WO2016043410A1 - Oct4 및 sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포 및 그 용도 - Google Patents

Oct4 및 sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포 및 그 용도 Download PDF

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WO2016043410A1
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sox2
oct4
mesenchymal stem
stem cells
cells
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PCT/KR2015/006244
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윤화영
이희우
한세명
장구
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서울대학교산학협력단
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes

Definitions

  • the present application relates to the use of mesenchymal stem cells and liver disease cell therapy for overexpressing Oct4 and Sox2.
  • stem cells for therapeutic purposes have been rapidly increasing in various fields such as metabolic diseases, degenerative diseases, cancer and repair of damaged tissues.
  • Stem cells are cells that have the ability to differentiate into various types of body tissues, and include largely embryonic stem cells, adult stem cells, and pluripotent induced stem cells.
  • the research on the treatment using adult stem cells is the most active, which, unlike embryonic stem cells, has the advantage that it is possible to use autologous cells to minimize the immune cell response, which is one of the problems of ethical aspects and stem cell therapeutics.
  • Adult stem cells are distinct from embryonic stem cells obtained early in the development of fertilized eggs and are stem cells found after development. It refers to cells with various forms of regenerative capacity even after the end of development in each part of the body, and they have varying degrees of multidifferentiation. Refers to a comprehensive collection of stem cells found in bone marrow, umbilical cord blood, skin, adipose tissue, nerve tissue, liver, pancreatic ducts, and the like.
  • liver is an important organ in the body that maintains its properties such as detoxification, hormone production, plasma protein synthesis, red blood cell breakdown, and glycogen storage.
  • liver transplantation is the only established method for treating liver failure due to advanced chronic liver disease.
  • liver transplantation has problems such as an absolute shortage of donors, high medical costs, surgical complications, continuous immunosuppressive and chronic renal failure, and cardiovascular complications after transplantation.
  • treatment for cirrhosis remains to maximally delay the progression of symptoms and the resulting decrease in liver function.
  • stem cell-based cell therapy can replace damaged liver cells and correct the imbalance between damage and regeneration of hepatic substrates.
  • Korean Unexamined Patent Publication No. 2010-0059781 discloses a multipotent / pluripotent cell and a manufacturing method.
  • the efficiency of hepatocyte differentiation is low, and the stem cells that can differentiate into hepatocytes, the differentiation mechanism, and the research and treatment for improving the differentiation efficiency are very poor, and the development and research are urgent.
  • the present application is to provide a stem cell with improved proliferative capacity and differentiation ability to specific cells and a therapeutic agent using the same.
  • the disclosure provides mesenchymal stem cells overexpressing Oct4 and Sox2.
  • Mesenchymal stem cells may be of various origin, in particular may be derived from human adipose tissue.
  • Cells according to the present invention has been increased stem cells, proliferative capacity, differentiation ability to osteocytes or hepatocytes by overexpression of Oct4 and Sox.
  • the present application also relates to mesenchymal stem cells overexpressing Oct4 and Sox2 according to the present disclosure; Progenitor cells capable of differentiating into hepatocytes or bone cells derived from the mesenchymal stem cells; Or it provides a pharmaceutical composition for treating liver disease or bone disease comprising hepatocytes or bone cells differentiated from the mesenchymal stem cells as an active ingredient, respectively.
  • the mesenchymal stem cells according to the present application may be autologous, taga or heterologous, and in particular autologous derivation may be used.
  • composition according to the present invention may be injected via intravenous injection or administered locally, such as by direct injection into an organ or damaged tissue in need of application of the cell or composition according to the present application.
  • the cells or compositions according to the present invention can be used for the treatment of various liver diseases, such as acute or chronic hepatitis, cirrhosis or hepatocellular carcinoma, which are caused by the damage of hepatocytes, which require the production of hepatocytes, for example viruses, alcohols or drugs.
  • liver diseases such as acute or chronic hepatitis, cirrhosis or hepatocellular carcinoma, which are caused by the damage of hepatocytes, which require the production of hepatocytes, for example viruses, alcohols or drugs.
  • Cells or compositions according to the present invention is a variety of bone diseases that require the production of osteocytes due to bone damage, such as osteoporosis, incomplete bone formation, osteomalacia, fractures, osteofibromatosis, cystic fibrosis, exfoliate osteochondritis, osteoporosis It can be used to treat bone cancer, chondroma, or secondary bone tumors.
  • the present invention also provides a method for treating liver disease or bone disease, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a cell or composition according to the present invention.
  • the proliferative capacity of mesenchymal stem cells overexpressing Oct4 and Sox2 and differentiation into adipocytes, bone cells and hepatocytes were significantly improved.
  • hepatocytes with increased hepatocellular function such as urea production and glycogen synthesis ability can be obtained compared to conventional adipose-derived mesenchymal stem cells, which are used to treat chronic liver disease such as cirrhosis. Not only can it replace tissue transplantation, but it can also improve liver function and promote regenerative damage caused by liver disease.
  • Figure 1 is an analysis of Oct4 and Sox2 expression in Oct4 / Sox2-ATMSC according to an embodiment of the present application
  • A is RTP-PCR analysis Oct4 and Sox2 expression in Oct4 / Sox2-ATMSC 24 hours after transformation RFP-
  • the results were significantly higher than in ATMSC and RT-PCR results were assessed semi-quantitatively using densitometry.
  • the results are expressed as the percentage of Oct4 and Sox2 expression normalized to GAPDH mRNA levels.
  • Western blot showed high levels of Oct4 and Sox2 expression in Oct4 / Sox2-ATMSC.
  • Western blot results were assessed semi-quantitatively using densitometry.
  • the results are expressed as the percentage of Oct4 and Sox2 expression normalized to beta-actin protein levels.
  • the data are the results of three independent experiments with similar results, with data presented as mean ⁇ s.d. ** determined by Student's t-test, p ⁇ 0.01 compared to control (RF
  • FIG. 2 shows phenotypes of RFP- and Oct4 / Sox2-transformed ATMSCs according to one embodiment of the present application, untransformed MSCs of passage 3, RFP-transformed ATMSCs of passage 5 and Oct4 / of passage 5 Sox2-transformed ATMSCs have surface markers of CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90 and CD105. Expression of surface markers of ATMSCs transformed with Oct4 / Sox2 or RFP was not different from that of untransformed ATMSCs. The data are the results of three independent experiments with similar results.
  • FIG. 3 shows the results of proliferation analysis using Oct4 / Sox2-ATMSCs according to an embodiment of the present application
  • A is WST-1 analysis, Oct4 / Sox2-ATMSC at days 1, 2 and 3 is higher than RFP-ATMSC It has cellular metabolic activity.
  • B showed a significant increase in viable cell numbers in Oct4 / Sox2-ATMSCs cultured for 9 days compared to RFP-ATMSCs in a trypan blue exclusion assay. Data is shown as mean ⁇ s.d. ** P ⁇ 0.01 as determined by Student's t-test compared to the corresponding control value.
  • FIG. 4 shows the cell cycle analysis by flow cytometry, and Western blot analysis of cyclin D1 in Oct4 / Sox2-ATMSCs according to an embodiment of the present application
  • A is a representative flow cytometry results of RFP- and Oct4 / Sox2-ATMSCs to be.
  • B is the percentage of cells at each cell cycle stage as determined by flow cytometry analysis.
  • the cell cycle analysis showed that the ratio of Oct4 / Sox2-ATMSCs in G0 / G1 phase was decreased while in S phase.
  • FIG. 5 shows an RT? PCR analysis for adipogenic differentiation analysis and adipogenic marker using Oct4 / Sox2-ATMSCs according to an embodiment of the present application.
  • A was strong at 7, 14 and 21 days for oil red O staining for lipid droplets in Oct4 / Sox2-transformed ATMSCs during adipose differentiation compared to RFP-ATMSC.
  • B showed a significant increase in PPAR ⁇ and lipoprotein lipase mRNA expression at days 7, 14 and 21 during adipose differentiation as a result of RT-PCR.
  • the amount of PPAR ⁇ in RT-PCR was assessed semi-quantitatively with densitometry. The results are expressed as the percentage of PPAR ⁇ expression normalized to GAPDH mRNA levels.
  • the data are three independent experiments with similar results: 1 for RFP-ATMSCs and 2 for Oct4 / Sox2-ATMSC.
  • FIG. 6 shows RT-PCR for osteogenic differentiation analysis and osteogenic markers using Oct4 / Sox2-ATMSCs according to an embodiment of the present application, where A is compared with RFP-ATMSCs, Alizarin Red S staining for mineralization in Oct4 / Sox2-ATMSCs during osteogenic differentiation was strong at 7, 14 and 21 days.
  • B showed in RT-PCR upregulation of collagen I and osteocalcin mRNA levels in Oct4 / Sox2-ATMSCs at days 7, 14 and 21 during osteogenic differentiation compared to RFP-ATMSCs.
  • Band density of collagen I and osteocalcin in RT-PCR was assessed semi-quantitatively with densitometry. Results are shown as the ratio of collagen I and osteocalcin expression normalized with GAPDH mRNA. The data show the results of three independent experiments with similar results: 1 for RFP-ATMSCs and 2 for Oct4 / Sox2-ATMSC.
  • Figure 7 is the result of observing the cell morphology after induction of hepatic differentiation of Oct4 / Sox2-ATMSC according to an embodiment of the present application.
  • liver marker expression after induction of hepatocyte differentiation is a result of analysis of liver marker expression after induction of hepatocyte differentiation according to an embodiment of the present application.
  • 9 is a result of analyzing differentiation into hepatocytes through immunofluorescence staining according to an embodiment of the present application.
  • the present application is based on the finding that the overexpression of Oct4 and Sox2 genes in mesenchymal stem cells increased the stem cell proliferation and proliferative capacity of mesenchymal stem cells and increased the efficiency of osteoblast and hepatocyte differentiation.
  • the present application relates to mesenchymal stem cells overexpressing Oct4 and Sox2.
  • MSC Mesenchymal Stem Cell
  • adipocytes chondrocytes
  • chondrocytes pluripotent or multipotent cells capable of differentiating into osteoblasts and the like.
  • mesenchymal stem cells are characterized by being able to effectively engraft in allogeneic or heterologous recipients without the use of immunosuppressive agents.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells of animals, preferably mammals, more preferably humans.
  • the mesenchymal stem cells are stem cells derived from adipose tissue.
  • Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have a practical advantage in that they can be provided in large quantities, unlike bone marrow, amniotic fluid, and cord blood stem cells, and about 1% of fat cells are estimated to be stem cells. Considering that the plastic surgery being performed is liposuction, the fat-derived stem cells are virtually infinitely useful.
  • the procedure for obtaining mesenchymal stem cells is as follows: Mesenchymal stem cells from a mammal, including human or mouse, preferably human, mesenchymal stem cell sources, such as adipose tissue, blood or bone marrow Isolate stem cells. The cells are then cultured in a suitable medium. Suspension cells are removed during the culturing and passaged cells attached to the culture plate are obtained to finally obtain mesenchymal stem cells.
  • the medium used in the above process any medium commonly used for culturing stem cells can be used.
  • the medium contains serum (eg fetal calf serum, horse serum and human serum).
  • serum eg fetal calf serum, horse serum and human serum.
  • Mediums that can be used in the present invention are, for example, RPMI series, Eagles' MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)), ⁇ -MEM (Stanner, CP et al., Nat New Biol. 230: 52 (1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)), 199 medium (Morgan et al., Proc. Soc.Exp.
  • the medium may include other components such as antibiotics or antifungal agents (eg, penicillin, streptomycin), glutamine, and the like. General descriptions of media and cultures are described in R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984), which is incorporated herein by reference.
  • Identification of mesenchymal stem cells can be carried out, for example, via flow cytometry. Such flow cytometry is performed using specific surface markers of mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells according to the present expression CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105.
  • Mesenchymal stem cells according to the present application overexpress Oct4 and Sox2.
  • the proliferative and differentiating ability of mesenchymal stem cells was improved. Specifically, it was confirmed that cell activity and differentiation into bone, adipocytes, and hepatocytes were enhanced, and in particular, the efficiency of differentiation into hepatocytes was enhanced.
  • Oct4 and Sox2 are transcription factors belonging to the Sox and octamer protein binding family, so as to achieve the object of the present invention, as long as the effects of the present invention are achieved.
  • Oct4 and Sox2 genes of various origins and / or forms are mesenchymal stem It can be introduced into cells and used for their expression. Genes in which part of the nucleotide sequence is artificially modified, and genes in which a part of the nucleotide sequence is naturally modified, or fragments thereof, are advantageous, as well as wild type sequences, such as characteristics such as expression in cells or stability of proteins. It is to include.
  • Modification of a gene sequence may or may not involve a modification of the corresponding amino acid, where in the case of an amino acid modification, the gene that caused the modification may be substituted, deleted, added, or substituted with one or more amino acids in the protein encoded by it. And / or encodes a protein consisting of an inserted amino acid sequence, comprising mutants, derivatives, alleles, variants and homologues. If the mutation of the gene sequence does not involve modification of amino acids in the protein, for example, there are degeneracy mutations, and such degeneracy mutants are also included in the gene of the present invention.
  • the gene described above may be provided in the form of a vector operably linked to a promoter to enable expression in the cells of the subject to which the pharmaceutical composition is administered.
  • the Oct4 and Sox2 genes are of mammalian origin, such as apes, humans, etc., in particular human.
  • Oct4 and Sox2 genes and proteins may also be used as long as they achieve their full length or effects herein, and full length sequences are available, for example, from GenBank Accession Number (Oct4: NM_002701.4; Sox2: NM_003106.3). Can be.
  • Overexpression of these genes significantly improved proliferative capacity and differentiation ability into specific cells.
  • Oct4 and Sox2 genes produced primers capable of specifically recognizing them from the known sequences, using them to amplify the genes through polymerase chain reaction and eukaryotic expression as described above.
  • the expression vectors are cloned so that the Oct4 and Sox2 genes are operably linked to expression promoters in appropriate eukaryotic expression vectors, such as phage, virus or retrovirus derived vectors or plasmids.
  • appropriate eukaryotic expression vectors such as phage, virus or retrovirus derived vectors or plasmids.
  • Methods of introduction include, but are not limited to, for example, calcium phosphate, DEAE-dextran mediated transduction, positively charged lipid mediated transduction, electroporation, transduction using phage systems, or infection with viruses, and the like. It is not.
  • the present application relates to a pharmaceutical composition or cell therapy for treating bone disease or liver disease, including mesenchymal stem cells overexpressing Oct4 and Sox2.
  • cell therapy refers to the proliferation or selection of live autologous, allogenic, xenogenic cells in vitro to alter the function of cells and tissues, or to alter the biological characteristics of the cells by other means. Medicines used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention through a series of methods. Since 1993, the United States has managed cell therapy as a medicine since 2002. Such cell therapies include, but are not limited to, stem cell therapies for tissue regeneration or organ function recovery.
  • Mesenchymal stem cells included in the pharmaceutical composition or cell therapeutic agent of the present invention may be referred to the above description.
  • the mesenchymal stem cells included in the pharmaceutical composition or cell therapeutic agent of the present disclosure may be autologous or taga or allogenic or xenogenic. Most preferably, since it is autologous and derived from the recipient, there is an advantage that the administration of the pharmaceutical composition is safe and safe from the problem of the immune response.
  • the mesenchymal stem cells included in the pharmaceutical composition or cell therapeutic agent of the present application may be mesenchymal stem cells of an animal, preferably may be mesenchymal stem cells of a mammal, more preferably human.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention may be derived from adipose tissue, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, liver, in particular adipose tissue.
  • treatment means to reverse, alleviate, inhibit, or prevent the progression of one or more symptoms of the disease or condition to which the term applies. .
  • cells that may be included in the cell therapy products herein include progenitor cells that can differentiate into hepatocytes, derived from mesenchymal stem cells, and / or cells differentiated into hepatocytes.
  • liver disease refers to a condition impairing liver function or damage to liver tissue thereby, and includes a disease that can be treated by the cells or compositions according to the present invention, such as the production of hepatocytes. Examples include, but are not limited to, acute or chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma caused by viruses, alcohols or various drugs. Even if the disease name is unclear, the liver disease also includes symptoms in which abnormalities are observed in indicators of liver function such as GOT, GPT, and ⁇ -GTP.
  • bone disease refers to a disease that requires the production of osteocytes, osteoporosis, incomplete bone formation, osteomalacia, fractures, osteofibroblasts, cystic fibrosis, exfoliated osteochondritis, osteoporosis, bone cancer, chondroblastoma, secondary Bone tumors.
  • the route of administration of the cell therapeutic agent or pharmaceutical composition comprising the cells according to the present application can be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • Parenteral administration for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration may be, but is not limited thereto.
  • the compositions according to the invention can be administered topically in a manner that is administered intravenously or directly to a damaged organ, such as the liver or liver tissue, which requires administration of the cells or compositions according to the invention.
  • the cell therapy or composition according to the present application is administered topically around a bone that is physically and / or pathologically damaged.
  • Therapeutic agents or compositions according to the invention may be formulated in a suitable form with the pharmaceutically acceptable carriers generally used.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, water, suitable oils, saline, carriers for parenteral administration such as aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • composition for cell therapy according to the present invention if necessary according to the administration method or dosage form, suspensions, dissolution aids, stabilizers, isotonic agents, preservatives, adsorption agents, surfactants, diluents, excipients, pH adjusters, analgesics , Buffers, antioxidants, and the like may be appropriately included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition.
  • the cell therapy composition of the present invention is in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art. It can be made or prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the composition may also be administered by any device in which the cell therapy agent can migrate to the target cell.
  • the cell therapy composition of the present invention may comprise a therapeutically effective amount of cell therapy for the treatment of a disease.
  • the term 'therapeutically effective amount' means an amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as thought by a researcher, veterinarian, physician or other clinical person, Amounts that induce alleviation of the symptoms of the disease or disorder. It will be apparent to those skilled in the art that the cell therapy agent included in the composition of the present invention will vary depending on the desired effect.
  • the optimal cell therapy content can be readily determined by one skilled in the art and includes the type of disease, the severity of the disease, the amount of other components contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, general health, sex and diet of the patient. It can be adjusted according to various factors including the time of administration, the route of administration and the rate of secretion of the composition, the duration of treatment, and the drugs used simultaneously.
  • the dosage of the composition of the present invention is 1.0 ⁇ 10 7 to 1.0 ⁇ 10 8 cells / kg (body weight), more preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 based on cells differentiated from stem cells as active ingredients. 8 cells / kg body weight.
  • the dosage may be variously prescribed by such factors as the formulation method, the mode of administration, the age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and reaction sensitivity of the patient. These factors can be taken into account to properly adjust the dosage.
  • the number of administrations may be one or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered to one or more than two sites for the administration site.
  • the same dosage as that of humans per kg or the volume ratio (for example, average value) of ischemic organs (heart, etc.) between the animal of interest and humans can be adjusted.
  • Equivalent amounts may be administered.
  • the animal to be treated according to the present invention include humans and mammals for other purposes, and specifically include humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cattle, dogs, horses, pigs, and the like. do.
  • the present invention also provides a method for treating liver disease or bone disease, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a cell or composition according to the present invention.
  • Cells, compositions and effective amounts, methods of administration and the like used in the methods according to the present application may be referred to the foregoing.
  • Oct4 and Sox2 obtained from human embryonic stem cells are amplified and inserted into PB-CA vector (Addgene, USA) and inserted into human adipose tissue mesenchymal stem cells (ATMSCs). Introduced. Subsequent overexpression of Oct4 and Sox2 was confirmed through reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunoblotting (Western blot) in Oct4 / Sox2-ATMSCs.
  • Oct4-IRES-Sox2 was inserted into PB-CA vector (Addgene, USA).
  • the vector was then introduced into human adipose tissue mesenchymal stem cells (ATMSC) using D-fection transfection reagent (Lugen Sci, Seoul, Korea) according to the manufacturer's method. It was. Transformed cells were stored in liquid nitrogen until use, and red fluorescent protein (Life Technology, USA) (RFP) was inserted into the PB-CA vector as a control.
  • ATMSC human adipose tissue mesenchymal stem cells
  • RFP red fluorescent protein
  • Transformed cells were suspended in fusion buffer (25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate and 0.1% SDS) containing protein inhibitors and incubated on ice for 30 minutes. After centrifugation at 16000 x g for 4 minutes at 4 °C, the supernatant containing the total cell extracts were collected and stored at -80 °C. The protein obtained from the cell extract was electrophoresed and transferred to a Hybond-PVDF membrane (Amersham Biosciences, USA).
  • fusion buffer 25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate and 0.1% SDS
  • the membrane was incubated for 1 hour at room temperature in blocking buffer (TBS-T containing 5% skim milk) and then diluted in blocking buffer, Oct4 (1: 1000), Sox2 (1: 500) Incubated overnight at 4 ° C with primary antigens against cyclin D1 (1: 1000) or beta-actin (1: 1000) (Santa Cruz Biotechnology Inc USA).
  • TBS-T blocking buffer
  • secondary antigen diluted in blocking buffer (1: 3000).
  • Antibody binding was visualized using the West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit (GenDEPOT, USA) according to the manufacturer's method.
  • FIGS. 1 and 2 The results are described in FIGS. 1 and 2.
  • RT-PCR and immunoblotting assays to assess expression of Oct4 and Sox2 in ATMSCs transformed with Oct4 / Sox2 genes levels of Oct4 and Sox2 mRNAs were significantly higher in ATMSCs than in RFP-ATMSCs, whereas RFPs Little Oct4 and Sox2 expression levels in -ATMSC were detected.
  • Immunoblotting analysis showed that Oct4 and Sox2 protein expression was significantly upregulated in Oct4 / Sox2-ATMSC.
  • Flow cytometry was performed to analyze cell surface marker expression in RFP- and Oct4 / Sox2 ATMSCs.
  • passage 5 a rapidly dividing homogeneous cell population with a fibroblastoid form was obtained.
  • ATMSC was fixed in 70% ethanol at 4 ° C. and stained for 30 min on ice with primary antibodies recognizing various surface molecules.
  • PE Phycoerythrin-conjugated
  • FITC fluorescein isothiocyanate-conjugated
  • PE mouse antimicrobial for cell surface antigen detection -Human CD34 BD Biosciences
  • FITC mouse anti-human CD44 BD Biosciences
  • FITC mouse anti-human CD45 BD Biosciences
  • PE mouse anti-human CD73 BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA
  • PE Mouse anti-human CD90 BD Biosciences
  • PE anti-human CD105 / endoglin R & D system, Minneapolis, MN, USA
  • CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD31, CD34 and CD45 were used to analyze the surface markers of the transformed ATMSCs.
  • Flow cytometry analysis revealed that CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105 surface markers were highly expressed in RFP- and Oct4 / Sox2-transformed ATMSCs, and that CD31, CD34, and CD45 surface markers were absent (FIG. 2). . This indicates that the surface marker of ATMSC was not changed by Oct4 / Sox2 gene introduction.
  • ATMSCs were seeded in 1 ⁇ 10 5 cells / well in 6-well culture plates and then incubated at 37 ° C. with 5% CO 2 . After 1, 2, 3, 5, 7 and 9 days, cells were pooled and stained with 0.4% trypan blue solution. Counting of viable cells was performed using a phase contrast microscope with a hemocytometer.
  • the results of the WST-1 and trypan blue exclusion assays showed that Oct4 / Sox2-overexpressing cells had significantly higher viability and proliferation rate than the control. These results were also evaluated in cell cycle progression by better cell cycle analysis and immune blotting of cyclin D1.
  • the cell cycle is a series of events in which cells divide and replicate and is an important process in determining cell proliferation and senescence.
  • the G0 / G1 phase is non-proliferative or resting; S phase contains DNA replication; At G2 the cells are ready to divide; And cleavage occurs in phase M.
  • RFP- and Oct4 / Sox2-ATMSCs were cultured in adipocyte induction medium (Gibco, USA) at a concentration of 5x10 3 cells / cm 2 and the medium was changed every 3 days. After 7, 14 and 21 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde to perform oil red O staining to confirm fat assembly.
  • RFP- and Oct4 / Sox2-ATMSC cells were cultured at a concentration of 5x10 3 cells / cm 2 and after 7, 14 and 21 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde to fix alizarin red S. Staining was performed to determine the mineralized substrate content.
  • Oct4 / Sox2 overexpression increased the number of positive cells stained with Oil Red O or Alizarin Red S and increased adipocyte or osteocytic marker expression, which was caused by Oct4 / Sox2-ATMSC adipocytes or osteocytes.
  • the ability to differentiate into furnaces is increased. It also means that the differentiation capacity was increased by Oct4 and Sox2 overexpression in differentiation media containing all the reagents necessary to induce MSCs into adipocyte and osteocytic pathways.
  • Co-overexpression of Oct4 and Sox2 effectively enhances mesoderm differentiation ability, thereby increasing the stem cellity of ATMSCs.
  • Oct4 / Sox2-ATMSCs are incubated for 2 weeks in first stage hepatocyte differentiation medium.
  • Culture medium contains 2% fetal bovine serum (FBS, HyClone, USA), 4.9 mM nicotinamide (Sigma), 20 ng / mL hepatocyte growth factor (HGF) (Sigma) and 10 ng / mL DMEM (Dulbecco modified Eagles medium) (Hyclone) containing fibroblast growth factor 4 (FGF) (Sigma) was used.
  • FBS fetal bovine serum
  • HyClone HyClone, USA
  • 4.9 mM nicotinamide Sigma
  • 20 ng / mL hepatocyte growth factor (HGF) Sigma
  • 10 ng / mL DMEM Dulbecco modified Eagles medium
  • FGF fibroblast growth factor 4
  • Oct4 / Sox2-ATMSC was incubated in hepatocyte differentiation medium for 4 weeks and then polysaccharide deposition was analyzed by Periodic acid-schiff staining (PAS) (Wako Pure Chemicals, Japan).
  • PAS Periodic acid-schiff staining
  • PAS staining was high in cells induced by differentiation into hepatocytes in Oct4 / Sox2-ATMSC, and when counted under a microscope, the number of PAS positive cells was significantly higher than that in RFP-ATMSC differentiation-inducing cells. Able to know.
  • the culture medium containing 5 mM ammonium chloride (NH 4 Cl) was added for 20 hours to remove the existing culture medium and stimulate urea production instead. After treatment with each cell, the culture solution was obtained, and the concentration of urea was measured by a colorimetric assay.
  • the concentration of urea produced was significantly higher in the differentiation-inducing cells of RFP-ATMSCs than in cells inducing differentiation into hepatocytes in Oct4 / Sox2-ATMSC as shown in FIG. This result shows that the cells that induce differentiation into hepatocytes from Oct4 / Sox2-ATMSCs are functionally superior to the cells capable of acting as hepatocytes.
  • the present invention was found that the adipose derived mesenchymal stem cells overexpressing the Oct4 and Sox2 genes were enhanced cell activity and stem cell (stemness), induced differentiation into bone cells and hepatocytes.
  • stemness stem cell
  • uric acid formation ability and glycogen synthesis ability increased as compared with general adipose-derived mesenchymal stem cells inducing differentiation into hepatocytes. Therefore, the present invention shows that the adipose derived mesenchymal stem cells (Oct4 / Sox2-ATMSCs) overexpressing Oct4 and Sox2 can be differentiated into functionally efficient hepatocytes, which is very useful as a cell therapeutic agent for liver disease.
  • the present invention which enhances the differentiation of stem cells and stem cells using Oct4 and Sox2, as well as differentiation into bone cells and hepatocytes, is very useful as a cell therapeutic agent for diseases caused by bone diseases or liver tissue damage.

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Abstract

본원은 Oct4와 Sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 세포치료제로서의 용도를 개시한다. 본원에 따른 Oct4와 Sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포는 증식능과 지방세포, 골세포 및 간세포로의 분화능이 월등히 향상되어, 특히 간경변증과 같은 만성간질환의 치료에 사용되어, 간질환에 의해 손상된 간 기능을 개선하고 재생 촉진효과를 기대할 수 있다.

Description

OCT4 및 SOX2를 과발현하는 중간엽줄기세포 및 그 용도
본원은 Oct4 및 Sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포 및 간질환 세포치료제로서의 그 용도와 관련된 것이다.
최근 들어 줄기세포를 대사성질환, 퇴행성질환, 암 및 손상된 조직의 복구 등 여러 분야에 걸쳐 치료적 목적으로 사용하려는 시도 및 연구가 급격히 증가하고 있다.
줄기세포는 여러 종류의 신체조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포로, 크게, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 만능유도줄기세포 등을 들 수 있다. 이중 성체줄기세포를 이용한 치료제 연구가 가장 활발하여, 이는 배아줄기세포와 달리 윤리적인 면과 줄기세포 치료제의 문제점의 하나인 면역세포 반응을 최소화 할 수 있는 자가세포 사용이 가능하다는 장점이 있다. 성체줄기세포는 수정란의 발생 초기에 얻게 되는 배아줄기세포와 구별되며 발생과정 후 발견되는 줄기세포를 말한다. 신체의 각 부분에 발생과정이 끝난 이후에 도 다양한 형태의 재생능을 가진 세포를 말하며, 이들은 다양한 정도의 다중분화능을 갖는다. 골수(bone marrow), 제대혈(umbilical cord blood), 피부, 지방조직, 신경조직, 간장, 췌담도 등에서 발견되는 줄기세포의 총괄적 집합체를 말한다.
간은 생체조직에서 해독작용, 호르몬 생산, 혈장 단백질 합성, 적혈구 분해, 글라이코겐 저장과 같이 우리 몸에서 대사항상성을 유지하는 중요한 기관이다. 전세계적으로 만성 간질환으로 인한 사망률이 급속히 증가하고 있지만, 현재까지 진행성 만성 간질환으로 인한 간부전의 치료법으로 확립된 방법은 간이식뿐이다. 하지만 간이식은 공여자의 절대적인 부족, 높은 의료비용, 수술의 합병증, 지속적인 면역억제제 투여와 만성 신부전, 이식 후 심혈관 합병증 등의 문제점을 가지고 있다. 현재까지 간경변증에 대한 치료는 증상의 진행 및 그로 인한 간 기능의 저하를 최대한 지연시키는데 머무르고 있다.
이런 대안으로 최근 줄기세포를 이용한 치료연구가 많이 진행되고 있다. 간경변의 발병원인의 관점에서, 줄기세포를 기반으로 하는 세포치료는 손상된 간세포를 대체하고, 간세포기질의 손상과 재생사이의 불균형을 교정할 수 있다.
하지만 기존에 중간엽줄기세포를 이용한 간세포 분화 및 간경변 치료에 관한 연구는 미미한 편이며, 대부분의 경우 아무런 유전자 조작없이 중간엽줄기세포만 이용하여 간세포 분화를 유도하였다. 그러나 간경변과 같은 만성간질환을 치료하기 위해서 분화능력을 더욱 증진시켜 세포치료제로 이용이 가능할 만큼 간세포분화능력이 뛰어난 줄기세포 치료제를 얻기 위한 방법의 개발이 필요하다.
대한민국 공개특허공보 제2010-0059781호는 다분화성/다능성 세포 및 제조방법을 개시하고 있다.
하지만 임상적용에서 간세포 분화의 효율성이 낮고 아직 간세포로의 분화할 수 있는 줄기세포와 분화기전, 분화 효율성을 높이는 연구 및 치료제 개발은 매우 미비한 실정으로, 그 개발 및 연구가 시급하다.
본원은 증식능과 특정 세포로의 분화능이 향상된 줄기세포 및 이를 이용한 치료제를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 Oct4 및 Sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포를 제공한다.
본원에 따른 중간엽줄기세포는 다양한 유래 일 수 있으며, 특히 인간 지방조직 유래일 수 있다.
본원에 따른 세포는 상기 Oct4 및 Sox의 과발현에 의해 줄기세포성, 증식능, 골세포 또는 간세포로의 분화능이 증가되었다.
따라서 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 Oct4 및 Sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포; 상기 중간엽줄기세포로부터 유래된 간세포 또는 골세포로 분화될 수 있는 전구세포; 또는 상기 중간엽줄기세포로부터 분화된 간세포 또는 골세포를 각각 유효성분으로 포함하는 간질환 또는 골질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본원에 따른 중간엽줄기세포는 자가, 타가 또는 이종유래일 수 있으며, 특히 자가 유래가 사용될 수 있다.
본원에 따른 조성물은 정맥주사를 통해 주입되거나 또는 본원에 따른 세포 또는 조성물의 적용을 필요로 하는 장기 또는 손상된 조직에 직접 주사 등의 방법을 통해 국소투여될 수 있다.
본원에 따른 세포 또는 조성물은 간세포의 손상으로 인해 간세포의 생성이 필요한 다양한 간질환 예를 들면 바이러스, 알코올 또는 약물에 유발된 급성 또는 만성 간염, 간경화 또는 간세포암의 치료에 사용될 수 있다.
본원에 따른 세포 또는 조성물은 골의 손상으로 인해 골세포의 생성이 필요한 다양한 골질환 예를 들면 골다공증, 불완전뼈형성, 골연화증, 골절, 골섬유형성이상, 낭성섬유뼈염, 박리뼈연골염, 골석화증, 골암, 연골모세포종, 또는 이차성골종양 치료에 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 치료적으로 유효한 양의 본원에 따른 세포 또는 조성물을 간질환 또는 골질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 간질환 또는 골질환 치료 방법을 제공한다.
본원에 따른 Oct4와 Sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포의 증식능과 지방세포, 골세포 및 간세포로의 분화능이 월등히 향상되었다. 특히 간세포로 분화유도한 경우 기존의 지방유래 중간엽줄기세포에 비하여 요소생성능력과 글리코겐합성능력과 같은 간세포기능이 증가된 간세포를 수득할 수 있어 간경변증과 같은 만성간질환의 치료에 사용되어, 간조직 이식을 대체할 수 있음은 물론 간질환에 의해 손상된 간 기능을 개선하고 재생 촉진효과를 기대할 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른 Oct4/Sox2-ATMSC에서 Oct4 및 Sox2 발현을 분석한 것으로 A는 RT-PCR 분석으로 Oct4/Sox2-ATMSC에서의 Oct4 및 Sox2 발현이 형질전환 24시간 후에 RFP-ATMSC에서보다 상당히 더 높은 것으로 나타났으며 RT-PCR 결과는 덴시토메트리를 이용하여 반-정량적으로 평가하였다. 결과는 GAPDH mRNA 레벨로 노말라이즈된 Oct4 및 Sox2 발현의 비율로 나타냈다. B는 웨스턴블랏결과로 Oct4/Sox2-ATMSC에서의 Oct4 및 Sox2 발현이 높은 수준으로 나타났다. 웨스턴블랏 결과는 덴시토메트리를 이용하여 반-정량적으로 평가하였다. 결과는 베타-액틴 단백질 레벨로 노말라이즈된 Oct4 및 Sox2 발현의 비율로 나타내었다. 데이터는 유사한 결과를 가진 3회의 독립적인 실험 결과로 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다. ** 스튜던트 t-테스트로 결정하여, 대조군(RFP-ATMSC) 수치와 비교하여 p<0.01.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 RFP- 및 Oct4/Sox2-형질전환된 ATMSC의 표현형을 나타낸 것으로 계대 3의 형질전환되지 않은 MSC, 계대 5의 RFP-형질전환된 ATMSC 및 계대 5의 Oct4/Sox2-형질전환된 ATMSC가 CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90 및 CD105의 표면마커를 갖는다는 것을 나타낸다. Oct4/Sox2 또는 RFP로 형질전환된 ATMSCs의 표면 마커의 발현은 형질전환되지 않은 ATMSC와는 다르지 않았다. 데이터는 유사한 결과를 가진, 3회 독립적인 실험 결과이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 Oct4/Sox2-ATMSCs를 사용한 증식분석 결과를 나타낸 것으로 A는 WST-1 분석으로, 1, 2 및 3일에 Oct4/Sox2-ATMSC가 RFP-ATMSC 보다 더 높은 세포 대사 활성을 가진다는 것을 나타낸다. B는 트립판 블루 배제 분석에서, RFP-ATMSCs와 비교하여 9일 동안 배양한 Oct4/Sox2-ATMSC에서 생존가능한 세포수가 상당히 증가하였다. 데이터는 평균 ± s.d로 나타내었다. ** 스튜던트 t-테스트로 결정하여, 상응하는 대조군 수치와 비교하여 P<0.01.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 유세포계수법에 의한 세포 주기 분석, 및 Oct4/Sox2-ATMSCs에서의 사이클린 D1의 웨스턴블랏 분석을 나타낸 것으로 A는 RFP- 및 Oct4/Sox2-ATMSCs의 대표적인 유세포계수법 결과이다. B는 유세포계수법 분석으로 결정된 각 세포 주기 단계에서의 세포 퍼센트. 대조군(RFP-ATMSCs)과 비교하면, 세포 주기 분석에서 G0/G1기에 Oct4/Sox2-ATMSCs의 비율이 감소한 것으로 나타난 반면, S기에서는 증가한 것으로 나타났다. C는 주요 조절자인 사이클린 D1의 발현은, RFP-ATMSCs와 비교하여, Oct4/Sox2-ATMSCs에서 증가하였다. 데이터는 평균 ± s.d로 나타냈다. ** 스튜던트 t-테스트로 결정하여, 상응하는 대조군 수치와 비교하여 P<0.01.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 Oct4/Sox2-ATMSCs를 사용한 지방세포화 분화(Adipogenic differentiation) 분석 및 지방세포화(adipogenic) 마커에 대한 RT?PCR 분석을 나타낸 것이다. A는 RFP-ATMSC와 비교하여 지방분화 동안 Oct4/Sox2-형질전환된 ATMSC에서 지방 소립(lipid droplets)에 대한 오일 레드 O 염색은 7, 14 및 21일에서 강하였다. B는 RT-PCR 결과로 지방 분화동안 7, 14 및 21일에서 PPARγ 및 지질단백질 리파아제 mRNA 발현이 상당히 증가한 것으로 나타났다. RT-PCR에서 PPARγ의 양은 덴시토메트리로 반-정량적으로 평가하였다. 그 결과를 GAPDH mRNA 레벨로 노말라이즈한 PPARγ 발현의 비율로 나타내었다. 데이터는 유사한 결과를 가진, 3회 독립적인 실험결과로 1은 RFP-ATMSCs, 2는 Oct4/Sox2-ATMSC를 나타낸다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 Oct4/Sox2-ATMSCs를 사용한 골형성(osteogenic) 분화 분석 및 골형성 마커(osteogenic markers)에 대한 RT-PCR을 나타낸 것으로, A는 RFP-ATMSCs와 비교하여, 골형성 분화동안 Oct4/Sox2-ATMSCs에서 미네랄화에 대한 알리자린 레드 S 염색은 7, 14 및 21일에 강하였다. B는 RFP-ATMSCs와 비교하여, 골형성 분화동안 7, 14 및 21일에 Oct4/Sox2-ATMSCs에서 콜라겐 I 및 오스테오칼신 mRNA 레벨이 상향조절된 것으로 RT-PCR에서 나타났다. RT-PCR에서 콜라겐 I 및 오스테오칼신의 밴드 밀도를 덴시토메트리로 반-정량적으로 평가하였다. GAPDH mRNA로 노말라이즈한 콜라겐 I 및 오스테오칼신 발현의 비율로 결과를 나타내었다. 데이터는 유사한 결과를 가진, 3회의 독립적인 실험결과로 1은 RFP-ATMSCs, 2는 Oct4/Sox2-ATMSC를 나타낸다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 Oct4/Sox2-ATMSC의 간분화 유도 후 세포 형태를 관찰한 결과이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 간세포 분화 유도 후 간 마커 발현을 분석한 결과이다.
도 9은 본원의 일 실시예에 따른 면역형광염색법을 통한 간세포로의 분화를 분석한 결과이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른 간세포 분화 유도 후 글리코겐 합성 능력 및 요소 생성 능을 분석한 결과이다.
본원은 중간엽줄기세포에 Oct4와 Sox2 유전자를 과발현하여 중간엽줄기세포의 줄기세포성 및 증식능이 증가되었으며, 골세포 및 간세포 분화 효율을 증가시킬 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
따라서 한 양태에서 본원은 Oct4 및 Sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)’는 제대혈, 지방, 골수(bone marrow), 혈액, 진피 또는 골막에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 골세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다. 또한, 중간엽줄기세포는 면역억제제의 사용 없이도 동종 또는 이종 수혜자에서 효과적으로 생착될 수 있는 특징이 있다. 상기 중간엽줄기세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포일 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서는 중간엽줄기세포는 지방 조직 유래의 줄기세포이다. 지방조직 유래의 중간엽줄기세포는 골수, 양수, 제대혈 줄기 세포와 달리 다량을 제공받을 수 있는 실용적인 장점을 가지고 있고, 지방 세포의 1% 정도가 줄기 세포로 추정되고 있으며, 최근 선진국에서 광범위하게 이루어지고 있는 성형수술이 지방흡입술(liposuction)임을 고려하다면 사실상 지방유래 줄기세포는 무한적인 그 유용성이 높다.
일 구현예에서 중간엽줄기세포를 얻는 과정을 설명하면 다음과 같다: 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 중간엽줄기세포 소스, 예컨대, 지방조직, 혈액 또는 골수로부터 중간엽줄기세포를 분리한다. 이어 상기 세포를 적합한 배지에서 배양한다. 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된(established) 중간엽줄기세포를 수득한다.
또한 골수 등에 매우 적은 양으로 존재하는 중간엽줄기세포는 이를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 미국특허 제5,486,359호에 개시되어 있다.
상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., VirProcy 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mo, h's MB752/1 (Waymo, h, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
중간엽줄기세포의 확인은, 예컨대, 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 간엽줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 중간엽줄기세포는 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105발현한다.
본원에 따른 중간엽줄기세포는 Oct4와 Sox2를 과발현한다. 상기 유전자의 과발현에서 의해 중간엽줄기세포의 증식능 및 분화능이 향상되었다. 구체적으로 세포활성과 골, 지방세포, 간세포로의 분화가 증진됨이 확인되었으며 특히 간세포로의 분화 효율성이 증진되었다.
따라서, Oct4와 Sox2 는 Sox와 옥타머 단백질 결합 패밀리에 속하는 전사인자로 본원 발명의 목적 달성을 위해, 본원 발명의 효과를 달성하는 한, 다양한 유래 및/또는 형태의 Oct4와 Sox2 유전자가 중간엽줄기세포에 도입되어 이의 발현에 사용될 수 있다. 야생형 서열은 물론, 세포내에서의 발현 또는 단백질의 안정성 등과 같은 특징이 유리하도록 염기서열의 일부가 인위적으로 변형된 유전자, 및 자연적으로 발견되는 염기서열 일부가 변형된 유전자 또는 이들의 모두의 단편을 포함하는 것이다. 유전자 염기서열의 변형은 상응하는 아미노산의 변형을 수반하거나 하지 않을 수 있으며, 아미노산의 변형을 수반하는 경우에는 이러한 변형이 유발된 유전자는 이에 의해 코딩되는 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 것으로, 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함하는 것이다. 유전자 염기서열의 변이가 단백질 중의 아미노산의 변형을 수반하지 않는 경우는 예를 들어 축중변이가 있고, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 상기 유전자에 포함된다.
인위적 유전자 염기서열의 변형은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, 부위-유도성 돌연변이법 (site-directed mutagenesis, Kramer et al, 1987), 에러유발 PCR (Cadwell, R.C. and G.F. Joyce. 1992. PCR methods Appl., 2:28-33.), 점돌연변이법 (Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.) 등에 의해 제조될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 상술한 유전자는 약학조성물이 투여되는 대상체의 세포내에서 발현이 가능하도록 프로모터에 작동가능하게 연결된 벡터의 형태로 제공될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서, Oct4와 Sox2 유전자는 유인원, 사람 등과 같은 포유동물 유래이며, 특히 사람 유래이다. Oct4와 Sox2 유전자 및 단백질은 그 전장 또는 본원의 효과를 달성하는 한 그 단편이 또한 사용될 수 있으며, 전장 서열은 예를 들면 GenBank 접근번호 (Oct4: NM_002701.4; Sox2: NM_003106.3)에서 입수할 수 있다. 이들 유전자의 과발현에 의해 증식능, 특정 세포로의 분화능이 현저히 향상되었다. Oct4와 Sox2 유전자는 상기 공지된 서열로부터 이를 특이적으로 인식할 수 있는 프라이머를 제작하고, 이를 이용하여 중합효소연쇄증폭반응 (Polymerase Chain Reaction)을 통해 상기 유전자를 증폭하고 이를 상술한 바와 같은 진핵발현 벡터에 도입한 후 이를 후술하는 바와 같이 본원에 따른 중간엽줄기세포에 전달이입하여 사용할 수 있다. 세포에서 단백질을 과발현하는 방법은 공지되어 있다.Oct4와 Sox2 유전자를 적절한 진핵세포 발현벡터 예를 들면 파아지, 바이러스 또는 레트로바이러스 유래의 벡터 또는 플라즈미드에 발현 프로모터에 작동가능하도록 연결되도록 클로닝 하여, 발현 벡터를 구축한 후, 이를 본원에 따른 세포에 도입할 수 있다. 도입 방법은 공지되어 있으며 예를 들면 칼슘포스페이트법, DEAE-덱스트란 매개 전달이입, 양하전 지질 매개 전달이입법, 전기천공, 파아지 시스템을 이용한 트랜스덕션 또는 바이러스를 이용한 감염 방법 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
이런 측면에서 본원은 Oct4 및 Sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포를 포함하는 골질환 또는 간질환 치료용 약학 조성물 또는 세포치료제에 관한 것이다.
본원에서 “세포치료제” 란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 기타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 방법을 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제를 포함하는 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 세포 치료제에 포함되는 중간엽줄기세포는 앞서 기재한 바를 참고할 수 있다.
본원의 약학적 조성물 또는 세포 치료제에 포함되는 중간엽줄기세포는 자가(autologous) 또는 타가 또는 동종이계 (allogenic) 또는 이종(Xenogenic) 일 수 있다. 가장 바람직하게는 자가유래의 것으로 수용자로부터 유래한 것이기 때문에 약제학적 조성물의 투여 시 면역 반응의 문제가 없고 안전하다는 이점이 있다.
일 구현예에서 본원의 약학적 조성물 또는 세포치료제에 포함되는 중간엽줄기세포는, 동물의 중간엽줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포일 수 있다. 또한 본 발명의 중간엽줄기세포는 지방조직, 골수, 지방조직, 말초혈액, 간 유래 일 수 있으나, 특히 지방조직 유래이다.
본원에서 사용된 용어 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 본 용어가 적용되는 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.
다른 구현예에서, 본원의 세포치료제에 포함될 수 있는 세포는 중간엽줄기세포로부터 유래된, 간세포로 분화될 수 있는 전구세포, 및/또는 간세포로 분화된 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 “간질환”이란, 간 기능에 장애가 있는 증상 또는 이에 의해 간조직이 손상된 것을 가리키는 것으로 간세포의 생성 등 본원에 따른 세포 또는 조성물에 의한 치료가 가능한 질환을 포함한다. 예를 들어, 바이러스, 알콜 또는 다양한 약물에 의해 유발된 급성 또는 만성 간염, 간경화 및 간세포암을 들 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 병명이 확실치 않은 경우라도, GOT, GPT, γ-GTP 등의 간 기능의 지표에 이상이 관찰되는 증상도 간질환에 포함된다.
본원에서 “골질환”이란 골세포의 생성이 필요한 질환을 일컫는 것으로 골다공증, 불완전뼈형성, 골연화증, 골절, 골섬유형성이상, 낭성섬유뼈염, 박리뼈연골염, 골석화증, 골암, 연골모세포종, 이차성골종양을 포함한다.
본원에 따른 세포 치료제 또는 세포를 포함하는 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 정맥 투여 또는 본 발명에 따른 세포 또는 조성물의 투여가 필요한 손상된 장기 예를 들면 간 또는 간 조직에 직접 주사되는 방식으로 국소 투여될 수 있다. 다른 구현예에서 본원에 따른 세포 치료제 또는 조성물은 물리적 및/또는 병리학적으로 손상된 골주위에 국소투여 된다.
본원에 따른 치료제 또는 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 세포치료용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 ‘치료적으로 유효한 양’은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.
그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조성물의 투여량은 유효성분인 줄기세포로부터 분화된 세포를 기준으로 1.0× 107 내지 1.0× 108 세포/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0× 105 내지 1.0× 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개 부위 또는 2개 부위 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 허혈기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
다른 양태에서 본원은 또한 치료적으로 유효한 양의 본원에 따른 세포 또는 조성물을 간질환 또는 골질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 간질환 또는 골질환 치료 방법을 제공한다.
본원에 따른 방법에 사용되는 세포, 조성물 및 유효한 양, 투여방법 등은 앞서 기재한 바를 참고할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
물질 및 방법
세포배양 K-STEMCELL (대한민국) IRB (Institutional review board) 동의 및 양해하에 얻은 피하지방을 지방흡입(liposuction)의 방법을 통하여 공여자의 서면동의하에 채취하였다. 사람지방에 collagenase type IA (1 mg/mL; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 처리하여 단일세포화 시킨 후 세척하고 원심분리하는 방법으로 중간엽줄기세포(human adipose tissue mesenchymal stem cells, ATMSC)를 분리하였다. 이어 항생제가 첨가된 RCKM 배양배지(MSC 증식 배지, 10% FBS 첨가, K-STEMCELL에서 제공)에 배양되었다. HepG2 헤파토사이트는 항생제가 첨가된 alpha minimum essential media (α-MEM) 배양배지(10% FBS 첨가)에 배양되었으며 두 세포 모두 5% CO2 공급하에 37℃ 조건하에서 배양되었다.
통계 분석 모든 실험은 최소 2번 수행하였다. 수치는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 스튜던트‘s 테스트와 관련된 확률은 두 그룹사이의 파라미터를 비교하기 위한 기능을 하였다. P-수치 < 0.05를 통계적으로 의미있는 것으로 간주하였다.
실시예 1. Oct4/Sox2 유전자가 도입된 ATMSC에서의 Oct4 및 Sox2의 과발현 확인
아래에 기재된 바와 같이 사람의 배아줄기세포로부터 얻어진 Oct4와 Sox2의 유전자를 증폭하여 PB-CA 벡터(Addgene,USA)에 삽입하고 사람지방 유래 중간엽줄기세포(human adipose tissue mesenchymal stem cells, ATMSC)에 도입하였다. 이어 Oct4/Sox2-ATMSCs에서 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 면역블로팅 (Western blot)을 통해 Oct4와 Sox2의 과발현을 확인하였다.
1-1. Oct4/Sox2-과발현 인체 ATMSC의 제작
Oct4-IRES-Sox2를 PB-CA 벡터(Addgene,USA)에 삽입하였다. 이어 상기 벡터를 사람지방 유래 중간엽줄기세포(human adipose tissue mesenchymal stem cells, ATMSC)에 D-펙션(fection) 형질전환 (transfection) 시약(Lugen Sci, Seoul, Korea)을 제조자의 방법대로 사용하여 도입하였다. 형질전환된 세포는 사용시까지 액체질소에 보관하였으며, 대조군으로는 RFP(Red fluorescent protein, Life Technology, USA)을 상기 PB-CA 벡터에 삽입하여 사용하였다.
1-2. RT-PCR 분석
상기 형질전환된 세포로부터 TRIZOL(Invitrogen, USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 총 RNA를 분리하였다. RNA 농도 및 순도는 나노포토미터(Implen, Munich, Germany)를 사용하여 260 및 280 nm에서 결정하였다. 이 중 3 ㎍ 총 RNA, M-MuLV RT 및 oligo(dT)-18 프라이머를 사용하여 역전사로 first-strand cDNA를 얻었다. 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타나있다. PCR 생성물을 1.5% 아가로스겔에서 전기영동시켜 증폭단편 크기를 확인하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2015006244-appb-I000001
1-3. 면역블로팅 분석
형질전환된 세포를 단백질저해제를 함유하는 융해버퍼(25mM Tris, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate 및 0.1% SDS)에 현탁하여 얼음상에서 30분간 배양하였다. 16000 x g에서 4℃ 15분간 원심분리한 후 총 세포 추출물을 함유하는 상층액을 모아 -80℃에서 보관하였다. 상기 세포추출액에서 얻은 단백질을 전기영동하여 Hybond-PVDF 멤브레인(Amersham Biosciences, USA)으로 옮겼다. 비특이적 단백질 결합을 막기 위하여 상기 멤브레인을 블락킹 버퍼(TBS-T containing 5% skim milk)에서 1시간동안 실온 배양하였고 그후 블락킹 버퍼에 희석된, Oct4 (1:1000), Sox2 (1:500), cyclin D1 (1:1000) 또는 베타-엑틴 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology Inc USA)에 대한 1차 항원과 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 상기 멤브레인을 TBS-T로 세척하여 블락킹 버퍼에 희석된(1:3000) 2차 항원과 함께 실온에서 1시간동안 배양하였다. 항체 결합은 West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit (GenDEPOT, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 가시화하였다.
결과는 도 1 및 2에 기재되어 있다. Oct4/Sox2 유전자로 형질전환된 ATMSC에서의 Oct4 및 Sox2의 발현을 평가하기 위한 RT-PCR 및 면역블로팅 분석에서 Oct4 및 Sox2 mRNA의 레벨은 RFP-ATMSC에서 보다는 ATMSC에서 상당히 더 높았으며, 반면 RFP-ATMSC에서의 Oct4 및 Sox2 발현 레벨은 거의 탐지되지 않았다. 면역블로팅 분석 결과, Oct4 및 Sox2 단백질 발현은 Oct4/Sox2-ATMSC에서 상당히 상향조절된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Oct4/Sox2-ATMSC가 형질전환에 의해 성공적으로 발현되었다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 2. RFP 및 Oct4/Sox2-ATMSC의 면역 표현형
RFP- 및 Oct4/Sox2?ATMSC에서의 세포 표면 마커 발현을 분석하기 위하여 유세포분석을 수행하였다. 계대배양 5에서, 섬유아세포타입(fibroblastoid) 형태를 지닌, 재빨리 분열하는 균질 세포 집단을 얻었다. ATMSC를 4℃에서 70% 에탄올로 고정시켜, 다양한 표면 분자를 인식하는 1차 항체와 함께 얼음상에서 30분간 염색하였다. 세포 표면 항원 탐지를 위해 피코에리트린(Phycoerythrin)-접합된(PE) 마우스 항-인간 CD29 (BD Biosciences, USA), FITC (fluorescein isothiocyanate-conjugated) 마우스 항-인간 CD31(BD Biosciences), PE 마우스 항-인간 CD34 (BD Biosciences), FITC 마우스 항-인간 CD44 (BD Biosciences), FITC 마우스 항-인간 CD45 (BD Biosciences), PE 마우스 항-인간 CD73 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA), PE 마우스 항-인간 CD90 (BD Biosciences), 및 PE 항-인간 CD105/endoglin (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였다. MSC의 면역표현형은 FACS 칼리버 유세포계수기(BD Biosciences, Bedford, MA, USA) with CELLQuest software (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
형질전환된 ATMSC의 표면마커를 분석하기 위해 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD31, CD34 및 CD45를 사용하였다. 유세포계수 분석에 의하면 RFP- 및 Oct4/Sox2-형질전환된 ATMSC에서 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105 표면마커가 높이 발현되었고, CD31, CD34 및 CD45 표면마커는 존재하지 않는 것으로 나타났다(도 2). 이에 의하면 ATMSC의 표면마커가 Oct4/Sox2 유전자 도입에 의해 변화하지 않았음을 나타낸다.
실시예 3. 세포증식 분석을 통한 과발현 Oct4/Sox2-ATMSC의 향상된 증식능력 확인(Oct4/Sox2-ATMSCs의 줄기세포성(stemness) 확인)
MSC 증식 비율에 대한 Oct4/Sox2 과발현의 효과를 알아보기 위하여, 세포 증식 및 생존 능력을 WST-1 세포 증식 시약 (WST-1 Cell Proliferation Reagent, Roche, USA) 및 트립판 블루베제분석으로 평가하였다. WST-1 세포 증식분석을 위해 세포를 96-웰 플레이트에 5x103 세포/웰로 각 칸에 씨딩하였다. 각 세포는, RFP-ATMSC 웰을 포함하여 삼중으로 분석하였다. 세포를 4 (0 일), 24 (1 일), 48 (2 일) 및 72 시간 (3일)동안 배양한 후, 각 웰에 10㎕ WST-1 시약을 첨가하였다. 상기 반응은 5% CO2와 같이 2시간동안 37℃에서 진행하였다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 각 샘플의 흡광도를 측정하였다.
트립판블루 배제 분석을 위해, ATMSC를 6-웰 배양 플레이트에 1x105 세포/웰에 씨딩한 후 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. 1, 2, 3, 5, 7 및 9일 후에, 세포를 모아 0.4% 트립판 블루 용액으로 염색하였다. 생존가능한 세포의 계수는 헤모사이토미터가 있는 위상차현미경(phase contrast microscope)을 사용하여 수행하였다.
대사 활성에 비례하는 세포 생존능력을 측정하는 WST-1 분석을 이용한 세포 성장결과(도 3의 A)를 보면, ATMSC에서의 Oct4/Sox2 과발현에 의하여 증식이 시간 의존적으로 증가하였다. 이러한 결과는 나아가 세포 생존 능력의 인덱스인 트립판 블루 배제 분석을 통해 확인되었다(도 3의 B). 생존가능한 Oct4/Sox2-ATMSCs의 수는, RFP-ATMSC와 비교하여 상당히 증가하였다. 이는 Oct4/Sox2-발현 ATMSC는 대조군 세포(RFP-ATMSC)보다 훨씬 더 높은 생장 가능성 및 세포 생존 능력을 가지고 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 4. 세포 주기 분석을 통한 과발현 Oct4/Sox2-ATMSCs에서의 G1에서 S기로의 진행 촉진 확인
형질전환 3일 후, ATMSC를 PBS로 두 번 세척하여 트립신을 처리하여 세포를 수확하였다. 상기 세포를 다시 PBS로 세척한 후 70% 에탄올로 1일 동안 -20℃에서 고정시켰다. 상기 고정된 세포를 얼음으로 차갑게 한 PBS로 세척한 후 100 ㎍㎖-1 RNase A (Sigma) 존재하에 50 ㎍㎖-1 프로피디움 아이오다이드(Sigma, USA)로 30분간 염색하였다. 세포 주기는 FACS Calibur flow cytometer (BD Biosciences)를 사용하여 분석하여 Oct4/Sox2 과발현에 의한 세포 증식을 촉진 효과를 평가하였다.
도 4의 A에 나타난 바와 같이 유세포계수기에 의한 세포 주기 분석 결과, Oct4/Sox2-ATMSC에서 G0/G1 기에 67.99±0.69%, S기에 14.38±0.84%, 그리고 G2/M기에 17.65±1.36%의 세포가 있는 것으로 나타났다. 그러나, RFP-ATMSCs에서의 S 및 G2/M기 세포의 퍼센트는 많이 낮았다(7.59±0.62%, 16.73±0.93%). RFP-ATMSCs와 비교하여 S기에 세포 수가 증가함과 동시에 모든 Oct4/Sox2-ATMSCs에서 G1기에 세포 수가 감소하였다. 세포 주기 진행을 입증하기 위하여, G1->S기 전이 및 세포 증식을 촉진하는 주요 조절자인 싸이클린 D1의 단백질 레벨 변화를 측정하였다. 도 4의 B에 나타난 바와 같이, ATMSC에서 Oct4/Sox2 발현이 증가하면 싸이클린 D1 발현이 증가하였다. 이는 Oct4/Sox2 과발현이 G1에서 S기로 세포 전이를 촉진함으로써 ATMSC 증식을 촉진한다는 것을 나타낸다.
즉, 상기 WST-1 및 트립판 블루배제 분석 결과에서, Oct4/Sox2-과발현 세포는 대조군보다 생존 능력 및 증식 비율이 상당히 더 높다는 것이 나타났다. 이러한 결과는 나아기 세포주기 분석에 의한 세포 주기 진행 및 사이클린 D1의 면역 블로팅에서도 평가되었다. 세포주기는 세포가 분열되고 복제되는 일련의 사건이며 세포증식 및 노쇠를 결정하는 중요한 과정이다. G0/G1기는 비증식 또는 휴식기이며; S기에는 DNA 복제가 포함되어 있고; G2에서 세포는 분열한 준비를 하며; 그리고 M 기에 분열이 일어난다.
본원에서는 ATMSCs에서의 Oct4/Sox2 과발현에 의해 S기가 연장되는 것을 확인하였다. 세포 주기 진행은 사이클린에 의해 엄격히 조절되며 사이클린 D1은 세포 주기에서 생성되는 첫 번째 사이클린이다. 사이클린 D1의 상향조절에 의해 S기로 진입하도록 조기성숙하게 되는데, 이는 G/S 전이에서 사이클린 D1이 속도-결정 역할을 한다는 것을 말한다. 사이클린 D1이 발현하면 세포 주기 진행에 영향을 미치게 되고 결과적으로 줄기세포가 증식하게 된다. 종합하면, 본 발명에서 Oct4/Sox2 과발현에 의해 사이클린 D1이 높은 레벨로 발현되어 세포가 DNA 복제를 개시하도록 하고 S기를 연장하도록 하여, 세포 성장 및 증식이 일어나게 되었다. 이는 G1에서 S기로의 세포 전이를 촉진시킴으로써, 대조군과 비교하여 Oct4/Sox2 발현이 세포 증식에 대하여 영향을 강하게 미친 결과이다.
실시예 5. Oct4/Sox2-ATMSCs의 지방세포 및 골형성 분화 증가 확인
ATMSCs의 전분화능(pluripotency)에 대한 Oct4/Sox2 과발현의 효과를 분석하기 위해, Oct4/Sox2-ATMSC의 지방세포 및 조골세포로의 분화 가능성을 전사수준에서 지방 및 골 유전자의 발현 및 염색 강도를 비교하여 평가하였다.
약 80% 채워진 인간 RFP 또는 Oct4/Sox2-ATMSC를 각각 지방세포화 또는 골형성 배지에서 21일간 지방세포 또는 골세포로 분화되도록 유도하였다. 지방세포 분화를 유도하기 위하여, 지방세포화 유도 배지(Gibco, USA)에서 RFP- 및 Oct4/Sox2-ATMSC 세포를 5x103 cells/cm2의 농도로 배양하고, 배지는 3일마다 교체하였다. 7, 14 및 21일 후에, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하여 오일 레드 O 염색을 수행하여 지방 조립을 확인하였다. 골형성 분화를 유도하기 위하여, RFP- 및 Oct4/Sox2-ATMSC 세포를 5x103 cells/cm2의 농도로 배양하고 7, 14 및 21일 후에, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하여 알리자린 레드 S 염색을 수행하여 미네랄화 기질 함량을 측정하였다.
결과는 도 5의 A에 기재되어 있다. Oct4/Sox2-ATMSC에서의 지방 소립에 대한 오일 레드 O 염색 강도가 RFP-ATMSC에서보다 더 강하였는데, 이는 Oct4/Sox2 발현이 ATMSCs의 지방세포분화를 촉진한다는 것을 의미한다. 이러한 결과를 입증하기 위하여, 계통(lineage)-특이적 유전자 발현을 분석한 결과 지방조직의 마커인 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 및 리포단백질 리파제가 Oct4/Sox2 과발현후에 상향조절된 것으로 나타났다 (도 5의 B). 유사하게, 알리자린 레드 S 염색 강도는 RFP-ATMSC보다는 Oct4/Sox2-ATMSC에서 훨씬 더 강하였다(도 6의 A). 이러한 표현형 결과와 일치하게, 골형성 분화의 마커(콜라겐 I 및 오스테오칼신)은 Oct4/Sox2 유전자 공학에 의하여 상향조절되었다(도 6의 B). 유전자 발현 패턴 및 표현형 분석의 결과를 통해, Oct4/Sox2 과발현에 의해 지방세포 및 조골세포로 분화시키는 ATMSC의 활성을 더 촉진시킨다는 것을 알 수 있다.
종합하면, Oct4/Sox2 과발현에 의해 오일 레드 O 또는 알리자린 레드 S로 염색된 양성 세포 수가 증가하고 지방세포 또는 골세포 마커 발현이 증가한 것으로 나타났는데, 이는 Oct4/Sox2-ATMSC에 의해 지방세포 또는 골세포로의 분화되는 능력이 증가하였다는 것을 나타낸다. 또한 지방세포화 및 골세포화 경로로 MSC를 유도하는데 필요한 모든 시약이 함유된 분화배지에서, Oct4 및 Sox2 과발현에 의해 분화 능력이 증가하였다는 것을 의미한다. Oct4 및 Sox2의 공동-과발현이 중배엽 분화 능력을 효과적으로 증강시켜 ATMSC의 줄기세포성을 증가시켰음을 나타내는 것이다.
실시예 6. Oct4/Sox2-ATMSC에서 간세포로의 분화능 분석
Oct4/Sox2-ATMSC를 첫 단계 간세포 분화용 배지에 2주간 배양한다. 배양 배지는 2% fetal bovine serum (FBS, HyClone, USA), 4.9 mM 니코티나미드 (nicotinamide) (Sigma), 20 ng/mL 간세포성장인자 (hepatocyte growth factor, HGF) (Sigma)와 10 ng/mL 섬유아세포 성장인자4 (fibroblast growth factor 4, FGF) (Sigma)을 포함하는 DMEM (Dulbecco modified Eagles medium) (Hyclone)을 사용하였다. 이후 2% FBS, 30 ng/mL oncostatin M (Gibco), 10 nM dexamethasone (Sigma) 그리고 10 μL/mL ITS가 첨가된 DMEM(Hyclone)에서 두 번째 단계로 2주간 분화 유도하였다. 현미경상에서 HepG2 헤파토사이트의 형태와 비교 관찰하고 RT-PCR 및 웨스턴블랏을 통해 간세포관련 특이적 유전자(alpha fetoprotein, transferrin, albumin)들의 발현을 조사하였다.
위와 같은 분화배지에서 간세포로의 분화를 유도하였을 때, 도 7과 같이 둥글고 입방형의 세포가 관찰 되었으며 4주간 분화 유도하였을 때 70%이상의 세포에서 입방형의 모양이 관찰되었다. RT-PCR 분석 결과 도 8에서와 같이 초기 간분화 마커인 α-fetoprotein(AFP)는 RFP-ATMSC에서 높게 발현이 되었으며, 후기 발현 마커인 알부민은 Oct4/Sox2-ATMSCs에서 더 높게 발현이 되었다. 이 결과는 간세포로 분화유도 하였을 때 Oct4/Sox2-ATMSCs가 RFP-ATMSCs보다 성숙한 간세포가 더 많을 것이라 판단할 수 있다. 간분화로의 평가는 도 9에서와 같이 면역 형광염색법을 통하여 AFP과 알부민 발현으로 검증되었다.
실시예 7. 글리코겐합성(Glycogen deposition) 분석
Oct4/Sox2-ATMSC를 간세포 분화용 배지에 4주간 배양한 다음 과요오드산-쉬프 염색 (Periodic acid-schiff staining, PAS) (Wako Pure Chemicals, Japan) 을 통해 다당류 침착 정도를 분석하였다.
도 10의 A에 나타난 바와 같이 Oct4/Sox2-ATMSC에서 간세포로 분화 유도한 세포에서 PAS 염색성이 높았으며 이를 현미경하에서 세어보았을 때 PAS 양성인 세포의 수는 RFP-ATMSC의 분화유도 세포에서 보다 현저히 많음을 알 수 있다.
실시예 8. 요소 생성능 분석 (Urea assay)
Oct4/Sox2-ATMSCs를 간세포 분화용 배지에 4주간 배양한 후, 기존의 배양액을 제거하고 대신에 요소생성을 자극하기 위해 5 mM 염화암모늄(NH4Cl)이 첨가되어 있는 기본배양액을 20시간 동안 각각의 세포에 처리한 후, 이 배양액을 얻어 발색반응 방법 (colorimetric assay)으로 요소의 농도를 측정하였다.
생성된 요소의 농도는 도 10의 B에서와 같이 Oct4/Sox2-ATMSC에서 간세포로 분화유도한 세포가 RFP-ATMSCs의 분화유도 세포에서 보다 유의적으로 많았다. 본 결과는 Oct4/Sox2-ATMSCs 에서 간세포로 분화유도한 세포가 기능적으로 간세포의 역할을 할 수 있는 세포로 분화능력이 뛰어난 것을 나타낸다.
따라서 본 발명에선 이 대표적인 두 유전자 Oct4와 Sox2를 동시에 과발현하여 중간엽줄기세포의 간세포로의 전환분화(transdifferentiation)능을 증진시켰다.
이에, 본 발명은 Oct4와 Sox2 유전자를 과발현시킨 지방유래 중간엽줄기세포가 세포 활성 및 줄기세포성(stemness)이 증진됨을 알 수 있었고, 골세포 및 간세포로 분화를 유도하였다. 특히 간세포로의 분화유도시 일반 지방유래 중간엽줄기세포에 비하여, 요산형성능력과 글리코겐합성능력이 증가하였음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명은 Oct4와 Sox2를 과발현하는 지방유래 중간엽줄기세포(Oct4/Sox2-ATMSCs)가 기능적으로 효율이 높은 간세포로 분화됨을 알 수 있고 이는 간질환을 위한 세포 치료제로서 매우 유용하다는 것을 나타낸다.
이상에서 설명한 바와 같이, Oct4와 Sox2를 이용한 줄기세포성, 증식능의 향상은 물론 골세포 및 간세포로의 분화능을 증진시킨 본 발명은 골질환 또는 간조직 손상으로 인한 질환의 세포치료제로서 매우 유용하다.

Claims (9)

  1. Oct4 및 Sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 인간 지방조직 유래인, Oct4 및 Sox2를 과발현하는 중간엽줄기세포.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 Oct4 및 Sox의 과발현에 의해 상기 중간엽줄기세포는 줄기세포성, 증식능, 골세포 또는 간세포로의 분화능이 증가된 것인, 중간엽줄기세포.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 중간엽줄기세포; 상기 중간엽줄기세포로부터 유래된 간세포 또는 골세포로 분화될 수 있는 전구세포; 또는 상기 중간엽줄기세포로부터 분화된 간세포 및 골세포를 각각 유효성분으로 포함하는 간질환 또는 골질환 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 자가, 타가 또는 이종유래인 간질환 치료용 약학 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 주사 또는 손상된 조직 또는 장기에 국소 투여되는 것인, 조성물.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 간질환은 바이러스, 알코올 또는 약물에 유발된 급성 또는 만성 간염, 간경화 또는 간세포암인, 조성물.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 불완전뼈형성, 골연화증, 골절, 골섬유형성이상, 낭성섬유뼈염, 박리뼈연골염, 골석화증, 골암, 연골모세포종, 또는 이차성골종양인, 조성물.
  9. 치료적으로 유효한 양의 제 1 항에 따른 세포 또는 제 4 항에 따른 조성물을 간질환 또는 골질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 간질환 또는 골질환 치료 방법.
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