atttttacat tcatcaatat ccctcttgta agtcatctac 960
ttaataaata ttacagtgaa ttacctgtct caatatgtca aaaaaaaaaa aaaaaaa 1017
<210> 6
<211> 450
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S100 calcium binding protein A
<400> 6
gtccaaacac acacatctca ctcatccttc tactcgtgac gcttcccagc tctggctttt 60
tgaaagcaaa gatgagcaac actcaagctg agaggtccat aataggcatg atcgacatgt 120
ttcacaaata caccagacgt gatgacaaga ttgagaagcc aagcctgctg acgatgatga 180
aggagaactt ccccaacttc cttagtgcct gtgacaaaaa gggcacaaat tacctcgccg 240
atgtctttga gaaaaaggac aagaatgagg ataagaagat tgatttttct gagtttctgt 300
ccttgctggg agacatagcc acagactacc acaagcagag ccatggagca gcgccctgtt 360
ccgggggcag ccagtgaccc agccccacca atgggcctcc agagacccca ggaacaataa 420
aatgtcttct cccaccagaa aaaaaaaaaa 450
<210> 7
<211> 1254
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lysosome-associated membrane glycoprotein 1
<400> 7
atggcggccc ccggcagcgc ccggcgaccc ctgctgctgc tactgctgtt gctgctgctc 60
ggcctcatgc attgtgcgtc agcagcaatg tttatggtga aaaatggcaa cgggaccgcg 120
tgcataatgg ccaacttctc tgctgccttc tcagtgaact acgacaccaa gagtggccct 180
aagaacatga cctttgacct gccatcagat gccacagtgg tgctcaaccg cagctcctgt 240
ggaaaagaga acacttctga ccccagtctc gtgattgctt ttggaagagg acatacactc 300
actctcaatt tcacgagaaa tgcaacacgt tacagcgtcc agctcatgag ttttgtttat 360
aacttgtcag acacacacct tttccccaat gcgagctcca aagaaatcaa gactgtggaa 420
tctataactg acatcagggc agatatagat aaaaaataca gatgtgttag tggcacccag 480
gtccacatga acaacgtgac cgtaacgctc catgatgcca ccatccaggc gtacctttcc 540
aacagcagct tcagccgggg agagacacgc tgtgaacaag acaggccttc cccaaccaca 600
gcgccccctg cgccacccag cccctcgccc tcacccgtgc ccaagagccc ctctgtggac 660
aagtacaacg tgagcggcac caacgggacc tgcctgctgg ccagcatggg gctgcagctg 720
aacctcacct atgagaggaa ggacaacacg acggtgacaa ggcttctcaa catcaacccc 780
aacaagacct cggccagcgg gagctgcggc gcccacctgg tgactctgga gctgcacagc 840
gagggcacca ccgtcctgct cttccagttc gggatgaatg caagttctag ccggtttttc 900
ctacaaggaa tccagttgaa tacaattctt cctgacgcca gagaccctgc ctttaaagct 960
gccaacggct ccctgcgagc gctgcaggcc acagtcggca attcctacaa gtgcaacgcg 1020
gaggagcacg tccgtgtcac gaaggcgttt tcagtcaata tattcaaagt gtgggtccag 1080
gctttcaagg tggaaggtgg ccagtttggc tctgtggagg agtgtctgct ggacgagaac 1140
agcatgctga tccccatcgc tgtgggtggt gccctggcgg ggctggtcct catcgtcctc 1200
atcgcctacc tcgtcggcag gaagaggagt cacgcaggct accagactat ctag 1254
<210> 8
<211> 1278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serpin B12
<400> 8
atggactctc ttgttacagc aaacaccaaa ttttgctttg atctttttca agagataggc 60
aaagatgatc gtcataaaaa catatttttc tctcccctga gcctctcagc tgcccttggt 120
atggtacgct tgggtgctag aagtgacagt gcacatcaga ttgatgaggt actacacttc 180
aacgaatttt cccagaatga aagcaaagaa cctgaccctt gtctgaaaag caacaaacaa 240
aaagtgctgg ctgacagctc tctggagggg cagaaaaaaa cgacagagcc tctggatcag 300
caggctgggt ccttaaacaa tgagagcgga ctggtcagct gctactttgg gcagcttctc 360
tccaaattag acaggatcaa gactgattac acactgagta ttgccaacag gctttatgga 420
gagcaggaat tcccaatctg tcaggaatac ttagatggtg tgattcaatt ttaccacacg 480
acgattgaaa gtgttgattt ccaaaaaaac cctgaaaaat ccagacaaga gattaacttc 540
tgggttgaat gtcaatccca aggtaaaatc aaggaactct tcagcaagga cgctattaat 600
gctgagactg tgctggtact ggtgaatgct gtttacttca aggccaaatg ggaaacatac 660
tttgaccatg aaaacacggt ggatgcacct ttctgtctaa atgcgaatga aaacaagagt 720
gtgaagatga tgacgcaaaa aggcctctac agaattggct tcatagagga ggtgaaggca 780
cagatcctgg aaatgaggta caccaagggg aagctcagca tgttcgtgct gctgccatct 840
cactctaaag ataacctgaa gggtctggaa gagcttgaaa ggaaaatcac ctatgaaaaa 900
atggtggcct ggagcagctc agaaaacatg tcagaagaat cggtggtcct gtccttcccc 960
cggttcaccc tggaagacag ctatgatctc aattccattt tacaagacat gggcattacg 1020
gatatctttg atgaaacgag ggctgatctt actggaatct ctccaagtcc caatttgtac 1080
ttgtcaaaaa ttatccacaa aacctttgtg gaggtggatg aaaacggtac ccaggcagct 1140
gcagccactg gggctgttgt ctcggaaagg tcactacgat cttgggtgga gtttaatgcc 1200
aaccaccctt ttctcttttt cattagacac aacaaaaccc aaaccattct cttttatggc 1260
agggtctgct ctccttaa 1278
<210> 9
<211> 2132
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactotransferrin
<400> 9
tgaaacttgt cttcctcgtc ctgctgttcc tcggggccct cggactgtgt ctggctggcc 60
gtaggaggag tgttcagtgg tgcgccgtat cccaacccga ggccacaaaa tgcttccaat 120
ggcaaaggaa tatgagaaaa gtgcgtggcc ctcctgtcag ctgcataaag agagactccc 180
ccatccagtg tatccaggcc attgcggaaa acagggccga tgctgtgacc cttgatggtg 240
gtttcatata cgaggcaggc ctggccccct acaaactgcg acctgtagcg gcggaagtct 300
acgggaccga aagacagcca cgaactcact attatgccgt ggctgtggtg aagaagggcg 360
gcagctttca gctgaacgaa ctgcaaggtc tgaagtcctg ccacacaggc cttcgcagga 420
ccgctggatg gaatgtccct atagggacac ttcgtccatt cttgaattgg acgggtccac 480
ctgagcccat tgaggcagct gtggccaggt tcttctcagc cagctgtgtt cccggtgcag 540
ataaaggaca gttccccaac ctgtgtcgcc tgtgtgcggg gacaggggaa aacaaatgtg 600
ccttctcctc ccaggaaccg tacttcagct actctggtgc cttcaagtgt ctgagagacg 660
gggctggaga cgtggctttt atcagagaga gcacagtgtt tgaggacctg tcagacgagg 720
ctgaaaggga cgagtatgag ttactctgcc cagacaacac tcggaagcca gtggacaagt 780
tcaaagactg ccatctggcc cgggtccctt ctcatgccgt tgtggcacga agtgtgaatg 840
gcaaggagga tgccatctgg aatcttctcc gccaggcaca ggaaaagttt ggaaaggaca 900
agtcaccgaa attccagctc tttggctccc ctagtgggca gaaagatctg ctgttcaagg 960
actctgccat tgggttttcg agggtgcccc cgaggataga ttctgggctg taccttggct 1020
ccggctactt cactgccatc cagaacttga ggaaaagtga ggaggaagtg gctgcccggc 1080
gtgcgcgggt cgtgtggtgt gcggtgggcg agcaggagct gcgcaagtgt aaccagtgga 1140
gtggcttgag cgaaggcagc gtgacctgct cctcggcctc caccacagag gactgcatcg 1200
ccctggtgct gaaaggagaa gctgatgcca tgagtttgga tggaggatat gtgtacactg 1260
caggcaaatg tggtttggtg cctgtcctgg cagagaacta caaatcccaa caaagcagtg 1320
accctgatcc taactgtgtg gatagacctg tggaaggata tcttgctgtg gcggtggtta 1380
ggagatcaga cactagcctt acctggaact ctgtgaaagg caagaagtcc tgccacaccg 1440
ccgtggacag gactgcaggc tggaatatcc ccatgggcct gctcttcaac cagacgggct 1500
cctgcaaatt tgatgaatat ttcagtcaaa gctgtgcccc tgggtctgac ccgagatcta 1560
atctctgtgc tctgtgtatt ggcgacgagc agggtgagaa taagtgcgtg cccaacagca 1620
acgagagata ctacggctac actggggctt tccggtgcct ggctgagaat gctggagacg 1680
ttgcatttgt gaaagatgtc actgtcttgc agaacactga tggaaataac aatgaggcat 1740
gggctaagga tttgaagctg gcagactttg cgctgctgtg cctcgatggc aaacggaagc 1800
ctgtgactga ggctagaagc tgccatcttg ccatggcccc gaatcatgcc gtggtgtctc 1860
ggatggataa ggtggaacgc ctgaaacagg tgttgctcca ccaacaggct aaatttggga 1920
gaaatggatc tgactgcccg gacaagtttt gcttattcca gtctgaaacc aaaaaccttc 1980
tgttcaatga caacactgag tgtctggcca gactccatgg caaaacaaca tatgaaaaat 2040
atttgggacc acagtatgtc gcaggcatta ctaatctgaa aaagtgctca acctcccccc 2100
tcctggaagc ctgtgaattc ctcaggaagt aa 2132
<210> 10
<211> 606
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alpha-1-acid glycoprotein 1
<400> 10
atggcgctgt cctgggttct tacagtcctg agcctcctac ctctgctgga agcccagatc 60
ccattgtgtg ccaacctagt accggtgccc atcaccaacg ccaccctgga ccggatcact 120
ggcaagtggt tttatatcgc atcggccttt cgaaacgagg agtacaataa gtcggttcag 180
gagatccaag caaccttctt ttacttcacc cccaacaaga cagaggacac gatctttctc 240
agagagtacc agacccgaca ggaccagtgc atctataaca ccacctacct gaatgtccag 300
cgggaaaatg ggaccatctc cagatacgtg ggaggccaag agcatttcgc tcacttgctg 360
atcctcaggg acaccaagac ctacatgctt gcttttgacg tgaacgatga gaagaactgg 420
gggctgtctg tctatgctga caagccagag acgaccaagg agcaactggg agagttctac 480
gaagctctcg actgcttgcg cattcccaag tcagatgtcg tgtacaccga ttggaaaaag 540
gataagtgtg agccactgga gaagcagcac gagaaggaga ggaaacagga ggagggggaa 600
tcctag 606
<210> 11
<211> 1044
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD5 antigen-like
<400> 11
atggctctgc tattctcctt gatccttgcc atttgcacca gacctggatt cctagcgtct 60
ccatctggag tgcggctggt ggggggcctc caccgctgtg aagggcgggt ggaggtggaa 120
cagaaaggcc agtggggcac cgtgtgtgat gacggctggg acattaagga cgtggctgtg 180
ttgtgccggg agctgggctg tggagctgcc agcggaaccc ctagtggtat tttgtatgag 240
ccaccagcag aaaaagagca aaaggtcctc atccaatcag tcagttgcac aggaacagaa 300
gatacattgg ctcagtgtga gcaagaagaa gtttatgatt gttcacatga tgaagatgct 360
ggggcatcgt gtgagaaccc agagagctct ttctccccag tcccagaggg tgtcaggctg 420
gctgacggcc ctgggcattg caagggacgc gtggaagtga agcaccagaa ccagtggtat 480
accgtgtgcc agacaggctg gagcctccgg gccgcaaagg tggtgtgccg gcagctggga 540
tgtgggaggg ctgtactgac tcaaaaacgc tgcaacaagc atgcctatgg ccgaaaaccc 600
atctggctga gccagatgtc atgctcagga cgagaagcaa cccttcagga ttgcccttct 660
gggccttggg ggaagaacac ctgcaaccat gatgaagaca cgtgggtcga atgtgaagat 720
ccctttgact tgagactagt aggaggagac aacctctgct ctgggcgact ggaggtgctg 780
cacaagggcg tatggggctc tgtctgtgat gacaactggg gagaaaagga ggaccaggtg 840
gtatgcaagc aactgggctg tgggaagtcc ctctctccct ccttcagaga ccggaaatgc 900
tatggccctg gggttggccg catctggctg gataatgttc gttgctcagg ggaggagcag 960
tccctggagc agtgccagca cagattttgg gggtttcacg actgcaccca ccaggaagat 1020
gtggctgtca tctgctcagg atag 1044
<210> 12
<211> 5235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Complement C4-B
<400> 12
atgaggctgc tctgggggct gatctgggca tccagcttct tcaccttatc tctgcagaag 60
cccaggttgc tcttgttctc tccttctgtg gttcatctgg gggtccccct atcggtgggg 120
gtgcagctcc aggatgtgcc ccgaggacag gtagtgaaag gatcagtgtt cctgagaaac 180
ccatctcgta ataatgtccc ctgctcccca aaggtggact tcacccttag ctcagaaaga 240
gacttcgcac tcctcagtct ccaggtgccc ttgaaagatg cgaagagctg tggcctccat 300
caactcctca gaggccctga ggtccagctg gtggcccatt cgccatggct aaaggactct 360
ctgtccagaa cgacaaacat ccagggtatc aacctgctct tctcctctcg ccgggggcac 420
ctctttttgc agacggacca gcccatttac aaccctggcc agcgggttcg gtaccgggtc 480
tttgctctgg atcagaagat gcgcccgagc actgacacca tcacagtcat ggtggagaac 540
tctcacggcc tccgcgtgcg gaagaaggag gtgtacatgc cctcgtccat cttccaggat 600
gactttgtga tcccagacat ctcagagcca gggacctgga agatctcagc ccgattctca 660
gatggcctgg aatccaacag cagcacccag tttgaggtga agaaatatgt ccttcccaac 720
tttgaggtga agatcacccc tggaaagccc tacatcctga cggtgccagg ccatcttgat 780
gaaatgcagt tagacatcca ggccaggtac atctatggga agccagtgca gggggtggca 840
tatgtgcgct ttgggctcct agatgaggat ggtaagaaga ctttctttcg ggggctggag 900
agtcagacca agctggtgaa tggacagagc cacatttccc tctcaaaggc agagttccag 960
gacgccctgg agaagctgaa tatgggcatt actgacctcc aggggctgcg cctctacgtt 1020
gctgcagcca tcattgagtc tccaggtggg gagatggagg aggcagagct cacatcctgg 1080
tattttgtgt catctccctt ctccttggat cttagcaaga ccaagcgaca ccttgtgcct 1140
ggggccccct tcctgctgca ggccttggtc cgtgagatgt caggctcccc agcttctggc 1200
attcctgtca aagtttctgc cacggtgtct tctcctgggt ctgttcctga agtccaggac 1260
attcagcaaa acacagacgg gagcggccaa gtcagcattc caataattat ccctcagacc 1320
atctcagagc tgcagctctc agtatctgca ggctccccac atccagcgat agccaggctc 1380
actgtggcag ccccaccttc aggaggcccc gggtttctgt ctattgagcg gccggattct 1440
cgacctcctc gtgttgggga cactctgaac ctgaacttgc gagccgtggg cagtggggcc 1500
accttttctc attactacta catgatccta tcccgagggc agatcgtgtt catgaatcga 1560
gagcccaaga ggaccctgac ctcggtctcg gtgtttgtgg accatcacct ggcaccctcc 1620
ttctactttg tggccttcta ctaccatgga gaccacccag tggccaactc cctgcgagtg 1680
gatgtccagg ctggggcctg cgagggcaag ctggagctca gcgtggacgg tgccaagcag 1740
taccggaacg gggagtccgt gaagctccac ttagaaaccg actccctagc cctggtggcg 1800
ctgggagcct tggacacagc tctgtatgct gcaggcagca agtcccacaa gcccctcaac 1860
atgggcaagg tctttgaagc tatgaacagc tatgacctcg gctgtggtcc tgggggtggg 1920
gacagtgccc ttcaggtgtt ccaggcagcg ggcctggcct tttctgatgg agaccagtgg 1980
accttatcca gaaagagact aagctgtccc aaggagaaga caacccggaa aaagagaaac 2040
gtgaacttcc aaaaggcgat taatgagaaa ttgggtcagt atgcttcccc gacagccaag 2100
cgctgctgcc aggatggggt gacacgtctg cccatgatgc gttcctgcga gcagcgggca 2160
gcccgcgtgc agcagccgga ctgccgggag cccttcctgt cctgctgcca atttgctgag 2220
agtctgcgca agaagagcag ggacaagggc caggcgggcc tccaacgagc cctggagatc 2280
ctgcaggagg aggacctgat tgatgaggat gacattcccg tgcgcagctt cttcccagag 2340
aactggctct ggagagtgga aacagtggac cgctttcaaa tattgacact gtggctcccc 2400
gactctctga ccacgtggga gatccatggc ctgagcctgt ccaaaaccaa aggcctatgt 2460
gtggccaccc cagtccagct ccgggtgttc cgcgagttcc acctgcacct ccgcctgccc 2520
atgtctgtcc gccgctttga gcagctggag ctgcggcctg tcctctataa ctacctggat 2580
aaaaacctga ctgtgagcgt ccacgtgtcc ccagtggagg ggctgtgcct ggctgggggc 2640
ggagggctgg cccagcaggt gctggtgcct gcgggctctg cccggcctgt tgccttctct 2700
gtggtgccca cggcagccac cgctgtgtct ctgaaggtgg tggctcgagg gtccttcgaa 2760
ttccctgtgg gagatgcggt gtccaaggtt ctgcagattg agaaggaagg ggccatccat 2820
agagaggagc tggtctatga actcaacccc ttggaccacc gaggccggac cttggaaata 2880
cctggcaact ctgatcccaa tatgatccct gatggggact ttaacagcta cgtcagggtt 2940
acagcctcag atccattgga cactttaggc tctgaggggg ccttgtcacc aggaggcgtg 3000
gcctccctct tgaggcttcc tcgaggctgt ggggagcaaa ccatgatcta cttggctccg 3060
acactggctg cttcccgcta cctggacaag acagagcagt ggagcacact gcctcccgag 3120
accaaggacc acgccgtgga tctgatccag aaaggctaca tgcggatcca gcagtttcgg 3180
aaggcggatg gttcctatgc ggcttggttg tcacggggca gcagcacctg gctcacagcc 3240
tttgtgttga aggtcctgag tttggcccag gagcaggtag gaggctcgcc tgagaaactg 3300
caggagacat ctaactggct tctgtcccag cagcaggctg acggctcgtt ccaggacctc 3360
tctccagtga tacataggag catgcagggg ggtttggtgg gcaatgatga gactgtggca 3420
ctcacagcct ttgtgaccat cgcccttcat catgggctgg ccgtcttcca ggatgagggt 3480
gcagagccat tgaagcagag agtggaagcc tccatctcaa aggcaagctc atttttgggg 3540
gagaaagcaa gtgctgggct cctgggtgcc cacgcagctg ccatcacggc ctatgccctg 3600
acactgacca aggcccctgc ggacctgcgg ggtgttgccc acaacaacct catggcaatg 3660
gcccaggaga ctggagataa cctgtactgg ggctcagtca ctggttctca gagcaatgcc 3720
gtgtcgccca ccccggctcc tcgcaaccca tccgacccca tgccccaggc cccagccctg 3780
tggattgaaa ccacagccta cgccctgctg cacctcctgc ttcacgaggg caaagcagag 3840
atggcagacc aggctgcggc ctggctcacc cgtcagggca gcttccaagg gggattccgc 3900
agtacccaag acacggtgat tgccctggat gccctgtctg cctactggat tgcctcccac 3960
accactgagg agaggggtct caatgtgact ctcagctcca caggccggaa tgggttcaag 4020
tcccacgcgc tgcagctgaa caaccgccag attcgcggcc tggaggagga gctgcagttt 4080
tccttgggca gcaagatcaa tgtgaaggtg ggaggaaaca gcaaaggaac cctgaaggtc 4140
cttcgtacct acaatgtcct ggacatgaag aacacgacct gccaggacct acagatagaa 4200
gtgacagtca aaggccacgt cgagtacacg atggaagcaa acgaggacta tgaggactat 4260
gagtacgatg agcttccagc caaggatgac ccagatgccc ctctgcagcc cgtgacaccc 4320
ctgcagctgt ttgagggtcg gaggaaccgc cgcaggaggg aggcgcccaa ggtggtggag 4380
gagcaggagt ccagggtgca ctacaccgtg tgcatctggc ggaacggcaa ggtggggctg 4440
tctggcatgg ccatcgcgga cgtcaccctc ctgagtggat tccacgccct gcgtgctgac 4500
ctggagaagc tgacctccct ctctgaccgt tacgtgagtc actttgagac cgaggggccc 4560
cacgtcctgc tgtattttga ctcggtcccc acctcccggg agtgcgtggg ctttgaggct 4620
gtgcaggaag tgccggtggg gctggtgcag ccggccagcg caaccctgta cgactactac 4680
aaccccgagc gcagatgttc tgtgttttac ggggcaccaa gtaagagcag actcttggcc 4740
accttgtgtt ctgctgaagt ctgccagtgt gctgagggga agtgccctcg ccagcgtcgc 4800
gccctggagc ggggtctgca ggacgaggat ggctacagga tgaagtttgc ctgctactac 4860
ccccgtgtgg agtacggctt ccaggttaag gttctccgag aagacagcag agctgctttc 4920
cgcctctttg agaccaagat cacccaagtc ctgcacttca ccaaggatgt caaggccgct 4980
gctaatcaga tgcgcaactt cctggttcga gcctcctgcc gccttcgctt ggaacctggg 5040
aaagaatatt tgatcatggg tctggatggg gccacctatg acctcgaggg acacccccag 5100
tacctgctgg actcgaatag ctggatcgag gagatgccct ctgaacgcct gtgccggagc 5160
acccgccagc gggcagcctg tgcccagctc aacgacttcc tccaggagta tggcactcag 5220
gggtgccagg tgtga 5235
<210> 13
<211> 2208
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mannan-binding lectin serine protease 1
<400> 13
atgagaccta cattcatgtc tttcaggtgg ctgcttctct attatgctct gtgcttctcc 60
ctgtcaaagg cttcagccca caccgtggag ctaaacaata tgtttggcca gatccagtcg 120
cctggttatc cagactccta tcccagtgat tcagaggtga cttggaatat cactgtccca 180
gatgggtttc ggatcaagct ttacttcatg cacttcaact tggaatcctc ctacctttgt 240
gaatatgact atgtgaaggt agaaactgag gaccaggtgc tggcaacctt ctgtggcagg 300
gagaccacag acacagagca gactcccggc caggaggtgg tcctctcccc tggctccttc 360
atgtccatca ctttccggtc agatttctcc aatgaggagc gtttcacagg ctttgatgcc 420
cactacatgg ctgtggatgt ggacgagtgc aaggagaggg aggacgagga gctgtcctgt 480
gaccactact gccacaacta cattggcggc tactactgct cctgccgctt cggctacatc 540
ctccacacag acaacaggac ctgccgagtg gagtgcagtg acaacctctt cactcaaagg 600
actggggtga tcaccagccc tgacttccca aacccttacc ccaagagctc tgaatgcctg 660
tataccatcg agctggagga gggtttcatg gtcaacctgc agtttgagga catatttgac 720
attgaggacc atcctgaggt gccctgcccc tatgactaca tcaagatcaa agttggtcca 780
aaagttttgg ggcctttctg tggagagaaa gccccagaac ccatcagcac ccagagccac 840
agtgtcctga tcctgttcca tagtgacaac tcgggagaga accggggctg gaggctctca 900
tacagggctg caggaaatga gtgcccagag ctacagcctc ctgtccatgg gaaaatcgag 960
ccctcccaag ccaagtattt cttcaaagac caagtgctcg tcagctgtga cacaggctac 1020
aaagtgctga aggataatgt ggagatggac acattccaga ttgagtgtct gaaggatggg 1080
acgtggagta acaagattcc cacctgtaaa attgtagact gtagagcccc aggagagctg 1140
gaacacgggc tgatcacctt ctctacaagg aacaacctca ccacatacaa gtctgagatc 1200
aaatactcct gtcaggagcc ctattacaag atgctcaaca ataacacagg tatatatacc 1260
tgttctgccc aaggagtctg gatgaataaa gtattgggga gaagcctacc cacctgcctt 1320
ccagagtgtg gtcagccctc ccgctccctg ccaagcctgg tcaagaggat cattgggggc 1380
cgaaatgctg agcctggcct cttcccgtgg caggccctga tagtggtgga ggacacttcg 1440
agagtgccaa atgacaagtg gtttgggagt ggggccctgc tctctgcgtc ctggatcctc 1500
acagcagctc atgtgctgcg ctcccagcgt agagacacca cggtgatacc agtctccaag 1560
gagcatgtca ccgtctacct gggcttgcat gatgtgcgag acaaatcggg ggcagtcaac 1620
agctcagctg cccgagtggt gctccaccca gacttcaaca tccaaaacta caaccacgat 1680
atagctctgg tgcagctgca ggagcctgtg cccctgggac cccacgttat gcctgtctgc 1740
ctgccaaggc ttgagcctga aggcccggcc ccccacatgc tgggcctggt ggccggctgg 1800
ggcatctcca atcccaatgt gacagtggat gagatcatca gcagtggcac acggaccttg 1860
tcagatgtcc tgcagtatgt caagttaccc gtggtgcctc acgctgagtg caaaactagc 1920
tatgagtccc gctcgggcaa ttacagcgtc acggagaaca tgttctgtgc tggctactac 1980
gagggcggca aagacacgtg ccttggagat agcggtgggg cctttgtcat ctttgatgac 2040
ttgagccagc gctgggtggt gcaaggcctg gtgtcctggg ggggacctga agaatgcggc 2100
agcaagcagg tctatggagt ctacacaaag gtctccaatt acgtggactg ggtgtgggag 2160
cagatgggct taccacaaag tgttgtggag ccccaggtgg aacggtga 2208
<210> 14
<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Proteasome subunit alpha type-6
<400> 14
atgtcccgtg gttccagcgc cggttttgac cgccacatta ccattttttc acccgagggt 60
cggctctacc aagtagaata tgcttttaag gctattaacc agggtggcct tacatcagta 120
gctgtcagag ggaaagactg tgcagtaatt gtcacacaga agaaagtacc tgacaaatta 180
ttggattcca gcacagtgac tcacttattc aagataactg aaaacattgg ttgtgtgatg 240
accggaatga cagctgacag cagatcccag gtacagaggg cacgctatga ggcagctaac 300
tggaaataca agtatggcta tgagattcct gtggacatgc tgtgtaaaag aattgccgat 360
atttctcagg tctacacaca gaatgctgaa atgaggcctc ttggttgttg tatgatttta 420
attggtatag atgaagagca aggccctcag gtatataagt gtgatcctgc aggttactac 480
tgtgggttta aagccactgc agcgggagtt aaacaaactg agtcaaccag cttccttgaa 540
aaaaaagtga agaagaaatt tgattggaca tttgaacaga cagtggaaac tgcaattaca 600
tgcctgtcta ctgttctatc aattgatttc aaaccttcag aaatagaagt tggagtagtg 660
acagttgaaa atcctaaatt caggattctt acagaagcag agattgatgc tcaccttgtt 720
gctctagcag agagagacta a 741
<210> 15
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peroxiredoxin-1
<400> 15
atgtcttcag gaaatgctaa aattgggcac cctgccccca acttcaaagc cacagctgtt 60
atgccagatg gtcagtttaa agatatcagc ctgtctgact acaaaggaaa atatgttgtg 120
ttcttctttt accctcttga cttcaccttt gtgtgcccca cggagatcat tgctttcagt 180
gatagggcag aagaatttaa gaaactcaac tgccaagtga ttggtgcttc tgtggattct 240
cacttctgtc atctagcatg ggtcaataca cctaagaaac aaggaggact gggacccatg 300
aacattcctt tggtatcaga cccgaagcgc accattgctc aggattatgg ggtcttaaag 360
gctgatgaag gcatctcgtt caggggcctt tttatcattg atgataaggg tattcttcgg 420
cagatcactg taaatgacct ccctgttggc cgctctgtgg atgagacttt gagactagtt 480
caggccttcc agttcactga caaacatggg gaagtgtgcc cagctggctg gaaacctggc 540
agtgatacca tcaagcctga tgtccaaaag agcaaagaat atttctccaa gcagaagtga 600
600
<210> 16
<211> 285
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Neutrophil defensin 3
<400> 16
atgaggaccc tcgccatcct tgctgccatt ctcctggtgg ccctgcaggc ccaggctgag 60
ccactccagg caagagctga tgaggttgct gcagccccgg agcagattgc agcggacatc 120
ccagaagtgg ttgtttccct tgcatgggac gaaagcttgg ctccaaagca tccaggctca 180
aggaaaaaca tggactgcta ttgcagaata ccagcgtgca ttgcaggaga acgtcgctat 240
ggaacctgca tctaccaggg aagactctgg gcattctgct gctga 285
<210> 17
<211> 2232
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD44 antigen
<400> 17
atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcgtgccgct gagcctggcg 60
cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 120
cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg 180
cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg 240
ttcatagaag ggcacgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac 300
aacacagggg tgtacatcct cacatccaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat 360
gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtcacag acctgcccaa tgcctttgat 420
ggaccaatta ccataactat tgttaaccgt gatggcaccc gctatgtcca gaaaggagaa 480
tacagaacga atcctgaaga catctacccc agcaacccta ctgatgatga cgtgagcagc 540
ggctcctcca gtgaaaggag cagcacttca ggaggttaca tcttttacac cttttctact 600
gtacacccca tcccagacga agacagtccc tggatcaccg acagcacaga cagaatccct 660
gctaccactt tgatgagcac tagtgctaca gcaactgaga cagcaaccaa gaggcaagaa 720
acctgggatt ggttttcatg gttgtttcta ccatcagagt caaagaatca tcttcacaca 780
acaacacaaa tggctggtac gtcttcaaat accatctcag caggctggga gccaaatgaa 840
gaaaatgaag atgaaagaga cagacacctc agtttttctg gatcaggcat tgatgatgat 900
gaagatttta tctccagcac catttcaacc acaccacggg cttttgacca cacaaaacag 960
aaccaggact ggacccagtg gaacccaagc cattcaaatc cggaagtgct acttcagaca 1020
accacaagga tgactgcaga tgtagacaga aatggcacca ctgcttatga aggaaactgg 1080
aacccagaag cacaccctcc cctcattcac catgagcatc atgaggaaga agagacccca 1140
cattctacaa gcacaatcca ggcaactcct agtagtacaa cggaagaaac agctacccag 1200
aaggaacagt ggtttggcaa cagatggcat gagggatatc gccaaacacc caaagaagac 1260
tcccattcga caacagggac agctgcagcc tcagctcata ccagccatcc aatgcaagga 1320
aggacaacac caagcccaga ggacagttcc tggactgatt tcttcaaccc aatctcacac 1380
cccatgggac gaggtcatca agcaggaaga aggatggata tggactccag tcatagtata 1440
acgcttcagc ctactgcaaa tccaaacaca ggtttggtgg aagatttgga caggacagga 1500
cctctttcaa tgacaacgca gcagagtaat tctcagagct tctctacatc acatgaaggc 1560
ttggaagaag ataaagacca tccaacaact tctactctga catcaagcaa taggaatgat 1620
gtcacaggtg gaagaagaga cccaaatcat tctgaaggct caactacttt actggaaggt 1680
tatacctctc attacccaca cacgaaggaa agcaggacct tcatcccagt gacctcagct 1740
aagactgggt cctttggagt tactgcagtt actgttggag attccaactc taatgtcaat 1800
cgttccttat caggagacca agacacattc caccccagtg gggggtccca taccactcat 1860
ggatctgaat cagatggaca ctcacatggg agtcaagaag gtggagcaaa cacaacctct 1920
ggtcctataa ggacacccca aattccagaa tggctgatca tcttggcatc cctcttggcc 1980
ttggctttga ttcttgcagt ttgcattgca gtcaacagtc gaagaaggtg tgggcagaag 2040
aaaaagctag tgatcaacag tggcaatgga gctgtggagg acagaaagcc aagtggactc 2100
aacggagagg ccagcaagtc tcaggaaatg gtgcatttgg tgaacaagga gtcgtcagaa 2160
actccagacc agtttatgac agctgatgag acaaggaacc tgcagaatgt ggacatgaag 2220
attggggtgt aa 2232
<210> 18
<211> 993
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arginase-1
<400> 18
atgagcgcca agtccagaac catagggatt attggagctc ctttctcaaa gggacagcca 60
cgaggagggg tggaagaagg ccctacagta ttgagaaagg ctggtctgct tgagaaactt 120
aaagaacaag taactcaaaa ctttttaatt ttagagtgtg atgtgaagga ttatggggac 180
ctgccctttg ctgacatccc taatgacagt ccctttcaaa ttgtgaagaa tccaaggtct 240
gtgggaaaag caagcgagca gctggctggc aaggtggcag aagtcaagaa gaacggaaga 300
atcagcctgg tgctgggcgg agaccacagt ttggcaattg gaagcatctc tggccatgcc 360
agggtccacc ctgatcttgg agtcatctgg gtggatgctc acactgatat caacactcca 420
ctgacaacca caagtggaaa cttgcatgga caacctgtat ctttcctcct gaaggaacta 480
aaaggaaaga ttcccgatgt gccaggattc tcctgggtga ctccctgtat atctgccaag 540
gatattgtgt atattggctt gagagacgtg gaccctgggg aacactacat tttgaaaact 600
ctaggcatta aatacttttc aatgactgaa gtggacagac taggaattgg caaggtgatg 660
gaagaaacac tcagctatct actaggaaga aagaaaaggc caattcatct aagttttgat 720
gttgacggac tggacccatc tttcacacca gctactggca caccagtcgt gggaggtctg 780
acatacagag aaggtctcta catcacagaa gaaatctaca aaacagggct actctcagga 840
ttagatataa tggaagtgaa cccatccctg gggaagacac cagaagaagt aactcgaaca 900
gtgaacacag cagttgcaat aaccttggct tgtttcggac ttgctcggga gggtaatcac 960
aagcctattg actaccttaa cccacctaag taa 993
Claims (8)
- 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7) 및 Galectin-7(GAL-7)로 이루어진 유전자군의 발현량이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염 및 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis) 중에서 선택된 면역질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
- 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7) 및 Galectin-7(GAL-7)로 이루어진 유전자군의 발현량이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제용 배지 조성물.
- 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7) 및 Galectin-7(GAL-7)로 이루어진 유전자군의 발현량이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀과 나이브 CD4+T 세포를 인 비트로 배양하는 단계를 포함하는 인 비트로에서 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제 방법.
- HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에서 유래하고, 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7) 및 Galectin-7(GAL-7)로 이루어진 유전자군에서 선택된 하나 이상을 발현하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
- 제5항에 있어서,
HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주는 H1ME-5(기탁번호: KCTC 13602BP)인, 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
- 제5항의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 포함하는 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염 및 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis) 중에서 선택된 면역질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
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-
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