KR101993027B1 - 줄기 세포 마이크로입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기 세포 마이크로입자, 이의 사용 및 생성, 특히 신경 줄기 세포 마이크로입자 및 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다. 줄기 세포 마이크로입자는 통상적으로 엑소좀 또는 마이크로소포이고, 신경 줄기 세포주로부터 유래할 수 있다. 신경 줄기 세포주는 조건 불멸화 줄기 세포주 예컨대 (ECACC에 수탁 번호 04091601로 수탁된) CTX0E03일 수 있다.

Description

줄기 세포 마이크로입자{STEM CELL MICROPARTICLES}
본 발명은 줄기 세포 마이크로입자, 이의 사용 및 생성, 특히 신경 줄기 세포 마이크로입자 및 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
줄기 세포는 자기 재생하고 기능상 상이한 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는다. 이들은 재생 의학, 특히 조직 대체, 재생 또는 복구를 요하는 재생 치료의 성장하는 분야에서 강력한 도구인 가능성을 갖는다(Banerjee et al. 2011). 그러나, 치료에서 줄기 세포의 사용에 단점이 존재한다: 기능상 안정성 및 표현형 안정성을 갖는 줄기 세포의 일정하고 실질적인 공급에 대한 수요가 존재하고, 관련된 높은 비용 및 시간 지연은 세포 생성, 저장, 수송 및 취급에 의해 발생하고; 수혜자에 의한 줄기 세포의 거부를 피하기 위해 면역학적 적합성에 대한 필요요건이 존재하고; 종양 또는 이소성 조직 형성의 가능한 안전성 위험과 관련된 복잡한 조절 문제가 존재한다. 추가로, 줄기 세포 이식의 치료학적 효율에도 불구하고, 회복 또는 대체 세포로의 예를 들면 생착 및 분화를 통한 이식된 줄기 세포의 직접적인 장기간 효과에 대한 확실한 증거가 없다.
신경 줄기 세포(NSC)는 뉴런, 성상교세포 및 희소돌기아교세포를 생성하는 자가 재생하는, 다분화능 줄기 세포이다(Kornblum, 2007). 신경 줄기 세포의 의학 잠재성은 널리 증명되었다. 손상된 중추 신경계(CNS) 조직은 매우 제한된 재생 능력을 가져서 신경학적 기능 소실은 대개 만성이고 진행성이다. 신경 줄기 세포(NSC)는 신경학적 손상 또는 질환의 줄기 세포 기반 치료에서 유망한 결과를 나타냈다(Einstein et al. 2008). 뇌졸중 후 동물의 뇌에 신경 줄기 세포(NSC)를 이식하면 이동 및 인지 시험에서 상당한 회복이 후행하는 것으로 나타났다(Stroemer et al. 2009). NSC가 손상된 조직들에서 어떻게 기능을 복구할 수 있는지가 완전히 이해되지 않지만, NSC가, 네이티브 면역계 및 다른 숙주 세포에 의한 조직 복구를 촉진하는, 자리 적절한 세포 분화, 신생혈관생성촉진(pro-angiogenic) 및 신경영양 활성 및 면역조정을 포함하는 복합 복구 특성을 갖는 것이 현재 점점 더 인식되고 있다(Miljan & Sinden, 2009, Horie et al., 2011). 많은 이러한 효과가 이식된 신경 줄기 세포로부터 숙주 환경으로의 일시적인 신호전달에 따라 달라지고, 예를 들면 NSC가 치유 및 복구를 촉진하는 천연 신생혈관생성촉진 및 조절 면역 반응을 지시하고 증폭시키는 허혈성 근육 조직 손상에서 이식될 때 전염증성 마커를 일시적으로 발현할 것이다(Hicks et al., 미공개 데이터). 만성 뇌졸중 뇌에서, NSC은 또한 실질적인 신경영양 효과를 갖는다. 예를 들면, 이들은 숙주 뇌 유래 더블코르틴 양성 신경아세포를 갖는 뇌졸중으로 손상된 선조체 뇌 조직의 골수증식을 촉진한다(Hassani, O'Reilly, Pearse, Stroemer et al., PLoS One. 2012;7(11)).
더욱이, 만성 뇌졸중을 갖는 동물 모델에서의 많은 NSC 회복 효과에 기초하여, 리뉴런 리미티드(ReNeuron Limited)(Surrey, UK)는 신경 줄기 세포를 사용한 임상 실험을 수행하여, 이의 "CTX0E03" 조건 불멸화 피질 유래 신경 줄기 세포를 사용하여 장애가 있는 뇌졸중 환자의 치료를 시험하였다(Clinicaltrials.gov Identifier: NCT01151124).
중간엽 줄기 세포(MSC)는 오직 중간엽 세포 유형, 즉 지방세포, 연골세포 및 골세포 계통의 유형으로 분화하는 능력을 갖는 계통 제한 줄기 세포이다(Pittenger et al 1999; Ding et al. 2011). MSC(중간엽 기질 세포 및 중간엽 전구 세포라고도 칭함)는 골수, 혈액, 지방 조직 및 다른 체조직을 포함하는 다양한 소스로부터 유래한다. 그러나, MSC의 치료학적 가능성은 비분화된 세포로서의 이들의 신생혈관생성촉진 및 면역 조정 특성의 적용에 더 지향된다. 인간 MSC의 생성은 이들 세포가 대략 15-20 초과한 수의 집단 배증으로 안정하게 증식하지 못하므로 제한된다.
중간엽 줄기 세포-조정 배지(MSC-CM)는 MSC 그 자체와 유사한 치료학적 효율을 가져, MSC 기반 치료의 파라크린 기전을 제시한다(Timmers et al. 2007). WO-A-2009/105044는 MSC에 의해 분비된 엑소좀으로서 공지된 입자가 MSC의 적어도 하나의 생물학적 특성을 포함한다고 개시하고 치료에서 이들 MSC 입자의 용도를 제시하지만, 문헌[Thery et al. 2011]은 엑소좀 및 다른 유사한 분비된 소포의 일반적인 검토를 제공한다. 직접적으로 치료학적 물질로서 줄기 세포를 사용하는 것의 단점 중 몇몇은 중간엽 줄기 세포 유래 엑소좀(예를 들면, 저장, 수송 및 취급)을 사용함으로써 극복되지만, 엑소좀을 제조하기 위해 기능상 및 표현형상 안정한 줄기 세포의 일정하고 실질적인 공급을 제공하는 문제점이 남아 있다. 치료학적 용도를 위해, 엑소좀은 바람직하게는 대규모로 제조될 필요가 있다. 줄기 세포주의 부재 하에, 줄기 세포의 소스로부터의 반복 유도를 통한 세포의 보충이 필요하고, 이는 각각의 새로운 뱃취의 시험 및 검증을 위한 되풀이되는 비용을 발생시킨다. 더욱이, MSC에 의해 치료될 수 있는 질환 및 장애는 제한될 수 있다.
개선된 줄기 세포 기반 치료를 위한 수요가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 신경 줄기 세포가 치료학적으로 유용한 마이크로입자를 포함한다는 놀라운 발견에 기초한다.
배양 배지에 성분들의 첨가에 의해, 저산소 조건 하에 줄기 세포를 배양함으로써 또는 다른 세포 유형과 동시 배양함으로써 줄기 세포에 의해 마이크로입자의 생성을 변경하는 것이 가능한 것으로 또한 발견되었고, 이에 의해 줄기 세포 마이크로입자를 제조하는 개선된 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태는 신경 줄기 세포 마이크로입자를 제공한다. 마이크로입자는 엑소좀(exosome), 마이크로소포, 막 입자, 막 소포, 엑소좀 유사 소포, 엑토솜 유사 소포, 엑토솜(ectosome) 또는 외부소포(exovesicle)일 수 있다. 통상적으로, 마이크로입자는 엑소좀이다. 마이크로입자는 줄기 세포 분화를 허용하는 환경에서 배양된 신경 줄기 세포로부터 유래할 수 있다. 마이크로입자는 부분적으로 분화된 신경 줄기 세포로부터 단리될 수 있다. 일 실시양태에서, 줄기 세포 분화를 허용하는 환경은 다구획 생물반응기이고, 통상적으로 여기서 세포는 7일 초과 동안 배양된다. 마이크로입자는 신경 줄기 세포주로부터 유래할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 신경 줄기 세포주는 "CTX0E03" 세포주, "STR0C05" 세포주, "HPC0A07" 세포주 또는 문헌[Miljan et al Stem Cells Dev. 2009]에 개시된 신경 줄기 세포주로부터 유래할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 마이크로입자는 배양에서 유지되는 혈청을 필요로 하지 않는 줄기 세포주로부터 유래한다. 마이크로입자는 전자현미경법에 의해 결정할 때 크기가 30㎚ 내지 1000㎚ 또는 30 내지 200㎚ 또는 30 내지 100㎚이고/이거나 수크로스 중의 밀도가 1.1 내지 1.2g/㎖이다. 마이크로입자는 RNA를 포함할 수 있다. RNA는 mRNA, miRNA 및/또는 임의의 다른 작은 RNA일 수 있다. 마이크로입자는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532를 포함할 수 있다. 마이크로입자는 통상적으로 세라마이드, 콜레스테롤, 스핑고미엘린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜콜린으로부터 선택된 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 마이크로입자는 하나 이상의 테트라스파닌, 통상적으로 CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 및/또는 CD37을 포함할 수 있다. 마이크로입자는 TSG101, 알릭스(Alix), CD109, thy-1 및 CD133 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 마이크로입자는 표 19 또는 표 21에 존재하는 단백질 중 적어도 10개를 포함할 수 있다. 마이크로입자는 신경 줄기 세포 또는 신경 줄기 세포-조정 배지의 적어도 하나의 생물학적 활성을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 생물학적 활성은 조직 재생 활성일 수 있다. 본 발명의 마이크로입자는 통상적으로 단리되거나 정제된다.
본 발명의 제2 양태는 치료에서 사용하기 위한 신경 줄기 세포 마이크로입자를 제공한다. 치료는 조직 대체, 재생 또는 복구를 요하는 재생 치료일 수 있고, 예를 들면 치료는 신생혈관생성, 신경생성 및/또는 신경보호를 요한다. 치료는 신경학적 질환, 장애 또는 결핍을 위한 것일 수 있다. 치료는 작용 및/또는 인지 회복을 개선할 수 있다. 치료는 하기를 포함하는 조직 재생, 혈관재생 또는 국소 소염 작용을 요하는 뇌졸중, 말초 동맥 질환, 신경병증 또는 임의의 다른 질환 또는 장애에 대한 것일 수 있다:
(ⅰ) 신경학적 장애, 질환 또는 결핍, 예컨대 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중 또는 ALS;
(ⅱ) 리소좀 축적 장애;
(ⅲ) 심혈관 장애, 예컨대 심근경색 울혈성 심부전, 말초 동맥 질환, 당뇨병성 궤양, 상처 치유;
(ⅳ) 특발성 폐 섬유증, 호흡 곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐 질환, 특발성 폐 고혈압, 낭포성 섬유증 및 천식을 포함하는 폐의 질환;
(ⅴ) 대사 또는 염증성 장애, 예컨대 당뇨병(I형 또는 II형), 류마티스성 관절염, 골관절염, 루푸스, 크론씨병, 과민성 장 질환 또는 이식편 대 숙주 질환;
(ⅵ) 정신학적 장애, 예컨대: 우울증, 조울증 장애, 정신분열증 또는 자폐증 장애, 예컨대 자폐증, 아스퍼거 증후군(Asperger's syndrome) 또는 레트 증후군(Rett Syndrome);
(ⅶ) 망막의 실명 유발 질환, 예컨대 나이 관련 황반변성, 스타가르트 질환(Stargardt disease), 당뇨병성 망막증 또는 색소성 망막염; 및
(ⅷ) 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 뇌성마비, 뇌교 수초 용해증, 척수매독, 횡단성 척수염, 데빅병(Devic's disease), 진행성 다소성 백질뇌증, 시신경염, 백질이영양증, 갈랑 바레 증후군, 항-MAG 말초 신경병증 및 샤르코 마리 투스병(Charcot-Marie- Tooth disease).
일 실시양태에서, 마이크로입자는 엑소좀이고, 치료는 조직 대체, 재생 또는 복구를 요하는 질환 또는 병증에 대한 것이다. 다른 실시양태에서, 마이크로입자는 마이크로소포이고, 치료는 신생혈관생성을 요하는 질환 또는 신경학적 질환, 장애 또는 결핍에 대한 것이다.
치료는 또한 마이크로입자가 유래하는 줄기 세포를 수용하기 위해 후속하여, 동시적으로 또는 동시에 일어나는 숙주에서의 관용, 통상적으로 면역관용을 유도하기 위한 예방학적 치료일 수 있다. 줄기 세포 치료의 투여 전에 또는 이와 동시적으로 환자에 대한 본 발명의 마이크로입자의 하나 이상의 용량의 투여는 줄기 세포 치료의 부정적 면역 반응, 즉, "거부"의 위험을 감소시키기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 제3 양태는 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의 신경 줄기 세포 마이크로입자의 용도를 제공한다.
본 발명의 제4 양태는 줄기 세포 마이크로입자, 통상적으로 신경 줄기 세포 마이크로입자를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 줄기 세포 분화를 허용하는 환경에서 줄기 세포를 배양하는 단계 및 이들 세포에 의해 제조된 마이크로입자를 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 부분적으로 분화된 신경 줄기 세포로부터 마이크로입자를 단리할 수 있다. 대사 폐기물의 효율적인 제거를 허용하는 조건 하에 줄기 세포를 배양할 수 있다. 일 실시양태에서, 줄기 세포 분화를 허용하는 환경은 통상적으로 연장된 기간(예를 들면, 7일 초과) 동안 다구획 생물반응기에서의 배양이다. 상기 방법은 줄기 세포-조정 배지로부터 마이크로입자를 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 줄기 세포-조정 배지는 줄기 세포에 의한 배지로의 마이크로입자의 방출을 자극하는 하나 이상의 추가의 성분들 또는 물질들을 포함할 수 있다. 하나 이상의 성분들은 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 인터페론-감마(IFN-γ) 및/또는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)로부터 선택될 수 있다. 마이크로입자는 줄기 세포가 저산소 조건 하에 배양되는 줄기 세포-조정 배지로부터 단리될 수 있다. NSC 틈새 환경을 형성하기 위해 상이한 세포 유형, 통상적으로 내피 세포와 동시 배양된 줄기 세포에 의해 제조된 줄기 세포-조정 배지로부터 마이크로입자를 단리할 수 있다.
본 발명의 제5 양태는 본 발명의 제4 양태에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 마이크로입자를 제공한다.
본 발명의 제6 양태는 신경 줄기 세포 마이크로입자 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 제7 양태는 줄기 세포에 의해 마이크로입자의 생성 속도를 변경하는 물질을 스크리닝하는 방법으로서, 줄기 세포를 후보 물질과 접촉시키는 단계 및 접촉된 줄기 세포에 의한 마이크로입자의 생성 속도가 대조군에 비해 증가하거나 감소하는지를 관찰하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제8 양태는 줄기 세포 마이크로입자를 제조하는 방법에서 사용하기 위한 키트로서, (a) 줄기 세포를 배양하기에 적합한 배지; (b) 줄기 세포; (c) 임의로 본 발명의 제4 양태의 하나 이상의 성분들; (d) 임의로 대조군으로서 사용하기에 적합한 줄기 세포 마이크로입자; (e) 임의로 제조된 마이크로입자의 특정한 검출에 적합한 검출 물질; 및 (f) 키트를 이용하여 줄기 세포 마이크로입자 를 제조하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 제9 양태는 2개, 3개 또는 모든 4개의 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532를 포함하는 조성물을 제공한다. 이 조성물은 임의로 약제학적으로-허용되는 담체, 희석제, 비히클 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다. 약제학적 조성물은 치료에서, 통상적으로 기재된 바와 같은 본 발명의 마이크로입자과 동일한 치료에서 적합하다.
도 1은 마이크로입자를 제조하는 CTX0E03 조건 불활화 신경 줄기 세포의 전자 현미경사진을 도시한 것이다. 패널 A-E는 직경 30㎚ 내지 50㎚의 엑소좀을 포함하는 세포내 다소포체(MVB)를 나타내고, 패널 F는 세포막에서 출아(budding) 과정을 통해 신경 줄기 세포로부터 방출된 직경 100㎚ 초과의 마이크로소포를 나타낸다.
도 2는 줄기 세포로부터 마이크로입자의 확인, 규명 및 생성을 위한 아웃라인 프로토콜이다.
도 3은 CTX0E03 조정 배지 및 비조정 배지에서 수행된 인간 신생혈관생성 ELISA 스트라이프 광학 밀도 판독을 나타낸다.
도 4a는 정상 배양 조건(3일 T175)과 비교하여 인테그라(Integra) 시스템으로부터 정제된 마이크로입자를 포함하는 15㎖ 배지로부터 추출된 (BCA 검정에 의해 측정된) 단백질의 양을 나타낸다. 도 4b는 (ⅰ) 인테그라 배양된 CTX0E03 엑소좀(상부 왼쪽 패널) 및 마이크로소포(상부 오른쪽 패널)에서의 CD63 및 (ⅱ) 인테그라 배양된 CTX0E03 엑소좀(하부 왼쪽 패널) 및 마이크로소포(하부 오른쪽 패널)에서의 CD81의 FACS 검출(2㎍/㎖에서, 1:250)을 나타낸다.
도 5는 정상 배양 조건(3일 T175)과 비교하여 인테그라 시스템으로부터 여과에 의해 정제된 마이크로입자를 포함하는 15㎖ 배지로부터 추출된 260/280㎚에서 측정된 단리된 전체 RNA의 양을 나타낸다.
도 6a는 정제된 CTX0E03 엑소좀의 첨가 시 또는 CTX0E03 조정 배지에서 배양된 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)의 이동 활성을 나타내는 상처 봉합/스크래치 검정의 결과를 나타낸다. 도 6b는 (엑소좀 없이) 기준 조건에 대한 10㎍의 CTX0E03 엑소좀의 영향을 비교하는, 72시간 후 스크래치 검정의 결과를 나타낸다. 도 6c는 기준 조건, 2㎍/㎖의 엑소좀, 6㎍/㎖의 엑소좀, 20㎍/㎖의 엑소좀 및 LSGS(적은 혈청 성장 보충) 양성 대조군에 대한 치유 면적(%)을 나타낸다. 도 6c의 상부 패널은 인테그라 셀라인 시스템에서 2주 동안 배양된 CTX0E03 세포로부터 단리된 엑소좀을 나타내고, 도 6c의 하부 패널은 인테그라 셀라인 시스템에서 6주 동안 배양된 CTX0E03 세포로부터 단리된 엑소좀을 나타낸다. 도 6d는 생체내 주사 상처 치유 검정에서 CTX0E03 세포를 음성 대조군(식염수)과 비교한다.
도 7은 3주 시점에서 표준 CTX0E03(T175) 배양 대 인테그라 셀라인 시스템으로부터의 배지마다 얻은 정제된 엑소좀의 분량을 나타낸다.
도 8a는 CTX0E03 인테그라 셀라인 배양 시스템의 1주, 2주 및 3주 후 2개의 상이한 플라스크로부터 수확한 엑소좀의 농도를 나타낸다. 도 8b는 CTX0E03 세포의 6주 연속 배양 동안 단일 인테그라 셀라인 플라스크로부터 수확한 엑소좀의 농도를 나타낸다.
도 9는 표준("대조군") CTX0E03(T175) 배양과 비교한 인테그라 셀라인 시스템에서 3주 동안 배양된 CTX0E03 세포에서 측정된 다양한 mRNA 마커의 발현 수준의 배수 변화를 나타낸다.
도 10은 표준(T175) 배양에서 CTX0E03 세포에서 기준 발현 수준에 대해 평가된, 표준 CTX0E03(T175) 배양으로부터 얻은 마이크로입자 및 인테그라 생물반응기 배양에서 3주 동안 배양된 CTX0E03 세포로부터 얻은 엑소좀에서의 다양한 miRNA의 상향 및 하향 배수 조절을 나타낸다.
도 11은 표준(T175) 조건 하에 배양된 CTX0E03 세포("CTX"), 마이크로소포("MV") 및 엑소좀("EXO")으로부터의 miRNA의 딥 서열분석으로부터 얻은 miRNA 프로필을 도시한 것이다. 도 11a 및 도 11b는 2의 배양으로부터의 결과를 나타낸다.
도 12는 HUVEC의 신생혈관생성에 대한 hNSC 마이크로소포의 효과를 나타낸다. 도 12a는 기준 HUVEC과 비교하여 마이크로소포가 첨가될 때(오른쪽 패널) 관찰된 튜브 형성의 명확한 증가를 나타내는 사진이다. 도 12b 및 도 12c는 다양한 농도(0.05㎍, 0.1㎍, 0.3㎍ - 도 12b; 및 0.6㎍/㎖ - 도 12c)에서 hNSC 마이크로소포에 의해 제공된 전체 튜브 길이의 증가를 나타낸다.
도 13은 PC-12 세포에서의 신경돌기 생육에 대한 hNSC 마이크로소포의 효과를 나타낸다.
도 14는 애질런트 RNA 바이오분석기에 의해 결정된 CTX0E03 세포, 엑소좀 및 마이크로소포에서 전체 RNA 함량 프로필을 나타내는 전기영동도이다.
도 15는 엑손과 완전 중첩하는 코딩 유전자, 및 (GENCODE 서열 데이터세트에 대해 NGS BAM 파일들을 실행함으로써 제조된) 인트론 또는 유전자간 서열 사이에 위치한 비코딩 전사체의 백분율의 도식적 표시이다.
도 16은 CTX0E03 프로듀서 세포와 비교하여 엑소좀 및 MV에서 상위 랭킹 우선적으로 셔틀링된 신규한 miRNA를 도시한 것이다.
도 17은 1, 2, 3, 4, 5 및 6주 동안 인테그라 셀라인 시스템에서 배양된 CTX0E03 엑소좀(도 17a) 및 마이크로소포(도 17b)의 입자 크기 및 농도를 결정하는 것을 수행하는 나노사이트(NanoSight) 분석의 결과를 나타낸다.
도 18은 CTX0E03 엑소좀 및 마이크로소포로부터 단백질체 데이터를 비교하고(도 18a 및 도 18b), 신경 줄기 세포 엑소좀을 중간엽 줄기 세포 엑소좀과 비교하는(도 18c 및 도 18d) Venn 다이아그램을 나타낸다. 도 18a는 2주 인테그라 배양 시스템으로부터 단리된, CTX0E03 엑소좀 및 마이크로소포 내의 독특한 단백질의 수를 나타낸다. 도 18b는 CTX0E03 엑소좀 및 마이크로소포 내의 확인된 단백질과 관련된 생물학적 과정을 비교한다. 도 18c는 CTX0E03 신경 줄기 세포 엑소좀 프로테옴을 중간엽 줄기 세포 엑소좀 프로테옴과 비교하고, 도 18d는 신경 줄기 세포 유래 엑소좀과의 MSC 유래 엑소좀에서 확인된 단백질과 관련된 생물학적 과정을 비교한다.
도 19는 NSC 유래 엑소좀 및 중간엽이 아닌 줄기 세포 엑소좀과 관련된 것으로 확인된 30개의 생물학적 과정을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 놀랍게도 신경 줄기 세포에서 마이크로입자를 확인하였다. 이들 마이크로입자는 이들이 유래한 신경 줄기 세포의 여러 기능을 보유하고 통상적으로 신경 줄기 세포와 동일한 치료에 치료학적으로 유용하다. 마이크로입자는 더 작고 덜 복잡하여 제조하고 유지하고 저장하고 수송하는 것이 더 쉽고 줄기 세포를 둘러싼 조절 문제 중 일부를 회피하는 가능성을 가지므로 상응하는 줄기 세포에 비해 유리하다. 마이크로입자는 대규모 생성 및 "상용(off-the-shelf)" 치료의 제공을 허용하는 예를 들면 생물반응기, 예컨대 다구획 생물반응기에서 조정 배지로부터 단리에 의해 계속해서 제조될 수 있다. 다구획 생물반응기는 통상적으로 2구획 생물반응기이다.
놀랍게도, 줄기 세포가 분화를 시작하도록 허용하는 환경에서 (신경 줄기 세포로 제한되지 않는 임의의 유형의) 줄기 세포를 배양하는 것이 제조된 마이크로입자의 수율을 급격히 증가시킨다는 것이 추가로 발견되었다.
본 발명자들은 놀랍게도 다구획 생물반응기에서 (신경 줄기 세포로 제한되지 않는 임의의 유형의) 줄기 세포를 배양하는 것이 줄기 세포를 더 분화된 형태로의 줄기 세포로 부분 분화시킨다는 것을 관찰하였다. 배양에서의 이 분화는 분화를 유도하는 물질의 첨가를 필요로 하지 않는다. 이 분화는 통상적으로 적어도 1주, 적어도 2주 또는 적어도 3주의 배양 기간을 요한다. 다구획 생물반응기에서 배양에서 발생하는 줄기 세포에 대한 변화는 배양된 줄기 세포에 의해 제조된 마이크로입자에 의해 반영된다. 따라서, 다구획 생물반응기에서 줄기 세포를 배양함으로써, 세포의 분화를 유도할 수 있다. 따라서, 통상적으로 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주 또는 적어도 6주 동안 다구획 생물반응기에서 배양된 줄기 세포로부터 마이크로입자를 수확함으로써 부분적으로 분화된 줄기 세포로부터의 마이크로입자는 제조될 수 있다. 임의로, 10주 이하 동안 NSC를 배양한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 부분적으로 분화된 신경 줄기 세포로부터 마이크로입자를 단리함으로써 마이크로입자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명자들 또한 줄기 세포로부터 마이크로입자의 분비를 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 신경 줄기 세포로 또한 제한되지 않고 임의의 줄기 세포로부터 마이크로입자의 생성에 사용될 수 있는 이러한 발견은 마이크로입자의 개선된 수율이 줄기 세포 배양으로부터 얻어지도록 한다. 분비되는 마이크로입자의 양을 제어할 수 있는 추가의 이점을 갖는, 상이한 정도로 마이크로입자의 분비를 증대시키는 여러 물질이 확인되었다. 저산소 조건 하에 줄기 세포를 배양하는 것은 또한 마이크로입자 생성을 개선한다. 추가로, 상이한 세포 유형, 특히 내피 세포 유형과의 줄기 세포의 동시 배양이 줄기 세포에 의해 제조된 마이크로입자를 유리하게 변경시킬 수 있는 것으로 발견되었다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 혈청 비함유 줄기 세포에 의해 제조된 마이크로입자, 통상적으로 엑소좀을 제공한다. 혈청은 많은 세포주의 성공적인 배양에 필요하지만, 이의 자체의 엑소좀을 포함하는 많은 오염물질들을 포함한다. 하기 기재된 바대로, 본 발명자들은 성공적인 배양을 위해 혈청을 필요로 하지 않는 줄기 세포로부터 마이크로입자를 제조하였다.
신경 줄기 세포 마이크로입자
본 발명은, 일 양태에서, 신경 줄기 세포로부터 얻을 수 있는 마이크로입자를 제공한다. 신경 줄기 세포 마이크로입자는 신경 줄기 세포에 의해 제조된 마이크로입자이다. 통상적으로, 마이크로입자는 신경 줄기 세포에 의해 분비된다. 더 통상적으로, 마이크로입자는 엑소좀 또는 마이크로소포가다. 다른 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포로부터의 마이크로입자가 당해 분야에 공지되어 있다.
"마이크로입자"는 세포로부터 방출되는 직경 30 내지 1000㎚의 세포외 소포가다. 이는 생물학적 분자를 둘러싸는 지질 이중층에 의해 제한된다. 용어 "마이크로입자"는 당해 분야에 공지되어 있고, 막 입자, 막 소포, 마이크로소포, 엑소좀 유사 소포, 엑소좀, 엑토솜 유사 소포, 엑토솜 또는 외부소포를 포함하는 마이크로입자의 다수의 상이한 종을 포함한다. 마이크로입자의 상이한 유형은 직경, 세포이하 기원, 수크로스에서의 이의 밀도, 형상, 침강 속도, 지질 조성물, 단백질 마커 및 분비 방식(즉, 신호(유도성)를 따르느냐 자발적이냐(구성적))에 기초하여 구별된다. 4개의 일반 마이크로입자 및 이의 구별되는 특징이 하기 표 1에 기재되어 있다.
표 1: 다양한 마이크로입자
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마이크로입자는 직접 및 간접 기전을 통해 공여 세포와 수혜 세포 사이의 비히클로서 작용함으로써 세포간 소통에 역할을 하는 것으로 생각된다. 직접 기전은 수혜 세포에 의해 마이크로입자 및 이의 공여 세포 유래 성분(예컨대, 단백질, 지질 또는 핵산)의 유입을 포함하고, 성분들은 수혜 세포에서 생물학적 활성을 갖는다. 간접 기전은 마이크로소포-수혜 세포 표면 상호작용을 포함하고 수혜 세포의 세포내 신호전달의 조절을 발생시킨다. 그러므로, 마이크로입자는 수혜 세포에 의한 하나 이상의 공여 세포 유래 특성의 획득을 중재할 수 있다. 동물 모델에서의 줄기 세포 치료의 효율에도 불구하고, 줄기 세포가 숙주로 이식되는 것으로 보이지 않는다는 것이 관찰되었다. 따라서, 줄기 세포 치료가 효과적인 기전은 명확하지 않다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 본 발명자들은 신경 줄기 세포에 의해 분비된 마이크로입자가 이들 세포의 치료학적 유용성에서 역할을 하고 따라서 그 지체가 치료학적으로 유용한 것으로 생각한다.
본 발명의 마이크로입자 및 줄기 세포는 단리된다. 용어 "단리된"은 이것이 언급하는 마이크로입자, 마이크로입자 집단, 세포 또는 세포 집단이 이의 천연 환경 내에 있지 않다는 것을 나타낸다. 마이크로입자, 마이크로입자 집단, 세포 또는 세포 집단은 주변 조직으로부터 실질적으로 분리된다. 몇몇 실시양태에서, 마이크로입자, 마이크로입자 집단, 샘플이 적어도 약 75%, 몇몇 실시양태에서 적어도 약 85%, 몇몇 실시양태에서 적어도 약 90%, 몇몇 실시양태에서 적어도 약 95%의 마이크로입자 및/또는 줄기 세포를 포함하는 경우, 세포 또는 세포 집단은 주변 조직으로부터 실질적으로 분리된다. 즉, 샘플이 마이크로입자 및/또는 줄기 세포 이외의 약 25% 미만, 몇몇 실시양태에서 약 15% 미만, 몇몇 실시양태에서 약 5% 미만의 물질을 포함하는 경우 샘플은 주변 조직으로부터 실질적으로 분리된다. 이러한 백분율 값은 중량%를 의미한다. 상기 용어는 세포 또는 마이크로입자가 기원하고 배양 중에 존재하는 유기체로부터 제거되는 세포 또는 마이크로입자를 포함한다. 상기 용어는 또한 세포 또는 마이크로입자가 기원하고 후속하여 유기체로 재삽입된 유기체로부터 제거되는 세포 또는 마이크로입자를 포함한다. 재삽입된 세포를 포함하는 유기체는 세포가 제거된 동일한 유기체이거나 상이한 유기체일 수 있다.
신경 줄기 세포는 (막 소포 및 마이크로소포를 형성하는) 혈장 막의 출아를 포함하는 다양한 기전에 의해 및 (마이크로입자를 포함하는) 세포내 다소포체와 세포 막의 융합 및 (엑소좀 및 엑소좀 유사 소포를 분비시키는) 세포외 구획으로의 마이크로입자의 방출의 결과로서 천연에서 마이크로입자를 제조한다.
본 발명의 마이크로입자를 제조하는 신경 줄기 세포는 태아, 배아 또는 성체 신경 줄기 세포일 수 있고, 예컨대 US5851832, US6777233, US6468794, US5753506 및 WO-A-2005121318에 기재되어 있다. 태아 조직은 인간 태아 피질 조직일 수 있다. 세포는 문헌[Yuan et al. (2011)]에 기재된 바대로 유도 만능 줄기(iPS) 세포의 분화로부터의 신경 줄기 세포, 또는 (예를 들면, 최근에 문헌[Their et al, 2012]에서 의해 재프로그래밍의 초기 단계로 Oct4 활성을 엄격히 제한하면서 Sox2, Klf4 및 c-Myc를 구성적으로 유도함으로써) 체세포, 예컨대 섬유아세포로부터 제조된 직접 유도된 신경 줄기 세포로부터 선택될 수 있다. 당해 분야에 공지된 바대로(예를 들면, Klimanskaya et al., 2006 및 Chung et al. 2008), 인간 배아 줄기 세포를 공여 배아의 생존능력을 보존하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 인간 배아 줄기 세포를 얻는 이러한 비파괴적 방법을 이용하여 본 발명의 마이크로입자가 얻어질 수 있는 배아 줄기 세포를 제공할 수 있다. 대안적으로, 성체 줄기 세포, iPS 세포 또는 직접 유도된 신경 줄기 세포로부터 본 발명의 마이크로입자를 얻을 수 있다. 따라서, 인간 배아의 파괴를 요하지 않는 다수의 방법 또는 기본 재료로서 인간 배아의 사용에 의해 본 발명의 마이크로입자를 제조할 수 있다.
통상적으로, 마이크로입자가 제조되는 신경 줄기 세포 집단은 실질적으로 순수하다. 본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 전체 세포 집단을 구성하는 다른 세포와 관련하여 적어도 약 75%, 몇몇 실시양태에서 적어도 약 85%, 몇몇 실시양태에서 적어도 약 90%, 몇몇 실시양태에서 적어도 약 95% 순수한 줄기 세포의 집단을 의미한다. 예를 들면, 신경 줄기 세포 집단과 관련하여, 이 용어는 전체 세포 집단을 구성하는 다른 세포와 비교하여 적어도 약 75%, 몇몇 실시양태에서 적어도 약 85%, 몇몇 실시양태에서 적어도 약 90%, 몇몇 실시양태에서 적어도 약 95% 순수한, 신경 줄기 세포가 있다는 것을 의미한다. 즉, 용어 "실질적으로 순수한"은 후속 배양 및 증폭 전에 약 25% 미만, 몇몇 실시양태에서 약 15% 미만, 몇몇 실시양태에서 약 5% 미만의 원래의 비증폭되고 단리된 집단에서의 계통 전속 세포를 포함하는 본 발명의 줄기 세포의 집단을 의미한다.
신경 줄기 세포 마이크로입자는 지질, 단백질 및 핵산을 포함하는 환경을 통상적으로 둘러싸는 적어도 하나의 지질 이중층을 포함한다. 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 및/또는 리보핵산(RNA)일 수 있다. RNA는 메신저 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 또는 임의의 miRNA 전구체, 예컨대 pri-miRNA, pre-miRNA 및/또는 작은 핵 RNA(snRNA)일 수 있다.
신경 줄기 세포 마이크로입자는 이것이 유래하는 줄기 세포의 적어도 하나의 생물학적 기능을 보유한다. 보유될 수 있는 생물학적 기능은 신생혈관생성 및/또는 신경생성을 증진시키는 능력, 뇌졸중을 겪은 환자의 뇌에서 인지 개선에 영향을 미치는 능력 또는 말초 동맥 질환에서 혈류 회복을 가속시키는 능력을 포함한다. 예를 들면, CTX0E03 세포는 PBMC 검정에서 T 세포 활성화를 억제하는 것으로 공지되어 있고, 일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 PBMC 검정에서 T 세포 활성화를 억제하는 능력을 보유한다. PBMC 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있고 검정을 수행하기 위한 키트는 상업적으로 구입 가능하다.
실시예 8, 표 2 및 도 6은 CTX0E03 줄기 세포 엑소좀이 상처 치유의 "스크래치" 모델에서 상처를 봉합하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다. 도 6a에서의 결과는 CTX0E03 조정 배지에서 배양된 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)의 이동 활성은 정제된 엑소좀의 첨가에서 관찰된 이동 활성과 거의 동일하다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 마이크로입자가 보유할 수 있는 하나의 생물학적 기능은 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)의 이동 활성을 자극하는 능력이다.
실시예 8은 또한 본 발명의 마이크로소포가 1차 HUVEC의 신생혈관생성을 자극하고 PC-12 세포의 신경돌기 생육을 자극할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 마이크로입자가 보유할 수 있는 생물학적 기능은 1차 HUVEC의 신생혈관생성을 자극하고/하거나 PC-12 세포의 신경돌기 생육을 자극하는 능력이다.
실시예 13에서의 단백질체 분석은 신경 줄기 세포 엑소좀이 유전 물질의 생성, 충전, 기능 및 분해와 관련된 생물학적 기능을 포함한다는 것을 나타낸다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 엑소좀은 통상적으로 RNA 중합효소 기능, RNA 분해 기능, 리보솜 기능 및 스플라스좀 기능 중 하나 이상인 이 기능을 보유한다.
신경 줄기 세포로부터 얻은 마이크로입자는 직경이 1000㎚ 이하이다. 통상적으로, 본 발명의 마이크로입자는 직경이 200㎚ 이하, 예를 들면 100㎚ 이하이다. 상기 표 1에 기재된 바대로, 마이크로소포는 직경이 100㎚ 내지 1000㎚이다. 엑소좀은 통상적으로 30-100㎚의 직경을 갖는 것으로 정의되어 있지만, 더 최근의 연구는 엑소좀이 또한 100㎚ 내지 200㎚의 직경을 가질 수 있다고 확인시켜준다(예를 들면, Katsuda et al, Proteomics 2013 및 Katsuda et al, Scientific Reports 2013). 따라서, 엑소좀은 통상적으로 직경이 30㎚ 내지 150㎚이다. 막 입자는 직경이 50㎚ 내지 80㎚이고, 엑소좀 유사 입자는 직경이 20㎚-50㎚이다. 직경은 전자 분광법 또는 동적 광 산란과 같은 임의의 적합한 기법에 의해 결정될 수 있다. 용어 마이크로입자는 막 입자, 막 소포, 마이크로소포, 엑소좀 유사 소포, 엑소좀, 엑토솜 유사 소포, 엑토솜 또는 외부소포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
도 1 패널 A-E는 직경 30-50㎚의 엑소좀을 포함하는 MVB의 신경 줄기 세포에서의 존재를 나타내고, 패널 F는 직경 100㎚ 초과의 마이크로소포를 나타낸다. 표 20 및 도 17(하기)은 특정한 신경 줄기 세포 엑소좀이 당해 분야에 기재된 (중간엽 줄기 세포로부터의) 엑소좀의 크기와 일치하는 대략 70㎚ 내지 대략 150㎚ 범위의 직경을 갖는 것으로 측정되었다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 엑소좀은 통상적으로 직경이 30㎚ 내지 200㎚, 더 통상적으로 50㎚ 내지 150㎚이다. 기재된 바대로, 엑소좀은 통상적으로 알릭스 마커(UNIPROT 수탁 번호 Q8WUM4)에 대해 양성이다.
도 1f 및 표 20은 대략 150㎚-200㎚의 모드 직경 또는 대략 180㎚-350㎚의 중앙 직경을 갖는 특정한 신경 줄기 세포 마이크로소포의 관찰된 크기를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 마이크로소포는 통상적으로 직경이 100 내지 1000㎚, 더 통상적으로 150㎚ 내지 350㎚이다.
본 발명의 몇몇 마이크로입자는 CD 133 표면 마커를 발현한다. 본 발명의 다른 마이크로입자는 CD133 표면 마커를 발현하지 않는다.
"마커"는 존재, 농도, 활성 또는 인산화 상태가 세포의 표현형을 확인하기 위해 검출되고 사용될 수 있는 생물학적 분자를 의미한다.
엑소좀은 엑소시토시스에 의해 세포로부터 방출된 통상적으로 30-100㎚ 직경, 때때로 100㎚ 내지 200㎚ 직경의 엔도솜 유래 지질 마이크로입자이다. 엑소좀 방출은 조절된 및 기능상 관련 방식으로 구성적으로 또는 유도 시 발생한다. 이들의 생물발생 동안, 엑소좀은 광범위한 시토졸 단백질(셰프론 단백질, 인테그린, 세포골격 단백질 및 테트라스파닌을 포함) 및 유전 재료를 편입시킨다. 결과적으로, 엑소좀은 상당한 거리에 걸쳐 모세포 마이크로환경에서 세포 사이의 단백질, 지질 및 유전 재료의 운반을 위해 세포내 소통 디바이스인 것으로 생각된다. 본 발명이 이 이론에 구속되는 것은 아니지만, 엑소좀이 신경 줄기 세포의 효율을 담당하는 것이 가능하다. 따라서, 신경 줄기 세포로부터의 엑소좀은 그 자체가 치료학적으로 효율적인 것으로 예상된다.
원하는 기능을 갖도록 설계된 마이크로입자
마이크로입자는 이들을 제조하는 줄기 세포의 기능 중 적어도 일부를 보유한다. 따라서, 하나 이상의 원하는 기능을 보유하도록 (본 발명의 신경 줄기 세포 마이크로입자가 일 실시양태로서 명확히 포함되더라도, 임의의 줄기 세포 유형일 수 있고 신경 줄기 세포에 제한되지 않는) 줄기 세포, 통상적으로 단백질 또는 miRNA를 조작함으로써 마이크로입자를 설계할 수 있다. 조작은 통상적으로 하나 이상의 외인성 코딩, 비코딩 또는 조절 핵산 서열들을 줄기 세포로 도입하는 유전자 엔지니어링이다. 예를 들면, 엑소좀 함유 VEGF 및/또는 bFGF가 바람직하지만, 엑소좀 생성 줄기 세포는 (높은 수준의) VEGF 및/또는 bFGF를 발현하도록 형질전환 또는 형질감염될 수 있고, 이는 이후 그 줄기 세포에 의해 제조된 마이크로입자로 편입된다. 유사하게, iPS 세포를 사용하여 마이크로입자를 제조할 수 있고, iPS 세포에 의해 제조된 마이크로입자에서 필요한 단백질 및 핵산(예를 들면, miRNA)을 제조하도록 이들 세포를 설계할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 임의의 줄기 세포 유형으로부터, ad hoc 마이크로입자가 제조되는 줄기 세포에 천연으로 존재하지 않는 작용을 포함하는 이들 마이크로입자를 제공하고, 즉 하나 이상의 외인성 단백질 또는 핵산 서열을 포함하는 마이크로입자(예를 들면, 엑소좀)는 천연이 아니고 조작된다.
일 실시양태에서, 단리된 또는 정제된 마이크로입자는 표적 세포에서 원하는 기능을 수행하도록 의도된 하나 이상의 외인성 핵산, 지질, 단백질, 약물 또는 프로드럭으로 로딩된다. 이는 줄기 세포의 조작을 요하지 않고, 외인성 재료는 임의로 마이크로입자에 직접 첨가될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산은 전기천공에 의해 마이크로입자로 도입될 수 있다. 이후, 마이크로입자는 외인성 재료를 위한 비히클 또는 담체로서 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 마이크로입자를 제조한 세포로부터 단리된 이들 마이크로입자는 통상적으로 전기천공에 의해 외인성 siRNA로 로딩되어 하나 이상의 병리학적 유전자들을 침묵화시키도록 고갈될 수 있는 마이크로입자를 제조한다. 이러한 방식으로, 마이크로입자는 하나 이상의 물질, 통상적으로 치료학적 또는 진단학적 물질을 표적 세포로 전달하는 비히클로서 사용될 수 있다. 이의 예는 하나 이상의 병리학적 유전자들을 침묵화시킬 수 있는 외인성 siRNA를 포함하는 신경 줄기 세포 엑소좀이다.
마이크로입자 마커
본 발명은 단리된 신경 줄기 세포 마이크로입자의 집단을 제공하고, 이 집단은 본질적으로 본 발명의 마이크로입자만을 포함하고, 즉 마이크로입자 집단은 순수하다. 많은 양태들에서, 마이크로입자 집단은 적어도 약 80%(다른 양태들에서, 적어도 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100%)의 본 발명의 마이크로입자를 포함한다.
본 발명의 단리된 신경 줄기 세포 마이크로입자는 특정한 마커에 대해 독특한 발현 프로필을 갖고 다른 세포 유형으로부터의 마이크로입자로부터 구별된다는 것을 특징으로 한다. 마커가 본원에 기재될 때, 마이크로입자를 구별하기 위해 이의 존재 또는 부재는 이용할 수 있다. 예를 들면, 용어 "포함할 수 있다" 또는 "발현할 수 있다"는 또한 마커가 존재하지 않는 반대의 실시양태를 개시하고, 예를 들면 구절 "마이크로입자는 하나 이상의 테트라스파닌, 통상적으로 CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 및/또는 CD37을 포함할 수 있다"는 또한 마이크로입자가 하나 이상의 테트라스파닌, 통상적으로 CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 및/또는 CD37을 포함하지 않을 수 있는 반대의 실시양태를 기술한다.
적어도 약 70%의 집단의 마이크로입자, 예를 들면 70%의 막 입자, 막 소포, 마이크로소포, 엑소좀 유사 소포, 엑소좀, 엑토솜 유사 소포, 엑토솜 또는 외부소포가 마커의 검출 가능한 수준을 나타내는 경우, 본 발명의 신경 줄기 세포 마이크로입자는 통상적으로 마커를 보유하는 것으로 생각된다. 다른 양태들에서, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 이상의 집단은 마커의 검출 가능한 수준을 나타낸다. 특정한 양태들에서, 적어도 약 99% 또는 100%의 집단은 마커의 검출 가능한 수준을 나타낸다. 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 통해 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 마커의 정량을 검출할 수 있다. 이 기재는 오직 예의 방식으로 제공되고 제한이도록 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 통상적으로, 적어도 약 90%의 집단의 마이크로입자가 FACS에 의해 검출되는 마커의 검출 가능한 수준을 나타내는 경우, 본 발명의 신경 줄기 세포 마이크로입자는 마커를 보유하는 것으로 생각된다.
본원에 기재된 마커는, qRT-PCR에 의해 측정된 이의 발현 수준이 35(qRT-PCR 어레이에서 표준 컷오프) 이하의 교차점(Cp) 값을 갖는 경우 본 발명의 집단의 세포에 의해 발현되는 것으로 생각되다. Cp는 증폭 곡선이 검출 쓰레스홀드와 교차하고 교차하는 쓰레스홀드(ct)로서 또한 보고될 수 있는 점을 나타낸다.
일 실시양태에서, 본 발명은 신경 줄기 세포 집단에 의해 제조된 마이크로입자에 관한 것이고, 집단의 세포가 네스틴, Sox2, GFAP, βIII, 튜불린, DCX, GALC, TUBB3, GDNF 및 IDO 마커 중 하나 이상을 발현하는 것으로 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 마이크로입자는 엑소좀이고, 엑소좀의 집단은 DCX(더블코르틴 - 초기 뉴런 마커), GFAP(신경교섬유질 산성 단백질 - 성상교세포 마커), GALC, TUBB3, GDNF 및 IDO 중 하나 이상을 발현한다.
본 발명의 신경 줄기 세포 마이크로입자는 동일한 종의 중간엽 줄기 세포 마이크로입자에서의 마커의 발현 수준보다 낮거나 높은 수준으로 하나 이상의 단백질 마커를 발현할 수 있다. CTX0E03 세포 마이크로입자에 의해 발현된 단백질 마커는 본원 및 하기에서 확인된다. 몇몇 실시양태에서, 마이크로입자는 튜불린 또는 다른 이러한 조절 단백질(들)에 대한 수준으로 단백질 마커를 발현할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 조절 단백질에 비해 적어도 ±1.2배 변화, 통상적으로 조절 단백질에 비해 적어도 ±1.5배 변화, 조절 단백질에 비해 적어도 ±2배 변화 또는 조절 단백질에 비해 적어도 ±3배 변화의 수준으로 이 단백질을 발현할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 마이크로입자는 튜불린 또는 다른 조절 단백질에 비해 10-2 내지 10-6 카피의 수준으로 단백질 마커를 발현할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 튜불린 또는 다른 조절 단백질에 비해 세포당 10-2 내지 10-3 카피의 수준으로 이 단백질을 발현할 수 있다.
본 발명의 신경 줄기 세포 마이크로입자는 동일한 종의 중간엽 줄기 세포 마이크로입자에서 miRNA(miRNA 전구체 포함)의 발현 수준보다 낮거나 높은 수준으로 하나 이상의 miRNA(miRNA 전구체 포함)를 발현할 수 있다. CTX0E03 세포 마이크로입자에 의해 발현된 miRNA 마커는 하기 확인된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 U6B 또는 15a 또는 임의의 다른 miRNA 기준 유전자(내부 조절 유전자라고도 함)에 비해 (널리 공지된 ㅿㅿct 방법에 따라 계산된) 적어도 ±1.5배 변화, 통상적으로 적어도 ±2배 변화 또는 적어도 ±3배 변화의 수준에서 마커 miRNA를 발현할 수 있다.
본 발명의 신경 줄기 세포 마이크로입자는 동일한 종의 중간엽 줄기 세포 마이크로입자에서 mRNA의 발현 수준보다 낮거나 높은 수준으로 mRNA를 발현할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 ATP5B 또는 YWHAZ 또는 임의의 다른 기준 유전자(내부 조절 유전자라고도 함)에 비해 (ㅿㅿct에 따라 계산된) 적어도 ±1.5배 변화, 통상적으로 적어도 ±2배 변화 또는 적어도 ±3배 변화의 수준에서 마커 mRNA를 발현할 수 있다.
본 발명의 엑소좀은 통상적으로 이들의 표면에서 특이적 인테그린, 테트라스파닌, MHC I형 및/또는 II형 항원, CD 항원 및 세포 부착 분자를 발현하여, 특이적 세포 유형에 의한 이들의 흡수를 촉진할 수 있다. 엑소좀은 다양한 세포골격 단백질, GTPase, 클라트린, 셰프론 및 대사 효소(그러나 미토콘드리아, 리소좀 및 ER 단백질을 배제하여, 전체 프로필은 세포질을 닮지 않음)를 포함한다. 이들은 또한 mRNA 스플라이싱(splicing) 및 번역 인자를 포함한다. 마지막으로, 엑소좀은 일반적으로 신호전달 역할을 하는 것으로 공지된 몇몇 단백질, 예컨대 HSP70, HSP90 및 아넥신을 포함하지만, 전통적인(ER-골지) 기전에 의해 분비되지 않는다.
엑소좀의 지질 이중층은 통상적으로 콜레스테롤, 스핑고미엘린 및 세라마이드가 농후하다. 엑소좀은 또한 하나 이상의 테트라스파닌 마커 단백질을 발현한다. 테트라스파닌은 CD81, CD63, CD9, CD53, CD82 및 CD37을 포함한다. 엑소좀은 또한 성장 인자, 사이토카인 및 RNA, 특히 miRNA를 포함할 수 있다. 엑소좀은 통상적으로 마커 TSG101, 알릭스, CD109, thy-1 및 CD133 중 하나 이상을 발현한다. 알릭스(Uniprot 수탁 번호 Q8WUM4), TSG101(Uniprot 수탁 번호 Q99816) 및 테트라스파닌 단백질 CD81(Uniprot 수탁 번호 P60033) 및 CD9(Uniprot 수탁 번호 P21926)는 특징적인 엑소좀 마커이다.
알릭스는 엔도솜 경로 마커이다. 엑소좀은 엔도솜 유래이고, 따라서, 이 마커에 양성인 마이크로입자는 엑소좀으로 규명된다. 본 발명의 엑소좀은 통상적으로 알릭스에 양성이다. 본 발명의 마이크로소포는 통상적으로 알릭스에 음성이다.
마이크로입자 프로테옴
표 18 및 20은 인테그라 셀라인 다구획 생물반응기에서 2주 동안 배양된 CTX0E03 세포로부터 각각 단리된 엑소좀 및 마이크로소포에서 질량 분광광도법에 의해 검출된 모든 단백질을 기재한 것이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 엑소좀은 표 18에 기재된 단백질 중 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%를 포함한다. 유사하게, 본 발명의 마이크로소포는 통상적으로 표 20에 기재된 단백질 중 적어도 70% 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 마이크로소포 또는 엑소좀의 프로테옴은 표 18(엑소좀) 또는 표 20(마이크로소포)에 제공된 프로테옴과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 마이크로입자 또는 엑소좀의 단백질 함량을 결정할 때, 질량 분광광도법, 예를 들면 실시예 13에 기재된 LC/MS/MS 방법을 통상적으로 이용한다.
표 19 및 21은 인테그라 셀라인 다구획 생물반응기에서 2주 동안 배양된 CTX0E03 세포로부터 각각 단리된 엑소좀 및 마이크로소포에서 질량 분광광도법에 의해 검출된 100개의 가장 풍부한 단백질을 나타낸다. 통상적으로, 본 발명의 엑소좀은 표 19에 기재된 제1 10개의 단백질, 더 통상적으로 표 19에 기재된 제1 20개, 제1 30개, 제1 40개 또는 제1 50개의 단백질을 포함한다. 유사하게, 본 발명의 마이크로입자는 통상적으로 표 21에 기재된 제1 10개의 단백질, 더 통상적으로 표 21에 기재된 제1 20개, 제1 30개, 제1 40개 또는 제1 50개의 단백질을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 엑소좀은 표 19에 기재된 모든 100개의 단백질을 포하한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로소포는 표 21에 기재된 모든 100개의 단백질을 포함한다. 통상적으로, 본 발명의 엑소좀 또는 마이크로소포에서 100개의 가장 풍부한 단백질은 표 19(엑소좀) 또는 표 21(마이크로입자)에서 확인된 적어도 70개의 단백질을 포함한다. 더 통상적으로, 본 발명의 엑소좀 또는 마이크로소포에서 100개의 가장 풍부한 단백질은 표 19(엑소좀) 또는 표 21(마이크로입자)에서 확인된 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 95개, 96개, 97개, 98개 또는 99개 또는 모든 100개의 단백질을 포함한다.
마이크로입자 miRNA 함량
실시예 12(및 관련 도 11)는 CTX0E03 세포, 이들 세포에 의해 제조된 마이크로소포 및 엑소좀에 존재하는 miRNA의 딥 서열분석의 결과를 나타낸다. 이 실시예는, 놀랍게도, 마이크로입자에 존재하는 상이한 miRNA 종의 수가 세포에 존재하는 상이한 miRNA 종의 수와 비교하여 크게 감소한다는 것을 나타내고; 마이크로입자는 120개 미만의 상이한 miRNA를 포함하는 반면, 세포는 450개 내지 700개의 miRNA 종을 포함한다. 마이크로입자는 대부분의 hsa-miR-1246을 포함한다.
실시예 12에서의 데이터는 또한 마이크로입자가 4개의 주요 miRNA 종, 즉 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532를 특징으로 한다는 것을 나타낸다. 이들 4개의 miRNA는 마이크로입자에서 1000 초과의 판독수로 존재하는 유일한 miRNA이고; 이들 4개의 miRNA는 마이크로입자에서 다른 miRNA와 비교하여 매우 과량으로 존재한다. 이는 높은(1000 초과의 판독수) 또는 매우 높은(10,000 초과의 판독수) 수준으로 존재하는 훨씬 더 많은 miRNA의 수를 포함하는 세포에서의 프로필과 반대이다. 이론에 구속됨이 없이, 본 발명자들은 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532가 마이크로입자로 선택적으로 통행(또는 그렇지 않으면 편입)되고 마이크로입자의 기능에서 역할을 한다고 생각된다고 제시한다.
통상적으로, 일 실시양태에서 본 발명의 마이크로입자, 예를 들면 엑소좀은 1개, 2개, 3개 또는 모든 4개의 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532를 포함한다. 각각의 이들 miRNA 마커는 통상적으로 마이크로입자당 적어도 1000개의 (임의로 실시예 12에 기재된 딥 서열 기법을 이용하여 결정된) 판독수로 존재한다. hsa-miR-1246은 임의로 마이크로입자당 적어도 2000, 5000, 10,000, 20,000 또는 25,000의 판독수를 가질 수 있다. Hsa-miR-4492는 임의로 마이크로입자당 적어도 2000, 3000, 4000 또는 5000의 판독수를 가질 수 있다. Hsa-miR-4532는 임의로 마이크로입자당 적어도 2000 또는 3000의 판독수를 가질 수 있다.
일 실시양태에서, 각각의 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및/또는 hsa-miR-4532는 마이크로입자에 의해 제조된 세포에 존재하는 것보다 더 높은 판독수로 마이크로입자, 예를 들면 엑소좀에 존재한다. 특히, miR-1246은 통상적으로 마이크로입자에서 세포에서 판독수의 적어도 2배, 더 통상적으로 세포에서 판독수의 적어도 4배, 5배, 6배, 7배 또는 8배 및 임의로 세포에서 판독수의 10배, 15배 또는 20배의 판독수를 갖는다.
일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 마이크로입자를 제조한 세포에 존재하는 더 낮은 판독수에서 hsa-let-7a-5p, has-miR-92b-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-100-5p 및/또는 hsa-99b-5p를 포함한다. 통상적으로, 각각의 이들 miRNA는 본 발명의 마이크로입자에서 1000 미만, 더 통상적으로 100 미만, 예를 들면 50 미만의 판독수를 갖는다. 임의로, 본 발명의 마이크로입자는 50 미만 또는 25 미만의 판독수에서 hsa-let-7a-5p를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 통상적으로 miRNA의 120개 미만의 유형을 딥 서열분석함으로써 분석할 때 miRNA의 150개 미만의 유형(즉, 상이한 miRNA 종)을 포함한다.
일 실시양태에서, hsa-miR-1246은 (임의로 실시예 12에 기재된 딥 서열 기법을 이용하여 결정되는) 본 발명의 마이크로입자에서 가장 풍부한 miRNA이다. 통상적으로, 본 발명의 마이크로입자(예를 들면, 마이크로소포 및 엑소좀)에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 40%는 hsa-miR-1246이다. 통상적으로, 본 발명의 엑소좀에서 miRNA의 전체 수의 적어도 50%는 hsa-miR-1246이다.
hsa-miR-4492는 통상적으로 본 발명의 마이크로입자에서 제2의 가장 풍부한 miRNA이다. 통상적으로, 본 발명의 마이크로입자(예를 들면, 마이크로소포 및 엑소좀)에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 3%는 hsa-miR-4492이다. 더 통상적으로, 본 발명의 마이크로입자(예를 들면, 마이크로소포 및 엑소좀)에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 4%는 hsa-miR-4492이다.
통상적으로, 본 발명의 마이크로입자(예를 들면, 마이크로소포 및 엑소좀)에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 2%는 hsa-miR-4532이다.
통상적으로, 본 발명의 마이크로입자(예를 들면, 마이크로소포 및 엑소좀)에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 1%는 hsa-miR-4488이다.
일 실시양태에서 본 발명의 마이크로입자는 입자의 전체 miRNA 함량 중 적어도 0.1%의 수준으로 hsa-miR-4508, hsa-miR-4516 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
hsa-miR-3676-5p, hsa-miR-4485, hsa-miR-4497, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-3195, hsa-miR-3648, hsa-miR-663b, hsa-miR-3656, hsa-miR-3687, hsa-miR-4466, hsa-miR-4792, hsa-miR-99b-5p 및 hsa-miR-1973 중 하나 이상이 본 발명의 마이크로입자 중에 존재할 수 있다.
통상적으로, 각각의 hsa-let-7a-5p 및 hsa-100-5p는 본 발명의 마이크로입자에서 전체 miRNA 수 중 1% 미만, 더 통상적으로 0.1% 미만 또는 0.05% 미만으로 존재한다.
본 발명의 특정한 엑소좀에서, miRNA의 전체 수 중 적어도 50%는 hsa-miR-1246이고, 전체 miRNA 수 중 0.1% 미만은 hsa-let-7a-5p이다.
일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 90%는 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532를 포함한다. 통상적으로, 본 발명의 마이크로입자에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 95% 또는 96%는 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532를 포함한다. 이들 마이크로입자의 전체 miRNA 함량 중 10% 미만은 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532가 아닌 miRNA이다.
상기 기재된 miRNA 실시양태의 조합이 제공된다. 예를 들면, 본 발명의 마이크로입자는 통상적으로 적어도 1000의 판독수로 각각의 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532를 포함하고, 100 미만의 판독수로 각각의 hsa-let-7a-5p, hsa-miR-92b-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-100-5p 및 hsa-99b-5p를 포함한다. 통상적으로, 이들 마이크로입자에서 전체 miRNA 중 적어도 90% 또는 적어도 95%는 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532이다.
본 발명의 마이크로입자(예를 들면, 마이크로소포 또는 엑소좀)는 통상적으로 가장 풍부한 miRNA로서 hsa-miR-1246을 갖고, hsa-miR-4492는 제2의 가장 풍부한 miRNA이다. 이 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자(예를 들면, 마이크로소포 및 엑소좀)에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 40%는 hsa-miR-1246이고, 마이크로입자에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 3%는 hsa-miR-4492이다. 이들 마이크로입자에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 2%는 hsa-miR-4532이고, 이들 마이크로입자에서 miRNA의 전체 수 중 적어도 1%는 hsa-miR-4488이다. 각각의 hsa-let-7a-5p 및 hsa-100-5p는 이들 마이크로입자에서 전체 miRNA 수 중 0.1% 미만으로 존재한다.
세포와 비교한 상대 배수 변화로서의 엑소좀 및 마이크로소포에서의 딥 서열분석 결과의 플롯팅은 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532가 세포와 비교하여 엑소좀 및 마이크로소포에서 유의적으로 상향조절된다는 것을 확인시켜준다. 이 비교는 또한 miRNA hsa-miR-3195가 엑소좀 및 마이크로소포 둘 다에서 가장 상향조절되는 miRNA라는 것을 나타낸다. hsa-miR-3195의 절대 판독은 엑소좀 및 마이크로소포의 경우 약 40의 범위이지만, 세포에서 hsa-miR-3195가 검출되지 않는다. 따라서, hsa-miR-3195는 본 발명의 엑소좀 및 마이크로소포에서 독특하게 발견되고, 일 실시양태에서, 본 발명의 엑소좀 또는 마이크로소포는 hsa-miR-3195를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 하나 이상의 하기 miRNA 전구체을 포함한다:
AC079949.1(서열 번호 738)
Figure 112014105226690-pct00002

AP000318.1(서열 번호 739)
Figure 112014105226690-pct00003

AL161626.1(서열 번호 740)
Figure 112014105226690-pct00004

AC004943.1(서열 번호 741)
Figure 112014105226690-pct00005

AL121897.1(서열 번호 742)
Figure 112014105226690-pct00006

일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 (실시예 12의 파트 D에 기술된 바대로) 상기 기재된 전구체로부터 유래한 하기 성숙 miRNA 중 1개, 2개 또는 3개를 포함한다:
Figure 112014105226690-pct00007
(AL161626.1-201로부터 유래)(서열 번호 743)
Figure 112014105226690-pct00008
(AP000318.1-201로부터 유래)(서열 번호 744)
Figure 112014105226690-pct00009
(AC079949.1-201로부터 유래)(서열 번호 745)
이들 5개의 miRNA 전구체 및 3개의 성숙 miRNA는 이전에 단리되지 않았고, 각각의 서열은 따라서 또한 특히 새로운 서열로서 제공된다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 miRNA 전구체 AC079949.1, AP000318.1, AL161626.1, AC004943.1 및 AL121897.1 중 하나 이상을 포함하는 조성물 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은
Figure 112014105226690-pct00010
(AL161626.1-201로부터 유래),
Figure 112014105226690-pct00011
(AP000318.1-201로부터 유래) 및
Figure 112014105226690-pct00012
(AC079949.1-201로부터 유래)인 성숙 miRNA 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 임의로, 상기 조성물은 하나 이상의 miRNA 전구체 및/또는 하나 이상의 성숙 miRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이다. 실시예 12에 기재된 바대로, 이들 miRNA 및 전구체는 엑소좀 및 마이크로소포에서 선택적으로 셔틀링되는 것으로 보이고 그래서 마이크로입자의 기능을 적어도 부분적으로 담당할 수 있다.
실시예 12는 또한 신경 줄기 세포 마이크로입자가 다양한 비코딩 RNA 종을 포함한다는 것을 나타낸다. 일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 하나 이상의 리보솜 RNA, 작은 핵 RNA, 작은 핵 RNA, 마이크로RNA, 큰 유전자간 비코딩 RNA 및 기타 다른 RNA(예를 들면, RMRP, 볼트(vault) RNA, 후생동물 SRP 및/또는 RNY)를 포함한다.
실시예 4는 CTX0E03 세포에 의해 제조되고 qRT-PCR 어레이에 의해 결정된 35 미만의 Cp를 갖는 마이크로입자에 존재하는 miRNA를 나타낸다. 통상적으로, 일 실시양태에서 본 발명의 마이크로입자는 (Ambros 등에 따른 명칭에 따라 확인되고 www.mirbase.org에서 접근 가능한) 하기 miRNA 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 이상 또는 모두를 포함한다:
Figure 112014105226690-pct00013

Figure 112014105226690-pct00014

Figure 112014105226690-pct00015

실시양태에서, CTX0E03 마이크로입자는 (상기 목록으로부터 선택된) 하기 miRNA 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 또는 그 이상을 포함한다:
Figure 112014105226690-pct00016

Figure 112014105226690-pct00017

점 블롯에 의해 검출된 단백질
실시예 5는 점 블롯에 의해 검출된 CTX0E03 세포에 의해 제조된 마이크로입자에 존재하는 단백질을 나타낸다. 통상적으로, 본 발명의 마이크로입자는 하기 단백질 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 모두를 포함한다:
Figure 112014105226690-pct00018

갈렉틴-3 및 트롬보스폰딘-1은 또한 실시예 13에서 엑소좀 및 마이크로소포에 존재하는 것으로 확인된다. TIMP-1은 실시예 13에서 엑소좀에 존재하는 것으로 확인된다.
실시예 5는 또한 CTX0E03 세포에 의해 제조된 마이크로입자가 또한 하기 단백질 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 발현할 수 있다는 것을 나타낸다:
Figure 112014105226690-pct00019

EGF-R 및 Csk는 또한 실시예 13에서 엑소좀 및 마이크로소포 중에 존재하는 것으로 확인된다.
갈렉틴-3, SPARC, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, VEGF, MDC 및 엔도스타틴은 신생혈관생성을 조절하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 하나 이상의 이들 단백질을 포함하는 마이크로입자는 신생혈관생성의 조절을 요하는 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용하다.
IL-1a, LECT2, MCP-1 및 Csk는 염증을 조절하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 하나 이상의 이들 단백질을 포함하는 마이크로입자는 염증의 조절을 요하는 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용하다.
(ⅰ) 갈렉틴-3, SPARC, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, VEGF, MDC 및 엔도스타틴 중 하나 이상 및 (ⅱ) IL-1 a, LECT2, MCP-1 및 Csk 중 하나 이상을 포함하는 마이크로입자는 신생혈관생성 및 염증의 조절을 요하는 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용할 수 있다.
다구획 생물반응기 배양에서의 신경 줄기 세포
하기 실시예 10 및 도 9에 기재된 바대로, 3주 동안 다구획 생물반응기 배양 후, 신경 줄기 세포는 표준 단일 구획 T175 플라스크에서 표준 절차에 따라 배양된 신경 줄기 세포보다 유의적으로 높은 수준에서 다수의 마커를 발현한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 적어도 2주, 통상적으로 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주 또는 적어도 6주 동안 통상적으로 다구획 생물반응기에서 배양된 NSC로부터 단리된다. 임의로, NSC는 10주 이하, 예를 들면 2주 내지 10주, 3주 내지 10주, 4주 내지 10주, 5주 내지 10주 또는 6주 내지 10주 동안 배양된다.
다구획 생물반응기에서 3주 동안 배양된 CTX0E03 신경 줄기 세포는 표준 단일 구획 T175 세포 배양에서 배양된 신경 줄기 세포보다 높은 수준에서 DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF 및 IDO를 발현한다. 따라서, 통상적으로 2주 이상, 10주 이상, 2주 이상 또는 적어도 3주, 4주, 5주 이상 동안 다구획 생물반응기에서 배양된 신경 줄기 세포는 DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF 및 IDO 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 2구획 생물반응기에서 배양된 세포는 통상적으로 표준 조건 하에 배양된 줄기 세포와 비교하여 DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF 및 IDO 중 하나 이상의 발현 증가를 나타낸다. 다구획 생물반응기 배양된 세포에서 이들 마커의 발현 수준은 통상적으로 표준 단일 구획 T175 배양 플라스크에서 배양된 세포보다 유의적으로 높다. 통상적으로, 다구획 생물반응기에서 배양된 줄기 세포는 표준 배양 절차에 따라 T-175 플라스크에서 배양된 CTX0E03 세포에서 적어도 2배 높은 수준으로 DCX1, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF 또는 IDO 중 하나 이상을 발현한다. 일 실시양태에서, 표준 조건 하에 배양된 줄기 세포와 비교하여 DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF 및 IDO 중 하나 이상의 발현 증가를 나타내는 신경 줄기 세포로부터 마이크로입자, 통상적으로 엑소좀을 얻는다. 예를 들면, 인테그라 셀라인 생물반응기 배양된 신경 줄기 세포로부터 수집된 새로 여과된 조정 배지로부터 마이크로입자를 얻을 수 있다.
상향조절된 마커는 DCX(더블코르틴 - 초기 뉴런 마커), GFAP(신경교섬유질 산성 단백질 - 성상교세포 마커), GALC, TUBB3, GDNF 및 IDO를 포함한다. CTX0E03 세포는 뉴런, 성상교세포 및 희소돌기아교세포s의 3개의 상이한 세포 유형으로 분화할 수 있다. 다구획 생물반응기에서의 3주 후 DCX 및 GFAP의 높은 수준은 배양된 줄기 세포가 부분적으로 분화하고 뉴런(DCX+ 세포) 및/또는 성상교세포(GFAP+ 세포) 계통에 진입한다는 것을 나타낸다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 (ⅰ) 뉴런 계통, 통상적으로 DCX와 관련된 하나 이상의 마커 및/또는 (ⅱ) 성상교세포 계통, 통상적으로 GFAP와 관련된 하나 이상의 마커를 발현하는 신경 줄기 세포 집단에 의해 제조된 마이크로입자를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 (ⅰ) 뉴런 계통, 통상적으로 DCX와 관련된 하나 이상의 마커 및/또는 (ⅱ) 성상교세포 계통, 통상적으로 GFAP와 관련된 하나 이상의 마커를 발현하는 신경 줄기 세포 마이크로입자, 통상적으로 엑소좀을 제공한다. 이들 세포로부터 유래한 이들 세포 또는 마이크로입자(통상적으로 엑소좀)는 표준(T-175) 배양에서 상응하는 줄기 세포보다 높은 수준으로 DCX 및/또는 GFAP를 발현한다. 통상적으로, 이들 세포 또는 마이크로입자는 줄기 세포보다 적어도 2배, 더 통상적으로 표준 배양에서 상응하는 줄기 세포보다 적어도 2.5배, 표준 배양에서 상응하는 줄기 세포보다 적어도 5배, 표준 배양에서 상응하는 줄기 세포보다 적어도 7.5배 또는 표준 배양에서 상응하는 줄기 세포보다 적어도 10배의 수준으로 DCX 및/또는 GFAP를 발현한다. DCX의 발현을 위해, 표준(T-175) 배양에서 상응하는 줄기 세포와 비교하여 세포 또는 마이크로입자의 배수 증가는 임의로 표준 줄기 세포보다 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배 또는 적어도 1000배일 수 있다.
용어 "생물반응기"는 당해 분야에서 이의 일반적인 의미, 즉 생물과정을 수행하도록 사용되는 장치인 의미가 제공된다. 본원에 기재된 생물반응기는 줄기 세포 배양에서 사용하기에 적합하다. 세포 배양을 위한 단순한 생물반응기는 단일 구획 플라스크, 예컨대 통상 사용되는 T-175 플라스크(예를 들면, BD 팔콘(Falcon)(상표명) 175㎠ 배양 플라스크, 750㎖, 조직-배양 처리된 폴리스티렌, 직선 목, 청색 플러그-시일(plug-seal) 스크루 캡, BD 제품 코드 353028)이다. 생물반응기는 당해 분야에 공지된 바대로 다수의 구획을 가질 수 있다. 이들 다구획 생물반응기는 통상적으로 가스 및/또는 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 구획으로부터 세포를 포함하는 구획을 분리시키는 하나 이상의 막 또는 장벽에 의해 분리된 적어도 2개의 구획을 포함한다. 다구획 생물반응기는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 다구획 생물반응기의 예는 인테그라 셀라인 생물반응기이고, 이는 10kDa 반투과성 막에 의해 분리된 세포 구획 및 배지 구획을 포함하고; 이 막은 임의의 억제 폐기물의 동시 제거와 함께 세포 구획으로의 영양소들의 연속 확산을 허용한다. 구획의 개별 접근성은 배양을 기계적으로 방해하지 않으면서 세포에 새로운 배지를 공급하도록 한다. 실리콘 막은 세포 구획 베이스를 형성하고 세포 구획으로의 짧은 확산 경로를 제공함으로써 이산화탄소 수준의 제어 및 최적 산소 공급을 제공한다. 본 발명에 따라 임의의 다구획 생물반응기를 사용할 수 있다.
실시예 11, 표 3 및 도 10은 3주 동안 다구획 생물반응기에서 배양된 신경 줄기 세포에 의해 제조된 엑소좀의 miRNA 함량이 3주 동안 단일 구획 T175 배양 플라스크에서 배양된 신경 줄기 세포에 의해 제조된 마이크로입자 및 표준 T-175 플라스크에서 배양된 줄기 세포의 miRNA 함량과 다르다는 것을 나타낸다. 일 실시양태에서, 본 발명은 마이크로입자, 통상적으로 엑소좀을 제공하고, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 miRNA는 배수 조절에 의해 계산된 바대로 표준 T-175 플라스크에서 배양된 상응하는 줄기 세포와 비교하여 상향 또는 하향 조절된다(실시예 11 참조). 각각의 miRNA의 배수 조절은 임의로 적어도 2배 상향 또는 하향이다.
도 6c 및 실시예 8로부터, NSC가 7주 동안 배양될 때 NSC로부터 단리된 엑소좀은 특히 놀라운 효율을 나타낸다는 것을 볼 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 엑소좀은 적어도 2주, 통상적으로 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주 또는 적어도 6주 동안 통상적으로 다구획 생물반응기에서 배양된 NSC로부터 단리된다. 임의로, NSC는 10주 이하, 예를 들면 2주 내지 10주, 3주 내지 10주, 4주 내지 10주, 5주 내지 10주 또는 6주 내지 10주 동안 배양된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 신경 줄기 세포 엑소좀은 배수 조절에 의해 계산된 바대로 표준 T-175 플라스크에서 배양된 상응하는 줄기 세포에서 발현된 것보다 높은 수준에서 하기 miRNA 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개를 발현한다(여기서, 별표는 적어도 2배 조절 증가가 바람직한 miRNA를 나타냄):
Figure 112014105226690-pct00020

일 실시양태에서, 본 발명의 신경 줄기 세포 엑소좀은 배수 조절에 의해 계산된 바대로 표준 T-175 플라스크에서 배양된 상응하는 줄기 세포에서 발현된 것보다 낮은 수준에서 하기 miRNA 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상을 발현한다(여기서, 별표는 적어도 2배 조절 감소가 바람직한 miRNA를 나타냄):
Figure 112014105226690-pct00021

추가의 실시양태에서, 본 발명의 NSC 엑소좀은 (ⅰ) 상응하는 세포 in 표준 배양과 비교하여 엑소좀에서 증가한 상기 기재된 miRNA 중 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 수준 증가 및 (ⅱ) 표준 배양에서 상응하는 세포와 비교하여 엑소좀에서 감소한 상기 기재된 miRNA 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 수준 감소를 포함한다. 예를 들면, 신경 줄기 세포 엑소좀은 표준 배양에서 상응하는 세포와 비교하여 엑소좀에서 증가한 상기 기재된 miRNA 중 3개 이상의 배수 조절 증가 및 표준 배양에서 상응하는 세포와 비교하여 엑소좀에서 감소한 상기 기재된 miRNA 중 3개 이상의 배수 조절 감소를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 실시양태에서, 신경 줄기 세포 엑소좀은 표준 배양에서 상응하는 세포와 비교하여 엑소좀에서 증가한 상기 기재된 miRNA 중 5개 이상의 배수 조절 증가 및 표준 배양에서 상응하는 세포와 비교하여 엑소좀에서 감소한 상기 기재된 miRNA 중 5개 이상의 배수 조절 감소를 포함할 수 있다.
용어 "발현된"은 세포 또는 마이크로입자 내에 마커의 존재를 기술하기 위해 이용된다. 발현되는 것으로 생각되기 위해, 마커는 검출 가능한 수준으로 존재해야 한다. "검출 가능한 수준"은 표준 실험실 방법론, 예컨대 qRT-PCR 또는 qPCR, 블로팅, 질량 분광광도법 또는 FACS 분석 중 하나를 이용하여 마커가 검출될 수 있다는 것을 의미한다. 발현이 35 이하의 교차점(cp) 값에서 합당하게 검출될 수 있는 경우 유전자는 본 발명의 집단의 세포 또는 마이크로입자에 의해 발현되는 것으로 생각된다. 용어 "발현한다" 및 "발현"은 상응하는 의미를 갖는다. 이 cp 값 미만의 발현 수준에서, 마커는 발현되는 것으로 생각된다. 동일한 종으로부터 단리된 2개의 세포/마이크로입자 유형과 비교함으로써, 본 발명의 줄기 세포 또는 마이크로입자에서의 마커의 발현 수준과 다른 세포 또는 마이크로입자, 예를 들면 중간엽 줄기 세포에서의 동일한 마커의 발현 수준의 비교를 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 이들 종들은 포유동물이고, 더 바람직하게는 이들 종들은 인간이다. 역전사효소 중합효소 사슬 반응(RT-PCR) 실험을 이용하여 이러한 비교를 편리하게 수행할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유의적인 발현" 또는 이의 동등한 용어 "양성" 및 "+"는, 마커와 관련하여 사용될 때, 세포 또는 마이크로입자 집단에서, 세포/마이크로입자의 20% 초과, 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 98%, 99% 초과 또는 심지어 모든 세포가 상기 마커를 발현한다는 것을 의미하도록 취해져야 한다.
본원에 사용된, "음성" 또는 "-"는, 마커와 관련하여 사용될 때, 세포 또는 마이크로입자 집단에서, 세포/마이크로입자의 20%, 10% 미만, 바람직하게는 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 상기 마커를 발현하거나 어떤 것도 발현하지 않는다는 것을 의미하도록 취해져야 한다.
특이적 마이크로입자 표면 마커에 대한 신호가 배경 신호보다 큰지를 결정하기 위해 종래의 방법 및 장치(예를 들면, 당해 분야에 공지된 상업적으로 구입 가능한 항체 및 표준 프로토콜과 사용되는 베크만 코울터 에픽스 시스템(Beckman Coulter Epics) XL FACS system)을 이용하여 예를 들면 유세포분석법 및/또는 FACS에 의해 특이적 세포 표면 마커에 대한 마이크로입자 표면 마커의 발현을 결정할 수 있다. 배경 신호는 각각의 표면 마커를 검출하기 위해 사용된 특이적 항체와 동일한 아이소유형의 비특이적 항체에 의해 생성된 신호 강도로서 정의된다. 마커가 양성으로 생각되기 위해, 관찰된 특이적 신호는 배경 신호 강도에 비해 통상적으로 20% 초과, 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 500%, 1000%, 5000%, 10000% 이상 강하다. 관심 있는 마이크로입자 표면 마커의 발현을 분석하는 대안적인 방법은 관심 있는 세포-표면 마커에 대한 항체을 이용한 전자 분광법에 의한 육안 분석을 포함한다.
"형광 활성화 세포 분류(FACS)"는 형광 표지된 항체의 사용에 기초한 세포 정제 방법이다. 항체는 세포 표면 상의 마커에 지시되고 따라서 관심 있는 세포에 결합한다. 이후, 세포의 형광 방출 피크에 기초하여 세포를 분리한다.
겔 전기영동 이후 적합한 항체에 의한 웨스턴 블로팅, 면역침전 이후 전기영동 분석 및/또는 상기 기재된 바와 같은 전자 분광법과 함께 입자내 마커에 대한 마이크로입자 침투(permeabilisation)(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 단백질 발현을 평가하기 위해 당해 분야의 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 마이크로입자 마커(표면 및 세포내 단백질을 포함)를 또한 분석할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법 또는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법 중 하나 이상을 이용하여 하나 이상의 테트라스파닌의 발현을 평가할 수 있다. 예를 들면, qRT-PCR에 의해 RNA 수준을 또한 분석하여 마커 발현을 평가할 수 있다.
마이크로입자 기능
기재된 바대로, 신경 줄기 세포 마이크로입자는 이것이 유래한 줄기 세포의 적어도 하나의 생물학적 기능을 보유한다. 보유될 수 있는 생물학적 기능은 신생혈관생성, 조직 재생, 조직 복구 및/또는 신경생성을 촉진하는 능력, 뇌졸중을 겪은 환자의 뇌에서 인지 개선을 실행하는 능력 또는 말초 동맥 질환에서 혈류 회복을 가속시키는 능력을 포함한다.
예를 들면, CTX0E03 세포는 PBMC 검정에서 T 세포 활성화를 억제하는 것으로 공지되어 있고, 일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로입자는 PBMC 검정에서 T 세포 활성화를 억제하는 이의 능력을 보유한다. PBMC 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 검정을 수행하는 키트는 상업적으로 구입 가능하다.
실시예 8, 표 2 및 도 6은 CTX0E03 줄기 세포 엑소좀이 상처 치유의 "스크래치" 모델에서 상처를 봉합하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다. 이 결과는 CTX0E03 조정 배지에서 배양된 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)의 이동 활성이 정제된 엑소좀의 첨가에서 관찰된 이동 활성과 거의 동일하다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 마이크로입자가 보유할 수 있는 하나의 생물학적 기능은 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)의 이동 활성을 자극하는 능력이다. NHDF 이동 검정은 당해 분야에 공지되어 있다. 실시예 8(A)의 검정과 같은 실험실내 스크래치(상처 봉합) 검정을 이용하여 NHDF 이동의 자극을 결정할 수 있다. 상처 봉합은 0시간에 결정된 초기 상처 면적에 대한 NHDF 세포에 의해 덮인 면적으로서 계산된다. 이 검정에서 NHDF 이동의 자극은 통상적으로 상처 봉합 증가, 통상적으로 24시간 후 기준 조건(마이크로입자 없음) 하의 상처 봉합보다 적어도 1.2배 큰, 더 통상적으로 적어도 1.5배 큰 상처 봉합으로 정의된다. 48시간 후, 상처 봉합은 기준 조건(마이크로입자 없음) 하의 상처 봉합보다 통상적으로 적어도 1.2배 크거나 1.5배 크거나, 더 통상적으로 적어도 2배 크다. NHDF 이동의 자극은 100% 상처 봉합이 기준 조건 하에 관찰되기 적어도 24시간 전에, 스크래치 검정에 의해 결정되는, 100%의 상처 봉합을 발생시키는 것으로 또한 정의될 수 있다.
실시예 8은 본 발명의 마이크로소포가 1차 HUVEC의 신생혈관생성을 자극하고 PC-12 세포의 신경돌기 생육을 자극할 수 있다는 것을 또한 나타낸다. 따라서, 본 발명의 마이크로입자가 보유할 수 있는 생물학적 기능은 1차 HUVEC의 신생혈관생성을 자극하고/하거나 PC-12 세포의 신경돌기 생육을 자극하는 능력이다. 신생혈관생성 및 신경돌기 생육 검정은 당해 분야에 공지되어 있다. 관 길이 및 분기점의 ibidi 마이크로마이크로-슬라이드를 이용한 24시간 신생혈관생성 검정 및 Wimtube 검출 및 분석, 예를 들면 실시예 8(B)의 검정을 이용하여 1차 HUVEC의 신생혈관생성의 자극을 결정할 수 있다. 이 검정에서의 신생혈관생성의 자극은 통상적으로 기준 신생혈관생성과 비교한 증가, 예를 들면 100% 초과의 기준 신생혈관생성, 통상적으로 적어도 110%, 적어도 120% 또는 적어도 140%의 기준 신생혈관생성(즉, 신생혈관생성의 기준 수준의 적어도 1.1배, 적어도 1.2배 또는 적어도 1.4배)으로서 정의된다. 1㎛ 삽입, 예를 들면 실시예 8(C)의 검정을 통해 PC-12 세포의 생육을 검출함으로써 신경돌기 생육의 자극을 결정할 수 있다. 이 검정에서의 신경돌기 생육의 자극은 통상적으로 (마이크로입자가 없는) 기준 조건과 비교한 신경돌기 생육 증가 또는 분광광도계에 의해 정량화되는 것처럼 마이크로입자가 NGF 단독의 첨가와 비교하여 NGF와 조합될 때의 신경돌기 생육 증가로서 정의된다.
실시예 13에서의 단백질체 분석은 신경 줄기 세포 엑소좀이 유전 재료의 생성, 충전, 기능 및 분해와 관련된 생물학적 기능을 포함한다는 것을 나타낸다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 엑소좀은 3개의 기능, 통상적으로 하나 이상의 RNA 중합효소 기능, RNA 분해 기능, 리보솜 기능 및 스플라스좀 기능을 보유한다.
면역원성
본 발명의 (동종이계) 신경 줄기 세포 마이크로입자는 통상적으로 실험실내 또는 생체내 면역 반응을 촉발하거나 환자에게 동종이계 줄기 세포 집단의 주사 시 촉발할 것으로 예상된 것보다 실질적으로 약한 면역 반응을 촉발하지 않는다. 본 발명의 특정한 양태들에서, 적어도 약 70%의 마이크로입자가 면역 반응을 촉발하지 않는 경우 신경 줄기 세포 마이크로입자는 면역 반응을 촉발하는 것으로 생각되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%, 99% 이상의 마이크로입자가 면역 반응을 촉발하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 마이크로입자는 항체 매개 면역 반응을 촉발하지 않거나 체액 면역 반응을 촉발하지 않는다. 더 바람직하게는, 본 발명의 마이크로입자는 실험실내 항체 매개 반응 또는 체액 면역 반응을 촉발하지 않는다. 훨씬 더 바람직하게는, 본 발명의 마이크로입자는 혼합 림프구 면역 반응을 촉발하지 않는다. 당해 분야의 당업자는 면역 반응을 촉발하는 본 발명의 세포의 능력이 다양한 방식으로 시험될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
하지 허혈의 설치류 모델에 이식된 CTX0E03 세포는 비히클 치료군과 비교하여 신생혈관생성에 관여된 숙주 유전자들, 예컨대 CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL5, IGF1, ILβ, IL6, HGF, HIF1α, bFGF, VEGFA 및 VEGFC의 더 빠르고 일시적인 상향 조절이 이전에 입증되었다. hNSC 치료는 일시적으로 숙주 선천성 면역 및 혈관형성 반응을 상승시키고 조직 재생을 촉진한다.
CTX0E03 세포주는 인간 PBMC 검정을 이용하여, 면역원성이 아닌 것으로 이전에 입증되었다. 따라서, CTX0E03 세포에 의해 제조된 마이크로입자는 또한 비면역원성인 것으로 예상된다. 면역원성 결여는 마이크로입자가 숙주/환자 면역계에 의한 청소를 피하도록 하고 이에 의해 해로운 면역 및 염증성 반응 없이 이들의 치료학적 효과를 발휘한다.
신경 줄기 세포
마이크로입자를 제조하는 신경 줄기 세포는 줄기 세포주, 즉 안정하게 분열하는 줄기 세포의 배양물일 수 있다. 줄기 세포주는 단일의 한정된 소스를 사용하여 다량으로 성장될 수 있다. 불멸화는 자발 사건으로부터 발생하거나 불멸화 인자들을 코딩하는 줄기 세포로 외인성 유전 정보를 도입함으로써 성취될 수 있어서, 적합한 배양 조건 하에 줄기 세포의 비제한된 세포 성장을 발생시킨다. 이러한 외인성 유전 인자는 전사 인자 Myc를 코딩하는 유전자 "myc"를 포함할 수 있다. 외인성 유전 정보는 형질주입 또는 형질도입과 같은 다양한 적합한 방식을 통해 줄기 세포로 도입될 수 있다. 형질도입의 경우, 레트로바이러스, 예를 들면 렌티바이러스로부터 유래한 것과 같은 유전 조작 바이러스 비히클을 사용할 수 있다.
치료학적으로 효과적인 마이크로입자의 생성에 부정적으로 영향을 미치는 일 없이 불멸화 인자의 발현이 조절될 수 있는 조건 불멸화 줄기 세포주를 사용하여 추가의 이점을 획득할 수 있다. 세포에 활성화제가 제공되지 않는 경우, 불활성인 불멸화 인자를 도입함으로써 이를 성취할 수 있다. 이러한 불멸화 인자는 유전자 예컨대 c-mycER일 수 있다. c-MycER 유전자 생성물은 돌연변이체 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 도메인에 융합된 c-Myc 변이체를 포함하는 융합 단백질이다. C-MycER만이 합성 스테로이드 4-하이드록시타목시펜(4-OHT)의 존재 하에 세포 증식을 추진한다(Littlewood et al. 1995). 이 접근법은 신경 줄기 세포주로부터 유래한 마이크로입자에서 c-Myc 또는 이를 코딩하는 유전자의 존래로 인해 숙주 세포 증식(예를 들면, 종양 형성)에 대한 원치 않는 생체내 효과를 피하면서 실험실내 신경 줄기 세포의 제어 증식을 허용한다. 적합한 c-mycER 조건 불멸화 신경 줄기 세포는 미국 특허 7416888에 기재되어 있다. 조건 불멸화 신경 줄기 세포주의 사용은 따라서 기존의 줄기 세포 마이크로입자 단리 및 생성에 비해 개선을 제공한다.
바람직한 조건 불활화 세포주는 CTX0E03, STR0C05 및 HPC0A07 신경 줄기 세포주를 포함하고, 이들은 수탁 번호 04091601(CTX0E03); 수탁 번호 04110301(STR0C05); 및 수탁 번호 04092302(HPC0A07)로 European Collection of Animal Cultures(ECACC), Vaccine Research and Production laboratories, Public Health Laboratory Services(Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG 소재)에 기탁되었다.
이들 세포의 유래 및 기원은 EP1645626 B1에 기재되어 있다. 이들 세포의 이점은 이들 세포에 의해 제조된 마이크로입자에 의해 보유된다.
CTX0E03 세포주의 세포는 하기 배양 조건 하에 배양될 수 있다:
ㆍ 인간 혈청 알부민 0.03%
ㆍ 트랜스페린, 인간 5㎍/㎖
ㆍ 푸트레신 다이하이드로클로라이드 16.2㎍/㎖
ㆍ 인슐린 인간 재조합 5㎍/㎖
ㆍ 프로게스테론 60ng/㎖
ㆍ L-글루타민 2mM
ㆍ 나트륨 셀레네이트(셀레늄) 40ng/㎖
세포 증식을 위해, 염기성 섬유아세포 성장 인자(10ng/㎖), 표피 성장 인자(20ng/㎖) 및 4-하이드록시타목시펜 100nM 추가. 세포는 4-하이드록시타목시펜의 제거에 의해 분화될 수 있다. 통상적으로, 세포는 5% C02/37℃에서 또는 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 02의 저산소 조건 하에 배양될 수 있다. 이들 세포주는 혈청이 연속 배양될 것을 요하지 않는다. 혈청은 많은 세포주의 성공적인 배양에 필요하지만, 그 자체의 엑소좀을 비롯하여 많은 오염물질을 포함한다. CTX0E03, STR0C05 또는 HPC0A07 신경 줄기 세포주 또는 혈청을 요하지 않는 임의의 다른 세포주의 추가의 이점은 혈청에 의한 오염이 회피된다는 것이다.
CTX0E03 세포주의 세포(및 이들 세포로부터 유래한 마이크로입자)는 12주 인간 태아 피질로부터 원래 유래한 다분화능 세포이다. CTX0E03 세포주에 대한 단리, 제조 및 프로토콜은 Sinden 등에 의해 자세히 기재되어 있다(미국 특허 7,416,888 및 EP1645626 B1). CTX0E03 세포는 "배아 줄기 세포"가 아니고, 즉 이들은 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래한 다능성 세포가 아니고; 원래의 세포의 단리는 배아의 파괴를 발생시키지 않는다.
CTX0E03 세포(및 이들 세포로부터 유래한 마이크로입자)는 혈관형성이고, 그래서 신생혈관생성을 요하는 질환, 예컨대 말초 동맥 질환을 치료하는 데 유용하다. 이들 세포(및 이들 세포로부터 유래한 마이크로입자)는 또한 신경인성이고, 따라서 신경생성을 요하는 질환, 예컨대 허혈(뇌졸중) 손상 뇌를 치료하는 데 유용하다. CTX0E03은 레트로바이러스 감염에 의해 전달된 c-mycER 전이유전자의 단일 카피를 포함하고 4-OHT(4-하이드록시타목시펜)에 의해 조건 조절되는 클론 세포주이다. C-mycER 전이유전자는 4-OHT의 존재 하에 세포 증식을 자극하는 융합 단백질을 발현하고 따라서 4-OHT의 존재 하에 배양될 때 제어된 증식을 허용한다. 이 세포주는 클론성이고, 배양에서 신속히 증식하고(배가 시간 50-60시간), 정상 인간 핵형(46 XY)을 갖는다. 이는 유전적으로 안정하고 다수로 성장될 수 있다.
세포는 안전하고 비발암성이다. 성장 인자 및 4-OHT의 부재 하에, 세포는 성장 정지를 겪고 성상교세포로 분화한다. 허혈 손상 뇌로 이식되면, 이들 세포는 조직 손상의 부위로만 이동한다.
CTX0E03 세포주의 개발은 임상 용도를 위해 일정한 생성물의 규모 확대를 허용한다. 뱅킹된 물질로부터 세포의 생성은 상업적 용도를 위한 분량으로 세포의 생성을 허용한다(Hodges et al, 2007).
Pollock 등(2006)은 뇌졸중(MCAo)의 랫트 모델에서 CTX0E03의 이식이 이식 6-12주 후 감각운동 기능 및 큰 이동 비대칭 둘 다의 통계학적으로 유의적인 개선을 발생시킨다고 기술한다. 이들 데이터는 CTX0E03이 치료학적 세포주로서 개발에 필요한 적절한 생물학적 및 제조 특징을 갖는다는 것을 나타낸다.
Stevanato 등(2009)은 CTX0E03 세포가 MCAo 랫트 모델에서 EGF, bFGF 및 4-OHT 배출 후 실험실내 및 이식 후 생체내 둘 다에서 c-mycERTAM 전이유전자 발현을 하향 조절한다는 것을 확인시켜준다. c-mycERTAM 전이유전자의 침묵화는 생체내 잠재적 임상 분야를 위한 CTX0E03 세포의 추가의 안전성 특징을 제공한다.
Smith 등(2012)은 뇌졸중(일시적인 중대뇌동맥경색 폐색)의 랫트 모델에서 CTX0E03의 전임상 효율 시험을 기술한다. 이 결과는 CTX0E03 이식이 3달 프레임에 걸쳐 거동 이상을 확고히 회복하고 이 효과가 이의 이식 자리에 구체화된다는 것을 나타낸다. 병소 토폴로지는 잠재적으로 회복에서 중요한 인자이고, 뇌졸중은 더 큰 손상 부위와 비교하여 더 우수한 결과를 나타내는 선조체에 국한된다.
(예를 들면, US 7514259에 기재된) 신경 망막 줄기 세포주는 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
용어 "배양 배지" 또는 "배지"는 당해 분야에서 인식되고 일반적으로 살아 있는 세포의 배양에 사용되는 임의의 물질 또는 제제를 의미한다. 용어 "배지"는, 세포 배양과 관련하여 사용될 때, 세포를 둘러싸는 환경의 성분들을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 가스 또는 상 및 물질의 혼합물일 수 있다. 배지는 액체 성장 배지, 및 세포 성장을 지속하지 못하는 액체 배지를 포함한다. 배지는 또한 교질 배지, 예컨대 한천, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 기질을 포함한다. 예시적인 가스 배지는 페트리 접시 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체에서 성장하는 세포가 노출되는 기상을 포함한다. 용어 "배지"는 또한 세포와 접촉하지 않더라도 세포 배양에서 사용되도록 의도되는 물질을 의미한다. 즉, 박테리아 배양에 준비된 영양소 농후 액체는 배지이다. 유사하게, 물 또는 다른 액체와 혼합될 때 세포 배양에 적합하게 되는 분말 혼합물은 "분말화 배지"라 칭할 수 있다. "제한 배지"는 화학적으로 제한된(일반적으로 정제된) 성분으로 이루어진 배지를 의미한다. "제한 배지"는 불량하게 규명된 생물학적 추출물, 예컨대 효모 추출물 및 소 브로쓰(broth)를 포함하지 않는다. "농후 배지"는 특정 종의 대부분 또는 모든 생육 가능한 형태들의 성장을 지지하도록 설계된 배지를 포함한다. 농후 배지는 대개 복잡한 생물학적 추출물을 포함한다. "고밀도 배양의 성장에 적합한 배지"는 다른 조건(예컨대, 온도 및 산소 운반 속도)이 이러한 성장을 허용할 때 세포 배양물이 3 이상의 OD600에 도달하게 하는 임의의 배지이다. 용어 "기본 배지"는 임의의 특수 영양소 보충물들을 요하지 않는 많은 유형의 마이크로유기체들의 성장을 촉진하는 배지를 의미한다. 대부분의 기본 배지는 일반적으로 아미노산, 탄수화물, 무기 염 및 비타민의 4가지 염기성 화학 기를 포함한다. 기본 배지는 일반적으로 보충물, 예컨대 혈청, 완충제, 성장 인자, 지질 등이 첨가되는 더 복잡한 배지에 대한 기초로 작용한다. 일 양태에서, 성장 배지는 본 발명의 세포의 자가 재생 능력을 유지하면서 이들의 성장 및 증식을 지지하기 위해 필요한 성장 인자를 갖는 복잡한 배지일 수 있다. 기본 배지의 예는 이글 기본 배지, 최소 필수 배지, 둘베코 변형 이글 배지, 배지 199, 영양소 혼합물 햄 F-10 및 햄 F-12, 맥코이(McCoy) 5A, 둘베코 MEM/F-I 2, RPMI 1640 및 이스코브(Iscove) 변형 둘베코 배지(IMDM)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
약제학적 조성물
본 발명의 신경 줄기 세포 마이크로입자는 치료에 유용하고, 따라서 약제학적 조성물로서 제제화된다. 약제학적으로 허용되는 조성물은 통상적으로 본 발명의 마이크로입자 이외에 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 비히클 및/또는 부형제를 포함한다. 적합한 담체의 예는 링거 락테이트 용액이다. 이러한 성분들의 완전한 기술은 문헌[Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472]에 제공된다.
구절 "약제학적으로 허용되는"은 본원에서, 합당한 의학 판단의 범위 내에, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제점 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합당한 이익/위험 비율에 알맞은 이들 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제형을 의미하도록 이용된다.
조성물은, 원하는 경우, 또한 소량의 pH 완충제를 포함할 수 있다. 담체는 바이오라이프 솔루션즈 인크. 유에스에이(BioLife Solutions Inc., USA)로부터 상업적으로 구입 가능한 하이포써모솔(Hypothermosol)(등록상표)과 같은 저장 매질을 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E W Martin]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 피험체에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공하도록 적합한 양의 담체와 함께 바람직하게는 정제된 형태의 예방학적 또는 치료학적 유효량의 예방학적 또는 치료학적 마이크로입자를 포함한다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 바람직한 실시양태에서, 약제학적 조성물은 무균이고 피험체, 바람직하게는 동물 피험체, 더 바람직하게는 포유동물 피험체, 가장 바람직하게는 인간 피험체에 대한 투여에 적합한 형태이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 형태들일 수 있다. 이들은 예를 들면 반고체 및 액체 제형, 예컨대 동결건조 제제, 액체 용액 또는 현탄액, 주사용 및 점적용 용액을 포함한다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 주사용이다. 본 발명의 마이크로입자의 특정한 이점은 이들이 얻어진 줄기 세포와 비교하여 이들의 개선된 견고성이고; 마이크로입자는 따라서 줄기 세포에 적합하지 않은 제제, 예컨대 동결건조물로 처리될 수 있다.
본 발명의 방법, 약제 및 조성물은 손상 조직의 치료 또는 복구 및/또는 조직 장애와 관련된 하나 이상의 증상들의 치료, 조절, 예방 및/또는 경감에 사용되는 것이 바람직하다. 재생 치료, 통상적으로 뇌졸중, 말초 동맥 질환 또는 망막의 실명 유발 질환의 치료에서 본 발명의 방법, 약제, 조성물 및 마이크로입자의 사용이 특히 바람직하다.
약제학적 조성물은 일반적으로 수성 형태이다. 조성물은 보존제 및/또는 항산화제를 포함할 수 있다.
등장성을 제어하기 위해, 약제학적 조성물은 생리학적 염, 예컨대 나트륨염을 포함할 수 있다. 염화나트륨(NaCl)이 바람직하고, 이는 1 내지 20㎎/㎖로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산이나트륨 무수물, 염화마그네슘 및 염화칼슘을 포함한다.
조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 특정한 완충제는 인산염 완충제; 트라이스 완충제; 붕산염 완충제; 숙신산염 완충제; 히스티딘 완충제; 또는 시트르산염 완충제를 포함한다. 완충제는 통상적으로 5-20mM 범위의 농도로 포함된다. 조성물의 pH는 일반적으로 5 내지 8, 더 통상적으로 6 내지 8, 예를 들면 6.5 내지 7.5 또는 7.0 내지 7.8이다.
조성물은 바람직하게는 무균이다. 조성물은 바람직하게는 글루텐 비함유이다. 조성물은 바람직하게는 비발열성이다.
특정한 실시양태에서, 마이크로입자는 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산(트롤록스(Trolox)(등록상표), Na+, K+, Ca2 +, Mg2 +, Cl-, H2P04 -, HEPES, 락토비오네이트, 수크로스, 만니톨, 글루코스, 덱스트론-40, 아데노신 및 클루타티온을 포함하는 조성물 중에 현탁된다. 통상적으로, 조성물은 이극성 비양자성 용매, 예를 들면 DMSO를 포함하지 않는다. HypoThermasol(하이포써마솔) FRS와 같은 적합한 조성물이 상업적으로 구입 가능하다. 이러한 조성물은 마이크로입자가 연장된 기간(시간 내지 일) 동안 4℃ 내지 25℃에서 저장되거나 저온(cryothermic)의 온도, 즉 -20℃ 미만의 온도에서 보존되게 하면서 유리하다. 이후, 마이크로입자는 해동 후 이 조성물에서 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 치료하고자 하는 질환 또는 병증에 따라 당업자에게 명확한 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 특정한 투여 경로는 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 두개내, 비강 또는 복강내를 포함한다. 뇌의 장애의 치료를 위해, 하나의 옵션은 통상적으로 손상 또는 질환의 부위에 마이크로입자를 대뇌내 투여하는 것이다.
마이크로입자는 당업자에게 명확한 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 투여된다. 마이크로입자의 낮은 면역원성 또는 면역원성 부재로 인해, 해로운 면역 반응을 포함함이 없이 반복 용량을 투여할 수 있다.
치료학적 용도
본 발명의 마이크로입자는 질환의 치료 또는 예방에 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 마이크로입자를 사용하는 환자에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 포함한다. 용어 "환자"는 예방학적 또는 치료학적 치료를 수용하는 인간 및 다른 포유동물 피험체를 포함한다.
기재된 바대로, 본 발명의 miRNA를 포함하는 조성물은 이 치료에서 또한 유용하고, 본원에서의 마이크로입자의 치료학적 용도에 대한 언급은 따라서 miRNA를 포함하는 조성물에 동등하게 적용된다.
본 발명의 치료학적으로 유용한 마이크로입자는 재생 활성을 갖는다. 재생 활성을 갖는 마이크로입자는 재생 과정을 활성화하거나 증대시키거나, 퇴행성 과정을 억제하거나 감소시킬 수 있는 마이크로입자이다. 재생 과정은 세포 및 조직의 부활, 복원, 복구 및/또는 성장을 발생시킨다. 퇴행성 과정은 세포 또는 조직 통합성 및/또는 기능을 소실시킨다. 이는 손상된 또는 장애가 있는 세포 또는 조직, 예컨대 뇌졸중, 정신학적 장애, 심근경색 근위축성측삭경화증 및 말초 동맥 질환으로부터 생기는 것들을 치료하는 데 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 마이크로입자는 조직 재생에서 유용하다. "조직 재생"은 외상 후 조직에서 세포의 수를 증가시키는 과정이다. 외상은 세포 수가 감소하게 하는 어떤 것일 수 있다. 예를 들면, 사고, 자가면역 장애 또는 질환 상태는 외상을 구성한다. 조직 재생은 조직 내의 세포 수를 증가시키고, 조직의 세포 사이의 연결이 재확립되고 조직의 기능성이 재획득되게 한다.
치료는 조직 대체, 재생 또는 복구를 요하는 재생 치료일 수 있다. 치료는 신경학적 질환, 장애 또는 결핍을 위한 것일 수 있다. 치료는 기능 및/또는 인지 회복을 개선할 수 있다. 치료는 뇌졸중, 말초 동맥 질환, 신경병증 또는 조직 재생, 혈관재생 또는 국소 소염 작용을 요하는 임의의 다른 질환 또는 장애를 위한 것일 수 있다:
(ⅰ) 신경학적 장애, 질환 또는 결핍, 예컨대 파킨슨병 질환, 알츠하이머병 질환, 뇌졸중 또는 ALS;
(ⅱ) 리소좀 축적 장애;
(ⅲ) 심혈관 장애, 예컨대 심근경색 울혈성 심부전, 말초 동맥 질환, 당뇨병성 궤양, 상처 치유;
(ⅳ) 특발성 폐 섬유증, 호흡 곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐 질환, 특발성 폐 고혈압, 낭포성 섬유증 및 천식을 포함하는 폐의 질환;
(ⅴ) 대사 또는 염증성 장애, 예컨대 당뇨병(I형 또는 II형), 류마티스성 관절염, 골관절염, 루푸스, 크론씨병, 염증성 장 질환 또는 이식편 대 숙주 질환;
(ⅵ) 정신학적 장애, 예컨대 우울증, 조울증 장애, 정신분열증 또는 자폐증 장애, 예컨대 자폐증, 아스퍼거 증후군 또는 레트 증후군;
(ⅶ) 망막의 실명 유발 질환, 예컨대 나이 관련 황반변성, 스타가르트 질환, 당뇨병성 망막증 또는 색소성 망막염; 및
(ⅷ) 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 뇌교 수초 용해증, 척수매독, 횡단성 척수염, 데빅병, 진행성 다소성 백질뇌증, 시신경염, 백질이영양증, 갈랑 바레 증후군, 항-MAG 말초 신경병증 및 샤르코 마리 투스병.
일 실시양태에서, 마이크로입자 및 이들을 포함하는 조성물은 면역 조절에 사용되지 않는다. 일 실시양태에서, 치료는 면역조정에 관한 것이 아니다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 마이크로입자를 투여하여 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는 질환 또는 병증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 통상적으로, 질환 또는 병증은 상기 확인된 바와 같다.
본 발명의 마이크로입자는 이들이 얻어진 줄기 세포와 동일한 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 신경 줄기 세포는 뇌졸중, 뇌 손상, 예컨대 운동, 감각 및/또는 인지 결핍, 정신학적 장애, 심근경색 근위축성측삭경화증, 사지 허혈, 말초 동맥 질환을 포함하는, 질환의 치료에 유용한 것으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 마이크로입자는 뇌졸중, 뇌 손상, 예컨대 운동, 감각 및/또는 인지 결핍, 정신학적 장애, 심근경색 근위축성측삭경화증, 사지 허혈, 말초 동맥 질환의 치료에 또한 유용하다.
도 6 및 실시예 8은 신경 줄기 세포로부터 얻은 엑소좀이 상처 치유를 자극한다는 것을 나타낸다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 엑소좀은 조직 대체, 재생 또는 복구를 요하는 질환 또는 병증을 치료하기 위해 사용된다. 이러한 병증은 당뇨병성 궤양 및 상처 치유를 포함한다. 도 6c는 6주 동안 배양된 NSC로부터 단리된 엑소좀이 2주 동안 배양된 NSC로부터 단리된 엑소좀보다 효과적이라는 것을 나타낸다. 따라서, 일 실시양태에서, 적어도 2주, 더 통상적으로 적어도 4주 또는 적어도 6주 동안 (통상적으로 다구획 생물반응기에서) 배양된 NSC(통상적으로 CTX0E03 세포)로부터 단리된 엑소좀은 조직 대체, 재생 또는 복구를 요하는 질환 또는 병증을 치료하기 위해 사용된다. 임의로, NSC는 10주 이하, 예를 들면 2주 내지 10주, 3주 내지 10주, 4주 내지 10주, 5주 내지 10주 또는 6주 내지 10주 동안 배양되다.
6주 동안 (다구획 생물반응기에서) 배양된 NSC(CTX0E03 세포)로부터 단리된 엑소좀의 관찰된 효율 증가는 6주 동안 세포를 배양함으로써 또한 발생한 대략 70㎚ 직경으로의 엑소좀의 관찰된 크기 감소와 상관된다. 따라서, 일 실시양태에서, 적어도 6주 동안 (통상적으로 다구획 생물반응기에서) 배양된 NSC(통상적으로 CTX0E03 세포)로부터 단리된 엑소좀은 조직 대체, 재생 또는 복구를 요하는 질환 또는 병증을 치료하기 위해 사용된다. 기재된 바대로, 임의로 NSC는 10주 이하, 예를 들면 6주 내지 10주 동안 배양된다. 다른 실시양태에서, 직경이 100㎚ 미만, 통상적으로 80㎚ 미만, 예를 들면 대략 70㎚인 NSC(통상적으로 CTX0E03 세포)로부터 단리된 엑소좀은 조직 대체, 재생 또는 복구를 요하는 질환 또는 병증을 치료하기 위해 사용된다.
도 12에 도시되고 실시예 8에 기재된 바대로, 신경 줄기 세포로부터 얻은 마이크로소포는 신생혈관생성을 자극한다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로소포는 신생혈관생성을 요하는 질환 또는 병증, 통상적으로 조직 재생 및/또는 혈관재생에 의해 치료되는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용된다. 본 발명의 마이크로소포는 심혈관 장애, 예컨대 심근경색 울혈성 심부전, 말초 동맥 질환, 당뇨병성 궤양 및 상처 치유의 치료에서 사용될 수 있다. 신생혈관생성의 자극은 허혈, 특히 심장 허혈 및 사지 허혈의 치료에 치료학적으로 또한 유용하다. 도 12는 적어도 3주 동안 배양된 NSC로부터 수확된 마이크로소포가 1주 또는 2주 동안 배양된 NSC로부터 단리된 마이크로소포보다 효과적이라는 것을 나타낸다. 따라서, 일 실시양태에서, 적어도 3주, 더 통상적으로 적어도 4주 또는 적어도 6주 동안 (통상적으로 다구획 생물반응기에서) 배양된 NSC(통상적으로 CTX0E03 세포)로부터 단리된 마이크로소포는 신생혈관생성을 요하는 질환 또는 병증을 치료하기 위해 사용된다. 임의로, NSC를 10주 이하, 예를 들면 3주 내지 10주, 4주 내지 10주, 5주 내지 10주 또는 6주 내지 10주 동안 배양된다.
도 13에 도시되고 실시예 8에 기재된 것처럼, 신경 줄기 세포로부터 얻은 마이크로소포는 신경돌기 생육을 자극한다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 마이크로소포는 신경학적 질환, 장애 또는 결핍, 예컨대 파킨슨병 질환, 알츠하이머병 질환, 뇌졸중, 신경병증 또는 ALS를 치료하기 위해 사용된다.
예방학적 용도에서, 위험을 제거하거나 감소시키거나 질환의 개시를 지연시키기에 충분한 양으로 특정 질환에 걸리기 쉽거나, 그렇지 않으면 이 질환의 위험에 있는 환자에게 약제학적 조성물 또는 약제를 투여한다. 치료학적 용도에서, 질환 및 이의 합병증의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 이러한 질환에 걸리기 쉽거나, 이미 이 질환을 앓고 있는 환자에게 조성물 또는 약제를 투여한다. 이를 성취하기에 적절한 양은 치료학적 또는 약제학적 유효량으로 정의된다. 예방학적 및 치료학적 섭생 둘 다에서, 충분한 반응이 성취될 때까지 수회 용량으로 물질들을 통상적으로 투여한다. 통상적으로, 반응을 모니터링하고, 반응이 없어지기 시작하는 경우 반복 용량을 제공한다.
본 발명의 마이크로입자를 임의로 줄기 세포와 조합하여 조합 치료를 제공할 수 있다. 줄기 세포는 임의로 마이크로입자가 유래한 줄기 세포이고, 예를 들면 마이크로입자가 CTX0E03 세포로부터의 엑소좀인 경우, 조합 치료를 위해 사용되는 줄기 세포는 CTX0E03 세포일 수 있다. 줄기 세포 및 마이크로입자는 임의로 (ⅰ) 단일 약제학적 조성물으로 함께 투여되거나, (ⅱ) 동시적으로 또는 동시에 그러나 별개로 투여되거나, (ⅲ) 별개로 및 순차적으로, 예를 들면 줄기 세포에 이어 마이크로입자 또는 마이크로입자에 이어 줄기 세포로 투여될 수 있다. 줄기 세포 및 마이크로입자가 별개로 및 순차적으로 투여되는 경우, 세포 및 마이크로입자의 투여 사이의 기간은 1시간, 1일, 1주, 2주 이상일 수 있다.
일 실시양태에서, 예방학적 치료는 마이크로입자가 유래한 줄기 세포를 수용하는 숙주에서 관용, 통상적으로 면역관용을 유도한다. 일 실시양태에서, 줄기 세포 치료의 투여 전에 환자에 대한 본 발명의 마이크로입자의 하나 이상의 용량의 투여는 줄기 세포 치료의 불리한 면역 반응, 즉 "거부"의 위험을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 기재된 바대로 본 발명의 마이크로입자과 함께 줄기 세포를 투여함으로써 줄기 세포에 대한 관용은 증가할 수 있다.
상기 기재된 병증의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 방식, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제 및 치료가 예방학적 또는 치료학적인지의 여부를 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 환자는 인간이다.
CTX0E03 세포주는 뇌졸중, 말초 동맥 질환, 뇌 손상, 예컨대 운동, 감각 및/또는 인지 결핍 및 정신학적 장애를 치료하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 세포는 현재 장애가 있는 뇌졸중 환자s의 치료를 위한 임상 실험에서 시험되고 있다(Clinicaltrials.gov Identifier: NCT01151124). WO-A-2012/004611은 단극성 및 양극성 우울증, 정신분열증, 강박 신경증 장애, 자폐증 및 자폐증 장애를 포함하는 정신학적 장애를 치료하는 데 있어서의 CTX0E03 세포의 용도를 기술한다. 따라서, CTX0E03 세포에 의해 제조된 마이크로입자는 또한 뇌졸중, 말초 동맥 질환, 망막의 실명 유발 질환(예컨대, 색소성 망막염), 뇌 손상, 예컨대 운동, 감각 및/또는 인지 결핍 및 정신학적 장애를 치료할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료한다", "치료", "치료하는" 및 "치료"는, 환자 또는 피험체와 관련하여 직접 사용될 때, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 경감, 또는 장애 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 예방 또는 예방책을 의미하도록 취해져야 한다. 치료하고자 하는 장애은 퇴행성 장애, 조직 파괴를 수반하는 장애, 종양성 장애, 염증성 장애, 자가면역 질환 또는 면역학적 매개 질환(이식된 장기 및 조직의 거부 포함)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 상기 치료를 필요로 하는 피험체에 대한 본 발명의 마이크로입자 또는 이들 마이크로입자를 포함하는 약제학적 조성물의 투여로부터 증상의 경감 또는 예방이 발생한다.
생체내 투여된 세포 및 마이크로입자의 추적
본 발명은 신경 줄기 세포에 의해 제조된 마이크로입자에 대한 명확한 마커 프로필을 제공한다. 따라서, 환자로부터 얻은 샘플을 시험하고 샘플에서의 마커 프로필이 마이크로입자의 프로필과 일치하는지를 결정하는 것에 의해 생체내 이들 마이크로입자의 존재를 검출할 수 있다. 샘플 프로필이 본원에 기재된 마이크로입자의 프로필과 일치하는 경우, 이는 마이크로입자의 존재를 확인시켜준다. 이는 마이크로입자 그 자체의 존재 및/또는 생물분포뿐만 아니라 마이크로입자를 제조하는 줄기 세포의 존재를 검출하도록 사용될 수 있다. 이는 예를 들면 ADME(T) 연구에서 생체내 투여된 줄기 세포가 숙주 조직으로 이식되고/되거나 이동되는지를 검출할 때 특히 유용하다.
마이크로입자 또는 줄기 세포가 환자에게 투여되는 치료 과정을 모니터링하기 위해 생체내 마이크로입자의 검출을 이용할 수 있다. 환자에서 본 발명의 마이크로입자를 제조하는 세포의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 것은 용량 섭생이 변경되게 하여, 따라서 예를 들면 생체내 유효량의 마이크로입자 또는 줄기 세포를 제공하는 데 필요한 용량을 증가시키거나 감소시킨다.
마이크로입자의 제조 방법
마이크로입자는 줄기 세포 조정 배지로부터 단리된다. "조정 배지"(CM)는 필요한 경우 사용 전에 임의의 적합한 수단, 바람직하게는 여과에 의해 제거되고 무균화되는, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 48시간 또는 적어도 약 72시간, 통상적으로 168시간(7일) 이하 동안 줄기 세포의 대량 배양을 배양하기 위해 사용되는 줄기 세포를 위한 성장 배지일 수 있다.
대안적으로, 세포 배양을 허용하고, 그러므로 조정 배지가 더 긴 기간, 예를 들면 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주 이상 동안 유지되게 하는 2구획 생물반응기로부터 마이크로입자를 수확할 수 있다. 시스템은 10kDa 반투과성 막에 의해 배지의 더 큰 저장소로부터 분리된 작은 세포 구획(대략 15㎖) 내에 세포 및 분비된 마이크로입자를 유지시킨다. 이는 마이크로입자 생성을 최대화하기 위해 극도로 높은 세포 밀도를 효과적으로 유지시키면서 대사 폐기물의 효과적인 제거를 허용한다. 실시예 9 및 도 7 및 도 8은 2구획 생물반응기의 사용이 표준 세포 배양 플라스크(T175 플라스크)가 사용될 때 얻은 것보다 마이크로입자의 훨씬 더 높은 수율을 발생시킨다는 것을 나타낸다.
분자량, 크기, 형상, 유체역학 반경, 조성물, 전하, 기질-리간드 상호작용, 전자기파의 흡광도 또는 산란 또는 생물학적 기능에 기초하여 마이크로입자는 다른 배지 성분으로부터 분리될 수 있다. 일 실시양태에서, 적절한 크기의 필터를 사용하여 조정 배지를 여과시켜 원하는 마이크로입자, 예를 들면 100K MWCO 필터를 분리시킨다. 임의로, 농축된 NSC-조정 배지를 크기 배제 크로마토그래피로 처리함으로써 마이크로입자의 단리 전에 줄기 세포-조정 배지를 농축시킨다. 이후, 관심 있는 마이크로입자의 단리에 UV 흡광체 분획을 선택할 수 있다.
상이한 단리 기법 및 매개변수를 이용하여 배지로부터 상이한 마이크로입자를 단리할 수 있다. 예를 들면, 엑소좀은 1.13-1.19g/㎖의 소포 밀도를 갖고, 100,000-200,000g에서의 수크로스 구배 초원심분리 및 분별 원심분리에 의해 단리될 수 있다. 마이크로소포는 18,000-20,000g에서의 분별 원심분리 및 여과(100K MWCO)에 의해 단리될 수 있다. 막 입자는 1.04-01.07g/㎖의 밀도를 갖고, 엑소좀 유사 소포는 1.1g/㎖의 밀도를 갖는다.
특정한 생성 방법은 줄기 세포를 배양하여 조정 배지를 제공하는 단계; 1500rpm에서 원심분리에 의해 세포 조각을 제거하는 단계; 100K MWCO 필터를 통해 초원심분리에 의해 마이크로소포(<1000kDa)를 단리하거나 120,000g에서 초원심분리에 의해 엑소좀(30-100㎚)을 단리하는 단계; 이후 BCA 단백질 검정을 이용하여 정량하는 단계를 포함한다.
마이크로입자를 위한 프로듀서 세포로서의 조건 불활화 줄기 세포
본 발명의 일 양태에서, 마이크로입자, 예컨대 마이크로소포 및/또는 엑소좀을 제조하기 위해 조건 불활화 줄기 세포를 사용한다. 이들 조건 불활화 줄기 세포는 통상적으로 신경 줄기 세포이지만, 임의의 유형의 줄기 세포, 예를 들면 조혈 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 따라서, 조건 불활화 줄기 세포를 배양하는 단계 및 세포에 의해 제조된 마이크로입자를 수확하는 단계를 포함하는 줄기 세포 마이크로입자를 제조하는 방법이 제공된다. 줄기 세포의 조건 불멸화는 상기 기재된 바대로 당해 분야에 공지되어 있다. 논쟁을 피하기 위해, 이 방법은 신경 줄기 세포의 사용에 제한되지 않는다.
마이크로입자를 제조하는 데 사용되는 줄기 세포가 신경 줄기 세포일 때, 이것은 본원에 기재된 임의의 신경 줄기 세포, 예를 들면 클론성 표준화된 CTX0E03 조건 불활화 세포주일 수 있고, 실험실내 및 생체내 명확한 안전성을 나타내고, 스케일하여 안정한 엑소좀 생성을 위한 독특한 자원을 제공하도록 제조될 수 있다. 대안적으로, 신경 줄기 세포는 임의로 US 7514259에 기재된 바대로 신경 망막 줄기 세포주일 수 있다.
마이크로입자를 제조하기 위해 사용되는 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포일 때, 이는 임의로 WO-A-2009/105044에 기재된 조건 불활화 지방 유래 줄기 세포("ADSC") 또는 조건 불활화 버전의 중간엽 줄기 세포일 수 있고; 이들 세포는 CD29+, CD44+, CD49a+/e+, CD105+, CD166+, CD34-, CD45-이다.
마이크로입자 분비의 유도 방법
본 발명자들은 줄기 세포에 의한 마이크로입자의 생성을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 신경 줄기 세포로 제한되지 않고 임의의 줄기 세포로부터 마이크로입자의 생성에 사용될 수 있는 이러한 발견은 마이크로입자의 개선된 수율이 줄기 세포 배양으로부터 얻어지게 한다.
줄기 세포에 의한 마이크로입자의 생성을 증가시키는 제1 기법은 조정 배지의 제거 전에 12시간 내지 96시간 동안 통상적으로 1 내지 25ng/㎖, 예를 들면 10ng/㎖에서 TGF-β, IFN-γ 또는 TNF-α 중 하나 이상으로 줄기 세포를 처리하는 것이다.
하기 실시예 2에 기재된 것처럼, 다소포체(MVB)의 발생 빈도는 TGF-β, IFN-γ 또는 TNF-α(10ng/㎖)의 존재에 의해 변경되는 것으로 관찰되었다. 빈도는 TGF-β의 존재시 가장 높고, 그 다음 IFN-γ, 그 다음 TNF-α이다. 따라서, TGF-β, IFN-γ 또는 TNF-α 중 하나 이상을 줄기 세포 배양 배지에 첨가하는 것은 세포에 의한 마이크로입자의 생성을 자극한다. 이후, 상기 기재된 다른 성분으로부터 마이크로입자를 분리함으로써 마이크로입자를 수확할 수 있다.
줄기 세포에 의해 마이크로입자의 생성을 증가시키는 제2 기법은 저산소 조건 하에 세포를 배양하는 것이다. 저산소 조건 하에 세포를 배양하는 것은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 대기압 수준 미만의 02, 즉 21% 미만의 02를 갖는 분위기에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 산소 수준이 변경되는 항온처리기에서 세포를 위치시킴으로써 이를 통상적으로 성취한다. 저산소 배양은 통상적으로 10% 미만의 02, 더 통상적으로 5% 이하의 02,　예를 들면 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1%의 이하 02를 포함하는 분위기에서 배양하는 것을 포함한다.
본 발명자들은 또한 상이한 세포 유형과 줄기 세포를 동시 배양하는 것이 줄기 세포에 의한 마이크로입자의 생성을 변경할 수 있다는 것을 이해하였다. 상이한 세포 유형은 비줄기 세포, 즉 마지막으로 분화된 세포 유형일 수 있다. 통상적으로, 상이한 세포 유형은 줄기 세포가 생체내 상호작용하는 것이다. 일 실시양태에서, 신경 줄기 세포를 상피 세포, 예컨대 내피 세포, 통상적으로 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)와 동시 배양한다. 생체내, NSC 및 맥관구조가 상호작용하고, 증식하는 NSC가 혈관에 밀접히 근접하게 또는 인접하게 국소화된다는 것이 관찰되었다. NSC가 내피 세포와 동시 배양될 때 수용체 티로신 키나제 활성화 및 신호 단백질 분비가 또한 상향 조절되는 것으로 관찰되고, 이는 다시 맥관구조가 NSC의 증식 능력을 조절한다는 것을 나타낸다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 본 발명자들은 사이토카인 발현의 증폭을 통해 조직 재생 과정에서 NSC와 미세혈관(즉, 내피 세포) 사이에 생체내 중심적 상호작용이 있다고 생각한다. 내피 세포(예를 들면, HUVEC)과 동시 배양된 NSC(예를 들면, CTX0E03 세포)로부터 유래한 마이크로입자, 예를 들면 엑소좀은 줄기 세포 및 마이크로입자가 활성인 생체내 환경을 모방하는 환경에서 제조되므로 치료학적 용도를 위해 따라서 준비된다.
따라서, 줄기 세포를 상이한 세포 유형과 배양하는 것은 제조된 마이크로입자의 양을 개선하고/하거나 마이크로입자의 함량을 개선할 수 있어서, 통상적으로 줄기 세포에 의해 제조된 마이크로입자는 조직 복구의 활성화 상태에 대해 바이어스된다. 따라서, 다른 세포와 동시 배양된 줄기 세포에 의해 제조된 마이크로입자, 예를 들면 내피 세포와 동시 배양된 NSC는 유리하다. 본원에 기재된 바대로 동시 배양된 줄기-세포 조정 배지로부터 단리에 의해 이들 마이크로입자를 얻을 수 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 다구획 생물반응기에서 줄기 세포를 단순히 배양함으로써 줄기 세포에 의해 제조된 마이크로입자의 양이 크게 증가할 수 있다는 것을 이해하였다. 이러한 발견은 신경 줄기 세포로 제한되지 않고, 일반적으로 모든 줄기 세포의 배양에 적용된다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 다구획 생물반응기에서 배양된 줄기 세포로부터 마이크로입자를 제조하는 방법을 제공한다. 적어도 1주, 통상적으로 적어도 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일, 예를 들면 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일 이상, 예를 들면 적어도 3주, 4주, 5주, 6주 이상 동안 마이크로입자가 수확되는 세포를 통상적으로 배양한다. 도 8로부터 주별로 마이크로입자 생성 증가가 단지 부가적이지 않고 지수적이라는 것을 볼 수 있다. 연장된 배양은 통상적으로 인테그라 셀라인 시스템 2구획 생물반응기(Integra Biosciences AG(Zizer, Switzerland 소재)로부터 상업적으로 구입 가능)에서 관찰되지만, 이러한 발견은 이 특정한 다구획 생물반응기에 제한되지 않고; 임의의 다구획 생물반응기를 사용할 수 있다. 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 임의의 줄기 세포 유형으로부터 마이크로입자를 제조하기 위해 이 배양 방법을 이용할 수 있다.
마이크로입자 생성을 변경하는 물질의 스크리닝 방법
본 발명은 줄기 세포에 의한 마이크로입자의 생성을 변경하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 통상적으로 마이크로입자 생성에 적합한 조건 하에 줄기 세포를 후보 물질과 접촉하는 단계 및 (ⅰ) 접촉된 줄기 세포에 의한 마이크로입자의 생성 속도가 증가 또는 감소하는지 또는 (ⅱ) 물질과 접촉되지 않은 대조군 줄기 세포와 비교하여 마이크로입자 변화의 특징(예를 들면, 크기, 단백질, mRNA 또는 miRNA 함량)을 관찰하는 단계를 포함한다.
조정 배지의 전체 RNA 조성물의 스크리닝 방법
원심분리(1500rpm에서 5분) 이후, 여과(0.02-0.2㎛ 또는 100K MWCO)를 통해 조정 배지로부터 마이크로입자를 수집한다. 트라이졸계 추출, 이어서 퀴아젠(Qiagen) RNaesy 미니 키트를 사용한 정제를 이용하여 전체 RNA를 얻는다. 물 중의 추출물은 260:280㎚ 흡광도를 가져 이것이 RNA일 수 있다는 것을 제시한다. mRNA(Superscript II RT, Invitrogen) 또는 miRNA(mScript RT 키트, 퀴아젠)에 적합한 프로토콜로 전체 RNA를 역전사한다. mRNA 및 miRNA 존재의 검증은 각각 mRNA의 경우 ATP5B 및 YWHAZ 및 miRNA 하우스키핑 유전자들의 경우 U6B 및 15a에 대한 프라이머를 사용한 qRT-PCR에 의해 입증된다. 포괄절 유전자 발현 분석 검정, 예컨대 어레이(마이크로 어레이 또는 PCR 기반 어레이) 및 서열분석에 의해 RNA를 평가할 수 있다.
키트
본 발명은 본 발명의 마이크로입자를 제조하는 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 신경 줄기 세포 배양 배지, 신경 줄기 세포 및 키트를 사용하여 제1항 내지 제16항 또는 제23항 중 어느 한 항의 마이크로입자를 제조하기 위한 설명서를 포함한다. 임의로, 키트는 제19항 또는 21항의 하나 이상의 성분을 포함한다. 키트는 또한 대조군으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 마이크로입자를 포함할 수 있다. 대조군 마이크로입자는 임의로 동결건조된다. 키트는 제조된 마이크로입자, 예를 들면 마이크로입자를 확인하기 위해 사용될 수 있는 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 검출에 적합한 검출 물질을 임의로 또한 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 참조하여 추가로 기재되어 있다.
실시예
실시예 1 : 전자 분광법에 의한 가시화를 위한 신경 줄기 세포 및 신경 줄기 세포 마이크로입자의 제조.
방법
전자 분광법을 위한 엠베딩된 CTX0E03 세포
ㆍ 5 x 70% CTX0E03 배양물
ㆍ (24시간 동안 모두 10ng에서) ±40HT, IFNγ, TNFα 및 TGFβ로 처리
ㆍ 세포 탈착하고 0.1M 카코딜레이트(pH 7.4) 중의 2.5% 글루테르알데하이드 중에 밤새 고정
ㆍ 300g에서 세포를 스피닝
ㆍ 완충 오스뮴 2%, 1.5시간
ㆍ 스피닝, 세척수, 밤새
ㆍ 우라늄 아세테이트 2%, 2시간
ㆍ 스피닝, 세척수, 30분
ㆍ 1주일 동안 에탄올 구배 20, 35, 50, 70, 80, 90, 100%.
ㆍ 100% 산화프로필렌(PO), 1시간
ㆍ 스피닝, PO 중의 50% 한천 LV, 1시간
ㆍ 75% LV 수지/PO 5시간
ㆍ 60℃에서 밤새 100% 수지
ㆍ 절단(60-80㎚) 전에 실온으로 냉각, 200Kv에서 영상화된 TEM.
결과
도 1A-E는 대략 30㎚-50㎚의 직경의 엑소좀을 포함하는 다소포체(MVB)의 전자 현미경사진을 나타낸다. 도 1f는 100㎚ 초과의 직경의 마이크로소포를 나타낸다.
실시예 2 : 신경 줄기 세포주로부터의 신경 줄기 세포 마이크로입자의 생성.
방법
CTX0E03 세포의 동일한 배양물을 포함하는 5개의 포화이하 플라스크를 40HT의 첨가와 함께 또는 이것 없이 완전한 성장 배지 대조군과 함께 10ng/㎖ TGF-β, 10ng/㎖ IFNγ 또는 10ng/㎖ TNFα로 개별적으로 처리한다. 처리 72시간 후, 세포를 트립지안/EDTA를 사용하여 수집하고 세척하고 전자 분광법 평가에 준비된 0.1M 카콜레이트(pH 7.4) 중의 2.5% 글루테르알데하이드 중에서 밤새 고정하였다.
결과
다소포체(MVB)의 발생 빈도는 TGF-β, IFN-γ 또는 TNF-α의 존재에 의해 변경되는 것으로 관찰되었다. 빈도는 TGF-β, 그 다음 IFN-γ, 그 다음 TNF-α의 존재로 가장 높았다.
결론
신경 줄기 세포로부터의 마이크로입자의 생성은 TGF-β, IFN-γ 또는 TNF-α의 인자의 첨가에 의해 자극될 수 있다. 이는 더 효과적인 마이크로입자 생성의 가능성을 갖는다.
실시예 3 : 신경 줄기 세포 마이크로입자의 정제, 정량 및 규명.
방법
마이크로입자의 많은 분량을 제조하기 위한 아웃라인 프로토콜이 도 2에 제공된다. 주요 단계는 정제, 정량, 규명, 효율 시험 및 제조이다.
(1) 정제
1-2시간 동안 예를 들면 100000 x g에서 초원심분리에 의해 줄기 세포-조정 배지로부터 마이크로입자를 정제할 수 있다. 특이적 항체를 이용한 항체 기반 방법, 예를 들면 면역침전, 자기 비드 정제, 수지 기반 정제와 같은 정제의 대안적인 또는 추가의 방법을 이용할 수 있다.
(2) 정량
전체 핵산 또는 단백질 수준의 정량, 예를 들면 다양한 PCR 또는 비색 단백질 정량 방법, 예컨대 BCA 검정 등에 의해 정제된 마이크로입자를 정량할 수 있다. 전자 분광법 그리드 또는 마이크로입자 특이적 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 분획을 이용한 면역-검정(예를 들면, ELISA, 면역블로팅)을 포함하는 다른 정량 기법을 대안적으로 이용할 수 있다.
(3) 규명
마이크로입자는 기능적으로 또는 구조적으로 규명될 수 있다. 당해 분야에 널리 공지된 방법(SDS-PAGE, 질량 분광광도법, PCR)을 이용하여 RNA/mRNA/miRNA 및 단백질 프로파일링을 이용할 수 있다. 구성적으로 분비된 마이크로입자를 시험하고, 유도제, 예컨대 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 인터페론-감마(INF-γ) 및/또는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)의 첨가에 의해 유도된 마이크로입자과 비교할 수 있다.
(4) 치료학적 효율
실험실내 및 생체내 검정에 의해 마이크로입자의 효율을 시험할 수 있다. 실험실내 평가를 위해, 신경 줄기 세포 마이크로입자를 단핵구, PBMC, 내피 세포 및/또는 섬유아세포의 배양물에 첨가할 수 있고, 이러한 세포에 대한 마이크로입자의 효과를 평가할 수 있다. 적합한 동물 모델에 대한 신경 줄기 세포 마이크로입자의 투여를 이용하여 생체내 효율을 평가할 수 있다. 임상 실험을 수행하여 인간 피험체에서의 신경 줄기 세포 마이크로입자의 결과 및 안전성을 평가할 수 있다.
(5) 제조/규모 확대
신경 줄기 세포 마이크로입자의 대규모 제조를 위해 생물반응기, 예컨대 인테그라 일회용 T1000을 사용할 수 있다. 이후, 정제된 마이크로입자를 치료학적 생성물로서 제제화한다.
실시예 4 : CTX0E03 마이크로입자에서의 miRNA 규명
방법
ㆍ 3가지 조건: 표준 배양물 중의 CTX0E03 세포; 표준 배양물 중의 CTX0E03 세포로부터 얻은 마이크로입자; 및 인테그라 셀라인 시스템 중의 CTX0E03 세포로부터 유래한 정제된 엑소좀(하기 실시예 7 내지 11 참조)
ㆍ 제조업자의 지시에 따른 qRT-PCR 패널(퀴아젠)을 이용한 miRNA 어레이의 조사. 이 검정은 방법에 민감한 데이터 정규화/기준 유전자의 선택으로 고정밀 및 고감도를 제공한다. 이는 게놈 광범위 서열분석을 제공하지 않는다.
결과: A) (ⅰ) 표준 CTX0E03 세포, (ⅱ) 여과된 조정 배지(0.02-0.2㎛ 필터) 즉 마이크로입자 및 (ⅲ) 인테그라 셀라인 시스템으로부터 유래한 엑소좀(예비 miRNA qRT-PCR 미스크립트 어레이(퀴아젠) 결과)에서 발견된 cp ≤ 35에 의한 miRNA의 목록.
B) 기준(하우스키핑) 유전자의 산술 및 기하 평균
Figure 112014105226690-pct00022

Figure 112014105226690-pct00023

Figure 112014105226690-pct00024

실시예 5 : 단백질 점 블롯을 이용한 CTX0E03 조정 배지 분석
방법
ㆍ 컨티셔닝된 24시간 및 72시간 조정 배지(RMM 및 ITS 배지)
ㆍ 수집된 배지를 투석에 의해 '농축하고', 단백질을 바이오티닐화한다(특정한 전체 단백질 농도는 0.5㎎/㎖인 것으로 보임). 이후, 배지를 Raybiotech L507 인간 단백질 어레이(전체 단백질 농도 0.1㎎/㎖)와 항온처리한다. HRP 접합 스트렙타비딘을 갖는 어레이의 세척 및 항온처리 후, 화학발광에 의해 단백질의 존재를 검출한다. 어레이는 정량적 데이터를 제공한다(즉, 단백질은 존재하지만, 다른 단백질과 비교하여 이의 발현 수준을 나타내지 않음).
결과
Figure 112014105226690-pct00025

Figure 112014105226690-pct00026

* = 신생혈관생성
† = 염증
실시예 6 : 인간 신생혈관생성 ELISA 스트라이프(Signosis)를 이용한 조정 배지 분석
방법
제조업자의 지시에 따라 인간 신생혈관생성 ELISA 스트라이프(Signosis)를 이용하였다. 8개의 신생혈관생성 사이토카인; 종양 괴사 인자 α(TNFα), 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), VEGFA, 인터류킨-6(IL-6), bFGF, 형질전환 성장 인자 β1(TGFβ1), EGF 및 렙틴에 대해 새로운 RMM 배지 및 24시간 컨디셔닝된 CTX0E03 RMM 배지를 분석하였다. 특이적 신생혈관생성 사이토카인에 지시된 각각 1차 항체로 코팅된 스트라이프의 각각의 웰에 시험 샘플을 로딩하였다. 450㎚에서 분광광도계에 의해 흡광도를 측정하였다. 신생혈관생성 사이토카인의 농도는 시험 샘플의 색상 강도에 직접 비례한다.
결과는 도 3에 도시되어 있다.
실시예 7 : CTX0E03 세포로부터 마이크로입자의 생성을 위한 인테그라 셀라인 - 일회용 생물반응기.
효과적인 마이크로입자 생성 및 세포주로부터의 수확은 더 큰 세포 밀도에 대한 최적 배양 조건을 유지시키는 것에 의존한다. 세포에 공급된 산소 또는 영양소의 임의의 제한 또는 폐기 대사 생성물의 축적은 배양의 기간을 제한하고 따라서 마이크로입자 생성을 제한한다.
10kDa 반투과성 막에 의해 더 큰 배지 저장소로부터 분리된, 작은 세포 구획 내의 기질 인레이(inlay)에 부착된 부착성 세포를 수용하도록 2구획 셀라인 AD 1000은 설계된다. 이 막은 더 작은 세포 구획 내의 세포에 의해 제조된 임의의 마이크로입자를 농축시키면서 계속적인 영양소 확산 및 폐기물의 제거를 허용한다. 배지 구획의 큰 용적 용량(1리터)으로 인해, 시스템은 배지 변경의 필요성 없이 더 긴 기간 동안 고밀도 배양을 유지시키는 가능성을 갖는다. 중피종 종양 세포 배양으로부터의 엑소좀의 생성은 문헌[Mitchell et al, 2008]에 기재되어 있다.
방법
셀라인 AD1000의 최적 성능을 얻기 위해, 25㎖의 완전한 성장 배지(성장 인자 및 40HT와 함께 RMM)를 플라스크의 배지 구획에 위치시켜 반투과성 막을 예비 습윤시킨다. 플라스크를 실온에서 5분 동안 정치시킨 후, 37℃에서 최소 1시간 동안 15㎖의 라미닌 용액(DMEM/F12 중의 20㎍/㎖)을 세포 구획으로 첨가하여 마우스 라미닌으로 기질 인레이를 코팅한다. 라미닌 용액을 제거하고, 15㎖의 따뜻한 DMEM/F12를 세포 구획에 첨가하여 임의의 초과의 라미닌을 제거한다. 기질 인레이 건조를 회피하면서, 전체 15㎖의 완전한 성장 배지에서 대략 15x106개의 CTX0E03 세포를 천천히 도입한다. 세포 구획으로부터 임의의 공기 버블을 제거하도록 주의한다. 추가의 460㎖의 완전한 성장 배지를 조심스럽게 세포 구획에 첨가한 후, 플라스크를 37℃에서 5% C02 중에 밤새 항온처리한다. 다음날, 세포 구획으로부터 배지를 제거하고 15㎖의 예열된 성장 배지로 대체한다.
7일마다, 세포 구획으로부터 마이크로입자/배지를 수확한다. 1500rpm에서 5분 동안 배지를 원심분리하여 임의의 세포 조각을 제거하고 -80℃에서 저장한다. 다른 15㎖의 예열된 완전한 성장 배지를 세포 구획에, 485㎖의 완전한 성장 배지를 배지 구획에 조심스럽게 첨가하고, 다른 7일 동안 항온처리한다. 마이크로입자를 100K MWCO 여과에 의해 단리한다. 필요한 바대로 반복한다.
도 4a는 정상 배양 조건(3일 T175)과 비교하여 인테그라 시스템을 이용하여 정제된 마이크로입자를 포함하는 15㎖의 배지로부터 추출된 단백질의 양을 나타낸다. BCA 검정에 의해 측정된 밀리그램의 단백질. 도 5는 260/280㎚에서 측정된 단리된 전체 RNA의 상응하는 분량을 나타낸다.
마커 규명은 정제된 집단 둘 다(마이크로소포 및 엑소좀)가 CD63 및 CD81을 발현한다(FACS에 의해 결정됨 - 도 4b)는 것을 나타낸다. 엑소좀만이 엔도솜 마커 알릭스를 발현한다(웨스턴 블롯에 의해 결정됨, 데이터 비도시).
실시예 8: 효율 검정
(A) CTX0E03 조정 배지의 기능과 상처 치유 검정에서 CTX0E03 세포로부터 정제된 엑소좀의 기능의 비교.
방법 - 상처 봉합/스크래치 검정
ㆍ 12웰 플레이트의 웰마다 0.25x106개의 NHDF(정상 인간 진피 섬유아세포)를 시딩하고, 포화상태가 되게 한다(24시간).
ㆍ 24시간 동안 성장 인자를 제거한다
ㆍ 세포(스크래치)를 제거하고, 엑소좀/조정 배지와 항온처리한다
ㆍ 48시간 동안 이미지 수행 면적
ㆍ Image J를 이용한 예상 면적
결과
Figure 112014105226690-pct00027

표 2 - 정제된 엑소좀의 첨가 시 또는 CTX0E03 조정 배지에서 배양된 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)의 이동 활성을 나타내는 상처 봉합/스크래치 검정.
0시간에 결정된 초기 상처 면적에 대해 세포에 의해 덮인 면적으로서 상처 봉합을 계산하였다. 상처 봉합은 0시간의 초기 상처 면적의 백분율로서 표시된다. 이 데이터는 또한 사진으로 도 6a에 도시되어 있다.
도 6b는 10㎍의 CTX0E03 엑소좀이 기준 조건(엑소좀 없음)과 비교하여 72시간 후 (HDNF 스크래치/이동 검정에서 결정된) 상처 봉합을 유의적으로 증가시킨다는 것을 나타낸다.
추가의 실험은 (성장 인자 및 40HT의 존재 하의 인테그라 셀라인 생물반응기를 사용한) 연속 배양 동안 모든 시점(2-6주)으로부터 정제된 엑소좀(초원심분리에 의해; BCA 단백질 검정에 의해 정량됨; CD63 및 CD81에 >99% 양성인 것으로 규명되고 상응하는 마이크로입자 분획과 비교하여 알릭스의 더 큰 발현 수준을 가짐)이 기준 조건과 비교하여 5-10㎍/㎖의 피크 반응으로 섬유아세포 이동 및 상처 치유를 유의적으로 증대시킨다는 것을 확인시켜준다. 도 6c는 기준 조건, 2㎍/㎖ 엑소좀, 6㎍/㎖ 엑소좀, 20㎍/㎖ 엑소좀 및 LSGS(낮은 혈청 성장 보충물) 양성 대조군에 대한 치유 면적(%)을 나타낸다. 도 6c의 상부 패널은 인테그라 셀라인 시스템에서 2주 동안 배양된 CTX0E03 세포로부터 단리된 엑소좀을 나타내고, 도 6c의 하부 패널은 인테그라 셀라인 시스템에서 6주 동안 배양된 CTX0E03 세포로부터 단리된 엑소좀을 나타낸다. 이 데이터는 모든 시험된 NSC 엑소좀의 모든 용량이 기준 조건과 비교하여 증가된 치유를 제공하고, 치유(%)가 72시간 후 양성 대조군(LSGS)에 접근한다는 것을 나타낸다.
도 6c에서의 데이터는 또한 6주 동안 배양된 NSC로부터 단리된 엑소좀이 (2주 엑소좀보다) 더 빠른 치유를 발생시키고, 치유(%)가 모든 용량에 대해 오직 48시간 후 100%에 접근한다는 것을 나타낸다.
도 6d는 마우스에서 생체내 주사 상처 검정의 결과를 나타내어, CTX0E03 세포가 생체내 통계적으로 유의적인 정도로 상처 치유를 자극한다는 것을 확인시켜준다. 이는 생체내 마이크로입자의 효율을 확인시켜 주기 위해 이용될 수 있는 단순한 생체내 생물검정이다.
결론 인간 신경 줄기 세포주 CTX0E03으로부터 방출된 엑소좀은 상처 치유의 실험실내 모델에서 섬유아세포 이동을 증대시키고, 이는 엑소좀이 hNSC가 복구를 촉진하는 기전에 기여할 수 있다는 것을 제시한다. 6주 동안 배양된 세포로부터 단리된 엑소좀은 2주 동안 배양된 세포로부터 단리된 엑소좀과 비교하여 실험실내 개선된 상처 치유 효율을 나타낸다.
(B) 신생혈관생성의 자극
(관 길이 및 분기점의) Ibidi 마이크로마이크로-슬라이드 및 자동화 Wimtube 검출 및 분석을 이용하여 1차 HUVEC에서 신생혈관생성을 검출하는 24시간 검정을 수행하였다. 1주, 2주, 3주, 4주 및 6주에 인테그라 플라스크로부터 수확한 마이크로소포를 HUVEC에 첨가하고, 신생혈관생성을 기준 HUVEC(첨가 없이)와 비교하였다. LSGS(낮은 혈청 성장 보충물)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 12에 도시된 결과는 신경 줄기 세포 마이크로소포가 신생혈관생성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 추가로, 이 데이터는 1주 또는 2주 동안 배양된 마이크로소포에 제공된 것보다 배양의 적어도 3주 후(즉, 인테그라 셀라인 생물반응기에서 3주, 4주 및 6주 배양 후) 수확된 마이크로소포에 의해 더 큰 신생혈관생성 증가가 제공된다는 것을 나타낸다. 적어도 3주 동안 배양된 마이크로소포는 통계학적으로 유의적인 수준 및 양성 대조군의 수준에 근접한 수준으로 신생혈관생성을 자극하였다. 가장 큰 신생혈관생성 증가는 4주 후 수확된 마이크로소포에 제공된 것으로 나타났고; 이 마이크로소포는 양성 대조군으로서 동일한 양만큼 신생혈관생성을 자극하였다.
이 데이터는 hNSC 마이크로소포가 신생혈관생성을 자극한다는 것을 나타낸다.
(C) 신경돌기 생육의 자극
1㎛ 삽입체를 통해 PC-12 세포를 사용하여 신경돌기 생육을 결정하였다. 72시간 후, PC-12 세포체를 제거하고, 신경돌기를 삽입체의 밑면에서 염색시켰다. 이후, 염색물을 추출하고 분광광도계에서 정량하였다. 2주에 인테그라 플라스크로부터 수확된 마이크로소포를 각각 100ng/㎖의 NGF(신경 성장 인자)와 함께 0.03㎍, 0.3㎍ 및 3㎍에서 세포에 첨가하였다. 신경돌기 생육을 기준 세포(첨가 없음)와 비교하였다. 100ng/㎖의 NGF를 대조군으로서 사용하였다. 도 13에 도시된 것처럼, 3㎍의 hNSC 마이크로소포의 첨가는 NGF 단독의 첨가와 비교하여 주목할만한 신경돌기 생육 증가를 발생시킨다.
이 데이터는 hNSC 마이크로소포가 신경돌기 생육을 자극한다는 것을 나타낸다.
실시예 9 : 인테그라 셀라인 시스템을 이용한 엑소좀의 생성.
CTX0E03 세포를 인테그라 셀라인 시스템을 이용하여 배양하고 엑소좀을 실시예 7에 기재된 바대로 정제하였다. 3주 시점에 셀라인 시스템을 이용하여 배지로부터 정제된 엑소좀의 농도 및 대조군으로서 당해 분야에 통상적으로 사용되는 표준 T175 시스템을 (단백질 함량을 예상하기 위한 BCA 검정을 이용하여) 정량하였다. 도 7은 인테그라 셀라인 시스템을 사용하는 엑소좀의 생성이 종래의 배양(T175 플라스크)을 사용하는 것과 비교하여 몇 배수의 증가라는 것을 나타낸다.
인테그라 셀라인 시스템을 이용하여, CTX0E03 세포를 3주 기간 동안 배양하고, 실시예 7에 도시된 바대로 엑소좀의 정제 및 정량을 위해 1주, 2주 및 3주에 배지를 수확하였다. 도 8a는 마이크로입자의 생성이 3주 배양 기간 동안 지수적으로 증가하여, 마이크로입자의 효과적인 대규모 생성을 허용한다는 것을 나타낸다. 이후, 단일 인테그라 셀라인 플라스크로부터 수확된 엑소좀의 농도를 연속 CTX0E03 배양의 1-6주 동안 모니터링하고, 결과는 하기 기재되어 있고 도 8b에 도시되어 있다:
Figure 112014105226690-pct00028

이 결과는 줄기 세포가 주, 통상적으로 적어도 3주 동안 다구획 생물반응기에서 배양될 때 엑소좀 생성이 놀랍게도 증대된다는 것을 나타낸다.
실시예 10 : 인테그라 셀라인 및 표준(T175) 배양 시스템으로부터 얻은 세포의 표현형의 규명.
실시예 7에 도시된 바대로 인테그라 셀라인 생물반응기 및 표준 배양을 이용하여 CTX0E03 세포를 배양하였다. 마커 특이적 항체 및 형광 분광법을 이용하여 DCX 및 GFAP 단백질 마커의 발현은 확인하였다.
세포로부터 얻은 샘플에서 qRT-PCR에 의해 DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF 및 IDO 마커의 발현을 검출하였다. 표준(T175) 배양에서의 CTX0E03 세포에서의 발현 수준의 기준치에 대해 평가된, 3주 배양된 인테그라 셀라인 시스템으로부터 얻은 엑소좀과 표준(T175) 배양으로부터 얻은 마이크로입자 사이의 마커 발현을 비교하였다.
본 발명자들은 표준품으로부터 대조군 세포와 비교하여 인테그라 셀라인 시스템으로부터 얻은 세포의 마커 발현에서의 놀라운 차이를 관찰하였다. 부분적으로 분화된 세포의 마커는 표준 배양으로부터 얻은 대조군 세포와 비교하여 인테그라 셀라인 시스템에서 배양된 세포가 몇 배수 증가하였다(도 9). 특히 놀라운 변화는 DCX1(더블코르틴 - 신경 계통에 대한 진입을 위한 마커), GFAP(신경교섬유질 산성 단백질 - 성상교세포 계통에 대한 진입을 위한 마커), GDNF(신경교세포 유래 신경영양 인자) 및 IDO(인돌아민 2,3-다이옥시게나제)의 마커의 발현 증가이다. 이는 2구획 생물반응기에서 배양된 신경 줄기 세포가 신경(DCX+) 또는 성상교세포(GFAP+) 계통의 세포로 부분적으로 분화한다는 것을 나타낸다. 인테그라 배양된 세포에서의 DCX 및 GFAP의 발현은 형광 분광법에 의해 확인되어, 인테그라 셀라인 생물반응기를 사용하여 배양된 CTX0E03 세포가 표준 CTX0E03 세포보다 더 분화된 뉴런 표현형을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 11 : 인테그라 셀라인 배양으로부터 얻은 엑소좀 및 표준(T175) 배양으로부터 얻은 마이크로입자의 miRNA 발현 프로필의 규명.
인테그라 셀라인 배양을 사용하여 및 단일 구획 T-175 플라스크에서 표준 배양에서 CTX0E03 세포를 3주 동안 배양하였다. 엑소좀을 인테그라 배양으로부터 정제하고, 마이크로입자를 실시예 7에 기재된 바대로 표준 T-175 배양으로부터 정제하였다. 표준 배양 또는 인테그라 셀라인 시스템으로부터 얻은 엑소좀 및 마이크로입자에서 발현된 다양한 miRNA의 상대 발현 수준을 제조업자의 지시에 따라 qRT-PCR 패널(퀴아젠)을 사용하여 miRNA 어레이로 결정하고, 표준 CTX0E03 세포주 대조군과 비교하여 조절 수준의 배수 증가 및 감소로 전환시켰다(표 3 및 도 10 참조). 이 데이터는 3주 동안 인테그라 셀라인 배양 시스템으로부터 얻은 엑소좀, 표준 단일 플라스크 배양으로부터 얻은 마이크로입자 및 세포 사이의 시차 miRNA 발현 프로필을 나타낸다.
표 3: 대조군(CTX0E03 세포)에 대한 표준 배양으로부터 얻은 마이크로입자 또는 인테그라 셀라인 시스템으로부터 얻은 엑소좀에서의 miRNA의 배수 조절.
Figure 112014105226690-pct00029

Figure 112014105226690-pct00030

하기 식을 이용하여 값을 계산하였다.
Figure 112014105226690-pct00031

Figure 112014105226690-pct00032

Figure 112014105226690-pct00033

Figure 112014105226690-pct00034

Figure 112014105226690-pct00035

CT = 사이클 쓰레스홀드
GOI = 관심 있는 유전자(조사된 miRNA)
HKG = 하우스키핑 유전자(데이터를 정규화하기 위해 이용되는 기준 miRNA)
실시예 12 : 전체 miRNA 분석
세포는 세포외 공간으로 방출에 결정된 마이크로입자로 RNA를 셔틀링할 수 있다. 이는 세포 사이의 유전자 코딩된 메시지의 운반을 허용한다. 본 발명자들은 본원에서 총체적으로 세포외 RNA를 '셔틀 RNA'라 칭한다. 본 발명자들은 다음 생성 서열분석을 이용하여 CTX0E03 신경 줄기 세포(NSC)에 의해 방출된 비코딩 RNA 종을 포괄적으로 분석하는 것을 목표로 한다.
비코딩 RNA는 2개의 카테고리(작은 것 및 긴 것)로 분할된다. 작은 비코딩 RNA 바이오유형은 리보솜 RNA(rRNA), 작은 핵(snoRNA), 작은 핵 RNA(snRNA), 마이크로RNA(miRNA), 기타 다른 RNA(misc_RNA, 예를 들면 RMRP, 볼트 RNA, 후생동물 SRP 및 RNY)를 포함하고, 긴 비코딩 RNA 바이오유형은 긴 비코딩 RNA(IncRNA) 및 큰 유전자간 비코딩 RNA(lincRNA)를 포함한다.
본원에서, 본 발명자들은 프로듀서 NSC의 RNA 함량과 비교하여 NSC 유래 엑소좀 및 마이크로소포(MV)로부터 방출된, 작은 및 긴 비코딩 RNA를 포함하는 셔틀 RNA를 규명하였다.
A) 애질런트 RNA 바이오분석기에 의해 확인된 세포, 엑소좀 및 마이크로소포에서의 전체 RNA 함량
엑소좀 및 마이크로소포 둘 다에서 RNA는 도 14에 도시된 작은 RNA 종으로 주로 이루어진다. 대부분의 뉴클레오타이드(nt)는 분자 사다리에 대해 나타난 것처럼 ≤200이었다.
B) RNA 조성물
딥 서열분석에 의해 셔틀 및 세포 RNA의 조성을 조사하기 위해 작은 RNA 서열분석 라이브러리를 생성하였다(Next 생성 서열분석). 결과가 도 15에 도시되어 있다.
C) 표준( T175 ) 배양으로부터 CTX0E03 세포, 마이크로소포 및 엑소좀 miRNA 발현의 딥 서열분석.
딥 서열분석은 서열분석에 따른 cDNA 라이브러리의 제조에 기초하고, 마이크로소포 및 엑소좀에서의 상이한 miRNA의 전체 서열 판독에 대한 정보를 제공한다. 이 딥 서열 데이터는 상기 기재된 qRT-PCR 어레이 데이터를 보완하고, 세포 및 마이크로입자의 miRNA 프로필의 포괄적인 분석을 제공한다. qRT-PCR 어레이 분석과 달리, 딥 서열분석은 프로브 어레이에 존재하는 서열의 확인으로 제한되지 않고, 그래서 확인하고자 하는 서열은 미리 공지될 필요는 없다. 딥 서열분석은 또한 직접 판독 및 매우 짧은 서열을 서열분석하는 능력을 제공한다. 그러나, 딥 서열분석은 낮은 발현을 갖는 전사체의 검출에 적합하지 않다.
방법
딥 서열분석, 이후 각각의 샘플에 대한 1개의 태그화 miRNA 라이브러리의 구축에 의해 분별 원심분리에 의해 정제된 부모 세포 및 이의 엑소좀(30-100㎛) 및 마이크로소포(100-1000㎛)에서의 다양한 miRNA의 존재를 확인하였다.
추가로, 매우 셔틀링된 miRNA(예를 들면, hsa-miR-1246)에 대한 특이적 프라이머가 실시간 역전사 PCR(qRT-PCR)에서 설계되고 사용되어 생체내 이식 후 엑소좀/마이크로소포를 추적한다.
딥 서열분석은 GATC Biotech(독일)에 의해 수행되고, 각각의 샘플에 대한 태그화 miRNA 라이브러리의 제조, 이후 서열분석 및 미르베이스 스캐닝을 요한다:
● 태그화 miRNA 라이브러리(22 내지 30개의 nt)의 구축
o 각각의 샘플에 대한 3' 및 5' 말단 둘 다에 대한 특이적 RNA 어답터의 결찰, 이후 작은 RNA 라이브러리의 역전사, 증폭 및 정제에 의해 서열분석 라이브러리를 생성하였다(포함된 작은 RNA 분획 22 내지 30개의 nt의 크기 범위).
● 일루미나(Illumina) HiSeq 2000(단일 판독)에서의 서열분석
o 일루미나 HiSeq 2000(단일 판독)을 이용하여 서열분석을 수행하였다. 하나의 풀의 분석은 최대 45,000,000의 단독 판독을 포함하고 각각의 판독 길이는 50개 이하의 염기이다. 서열분석은 FastQ File(서열 및 품질 점수)을 사용하여 제어되는 품질이다.
● 공지된 miRNA의 확인을 하기한 바대로 수행하였다:
o 생성된 서열 및 초기화된 원데이터로부터 RNA 어답터를 트리밍하였다. 원데이터를 클러스터화하고 각각의 클러스터에 대해 다수의 판독이 제공되었다. 미르베이스 스캐닝(Ssearch)에 의해 MiRNA를 확인하였다.
결과
많은 마이크로소포 및 엑소좀 miRNA는 세포에 비해 농후하고, 이는 세포가 세포외 방출에 대해 miRNA를 특이적으로 분류한다는 것을 나타낸다. 더욱이, miRNA 함량은 엑소좀 및 마이크로소포 둘 다에서 유사하여, 배설된 마이크로소포에서 선택적 miRNA 흡수의 일반 장치를 나타낸다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 이는 hNSC 아형을 확인하기 위한 핑거프린트로서 분비된 마이크로소포 및 엑소좀에서의 miRNA 함량을 이용할 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.
따라서, 딥 서열분석 분석은 이전에 보고되지 않은 hNSC 엑소좀 및 마이크로소포 둘 다에서 독특한 세트의 miRNA를 확인하였다. 배설된 소포에서의 miRNA 함량은 유사하지만, hNSC와 비교하여 우선적 miRNA 흡수를 나타낸다. 이러한 발견은 hNSC에 대해 이전에 기재되지 않은 셔틀 miRNA에 의해 중재되는 생물학적 효과를 지지한다.
결과는 하기 표 4 내지 9에 기재되어 있다. 데이터는 또한 도 11에 도시되어 있고, 이는 세포와 비교하여 마이크로소포 및 엑소좀에 존재하는 유의적으로 다른 miRNA 프로필을 명확히 나타낸다. 요약하면, 이 데이터는 세포와 비교하여 마이크로소포 및 엑소좀에서 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532의 양(판독수)에서의 큰 증가를 나타낸다. hsa-miR-4508, hsa-miR-4516, has-miR-3676-5p 및 hsa-miR-4485에서 또한 큰 증가가 나타난다. hsa-let-7a-5p, has-miR-92b-3p, has-miR-21-5p. hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-100-5p 및 hsa-99b-5p를 포함하는, 특정한 miRNA의 양(판독수)에서의 큰 감소가 나타난다.
엑소좀에서의 각각의 hsa-miR-1246, hsa-miR-4488, hsa-miR-4492, hsa-miR-4508, hsa-miR-4516 및 hsa-miR-4532의 존재는 qRT-PCR에 의해 검증되었다(데이터 비도시).
세포와 비교하여 상대 배수 변화로서 엑소좀 및 마이크로소포에서의 딥 서열분석 결과를 플로팅하는 것은 hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532가 세포와 비교하여 엑소좀 및 마이크로소포에서 유의적으로 상향 조절된다는 것을 확인시켜준다. 이 비교는 또한 miRNA hsa-miR-3195가 엑소좀 및 마이크로소포 둘 다에서 가장 상향 조절된 miRNA라는 것을 나타낸다. hsa-miR-3195의 절대 판독이 엑소좀 및 마이크로소포의 경우 약 40의 범위이지만, hsa-miR-3195가 세포에 존재하지 않는다.
상기 실시예 11에 기재된 것처럼, 엑소좀, 마이크로입자 및 부모 세포에서의 miRNA 함량을 PCR 어레이 분석을 이용하여 또한 시험하고 검증하였다. qRT-PCR에 의해 존재하는 하기 miRNA가 확인되었다: hsa-let-7g-5p, hsa-miR-101 -3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-128, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-134, hsa-miR-137, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-181 a-5p,hsa-miR-182-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-218-5p,hsa-miR-219-5p,hsa-miR-222-3p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p,hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-302a-3p,hsa-miR-302c-3p,hsa-miR-345-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-7-5p, hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-93-5p,hsa-miR-9-5p,hsa-miR-96-5p 및 hsa-miR-99a-5p.
표 4: 세포 EH
Figure 112014105226690-pct00036

Figure 112014105226690-pct00037

Figure 112014105226690-pct00038

Figure 112014105226690-pct00039

Figure 112014105226690-pct00040

Figure 112014105226690-pct00041

Figure 112014105226690-pct00042

Figure 112014105226690-pct00043

Figure 112014105226690-pct00044

Figure 112014105226690-pct00045

Figure 112014105226690-pct00046

표 5: 세포 EI
Figure 112014105226690-pct00047

Figure 112014105226690-pct00048

Figure 112014105226690-pct00049

Figure 112014105226690-pct00050

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Figure 112014105226690-pct00052

Figure 112014105226690-pct00053

Figure 112014105226690-pct00054

Figure 112014105226690-pct00055

Figure 112014105226690-pct00056

Figure 112014105226690-pct00057

Figure 112014105226690-pct00058

Figure 112014105226690-pct00059

Figure 112014105226690-pct00060

Figure 112014105226690-pct00061

Figure 112014105226690-pct00062

표 6: 마이크로소포 EI
Figure 112014105226690-pct00063

Figure 112014105226690-pct00064

Figure 112014105226690-pct00065

표 7: 엑소좀 EI
Figure 112014105226690-pct00066

Figure 112014105226690-pct00067

Figure 112014105226690-pct00068

Figure 112014105226690-pct00069

표 8. 마이크로소포 EH
Figure 112014105226690-pct00070

Figure 112014105226690-pct00071

Figure 112014105226690-pct00072

표 9. 엑소좀 EH
Figure 112014105226690-pct00073

Figure 112014105226690-pct00074

Figure 112014105226690-pct00075

D) 엑소좀 , MV 및 프로듀서 세포에서 수행된 게놈 분석에 의한 상부 랭킹 코딩 및 비코딩 RNA 의 확인
Figure 112014105226690-pct00076

표 10: 각각의 시험된 샘플에서의 GENCODE를 사용하여 확인된 서열 판독의 전체 수
서열 결과의 GENCODE 데이터베이스 분석을 이용하여, 표 11에 도시된 바대로 엑소좀(EXO), 마이크로소포(MV) 및 프로듀서 세포에서 7개의 추정상 신규한 miRNA 서열이 확인되었다. (nb CTX0E03 07EI MV 판독은 출발 물질의 더 적은 양으로 인해 잘못 표시된다 - 표 10 참조). 이 데이터는 도 16에 도식적으로 도시되어 있고, 이 도면은 이 서열이 세포와 비교하여 엑소좀 및 마이크로소포로 우선적으로 셔틀링된다는 것을 나타낸다.
Figure 112014105226690-pct00077

표 11: 엑소좀(EXO), 마이크로소포(MV) 및 프로듀서 세포에서 GENCODE을 이용한 추정상 신규한 miRNA 서열의 확인. CTX0E03 07EI MV 판독은 출발 물질의 더 적은 양으로 인해 잘못 표시된다(표 1). 전사체 번호는 Ensembl 데이터베이스(www.ensembl.org)로부터 취한다.
신규한 miRNA 의 검증
AC079949.1-201(서열 번호 738)
유전자: AC079949.1 ENSG00000239776
Figure 112014105226690-pct00078

AC079949.1-201의 경우, 추정상 성숙 miRNA,
Figure 112014105226690-pct00079
(서열 번호 745)는 Naive Bays 분류기를 이용하여 miRNA 전구체 서열 내에 성숙 miRNA를 확인하기 위한 도구인 http://mirna.imbb.forth.gr/MatureBayes.html을 이용하여 가능한 5' 줄기 성숙 miRNA로서 확인되었다. AGGGTCCGGTGCGGAGT(서열 번호 746) 프라이머 서열을 사용하여 이의 존재 검증을 수행하였다. 이 서열은 미르베이스(http://www.mirbase.org/)에 엔터 입력되고, 하기 miRNA는 유사한 서열: Bos 타우루스 miR-2887-1(수탁 번호 MIMAT0013845)로 확인되었다.
bta - miR -2887: 9-20(서열 번호 747)
Figure 112014105226690-pct00080

정제된 엑소좀 역전사된 miRNA에서 qRT-PCR에 의해 이 신규한 miRNA의 존재를 시험하였다.
서열
Figure 112014105226690-pct00081
(서열 번호 748)인 AC079949의 3' 줄기에서 동일한 분석을 수행하였지만, 이 경우 유사한 miRNA가 미르베이스에서 확인되지 않았다.
AP000318 .1-201(서열 번호 739)
유전자: AP000318.1 ENSG00000266007
Figure 112014105226690-pct00082

AP0003118-201 추정상 성숙 miRNA의 경우,
Figure 112014105226690-pct00083
(서열 번호 744)는 가능한 5' 줄기 성숙 miRNA로서 확인되었다.
Figure 112014105226690-pct00084
(서열 번호 749) 프라이머 서열을 사용하여 이의 존재 검증을 수행하였다. 카에노합디티스 레마네이(Caenorhabditis remanei) miR-55 줄기-루프는 유사한 miRNA로서 확인되었다. qRT-PCR에 의해 프라이머 검증을 다시 수행하였다.
crm - miR -55-5p: 4-1 7(서열 번호 750)
Figure 112014105226690-pct00085

AL161626 .1-201(서열 번호 740)
유전자: AL161626.1 ENSG00000241781
Figure 112014105226690-pct00086

AL161626.1-201 추정상 성숙 miRNA의 경우,
Figure 112014105226690-pct00087
(서열 번호 743)는 가능한 5' 줄기 성숙 miRNA로서 확인되었다.
Figure 112014105226690-pct00088
(서열 번호 751) 프라이머 서열을 사용하여 이의 존재 검증을 수행하였다. 제아 메이스(Zea may) miR164c 줄기-루프 및 아치포디움 디스타촌(Achypodium distachyon) miR164f 줄기-루프는 유사한 miRNA로서 확인되었다. qRT-PCR에 의해 프라이머 검증을 다시 수행하였다.
zma - miR164c -3p: 4-15(서열 번호 752)
Figure 112014105226690-pct00089

AC004943 .1(서열 번호 741)
유전자: AC004943.1 ENSG00000265573
Figure 112014105226690-pct00090

AL121897 .1(서열 번호 742)
유전자: AL121897.1 ENSG00000264308
Figure 112014105226690-pct00091

신규한 추정상를 포함한 기타 RNA( misc _ RNA )
Misc_RNA는 일련의 기타 작은 RNA에 대한 일반 용어인 기타 RNA에 대해 짧다. 기타 전사체 특징은 다른 RNA 키에 의해 정의되지 않았다.
이전에 공지된 상위 랭킹 및 GENCODE 서열 데이터세트를 사용하여 확인된 신규한 misc_RNA의 목록:
Figure 112014105226690-pct00092

표 12: 엑소좀(EXO), 마이크로소포(MV) 및 프로듀서 세포에서 GENCODE을 사용하는 서열인 추정상 신규한 misc_RNA를 포함하는 misc_RNA의 확인. (CTX0E03 07EI MV 판독은 더 낮은 양의 출발 물질로 인해 잘못 표시된다 - 표 10). 전사체 번호는 Ensembl 데이터베이스(www.ensembl.org)로부터 취한다.
misc_RNA 중에서, 하기 서열은 엑소좀 및 MV에서 우선적으로 하향 또는 상향 셔틀링된 것으로 확인되었다: 각각 상향 셔틀링된 RPHI, RMRP 및 VTRNA1-1 및 하향 셔틀링된 Y_RNA.725-201 및 Y_RNA.125-201. RPHI는 리보뉴클레아제 P RNA 성분들 H1이다. RMRP 유전자는 미토콘드리아 DNA 복제의 프라이밍 자리에서 미토콘드리아 RNA를 개열시키는, 엔도리보뉴클레아제를 보유하는 미토콘드리아 RNA의 RNA 성분을 코딩한다. 이 RNA는 또한 RNA 의존적 RNA 중합효소 활성을 갖는 명확한 리보뉴클레오단백질 복합체를 형성하기 위해 텔로머라제 역전사효소 촉매 서브유닛과 상호작용하고, 작은 간섭 RNA로 처리될 수 있는 이중 가닥 RNA를 제조한다. VTRNA1-1은 볼트 RNA 성분 1이다. 볼트는 큰 세포질 리보뉴클레오단백질이고, 이는 주요 볼트 단백질, MVP, 2 마이너 볼트 단백질, TEP1 및 PARP4 및 비전사된 RNA 성분, VTRNA1-1로 이루어진다. Y_RNA.725-201 및 Y_RNA.125-201은 신규한 misc_RNA이고, 이의 기능은 정의되지 않았다.
후생동물 기타 RNA
7SL, 6S, ffs 또는 4.5S RNA로도 공지된 신호 인식 입자 RNA는 신호 인식 입자(SRP) 리보뉴클레오단백질 복합체의 RNA 성분이다. SRP는 세포 내의 단백질의 통행을 지시하고 이들이 분비되게 하는 보편적으로 보존된 리보뉴클레오단백질이다. SRP RNA는 하나 이상의 SRP 단백질과 함께 신호 펩타이드의 결합 및 방출에 기여한다. 이 복합체의 RNA 및 단백질 성분은 매우 보존되지만, 상이한 삶의 왕국 내에서 변한다.
GENCODE 서열 데이터세트를 사용하여 확인된 상위 랭킹 후생동물 misc_RNA의 목록:
Figure 112014105226690-pct00093

표 13: 엑소좀(EXO), 마이크로소포(MV) 및 프로듀서 세포에서 GENCODE를 사용한 신호 인식 입자 RNA(misc_RNA) 서열의 확인. 전사체 번호는 Ensembl 데이터베이스(www.ensembl.org)로부터 취한다.
RRNA(리보솜 RNA )
리보솜 RNA(rRNA)는 리보솜으로 공지된 단백질 합성 소기관의 일부를 형성하고, 세포질로 배출되어 단백질로 메신저 RNA(mRNA)에서 정보를 번역하도록 돕는다. 진핵생물 리보솜(80S) rRNA 성분은 큰 유닛(rRNA 5S, 5.8S 및 28S) 작은 유닛(rRNA 18S)이다. rRNA 28S 및 5.8S 둘 다는 엑소좀 및 MV에서 선택적으로 상향 셔틀링된다.
GENCODE 서열 데이터세트를 사용하여 확인된 상위 랭킹 rRNA의 목록:
Figure 112014105226690-pct00094

표 14: 엑소좀(EXO), 마이크로소포(MV) 및 프로듀서 세포에서 GENCODE를 사용한 rRNA 서열의 확인. 전사체 번호는 Ensembl 데이터베이스(www.ensembl.org)로부터 취한다.
작은 인 RNA : snoRNA
작은 인 RNA(snoRNA)는 다른 RNA, 주로 리보솜 RNA의 화학 변형을 주로 가이드하고, RNA 및 작은 핵 RNA를 운반하는 작은 RNA 분자의 종류이다. 메틸화와 관련된 C/D 박스 snoRNA 및 유사 우리딜화와 관련된 H/ACA 박스 snoRNA의 2가지 주요 종류의 snoRNA가 있다.
GENCODE 서열 데이터세트를 사용하여 확인된 상위 랭킹 snoRNA의 목록:
Figure 112014105226690-pct00095

표 15: 엑소좀(EXO), 마이크로소포(MV) 및 프로듀서 세포에서 GENCODE를 사용한 snoRNA 서열의 확인. 전사체 번호는 Ensembl 데이터베이스(www.ensembl.org)로부터 취한다.
작은 핵 RNA( snRNA )
U-RNA로도 공지된 작은 핵 리보핵산(snRNA)은 U1, U2, U4, U5 및 U6이라 칭하는 주요 스플라스좀을 구성하고 여러 RNA-RNA 및 RNA-단백질 상호작용에 참여하는 작은 RNA 분자의 종류이다. 이의 1차 기능은 핵에서 프리-mRNA(hnRNA)의 프로세싱에서의 기능이다. 이는 텔로머를 유지시키면서 전사 인자(7SK RNA) 또는 RNA 중합효소 II(B2 RNA)의 조절에서 돕는 것으로 또한 나타났다.
GENCODE 서열 데이터세트를 사용하여 확인된 상위 랭킹 snRNA의 목록:
Figure 112014105226690-pct00096

표 16A: 엑소좀(EXO), 마이크로소포(MV) 및 프로듀서 세포에서 GENCODE를 사용한 snRNA 서열의 확인. 전사체 번호는 Ensembl 데이터베이스(www.ensembl.org)로부터 취한다.
LincRNA 및 신규한 lincRNA
큰 유전자간 비코딩 RNA(lincRNA)는 다양한 세포 과정의 중요한 조절자로서 나타난다. 각각의 lincRNA의 기능을 결정하는 것은 도전과제로 남아 있다. 긴 비코딩 RNA(긴 ncRNA, IncRNA)는 200개의 뉴클레오타이드보다 긴 비단백질 코딩 전사체이다.
GENCODE 서열 데이터세트를 사용하여 확인된 상위 랭킹의 이전에 공지되고 신규한 lincRNA의 목록:
Figure 112014105226690-pct00097

표 16B: 엑소좀(EXO), 마이크로소포(MV) 및 프로듀서 세포에서 GENCODE를 사용하는 lincRNA 및 추정상 신규한 lincRNA 서열의 확인. 전사체 번호는 Ensembl 데이터베이스(www.ensembl.org)로부터 취한다.
GAS5 lincRNA는 엑소좀 및 마이크로소포에서와 비교하여 세포 프로듀서에서 고도로 발현된다(엑소좀 및 MV 둘 다에서 하향 셔틀링됨).
mRNA
코딩 서열분석 mRNA가 또한 확인되었다.
Figure 112014105226690-pct00098

표 17: 엑소좀(EXO), 마이크로소포(MV) 및 프로듀서 세포에서 GENCODE를 사용한 mRNA 서열의 확인. 전사체 번호는 Ensembl 데이터베이스(www.ensembl.org)로부터 취한다.
실시예 12: 결론
딥 서열 분석의 주요 범위는 신경 줄기 세포 유래 소포(엑소좀 및 마이크로소포)에서 이의 miRNA 성분을 확인하는 것이다. 이 분석은 엑소좀 및 MV 둘 다로 우선적으로 셔틀링된 새로운 세트의 공지된 및 새로운 miRNA를 확인한다. 미르베이스 데이터베이스에 이미 포함된 확인된 miRNA 중에 hsa-miR-1246, hsa-miR-4488, hsa-miR-4492, hsa-miR-4508, hsa-miR-4516, hsa-miR-4532가 있고, 새로운 miRNA 중에 AC079949.1, AP000318.1, AL161626.1, AC004943.1, AL121897.1이 있다. 엑소좀에서 qRT-PCR에 의해 상부 랭킹 셔틀링된 miRNA(새로운 것을 포함)를 검증하였다.
본원에 도시된 바대로 셔틀 RNA의 크기 분포는 대부분 20개 내지 200개의 nt 범위이고, 다른 RNA 종은 세포외 공간으로 세포에 의해 방출된다. 딥 서열분석 및 GENCODE 서열 세트 분석에 의해, 본 발명자들은 비코딩 RNA 전사체의 더 큰 복합성 및 다양성을 확인하였다. 본 발명자들은 상세한 평가로 이 분석을 연장하였고, 이는 엑소좀 및 마이크로소포 둘 다에서 다른 비코딩 RNA의 우선적인 상향(≥2의 log2 배수 변화로 정의됨) 및 하향(≤-2의 log2 배수 변화로 정의됨) 셔틀의 발견을 발생시켰다. 시차 셔틀링된 비코딩 RNA는 거의 모든 비코딩 RNA 아형, 리보솜 RNA(rRNA), 작은 인(snoRNA), 작은 핵 RNA(snRNA), 마이크로RNA(miRNA), 기타 다른 RNA(misc_RNA, 예를 들면 RMRP, 볼트 RNA, 후생동물 SRP 및 RNY) 및 큰 유전자간 비코딩 RNA(lincRNA)에서 발견되었다.
유전자 조절에서 이의 역할에 대한 증가하는 증거와 조합된, 세포 및 셔틀 RNA에 걸친 검출된 RNA 종의 불균등 분포는 세포가 이 RNA를 특이적으로 방출하여 표적 세포의 기능을 변경한다는 것을 강하게 제시한다.
실시예 13: 단백질체 분석
방법
분별 초원심분리를 이용하여 CTX0E03 세포 인테그라 배양(2주)으로부터 엑소좀 및 마이크로소포 분획을 제조하였다. 엑소좀 및 마이크로소포를 변형 RIPA 완충제(50mM 트라이스 HCI, pH 8.0, 150mM NaCl, 1% SDS, 0.1% 트라이톤 X100, 10mM DTT, 1x 완전한 프로테아제 억제제(Roche) 및 1x PhosStop 포스파타제 억제제(Roche)) 중에 파괴시키고, 1㎖ 투베쿨린 주사기 및 25 게이지 바늘침을 사용하여 손으로 전단시켰다. Qubit 플루오로미터(Invitrogen)를 사용하여 파괴 후에 샘플을 재정량하였다. 20㎍의 각각의 샘플을 4-12% SDS-PAGE 겔(Novex, Invitrogen)에 로딩하였다. 겔을 레인마다 40개의 절편으로 분할하고, 하기 프로토콜로 로봇(ProGest, DigiLab)을 사용하여 겔 슬라이스를 처리하였다:
a) 25mM 중탄산암모늄, 이어서 아세토니트릴로 세척;
b) 60℃에서 10mM 다이티오트레이톨로 환원시킨 후, 실온에서 50mM 요오도아세타마이드로 알킬화;
c) 37℃에서 4시간 동안 트립신(Promega) 분해;
d) 포름산으로 급냉;
e) 추가의 처리 없이 직접 질량 분광광도법에 의해 상청액을 분석하였다.
질량 분광광도법
ThermoFisher Q Exactive와 인터페이스된 Waters NanoAcquity HPLC 시스템을 갖는 나노 LC/MS/MS에 의해 각각의 겔 분해물을 분석하였다. 펩타이드를 포획 컬럼에 로딩하고, 75㎛ 분석용 컬럼에서 350nL/분에서 용리시켰다; 컬럼 둘 다를 Jupiter Proteo resin(Phenomenex)에 팩킹하였다. 질량 분광광도계를 데이터 의존적 모드로 조작하고, MS 및 MS/MS를 각각 70,000 FWHM 및 17,500 FWHM 해상도로 Orbitrap에서 수행하였다.
엑소좀
초원심분리에 의해 정제된 엑소좀에서 질량 분광광도법에 의해 2572개의 단백질을 확인하였다. 인테그라 배양(2주)의 초기 단계로부터 엑소좀을 단리하였다. 모든 2572개의 단백질의 유전자 명칭 및 상응하는 SWISSPROT 수탁 번호(괄호 안)가 (유전자 명칭의 알파벳 순서로) 표 18에 기재되어 있고, 100개의 가장 풍부한 단백질은 풍부도 감소 순으로 표 19에 기재되어 있다. (PDCD6IP로도 공지된) 특징적인 엑소좀 마커 CD9, CD81 및 알릭스는 가장 풍부한 100개의 단백질에 존재한다.
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표 18: CTX0E03 엑소좀에서 확인된 모든 2572개의 단백질의 유전자 명칭 및 SWISSPROT 수탁 번호(유전자 명칭의 알파벳 순서로 기재됨).
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표 19: CTX0E03 엑소좀에서 확인된 100개의 가장 풍부한 단백질(명칭 및 SwissProt 수탁 번호)
마이크로소포
2940개의 단백질을 인테그라 배양(2주)의 초기 단계로부터 단리된 마이크로소포에서 질량 분광광도법에 의해 확인하고, 10,000 x g에서 원심분리에 의해 정제하였다. 모든 2940개의 단백질의 유전자 명칭 및 상응하는 SWISSPROT 수탁 번호(괄호 안)가 (유전자 명칭의 알파벳 순서로) 표 20에 기재되어 있고, 100개의 가장 풍부한 단백질은 풍부도 감소 순으로 표 21에 기재되어 있다.
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표 20: CTX0E03 마이크로소포에서 확인된 모든 2940개의 단백질의 유전자 명칭 및 SWISSPROT 수탁 번호(유전자 명칭의 알파벳 순서로 기재됨).
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표 21: CTX0E03 마이크로소포에서 100개의 가장 풍부한 단백질(명칭 및 SwissProt 수탁 번호)
단백질체 데이터의 토의
엑소좀 및 마이크로소포에서 CD63(MLA1 및 TSPAN30으로도 공지됨), TSG101(ESCRT-I 복합 서브유닛 TSG101로도 공지됨), CD109(150kDa TGF-베타-1-결합 단백질로도 공지됨) 및 thy-1(CD90으로도 공지됨)을 검출하였다.
다른 테트라스파닌을 또한 검출하였다: 엑소좀 분획에서 테트라스파닌-4, -5, -6, -9 및 14를 검출하였다; 마이크로소포에서 테트라스파닌-6 및 -14를 검출하였다.
마이크로소포가 아니라 엑소좀에서 CD133(AC133, 프로미닌-1, PROM1, PROML1 및 MSTP061로도 공지됨)을 검출하였다.
엑소좀 또는 마이크로소포에서 CD53(MOX44 및 TSPAN25로도 공지됨), CD82(KAI1, SAR2, ST6 및 TSPAN27로도 공지됨), CD37(TSPAN26으로도 공지됨) 및 CD40 리간드(CD40LG, CD40L 및 TNFSF5로도 공지됨)가 검출되지 않았다.
엑소좀 및 마이크로소포 분획 둘 다에서 네스틴, GFAP 및 튜불린 베타-3 사슬(TUBB3으로도 공지됨)을 검출하고, 튜불린 베타-3 사슬은 분획 둘 다에서 상위 100개의 단백질 내에 특히 우세하다. Sox2, DCX, GALC, GDNF 및 IDO는 검출되지 않았다.
설렉틴 및 TNFRI(TNF 수용체 1, TNFRSF1A, TNFAR 및 TNFR1로도 공지됨)는 검출되지 않았다.
엑소좀 및 마이크로소포 분획 둘 다에서 인테그린 알파-2, -3, -4, -5, -6, -7, -V 및 인테그린 베타-1, -4 및 -8을 검출하였다. 마이크로소포에서만 인테그린 베타-3 및 -5가 검출되었다.
엑소좀 및 마이크로소포 둘 다에서 MHC I형 항원(예를 들면, HLA_A1, HLA-A2 및 HLA-B27)이 검출되었다.
엑소좀 및 마이크로소포 둘 다에서 세포 접착 분자(예를 들면, CADM1, CADM4, ICAM1, JAM3, L1CAM, NCAM)가 검출되었다.
엑소좀 및 마이크로소포 분획 둘 다에서 세포골격 단백질(예를 들면, 액틴, 비멘틴, 케라틴, 카테닌, 디스트로글루칸, 신경미세섬유 폴리펩타이드, 미세소관 관련 단백질, 튜불린, 데스모플락틴, 플렉틴, 플라코필린, 셉틴, 스펙트린, 탈린, 빈쿨린 및 직신)이 검출되었다.
엑소좀 및 마이크로소포 둘 다에서 GTPase, 클라쓰린, 샤페론, 열 충격 단백질(예를 들면, Hsp90, Hsp70), 스플라이싱 인자, 번역 인자, 아넥신 및 성장 인자(예를 들면, TGF-베타)가 검출되었다.
엑소좀 및 마이크로소포 둘 다에서 갈렉틴-3, TIMP-1, 트롬보스폰딘-1, EGF 수용체 및 CSK가 검출되었다.
도 18은 엑소좀 및 마이크로소포로부터의 단백질체 데이터를 비교한다. 도 18a는 2주 인테그라 배양 시스템으로부터 단리된 각각의 마이크로입자 집단 내의 독특한 단백질의 수를 나타낸다. 도 18b는 2주 인테그라 시스템으로부터 단리된 각각의 마이크로입자 집단 내의 확인된 단백질과 관련된 생물학적 과정을 비교한다. 엑소좀 및 마이크로소포 내에 확인된 단백질은 매우 우수한 생물학적 과정과 관련된다.
바이오틴 대사와 관련된 단백질은 트립토판 생물합성에 관여된 엑소좀 및 단백질에서만 발견되고, 타우린/알파-리놀렌산 대사는 마이크로소포에서만 확인되었다.
도 18c는 문헌[Lai et al 2012]에 개시된 중배엽 줄기 세포 엑소좀 단백질체에 대해 CTX0E03 단백질체를 비교하고, 여기서 전체 857개의 단백질이 중배엽 줄기 세포로부터 방출된 엑소좀에서 확인되었다.
도 18d는 본 발명의 뉴런 줄기 세포 유래 엑소좀에 대해 MSC 유래 엑소좀(Lim 2012) 내에 확인된 단백질과 관련된 생물학적 과정을 비교한다. MSC 유래 엑소좀하고만 관련된 것으로 발견된 3개의 생물학적 과정은 (중요도가 감소하는 순서로) 하기와 같다: 천식; 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 생합성; 및 원발성 면역결핍. 뉴런 줄기 세포 유래 엑소좀하고만 관련된 것으로 발견된 30개의 생물학적 과정은 도 19에 도시되어 있고; 확인된 가장 유의적인 생물학적 기능은 RNA 중합효소에 관한 것이다.
MSC 유래 엑소좀 및 NSC 유래 엑소좀 둘 다에 의해 공유된 197개의 생물학적 과정의 추가의 비교는 NSC 엑소좀이 MSC 엑소좀과 비교하여 RNA 분해, 리보솜 및 스플라스좀에 관여된 주목할만한 더 많은 과정을 포함한다는 것을 나타낸다.
상기 비교는 NSC 유래 엑소좀과 MSC 유래 엑소좀(문헌[Lim et al 2012]에 의해 규명된 바와 같음) 사이의 다수의 상당한 비교를 나타낸다. 확인된 4개의 가장 유의적인 생물학적 차이는 림(Lim)의 연구진에 의해 확인된 것들 중에서 매우 낮은/부재한 것과 비교하여 NSC 엑소좀에서 존재하고, 모두 유전 물질, 즉 RNA 중합효소, RNA 분해, 리소좀 및 스플라스좀의 제조, 충전, 기능 및 분해와 관련되는 단백질을 포함한다.
실시예 14 : 마이크로입자의 크기 분포
1주, 2주, 3주, 4주, 5주 및 6주 동안 인테그라 셀라인 시스템에서 배양된 CTX0E03 세포로부터 단리된 마이크로소포("mv1" 대 "mv6") 및 엑소좀("exol" 대 "exo6")의 입자 크기 및 농도를 결정하기 위해 나노사이트 분석을 수행하였다. 모든 결과는 5회의 반복 측정에 기초한다.
나노입자 추적 분석(NTA)을 이용하여 입자 크기 분포를 측정하였다. NTA는 용액 중의 입자의 이동을 검출하고, 이를 입자 크기와 관련시킨다. 모든 샘플에 대해 모드 및 중앙 입자 크기를 계산하였다. 가장 민감한 카메라 세팅을 이용하여 엑소좀 샘플을 분석하여 가장 작은 소포를 포획하였다. 더 큰 소포의 과다 노출을 방지하기 위해 덜 민감한 카메라 세팅을 이용하여 마이크로소포 샘플을 분석하였다. 그 결과, 샘플에서 몇몇 더 작은 소포가 검출되지 않았다. MV 샘플에서 더 작은 소포가 존재하지만, 이는 질량의 면에서 샘플의 작은 백분율을 나타낸다.
Exo1의 비율을 형광 막 특이적 염료(CellMask™)로 라벨링하고, NTA 분석과 CellMask™ 라벨링의 조합은 NTA에 의해 검출된 사건이 막 소포에 상응한다는 것을 확인시켜준다(데이터 비도시).
결과가 하기 표 22 및 도 17에 기재되어 있다.
엑소좀은 대략 110㎚ 내지 대략 70㎚의 모드 직경, 또는 대략 130㎚ 내지 대략 75㎚의 중앙 직경으로부터 6주에서 크기 하강을 나타낸다. 70㎚ 내지 150㎚의 전체 크기 범위는 당해 분야에 기재된 다른 세포 유형으로부터 엑소좀의 크기와 일치한다. 6주 동안 세포를 배양한 후 대략 70㎚ 직경으로의 엑소좀의 관찰된 크기 감소는, 실시예 8 및 도 6에 보고된 것처럼, 6주 동안 다구획 생물반응기에서 배양된 CTX0E03 세포로부터 단리된 엑소좀의 효율 증가와 상관된다.
마이크로소포 및 엑소좀의 농도가 도 17의 6주 기간에 걸쳐 감소한다는 것이 또한 관찰되었고, 이는 시간에 따라 관찰된 개선된 효율을 광범위하게 반영한다.
마이크로소포는 예상된 것처럼 대략 150㎚ - 200㎚의 모드 직경 또는 대략 180㎚ - 350㎚의 중앙 직경으로 더 컸다.
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표 22: CTX0E03 마이크로소포 및 엑소좀의 크기 분포
참조문헌
Figure 112014105226690-pct00139
유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐스 04091601 20040916 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐스 04092302 20040923 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐스 04110301 20041103
SEQUENCE LISTING <110> Reneuron Limited <120> Stem Cell Microparticles <130> P059388WO <141> 2013-04-03 <150> GB 1205972.1 <151> 2012-04-03 <150> GB 1212848.4 <151> 2012-09-19 <150> GB 1302468.2 <151> 2013-02-12 <160> 752 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 aacccguaga uccgaacuug ug 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 cacccguaga accgaccuug cg 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 uccuguacug agcugccccg ag 22 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 uucacagugg cuaaguucug c 21 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 uauugcacuu gucccggccu gu 22 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 caacggaauc ccaaaagcag cug 23 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 ugagguagua aguuguauug uu 22 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 uucaaguaau ccaggauagg cu 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 uauugcacuc gucccggccu cc 22 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 ucggauccgu cugagcuugg cu 22 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 aacauucaac gcugucggug agu 23 <210> 16 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 uuuggcaaug guagaacuca cacu 24 <210> 17 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 ugagguagua gguuguaugg uu 22 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 ugguagacua uggaacguag g 21 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 ugagaacuga auuccauagg cu 22 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 caacaccagu cgaugggcug u 21 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 aauggauuuu uggagcagg 19 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RNA <213> Homo sapiens <400> 641 uccccuucug caggccugcu gg 22 <210> 642 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 642 uucagccagg cuagugcagu cu 22 <210> 643 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 643 agaaggggug aaauuuaaac gu 22 <210> 644 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 644 aucgggcccu cggcgccgg 19 <210> 645 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 645 ccugggcagc guguggcuga agg 23 <210> 646 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 646 ucuggccagc uacgucccca 20 <210> 647 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 647 guggaguccu ggggaaugga ga 22 <210> 648 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 648 aaaagcuggg uugagagggc aa 22 <210> 649 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 649 uuuaguguga uaauggcguu uga 23 <210> 650 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 650 ucagcaggca ggcuggugca gc 22 <210> 651 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 651 ugaguguugu cuacgagggc a 21 <210> 652 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 652 auuguagaac cuaagauugg cc 22 <210> 653 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 653 cuucccccca guaaucuuca uc 22 <210> 654 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 654 uuuguucguu cggcucgcgu ga 22 <210> 655 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 655 acuggacuug gaggcagaa 19 <210> 656 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 656 gagcaaugua gguagacugu uu 22 <210> 657 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 657 uguguggauc cuggaggagg ca 22 <210> 658 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 658 uuugggacug aucuugaugu cu 22 <210> 659 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 659 gcucggacug agcagguggg 20 <210> 660 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 660 uucgggcugg ccugcugcuc cgg 23 <210> 661 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 661 uaauacuguc ugguaaaacc gu 22 <210> 662 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 662 accugucugu ggaaaggagc ua 22 <210> 663 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 663 uuggaggcgu ggguuuu 17 <210> 664 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 664 ccaggaggcg gaggaggugg ag 22 <210> 665 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 665 cuagugcucu ccguuacaag ua 22 <210> 666 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 666 cgcgcggccg ugcucggagc ag 22 <210> 667 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 667 ugugacaaua gagaugaaca ug 22 <210> 668 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 668 uuuggacaga aaacacgcag gu 22 <210> 669 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 669 aacuguuugc agaggaaacu ga 22 <210> 670 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 670 aacucguguu caaagccuuu ag 22 <210> 671 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 671 uuucuucuua gacauggcag cu 22 <210> 672 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 672 cuuccggucu gugagccccg uc 22 <210> 673 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 673 cugggggacg cgugagcgcg agc 23 <210> 674 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 674 auacauguca gauuguaugc c 21 <210> 675 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 675 aacgggaaug caggcuguau cu 22 <210> 676 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 676 ucugaguucc uggagccugg ucu 23 <210> 677 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 677 gagcaggcga ggcugggcug aa 22 <210> 678 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 678 agaagauugc agaguaaguu cc 22 <210> 679 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 679 agcggggagg aagugggcgc ugcuu 25 <210> 680 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 680 ugagggcucc aggugacggu gg 22 <210> 681 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 681 caugcugacc ucccuccugc cccag 25 <210> 682 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 682 ucaggcaaag ggauauuuac aga 23 <210> 683 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 683 aaggcccggg cuuuccuccc ag 22 <210> 684 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 684 ugcggggaca ggccagggca uc 22 <210> 685 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 685 agccaggcuc ugaagggaaa gu 22 <210> 686 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 686 cgccugccca gcccuccugc u 21 <210> 687 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 687 auagcaauug cucuuuugga a 21 <210> 688 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 688 aauguuggaa uccucgcuag ag 22 <210> 689 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 689 ucugcacugu gaguuggcug gcu 23 <210> 690 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 690 uugaaaggcu auuucuuggu c 21 <210> 691 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 691 ugcuguauug ucagguagug a 21 <210> 692 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 692 agggcuggac ucagcggcgg agcu 24 <210> 693 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 693 aauuugguuu cugaggcacu uagu 24 <210> 694 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 694 ugaggacagg gcaaauucac ga 22 <210> 695 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 695 uuucccuuuc cauccuggca g 21 <210> 696 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 696 cagggcucag ggauuggaug gag 23 <210> 697 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 697 auucugcauu uuuagcaagu uc 22 <210> 698 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 698 aacggcaaug acuuuuguac ca 22 <210> 699 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 699 gaaaguaauu gcuguuuuug cc 22 <210> 700 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 700 aaaaguuauu gcgguuuugg cu 22 <210> 701 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 701 aaaaguaauu gcgguuuuug c 21 <210> 702 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 702 caagaaccuc aguugcuuuu gu 22 <210> 703 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 703 auauuaccau uagcucaucu uu 22 <210> 704 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 704 uaaaacuuua agugugccua gg 22 <210> 705 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 705 cagagugaca agcugguuaa ag 22 <210> 706 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 706 acuggcauua gugggacuuu u 21 <210> 707 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 707 uacagaugca gauucucuga cuuc 24 <210> 708 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 708 cucauuuaag uagucugaug cc 22 <210> 709 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 709 uuauugucac guucugauu 19 <210> 710 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 710 uucuggauaa caugcugaag cu 22 <210> 711 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 711 uugugucaau augcgaugau gu 22 <210> 712 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 712 cacacacugc aauuacuuuu gc 22 <210> 713 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 713 cacaagguau ugguauuacc u 21 <210> 714 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 714 uccauuacac uacccugccu cu 22 <210> 715 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 715 ugugcgcagg gagaccucuc cc 22 <210> 716 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 716 cgcgccgggc ccggguu 17 <210> 717 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 717 cggggcggca ggggccuc 18 <210> 718 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 718 gaggcugaag gaagaugg 18 <210> 719 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 719 gcugggcgag gcuggca 17 <210> 720 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 720 guggguacgg cccagugggg gg 22 <210> 721 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 721 gcuucuguag uguaguc 17 <210> 722 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 722 cggcuggagg ugugagga 18 <210> 723 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 723 uuacaggcgu gaaccaccgc g 21 <210> 724 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 724 ugggcuaagg gagaugauug ggua 24 <210> 725 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 725 ccgucgccgc cacccgagcc g 21 <210> 726 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 726 gguccagagg ggagauaggu uc 22 <210> 727 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 727 cauagcccgg ucgcugguac auga 24 <210> 728 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 728 ccccgccacc gccuugg 17 <210> 729 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 729 ugucagugac uccugccccu uggu 24 <210> 730 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 730 ucuggggaug aggacagugu gu 22 <210> 731 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 731 ucucaguaag uggcacucug u 21 <210> 732 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 732 agagcagaag gaugagau 18 <210> 733 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 733 ucaggccagg cacaguggcu ca 22 <210> 734 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 734 acuuuccuca cucccgugaa gu 22 <210> 735 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 735 ugacagcgcc cugccuggcu c 21 <210> 736 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 736 aagacugaga ggaggga 17 <210> 737 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 737 agaacucuug cagucuuaga ugu 23 <210> 738 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> genomic sequence of miRNA precursor <400> 738 ggccgcgccc cgtttcccag gacaaagggc actccgcacc ggaccctggt cccagcg 57 <210> 739 <211> 64 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> genomic sequence of miRNA precursor <400> 739 cccactccct ggcgccgctt gtggagggcc caagtccttc tgattgaggc ccaacccgtg 60 gaag 64 <210> 740 <211> 56 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> genomic sequence of miRNA precursor <400> 740 cgccgggacc ggggtccggg gcggagtgcc cttcctcctg ggaaacgggg tgcggc 56 <210> 741 <211> 81 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> genomic sequence of miRNA precursor <400> 741 gcttcacgtc cccaccggcg gcggcggcgg tggcagtggc ggcggcggcg gcggtggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggct c 81 <210> 742 <211> 89 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> genomic sequence of miRNA precursor <400> 742 gccgcccccg ccgccgccgc cgccgccgcc gccgccgccg ccgcccgctt tcggctcggg 60 cctcaggtga gtcggagggg ccgggcgcc 89 <210> 743 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 743 ggcggagugc ccuucuuccu gg 22 <210> 744 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 744 ggagggccca aguccuucug au 22 <210> 745 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 745 gaccaggguc cggugcggag ug 22 <210> 746 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> genomic primer sequence <400> 746 agggtccggt gcggagt 17 <210> 747 <211> 12 <212> RNA <213> Bos taurus <400> 747 ggguccggug cg 12 <210> 748 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> genomic primer sequence <400> 748 tgcggagtgc cctttgtcct 20 <210> 749 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> genomic primer sequence <400> 749 ggagggccca agtccttctg at 22 <210> 750 <211> 14 <212> RNA <213> Caenorhabditis remanei <400> 750 cccaagugcu ucug 14 <210> 751 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> genomic primer sequence <400> 751 cggagtgccc ttcttcct 18 <210> 752 <211> 12 <212> RNA <213> Zea mays <400> 752 gugcccuucu uc 12

Claims (33)

  1. ECACC 수탁 번호 04091601을 갖는 CTX0E03 신경 줄기 세포주로부터 유래된 신경 줄기 세포 마이크로입자.
  2. 제1항에 있어서, hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 및 hsa-miR-4532로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 신경 줄기 세포 마이크로입자.
  3. 제1항에 있어서, 엑소좀(exosome), 마이크로소포, 막 입자, 막 소포, 엑소좀 유사 소포, 엑토솜(ectosome) 유사 소포, 엑토솜 또는 외부소포(exovesicle)인 신경 줄기 세포 마이크로입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포주가 혈청 비함유 배지 중에서 성장된 것인 신경 줄기 세포 마이크로입자.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 전자현미경법으로 측정할 때 30㎚ 내지 1000㎚ 또는 30 내지 200㎚ 또는 30 내지 100㎚의 크기; 또는
    (b) 1.1 내지 1.2g/㎖의 수크로스 중의 밀도
    를 갖는 신경 줄기 세포 마이크로입자.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, mRNA를 포함하는 신경 줄기 세포 마이크로입자.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 신경 줄기 세포 마이크로입자:
    (a) 세라마이드, 콜레스테롤, 스핑고미엘린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티딜콜린으로부터 선택된 지질;
    (b) hsa-let-7g, hsa-miR-101, hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-126, hsa-miR-128, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-130a, hsa-miR-134, hsa-miR-137, hsa-miR-155, hsa-miR-15a, hsa-miR-15b, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-182, hsa-miR-183, hsa-miR-185, hsa-miR-18b, hsa-miR-192, hsa-miR-194, hsa-miR-195, hsa-miR-20a, hsa-miR-20b, hsa-miR-210, hsa-miR-218, hsa-miR-301a, hsa-miR-302a, hsa-miR-302c, hsa-miR-345, hsa-miR-375, hsa-miR-378, hsa-miR-7, hsa-miR-9, hsa-miR-93, hsa-miR-96 및 hsa-miR-99a로부터 선택된 miRNA;
    (c) 테트라스파닌;
    (d) TSG101, 알릭스(Alix), CD109 또는 thy-1; 또는
    (e) CD133.
  8. 제7항에서, 테트라스파닌이 CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 및 CD37로부터 선택된 것인 신경 줄기 세포 마이크로입자.
  9. 제1항에 있어서, 외인성 단백질, 핵산, 지질, 약물, 프로드럭, 치료학적 물질 또는 진단학적 물질을 포함하는 신경 줄기 세포 마이크로입자.
  10. CTX0E03 신경 줄기 세포-조정 배지로부터 마이크로입자를 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 또는 제3항에 정의된 신경 줄기 세포 마이크로입자의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 외인성 핵산, 지질, 단백질, 약물, 프로드럭, 치료학적 물질 또는 진단학적 물질을 상기 단리된 마이크로입자로 로딩하는 단계를 더 포함하는,
    신경 줄기 세포 마이크로입자의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 외인성 핵산, 지질, 단백질, 약물, 프로드럭, 치료학적 물질 또는 진단학적 물질은 상기 마이크로입자에 직접 첨가되는 것인,
    신경 줄기 세포 마이크로입자의 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 외인성 핵산은 전기천공에 의해 상기 마이크로입자로 로딩되는 것인,
    신경 줄기 세포 마이크로입자의 제조 방법.
  14. CTX0E03 줄기 세포-조정 배지로부터 마이크로입자를 단리하는 단계를 포함하는 줄기 세포 마이크로입자를 제조하는 방법으로서,
    (ⅰ) 줄기 세포-조정 배지가 줄기 세포들에 의한 배지로의 마이크로입자들의 방출을 유도하는 하나 이상의 성분들을 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 성분들은 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 인터페론-감마(INF-γ) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)로부터 선택된 것이거나;
    (ⅱ) 줄기 세포들이 02가 10% 미만인 저산소 조건 하에 배양되거나;
    (ⅲ) 줄기 세포들이 상이한 세포 유형과 동시 배양되고, 여기서 상기 상이한 세포 유형은 내피 세포이거나;
    (ⅳ) 줄기 세포들이 다구획 생물반응기에서 배양되는 것이며,
    여기서 CTX0E03는 ECACC 수탁 번호 04091601을 갖는 신경 줄기 세포주인 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 따른 마이크로입자 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이고,
    상기 조성물은
    (a) 손상 조직의 치료 또는 복구를 위한 재생 치료;
    (b) (ⅰ) 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중 또는 ALS로부터 선택되는 신경학적 장애, 질환 또는 결핍;
    (ⅱ) 리소좀 축적 장애;
    (ⅲ) 심근경색, 울혈성 심부전, 말초 동맥 질환, 당뇨병성 궤양 및 상처 치유로부터 선택되는 심혈관 장애;
    (ⅳ) 특발성 폐 섬유증, 호흡 곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐 질환, 특발성 폐 고혈압, 낭포성 섬유증 및 천식으로부터 선택되는 폐의 질환들;
    (ⅴ) I형 당뇨병, II형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 골관절염, 루푸스, 크론씨병, 과민성 장 질환 또는 이식편 대 숙주 질환으로부터 선택되는 대사 또는 염증성 장애;
    (ⅵ) 우울증, 조울증, 또는 정신분열증로부터 선택되는 정신학적 장애, 또는 자폐증, 아스퍼거 증후군(Asperger's syndrome) 또는 레트 증후군(Rett Syndrome)으로부터 선택되는 자폐증 장애;
    (ⅶ) 나이 관련 황반변성, 스타가르트 질환(Stargardt disease), 당뇨병성 망막증 또는 색소성 망막염으로부터 선택되는 망막의 실명 유발 질환; 또는
    (ⅷ) 다발성 경화증, 뇌교 수초 용해증, 척수매독, 횡단성 척수염, 데빅병(Devic's disease), 진행성 다소성 백질뇌증, 시신경염, 백질이영양증, 갈랑 바레 증후군, 항-MAG 말초 신경병증 및 샤르코 마리 투스병(Charcot-Marie-Tooth disease)으로부터 선택되는 탈수초성 질환
    의 치료; 및
    (c) 인지 회복을 개선하는 치료
    로부터 선택되는 치료에 사용하기 위한 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 뇌졸중, 말초 동맥 질환 또는 망막의 실명 유발 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    (ⅰ) 상기 마이크로입자가 엑소좀이고, 상기 조성물이 조직 대체, 재생 또는 복구를 요하는 질환 또는 병증의 치료에 사용하기 위한 것이거나; 또는
    (ⅱ) 상기 마이크로입자가 마이크로소포이고, 상기 조성물이 신생혈관생성을 요하는 질환 또는 신경학적 질환, 장애 또는 결핍의 치료에 사용하기 위한 것인 조성물.
  18. ECACC 수탁 번호 04091601을 갖는 CTX0E03 신경 줄기 세포주로부터의 줄기 세포에 의한 마이크로입자의 제조 속도를 변경하는 물질을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 줄기 세포를 후보 물질과 접촉시키는 단계 및 접촉된 줄기 세포에 의한 마이크로입자들의 제조 속도가 대조군에 비해 증가하거나 감소하는지를 관찰하는 단계를 포함하는 방법.
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