TW201920658A - 幼豬由來幹細胞及其製備方法 - Google Patents

幼豬由來幹細胞及其製備方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201920658A
TW201920658A TW107131628A TW107131628A TW201920658A TW 201920658 A TW201920658 A TW 201920658A TW 107131628 A TW107131628 A TW 107131628A TW 107131628 A TW107131628 A TW 107131628A TW 201920658 A TW201920658 A TW 201920658A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
stem cells
msc
cell
stem cell
Prior art date
Application number
TW107131628A
Other languages
English (en)
Inventor
西村益浩
藤田泰毅
渡邉奈月
阮論
松本慎一
Original Assignee
日商大塚製藥工場股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商大塚製藥工場股份有限公司 filed Critical 日商大塚製藥工場股份有限公司
Publication of TW201920658A publication Critical patent/TW201920658A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明的目的在於提供一種具有優異的增殖能力及分化能力的幹細胞。本發明是有關於一種自幼豬分離出的幹細胞及其製備方法。

Description

幼豬由來幹細胞及其製備方法
本發明是有關於一種幼豬由來幹細胞及其製備方法，更詳細而言，是有關於一種可分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞的幼豬由來的間葉系幹細胞及其製備方法。
根據近年來的以間葉系幹細胞為代表的成體幹細胞研究的進步，成體幹細胞的臨床應用已經從基礎的研究階段向開發階段轉移。成體幹細胞大致具有三種功能（多分化能力、免疫調節能力、細胞外環境的重塑能力），作為難治性疾病的治療用細胞而備受期待。
關於第一類的多分化能力，是成體幹細胞直接分化為骨、軟骨等的能力，藉由所投入的成體幹細胞補充損失的細胞或取代功能不充分的細胞來發揮治療效果。 第二類的免疫調節能力藉由經由來源於成體幹細胞的抗炎性細胞因子、趨化因子、外泌體等分泌或者經由細胞間的黏附因子等，作用於患者的免疫活性細胞，並抑制炎症或移植物抗宿主病等免疫反應來發揮治療效果。 關於第三類的細胞外環境的重塑能力，對於缺血性疾病中的梗塞部位或由炎症引起的纖維化部位等，藉由來源於成體幹細胞的血管誘導因子、成長因子、抗纖維化因子等的分泌來發揮治療效果。
間葉系幹細胞存在於哺乳類的骨髓、脂肪、胰島、臍帶血等中，為來源於中胚層性組織（間葉）的成體幹細胞，且具有對屬於間葉系的細胞的分化能力。近年來，對於移植物抗宿主病、心血管障礙、自身免疫疾病、變形性關節炎、成骨不全、肝障礙、呼吸道疾病、脊髓損傷、腦梗塞、腎功能衰竭等疾病進行臨床試驗（非專利文獻1）。
間葉系幹細胞可期待各種臨床應用，但存在供體確保、對供體的侵襲、每一供體的病毒否定檢查等安全性的保證等課題。另外，所獲得的間葉系幹細胞的效力根據供體或其年齡等條件而發生大幅變動，治療用細胞的穩定的品質確保亦為大課題。使患者的骨髓等由來的間葉系幹細胞於體外增殖，並對同一患者使用所述細胞進行治療的技術可成為因供體不足而成為問題的組織、臟器移植的替代的治療法。但是，細胞的增殖能力、分化能力存在個人差異，所有的患者由來的細胞無法顯示出相同的行為（非專利文獻2）。如以上般，於準備對於治療而言充分的幹細胞時要求供體確保、安全性的確認、幹細胞的優異的增殖能力、分化能力。 [現有技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Lemos NE, de Almeida Brondani L, Dieter C, Rheinheimer J, Boucas AP, Bauermann Leitao C, Crispim D, Bauer AC. Islets. 2017 Jul 5：e1335842. doi： 10.1080/19382014.2017.1335842 [非專利文獻2]大串 始，「生物化學」，第81卷，第2號，99頁～104頁，2009年2月
[發明所欲解決之課題] 如所述般，於將幹細胞用於再生治療的情況下，要求供體確保、安全性的確認、幹細胞的優異的增殖能力、分化能力，但幹細胞若經歷數傳代，則其增殖能力、分化能力會下降，因此存在製備對於治療而言充分的幹細胞時需要成本及時間的問題。因而，本發明的目的在於提供一種將可實現穩定供給或病原體的管理的幼小醫療用豬作為供體來源、並具有優異的增殖能力及分化能力的幹細胞。 [解決課題之手段]
本發明者等人發現，與先前的間葉系幹細胞相比，由幼豬的骨髓製備的間葉系幹細胞具有增殖速度顯著迅速且增殖能力優異、細胞尺寸小的優異的特性，從而完成了本發明。
即，本發明是有關於下述內容。 1.一種幹細胞，其是自幼豬分離。 2.如所述1所述的幹細胞，其平均直徑為17 μm以下。 3.如所述1或2所述的幹細胞，其中對數增殖期中的加倍時間為36小時以下。 4.如所述1至3中任一項所述的幹細胞，其為間葉系幹細胞。 5.如所述1至4中任一項所述的幹細胞，其中幼豬為可對人進行細胞移植的幼豬。 6.如所述1至5中任一項所述的幹細胞，其是自幼豬的骨髓或胰島分離。 7.如所述1至6中任一項所述的幹細胞，其為移植用的幹細胞。 8.如所述7所述的幹細胞，其為對人移植用的幹細胞。 9.如所述1至6中任一項所述的幹細胞，其為餵養細胞用的幹細胞。 10.如所述9所述的幹細胞，其為用以使人移植用的幹細胞增殖的餵養細胞用的幹細胞。 11.一種幹細胞的製備方法，其包括自幼豬分離細胞的步驟。 12.如所述11所述的幹細胞的製備方法，其包括對幹細胞接種後3日～12日後進行傳代的步驟。 13.如所述11或12所述的幹細胞的製備方法，其中自幼豬分離的細胞為單核細胞組分的細胞。 14.如所述11至13中任一項所述的幹細胞的製備方法，其中自幼豬的細胞的分離為自幼豬的骨髓或胰島的細胞的分離。 15.如所述13或14所述的幹細胞的製備方法，其包括將經分離的單核細胞組分的細胞冷凍的步驟。 [發明的效果]
與先前的幹細胞相比，本發明的幹細胞具有增殖速度顯著迅速且增殖能力優異、且細胞尺寸小的優點。本發明的幹細胞的增殖速度顯著迅速，藉此可以短時間且廉價地大量獲取移植用、餵養細胞用等用途中使用的幹細胞。另外，存在因幹細胞的投入而該幹細胞阻塞肺並引起肺栓塞的情況，但本發明的幹細胞的細胞尺寸小，藉此可防止此種肺栓塞的形成。
本發明的幹細胞為自幼豬分離出的幹細胞。再者，後述的實施例中記載的幹細胞是自幼豬的骨髓或胰島分離，但例如幼豬的皮膚、脂肪等由來的幹細胞亦包含於本發明中。
本發明中，所謂「幼豬」表示自胎兒出生後未滿1個月、較佳為出生後未滿25日的豬。幼豬較佳為用於醫療，更佳為可對人進行細胞移植的幼豬。豬的種類並無特別限定，例如可列舉：蘭德瑞斯（land race）品種（例如，丹麥·蘭德瑞斯品種、美國·蘭德瑞斯品種、不列顛·蘭德瑞斯品種、荷蘭·蘭德瑞斯品種、瑞典·蘭德瑞斯品種）、大約克夏品種、巴克夏品種、杜羅克品種、漢普夏品種、中約克夏品種、迷你豬，其中較佳為蘭德瑞斯品種。
一般而言，所謂「幹細胞」是指具有自我複製能力及分化能力、增殖能力的未成熟的細胞。幹細胞根據分化能力而包含多能幹細胞（pluripotent stem cell）、多潛能幹細胞（multipotent stem cell）、單潛能幹細胞（unipotent stem cell）等亞群。
所謂多能幹細胞，是指其自身無法成為個體，但具有可分化為構成生物體的所有組織或細胞的能力的細胞。所謂多潛能幹細胞，是指並非所有的種類，但具有可分化為多種組織或細胞的能力的細胞。所謂單潛能幹細胞，是指具有可分化為特定的組織或細胞的能力的細胞。
本發明的幹細胞較佳為多潛能幹細胞。作為多潛能幹細胞，例如可列舉：間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神經系幹細胞、骨髓幹細胞、生殖幹細胞等成體幹細胞等，較佳為間葉系幹細胞。
本發明的幹細胞若為自幼豬分離出的幹細胞，則作為其初代培養細胞、對該初代培養細胞進行傳代培養的細胞、且可產生表現出各種分化標記的各種細胞的幹細胞亦包含於本發明的幹細胞中。另外，於本發明的幹細胞為間葉系幹細胞的情況下，作為細胞標記的CD44及CD90較佳為均為60%以上且為陽性，更佳為70%以上、進而佳為80%以上且為陽性。另外，作為細胞標記的CD29較佳為60%以上且為陽性，更佳為70%以上、進而佳為80%以上且為陽性。
本發明的幹細胞的對數增殖期中的加倍時間較佳為36小時以下，更佳為32小時以下，進而佳為28小時以下，特佳為24小時以下，最佳為20小時以下。另外，對數增殖期中的加倍時間較佳為14小時以上，更佳為16小時以上。
本發明的幹細胞的對數增殖期中的培養例可藉由如下方式進行：將本發明的幹細胞接種至後述的含有維生素C的培養基（例如，MSC培養基），於37℃、5%CO2 的存在下利用培養用培養器加以培養。對數增殖期中的加倍時間越短，越可以短時間且廉價地製備大量的幹細胞。
本發明的幹細胞的平均直徑較佳為17 μm以下，更佳為16.5 μm以下，進而佳為16 μm以下，特佳為15.5 μm以下，最佳為15 μm以下。平均直徑較佳為10 μm以上，更佳為12 μm以上。平均直徑越小，越可防止由幹細胞的投入引起的肺栓塞的形成。平均直徑例如可使用細胞計數器（Nucleo Counter）NC-200（商標）來測量。此處，所謂平均是指相加平均。
自本發明的間葉系幹細胞向脂肪細胞的分化例如可藉由於胰島素、MCGS（血清成分、間葉細胞生長補充劑（Mesenchymal Cell Growth Supplement））、地塞米松、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤等的存在下，培養本發明的間葉系幹細胞來分化誘導為脂肪細胞。
針對脂肪細胞的分化及維持時可使用市售的試劑盒或培養基等，例如可列舉：龍沙沃克斯維爾（Lonza Walkersville）公司製造的hMSC分化試劑盒（differentiation BulletKit）（商標）-成脂（adipogenic）（PT-3004）、龍沙沃克斯維爾（Lonza Walkersville）公司製造的hMSC成脂誘導培養基（adipogenic induction medium）（PT-3102B）、龍沙沃克斯維爾（Lonza Walkersville）公司製造的hMSC成脂維持培養基（adipogenic maintenance medium）（PT-3102B）等。自間葉系幹細胞分化為脂肪細胞可使用市售的試劑盒來確認，例如可列舉龍沙（Lonza）公司製造的阿迪波紅（Adipo Red）（商標）檢定試劑（assay reagent）。
自本發明的間葉系幹細胞的骨細胞的分化例如可藉由於地塞米松、抗壞血酸鹽、MCGS、β-甘油磷酸等的存在下，培養本發明的間葉系幹細胞來分化誘導為骨細胞。另外，可使用市售的試劑盒，例如可列舉：龍沙沃克斯維爾（Lonza Walkersville）公司製造的hMSC分化試劑盒（differentiation BulletKit）（商標）-成骨（osteogenic）（PT-3004）等。自間葉系幹細胞分化為骨細胞可藉由市售的鹼性磷酸酶染色試劑盒（例如，宇宙生物（Cosmo Bio）公司製造等）、市售的石灰化染色試劑盒（例如，宇宙生物（Cosmo Bio）公司製造等）等來確認。
自本發明的間葉系幹細胞向軟骨細胞的分化例如可藉由於TGF-β3、地塞米松、胰島素-運鐵蛋白-亞硒酸（insulin-transferrin-selenous acid，ITS）、丙酮酸鈉、脯胺酸、抗壞血酸鹽的存在下，培養本發明的間葉系幹細胞來分化誘導為軟骨細胞。另外，可使用市售的試劑盒，例如可列舉：龍沙沃克斯維爾（Lonza Walkersville）公司製造的hMSC分化試劑盒（differentiation BulletKit）（商標）-軟骨形成（chondrogenic）、（PT-3003）等。自間葉系幹細胞分化為軟骨細胞可藉由阿爾新藍染色等來確認。
幹細胞的移植可藉由將幹細胞的懸浮液注入至宿主中而容易地進行。注入可對欲再生治療的臟器或其附近、或者靜脈內等進行。另外，所注入的幹細胞的個數並無特別限定，可根據症狀、寄主的體重或投藥方法等適宜選擇，但通常設為102 個～1010 個左右。
本說明書中，所謂「餵養細胞(feeder cell)」，表示用於調整欲引起增殖或分化的目標細胞的培養條件、發揮輔助作用的其他細胞品種。
於用作餵養細胞的情況下，較佳為通常預先藉由γ射線照射或抗生物質進行處理以不發生增殖。作為幹細胞的餵養細胞，主要使用胎鼠由來的成纖維細胞，但根據實驗的目的或細胞而3T3或SNL等成纖維細胞等各種細胞品種可被用作餵養細胞。本發明的幹細胞較佳為藉由自可對人進行細胞移植的幼豬分離而可用作對人移植用的幹細胞的餵養細胞。
本發明的幹細胞的製備方法的特徵在於：包括自幼豬分離細胞的步驟。作為本發明的幹細胞的製備方法的一實施方式，例如可列舉包括以下步驟的方法。 （1）自幼豬採集細胞的步驟 （2）培養步驟（1）中採集的細胞並製備幼豬由來幹細胞的步驟 以下，對各步驟進行說明。
（1）自幼豬採集細胞的步驟 步驟（1）中，自幼豬的骨髓、脂肪、皮膚、胰臟等採集細胞。 具體而言，例如於自幼豬的骨髓採集細胞的情況下，可自幼豬的大腿骨、髂脊及胸骨等採集骨髓細胞。例如，自幼豬回收大腿骨，將兩端切斷並插入針，利用添加有肝素的生理緩衝液（例如磷酸緩衝液，以後亦稱為PBS）進行沖洗，自相反側的部位回收流出液作為骨髓液。若流出液的量減少，則將骨倒置並於相反側插入針，利用PBS再次沖洗，製備作為含細胞的溶液的骨髓液。
進而，通常可藉由對所述中製備的含細胞的溶液進行離心分離來分離幼豬由來單核細胞組分。利用PBS等稀釋所述中製備的含細胞的溶液，將稀釋的含細胞的溶液放入至放入有人淋巴細胞分離用介質（例如，GE醫療生命科學（GE Healthcare Life Sciences）公司製造的菲科爾帕克（Ficoll-Paque）PLUS等）的管內的該介質層上。
對所述管進行離心分離並使其分層，回收包含幼豬由來單核細胞的層。對所回收的溶液進一步進行離心分離並去除上清後，利用PBS等加以稀釋並再次進行離心分離，從而分離單核細胞組分。以所述方式分離出的單核細胞組分的細胞亦可於培養前進行冷凍保存。藉由將分離的幼豬由來單核細胞組分的細胞冷凍，可選擇性地製備不易受冷凍溶解的影響的細胞。於在培養前進行冷凍保存的情況下，溫度較佳為-80℃以下，更佳為-150℃以下。
另外，例如於自幼豬的胰臟採集細胞的情況下，自幼豬回收胰島，進而視情況對所述胰島進行懸浮培養而製備出用於黏附培養的細胞塊，藉此達成製備幹細胞的目的。
另外，例如於自幼豬的脂肪採集細胞的情況下，自幼豬採集脂肪並利用剪刀切細後進行酶處理。利用細胞過濾網施加過濾，並以低速進行離心。將沈降至管底的細胞用於培養。另外，例如於自幼豬的皮膚（包含毛）採集細胞的情況下，自幼豬採集皮膚並進行酶處理。於酶處理後自皮膚拔毛並採集凸起（Bulge）部分而用於培養。於進行培養時使用3T3餵養細胞。
（2）培養步驟（1）中採集的細胞並製備幼豬由來幹細胞的步驟 所述步驟（1）中採集的細胞、細胞組分、或細胞塊中大多包含幹細胞以外的目標外細胞。通常，可使用藉由使用對於該些目標外細胞的生存所必需的不含維生素C的基礎培養基（例如，後述的MSC基礎培養基）來去除該些細胞的培養方法。
本發明的步驟（2）中，對於所述步驟（1）中採集的細胞、細胞分畫、或細胞塊，於較佳為35℃～39℃、更佳為36℃～38℃、最佳為37℃下，較佳為4%～6%、更佳為4.5%～5.5%、最佳為5%、CO2 的存在下利用培養用培養器進行培養，藉此去除幹細胞以外的目標外細胞，並使本發明的幹細胞增殖。
本發明的幹細胞的增殖速度顯著迅速，故為了進行去除所述目標外細胞的培養，即便不使用不含維生素C的基礎培養基，而僅使用包含維生素C的培養基（例如，後述的MSC培養基），亦可製備本發明的幹細胞。再者，為了去除所述目標外細胞，使用不含維生素C的基礎培養基進行培養後，更換為包含維生素C的培養基而使本發明的幹細胞增殖，藉此亦可製備本發明的幹細胞。
本發明的幹細胞具體例如是利用以下的方法進行培養。使用利用明膠進行了塗佈的培養用容器（例如，利用0.1%明膠進行了塗佈的板）或無明膠塗佈的培養用容器（例如，板），並使用不含維生素C的基礎培養基（例如，後述的MSC基礎培養基）或包含維生素C的培養基（例如，後述的MSC培養基），較佳為接種5.0×105 個細胞/9.6 cm2 ～5.0×107 個細胞/9.6 cm2 ，例如於37℃、5%CO2 、90%濕度的條件下進行培育來獲得初代培養細胞。用以獲得初代培養細胞的培養時期為於接種後較佳3日～12日，更佳3日～11日，最佳3日～10日。初代培養細胞亦可進行傳代。將進行傳代而獲得的幹細胞亦稱為傳代培養細胞。關於初代培養細胞或傳代培養細胞的傳代，於接種幹細胞後較佳2日～6日後、更佳2日～5日後、進而佳2日～4日後、最佳3日後，幹細胞達到30%～100%匯合、較佳達到50%～95%匯合、更佳達到60%～90%匯合、最佳達到70%～85%匯合以後進行。幹細胞的接種是使用利用明膠進行了塗佈的培養用容器（例如，利用0.1%明膠進行了塗佈的板）或無明膠塗佈的培養用容器（例如，板），並使用包含維生素C的培養基（例如，後述的MSC培養基），較佳為接種5.0×105 個細胞/9.6 cm2 ～5.0×107 個細胞/9.6 cm2 。幹細胞的培養例如是於37℃、5%CO2 、90%濕度的條件下進行培養。於幹細胞培養期間視需要進行培養基更換來使本發明的幹細胞增殖。
MSC基礎培養基及MSC培養基可使用先前習知者，亦可使用市售品。作為MSC基礎培養基，例如可列舉：向500 mL的Gibco公司製造的MEMα（核苷，無抗壞血酸）中添加55 mL的Gibco公司製造的胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）及5.5 mL的西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich）公司製造的青黴素-鏈黴素而成的培養基。另外，作為MSC培養基，例如可列舉：向500 mL的Gibco公司製造的MEMα（核苷）中添加55 mL的Gibco公司製造的胎牛血清（FBS）、5.5 mL的西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich）公司製造的青黴素-鏈黴素及22.2 μL的西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich）公司製造的以適合於細胞培養的大腸桿菌來表達的鹼性重組FGF（最終濃度：1 ng/mL）而成的培養基。
傳代較佳為實施至少一次以上。關於傳代次數，只要可獲得本發明的幹細胞，則並無特別限定，但較佳為1次～3次，更佳為1次～20次。
本發明的幹細胞可進行冷凍保存。冷凍保存的時機並無特別限定，但較佳為傳代1次～20次後，更佳為傳代2次～10次後。冷凍保存及解凍的方法可使用先前習知的方法。
作為幹細胞的冷凍保存方法，具體而言，例如可使其分散於冷凍保存液中，視需要在冷藏庫中於-80℃以下或液態氮中進行冷凍保存。作為冷凍保存液，例如可列舉：將OPF-301[含有3%海藻糖及5%葡聚糖的乳酸林格氏溶液（國際公開第2014/208053號）]與二甲基亞碸（DMSO）以9：1的比率混合而成的溶液、可用於動物細胞的冷凍保存的含血清的保存液或無血清保存液、或者市售的細胞冷凍保存用試劑[較佳為寶生物工程（Takarabio）公司製造的CELLBANKER（註冊商標）等細胞阪卡（CellBanker）]。 [實施例]
試驗例1 〔幼豬由來骨髓細胞的回收〕 自幼豬的大腿骨採集骨髓。自幼豬（出生後23日的醫療用蘭德瑞斯品種豬）回收大腿骨，將兩端切斷並插入12G針，利用50 mL的經肝素處理的PBS（3 mL的肝素（1000 U/mL）、47 mL的PBS）進行沖洗，自相反側的部位回收50 mL的骨髓的流出液（以下，亦簡稱為骨髓液）。若流出液的量減少，則將骨倒置並於相反側插入針，利用PBS再次沖洗來收集骨髓液。利用計數用的15 mL圓錐管將50 μL的樣品取至1950 μL的PBS（40倍稀釋），並利用細胞計數器測定細胞數。
〔幼豬由來單核細胞（npMNC）組分的分離〕 使按照所述順序獲得的骨髓液靜靜地再懸浮。將骨髓液整體以各10 mL為單位分至4根50 mL的管中，分別利用PBS稀釋為30 mL，確認細胞未附著於管後充分混合。將10 mL的菲科爾帕克（Ficoll-Paque）PLUS（GE醫療生命科學（GE Healthcare Life Sciences）公司製造）加入至4根新的50 mL的管中，於菲科爾帕克（Ficoll-Paque）PLUS層上放入與PBS混合的30 mL的骨髓液。
將所述管於20℃下以400×g離心分離30分鐘，緩慢地不加節制地使其加速（全速的1/3），形成三個不同的層。單核細胞組分被配置於懸浮白色環，因此於包含25 mL的PBS的50 mL的管（×4）中回收白色環整體。於室溫下以400×g離心分離7分鐘，並去除上清。將PBS加入至40 mL為止，於室溫下以400×g再次離心分離7分鐘。與所述同樣地測定細胞數，結果骨髓細胞整體中25%～30%的細胞作為單核細胞組分而分別被分離（20～300）×106 個。
〔幼豬由來單核細胞（npMNC）組分的細胞的冷凍保存〕 將經分離的單核細胞組分的細胞放入至包含107 細胞/mL的混合有DMSO的FBS（90%FBS與10%DMSO）的冷凍小瓶（cryovial）中，將細胞懸浮液的總容量設為1 ml[設為細胞數/10×106 =混合有DMSO的FBS的容量（mL）]。將冷凍小瓶於-20℃下保存1小時，繼而於-80℃下保存24小時後，最終移至長期保存用的液態氮槽。
〔幼豬由來單核細胞（npMNC）組分的細胞的培養及幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的製備〕 於37℃的水浴中將冷凍保存於冷凍小瓶中的包含幼豬由來單核細胞（npMNCs）組分的細胞的細胞懸浮液快速解凍，使用微吸管並將解凍的細胞懸浮液靜靜地加入至30 mL的調整為溫度平衡（37℃）的MSC基礎培養基[向500 mL的Gibco公司製造的MEMα（核苷，無抗壞血酸）中添加55 mL的Gibco公司製造的胎牛血清（FBS）及5.5 mL的西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich）公司製造的青黴素-鏈黴素而成的培養基，以下相同]。於室溫下以500×g離心分離5分鐘，將團塊再懸浮於4 mL的以溫度實現了平衡化的MSC基礎培養基中，於上下平穩地進行移液。測量總細胞數及活細胞數的結果為：總細胞數為4.18×106 個、活細胞數為6.6×105 個、存活率：15.8%。
利用0.1%明膠塗佈6孔板（well plate），於培養器（37℃、5%CO2 ）中靜置10分鐘～15分鐘後，於使用前去除明膠。向所製備的各0.1%明膠被覆6-孔板加入細胞懸浮液，平穩地搖動而使細胞懸浮液分散於增殖表面（明膠塗佈）上，於2 mL的MSC基礎培養基中接種2.09×106 個細胞/1孔。於CO2 培養器中在37℃、5%CO2 、90%濕度的條件下進行培養，3日後更換為MSC培養基[向500 mL的Gibco公司製造的MEMα（核苷）中添加55 mL的Gibco公司製造的胎牛血清（FBS）、5.5 mL的西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich）公司製造的青黴素-鏈黴素及22.2 μL的西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich）公司製造的以適合於細胞培養的大腸桿菌來表達的鹼性重組FGF（最終濃度：1 ng/mL）而成的培養基，以下相同]來使細胞增殖，以後於3日間進行一次MSC培養基的更換。10日後幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）匯合。再者，對於使用無明膠塗佈的板的情況，同樣地於10日後幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）亦匯合。
〔傳代〕 幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）大致達到100%匯合後，自2孔回收細胞，於0.1%明膠塗佈有或無的狀態下將該些再接種至T75燒瓶中。
利用2 mL的PBS（不含鈣及鎂）清洗細胞，於每一孔加入0.25%胰蛋白酶320 μL，並於培養器中靜置數分鐘，細胞剝離後，於1680 μL的MSC培養基中進行中和。使用1 mL吸管將細胞懸浮液採集至50 mL的管中，添加16 mL（8 mL×2孔）的MSC培養基後，於室溫下以500×g離心分離5分鐘。使用吸管，將所獲得的團塊平穩地再懸浮於實現了溫度平衡化的MSC培養基（2 mL）。測量總細胞數及活細胞數的結果為：總細胞數為2.05×106 個、活細胞數為2.02×106 個、存活率：98.5%。
將MSC培養基加入至0.1%明膠塗佈有及無的T75燒瓶中，以成為4.5×105 活細胞/燒瓶T75燒瓶的方式再接種，於CO2 培養器中在37℃、5%CO2 、90%濕度的條件下進行培養。將該些細胞設為第1傳代。於接種第1傳代的3日後，無論0.1%明膠塗佈的有無，均達到100%匯合。
〔幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的製備〕 幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）大致達到100%匯合後，自包含或不包含0.1%明膠塗佈的T75燒瓶的兩個燒瓶中回收細胞。利用8 mL的PBS（-）清洗細胞，於每一孔加入0.25%胰蛋白酶2.4 mL，並於培養器中靜置數分鐘，細胞剝離後，於12.6 mL的MSC培養基中進行中和。將細胞懸浮液收集至50 mL的管中，於室溫下以500×g離心分離5分鐘。
向所獲得的團塊中添加實現了溫度平衡化的MSC培養基（10 mL），利用吸管於上下靜靜地再懸浮，於下述示出測量總細胞數及活細胞數而得的結果。 自經0.1%明膠塗佈的燒瓶（×2）的細胞：總細胞數為1.62×107 個、活細胞數為1.60×107 個、存活率：98.8% 自無明膠塗佈的燒瓶（×2）的細胞：總細胞數為1.48×107 個、活細胞數為1.46×107 個、存活率：98.6%
〔幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的冷凍保存〕 與所述培養分開，將早期傳代的幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）冷凍並製作細胞儲備液。使經胰蛋白酶處理的npBM-MSC團塊再懸浮於將所期望的濃度的CELLBANKER（註冊商標）1或OPF-301[含有3%海藻糖及5%葡聚糖的乳酸林格氏溶液（國際公開第2014/208053號）]與DMSO以9：1的比率混合而成的溶液中，作為1.5×106 細胞/1 mL/小瓶。將小瓶放入至細胞冷凍儲存杯（Bicell）中並於-80℃下保存24小時後，將細胞自-80℃移至液態氮中而加以長期保存。
〔CFU分析〕 對於幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）（P2），以30細胞/cm2 的密度將630個細胞接種至21 cm2 培養皿（無明膠塗佈或0.1%明膠塗佈）中，於MSC培養基中進行培養。MSC培養基是每三日進行更換。於培養6日後，利用4 mL的PBS將黏附細胞清洗兩次，並利用4 mL的冰冷甲醇於4℃下固定15分鐘。為了使菌落可視化，利用以磷酸緩衝液稀釋為1：19的4 mL的吉姆薩將細胞染色30分鐘後，於室溫（RT）下進行清洗，並利用H2 O清洗兩次。
繼而，測量超過50個的細胞的菌落數並計算細胞的菌落形成效率。細胞的菌落形成效率是藉由每一皿的菌落數除以每一皿接種的細胞數（630個）來計算。將結果示於表1中。再者，表1的值表示平均值±SD（n=3）。
[表1] 細胞的菌落(colony)形成效率（%）
如表1所示，根據CFU分析的結果可知，所獲得的幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）無論明膠塗佈的有無，均可形成菌落。
〔細胞的平均直徑〕 對於人骨髓由來間葉系幹細胞（hBM-MSC，傳代次數P4）及所獲得的幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC），將測量細胞的平均直徑的結果示於表2中。細胞的平均直徑是使用細胞計數器（Nucleo Counter）NC-200（商標）進行測量，算出平均值（n=3）。
[表2] 細胞的平均直徑
如表2所示，可知與人骨髓由來間葉系幹細胞相比，所獲得的幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的平均直徑小。
〔增殖速度的評價〕 對於人骨髓由來間葉系幹細胞（hBM-MSC）及幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC），將細胞以5000細胞/cm2 （1.25×105 細胞/燒瓶）的密度接種至T25燒瓶中，使用MSC培養基進行培養。MSC培養基是每三日進行更換。計數於培養開始1日、2日、4日及8日後可存活的細胞及死去的細胞的總數。將結果示於表3及表4、以及圖1A及圖1B中。再者，表3及表4的值為平均值±SD（n=4）。
[表3] 總細胞量（×104 細胞）
[表4] 總細胞增殖率（%）
如表3及表4、以及圖1A及圖1B所示，可知與人骨髓由來間葉系幹細胞相比，所獲得的幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的細胞的增殖速度顯著迅速。
〔分化為脂肪細胞〕 對於人骨髓由來間葉系幹細胞（hBM-MSC）及幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC），使用hMSC分化試劑盒（differentiation BulletKit）（商標）-成脂（adipogenic）、（PT-3004）（龍沙沃克斯維爾（Lonza Walkersville）公司製造），依據方案來誘導分化為脂肪細胞。將於誘導開始後第17日使用西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich）公司製造的油紅（Oil Red）進行染色而得的結果分別示於圖2A及圖2B中。
如圖2A及圖2B所示，可知與人骨髓由來間葉系幹細胞同樣地，所獲得的幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）可分化為脂肪細胞。
〔分化為骨細胞〕 對於人骨髓由來間葉系幹細胞（hBM-MSC）及幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC），使用hMSC分化試劑盒（differentiation BulletKit）（商標）-成骨（osteogenic）（PT-3002）（龍沙沃克斯維爾（Lonza Walkersville）公司製造），依據方案來誘導分化為骨細胞。將於誘導開始後第14日使用宇宙生物（Cosmo Bio）公司製造的鹼性磷酸酶染色試劑盒進行染色而得的結果分別示於圖3A及圖3B中，並將使用宇宙生物（Cosmo Bio）公司製造的石灰化染色試劑盒進行染色而得的結果分別示於圖4A及圖4B中。
如圖3A及圖3B、以及圖4A及圖4B所示，可知與人骨髓由來間葉系幹細胞同樣地，所獲得的幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）可分化為骨細胞。
〔分化為軟骨細胞〕 對於幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC），使用hMSC分化試劑盒（differentiation BulletKit）（商標）-軟骨形成（chondrogenic）（PT-3003）（龍沙沃克斯維爾（Lonza Walkersville）公司製造），依據方案來誘導分化為骨細胞。將於誘導開始後第19日進行HE染色而得的結果及進行阿爾新藍染色而得的結果分別示於圖5A及圖5B中。
如圖5A及圖5B所示，可知所獲得的幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）可分化為軟骨細胞。
試驗例2 〔幼豬由來單核細胞（npMNC）組分的細胞的培養及幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的製備〕 MSC基礎培養基或MSC培養基是於使用前於培養器（37℃、5%CO2 ）中靜置10分鐘～15分鐘。與試驗例1同樣地，於37℃的水浴中將冷凍保存於冷凍小瓶中的包含幼豬由來單核細胞（npMNC）組分的細胞的細胞懸浮液快速解凍。使用微吸管將解凍的細胞懸浮液靜靜地加入至30 mL的溫度平衡（37℃）的MSC基礎培養基中，向2根50 mL的管中分注各15 mL。
於室溫下以500×g離心分離5分鐘，將團塊再懸浮於2 mL的溫度平衡MSC基礎培養基或MSC培養基中，於上下平穩地進行移液。於下述示出測量總細胞數及活細胞數而得的結果。 2 mL的MSC基礎培養基：總細胞數為2.60×106 個、活細胞數為4.8×105 個、存活率為18.5% 2 mL的MSC培養基：總細胞數為2.55×106 個、活細胞數為4.5×105 個、存活率為17.6%
將接種細胞數以成為下述的方式計算出的量的細胞懸浮液加入至針對各孔放入有下述培養基的6孔板（無明膠塗佈）中，平穩地進行搖動而使細胞懸浮液分散於增殖表面上。 2 mL的MSC基礎培養基：接種2.60×106 個/1孔的細胞 2 mL的MSC培養基：接種2.55×106 個/1孔的細胞
放入CO2 培養器中，於37℃、5%CO2 、90%濕度的條件下進行培育。於接種3日後及6日後利用MSC培養基進行培養基更換而使細胞增殖，於接種後第8日進行傳代。
〔傳代〕 幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）大致達到50%～60%匯合後，自1孔回收細胞，於無明膠塗佈的狀態下將該些再接種至T75燒瓶中。
利用2 mL的PBS（-）清洗細胞，於每一孔加入320 μL的0.25%胰蛋白酶，並於培養器中靜置數分鐘，細胞剝離後，於1680 μL的MSC培養基中進行中和。將細胞懸浮液收集至50 mL的管中，並加入8 mL的MSC培養基，於室溫下以500×g離心分離5分鐘。
向所獲得的團塊中添加實現了溫度平衡化的MSC培養基（2 mL），利用吸管於上下平穩地再懸浮，於下述示出總細胞數及活細胞數的測量後的結果。 P0接種時MSC基礎培養基的群組：總細胞數為5.0×105 個、活細胞數為5.0×105 個、存活率：100% P0接種時MSC培養基的群組：總細胞數為3.3×105 個、活細胞數為3.3×105 個、存活率：100%
將15 mL的MSC培養基加入至T75燒瓶（無明膠塗佈）中，於以成為下述細胞數的方式再接種有幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的培養器中進行培養。將該些細胞設為第1傳代。 P0接種時MSC基礎培養基的群組：活細胞數為5.0×105 個/燒瓶 P0接種時MSC培養基的群組：活細胞數為3.3×105 個/燒瓶
〔幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的製備〕 於藉由所述順序而再接種的細胞達到大致80%～90%匯合後，自T75燒瓶（無明膠塗佈）的1燒瓶中收集細胞。利用8 mL的PBS（-）清洗細胞，加入0.25 mL/1孔的胰蛋白酶2.4 mL，並於培養器中靜置數分鐘，細胞剝離後，於12.6 mL的MSC培養基中進行中和。將細胞懸浮液收集至50 mL的管中，於室溫下以500×g離心分離5分鐘。
向所獲得的團塊中添加實現了溫度平衡化的MSC培養基（5 mL），利用吸管於上下靜靜地再懸浮，於下述示出測量總細胞數及活細胞數而得的結果。 自1個燒瓶中的細胞（P0接種後的3日的MSC基礎培養基）：總細胞數為5.12×106 個、活細胞數為5.09×106 個、存活率：99.5% 自1個燒瓶中的細胞（自P0接種時MSC培養基）：總細胞數為4.76×106 個、活細胞數為4.73×106 個、存活率：99.4%
〔幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的冷凍保存〕 與所述培養分開，與試驗例1同樣地將早期傳代的細胞冷凍並製作細胞儲備液。
試驗例3 對試驗例1及試驗例2中製備的幼豬由來單核細胞（npMNC）的細胞表面抗原進行分析。將用於分析的各樣品的製備方法示於表5中。表5中，所謂「切換（Switch）」表示於初期培養時使用MSC基礎培養基（無維生素C），於增殖培養時變更為作為增殖培養基的MSC培養基（含有維生素C）來進行培養。
[表5] 各樣品的製備法
〔細胞表面抗原的分析〕 將各細胞樣品自液態氮槽中取出並對蓋緩緩排壓，再次關閉蓋，於預先加溫至37℃的恒溫槽中輕輕攪拌1分鐘～2分鐘並進行溶解。將溶解的各細胞移至放入有5 mL的染色緩衝液（Stain Buffer）（BD公司製造）的15 mL的離心管中，於4℃下以500×g離心5分鐘並去除上清。放入5 mL的染色緩衝液並於4℃下以500×g離心5分鐘而清洗兩次。
於2 mL的染色緩衝液（BD公司製造）中進行再懸浮，並計數活細胞數。進行再離心（500×g、5分鐘、4℃），以細胞數成為1×107 個/mL的方式於染色緩衝液（BD公司製造）中進行再懸浮，以20 μL（細胞數2×105 個）為單位分注至1.5 mL的管中，從而各製備非染色對照、CD44、CD90、同型對照共計4根。
將4 μL的抗CD44,小鼠(MEM-263), PE（GeneTex公司製造）、1 μL的PE小鼠抗人CD90（BD公司製造）（與豬具有交叉性）、4 μL的PE小鼠IgG1, κ同型對照（BD公司製造）添加至各個管中，於遮光冰上培育45分鐘。非染色對照亦於冰上進行保管。
以1 mL為單位將染色緩衝液（BD公司製造）放入各管中，並於4℃下以500×g離心5分鐘而清洗兩次。敲擊細胞團塊並解開，於500 μL的染色緩衝液（BD公司製造）中進行再懸浮，於即將分析前通過過濾器而移至流動觀察孔用的試管中。於直至分析的期間於遮光冰上進行保管，使用流式細胞術進行分析。將CD44的結果示於圖6中，將CD90的結果示於圖7中。
如圖6及圖7所示，任一樣品中作為間葉系幹細胞的標記的CD44及CD90為陽性。另外，認為即便於初期培養時不進行利用明膠的塗佈，亦可建立目標間葉系幹細胞。再者，於任一情況下在同型對照的測定中未看到非特異的反應。
試驗例4 〔幼豬胰島由來間葉系幹細胞的製備〕 自幼豬回收胰島，並進行懸浮培養，藉此製備細胞塊，然後與試驗例1同樣地進行冷凍保存。於37℃的水浴中將冷凍保存於冷凍小瓶中的幼豬胰島快速解凍。
使用微吸管，將解凍的胰島懸浮液靜靜地加入至30 mL的調整為溫度平衡（37℃）的MSC基礎培養基中。於4℃下以210×g離心分離1分鐘。再者，於未將胰島冷凍的情況下，於室溫下藉由自然落下而胰島沈澱後，去除上清。將團塊再懸浮於4 mL的以溫度實現了平衡化的MSC基礎培養基中，於上下平穩地進行移液。
將胰島懸浮液加入至6-孔板中，平穩地搖動並使細胞懸浮液分散於增殖表面（無明膠塗佈）上，將1650 IEQ～2125 IEQ的範圍的胰島/1孔接種至2 mL的MSC基礎培養基中。
於CO2 培養器中在37℃、5%CO2 、90%濕度的條件下進行培養，於3日後更換為MSC培養基而使細胞增殖，以後於三日進行一次MSC培養基的更換。於表6中示出樣品的製備條件。無論有無初期冷凍，進行接種6天後達到100%匯合。
[表6] *括弧內為10%DMSO溶液的種類
〔傳代〕 幼豬胰島由來間葉系幹細胞（npISLET-MSC）達到約80%～大致95%匯合後，自2孔回收細胞，於無明膠塗佈的狀態下將該些再接種至T75燒瓶中。
利用2 mL的PBS（不含鈣及鎂）清洗細胞，於每一孔加入0.25%胰蛋白酶320 μL，並於培養器內靜置數分鐘，細胞剝離後，於1680 μL的MSC培養基中進行中和。使用1 mL吸管將細胞懸浮液採集至50 mL的管中，添加16 mL（8 mL×2孔）的MSC培養基後，於室溫下以500×g離心分離5分鐘。使用吸管，將所獲得的團塊平穩地再懸浮於實現了溫度平衡化的MSC培養基（2 mL）。
〔細胞的平均直徑〕 將20 mL的所述MSC培養基加入至無明膠塗佈的T75燒瓶中再接種，於CO2 培養器中在37℃、5%CO2 、90%濕度的條件下進行培養。將該些細胞設為第1傳代。於接種第1傳代的3日後，無論有無初期冷凍，均達到100%匯合。由此可知，由幼豬的胰島製備的間葉系幹細胞的增殖速度與由幼豬的骨髓製備的間葉系幹細胞的增殖速度為相同程度。將所獲得的幼豬胰島由來間葉系幹細胞的平均直徑示於表7中。
[表7]
如表7所示可知，無論胰島製備中的冷凍條件如何，均可製備幼豬胰島由來間葉系幹細胞，與有冷凍的情況、無冷凍的情況無關地，平均直徑均為相同程度。
〔細胞表面抗原的分析〕 將各細胞樣品自液態氮槽中取出並對蓋緩緩排壓，再次關閉蓋，於預先加溫至37℃的恒溫槽中輕輕攪拌1分鐘～2分鐘並進行溶解。將溶解的各細胞移至放入有5 mL的染色緩衝液（BD公司製造）的15 mL的離心管中，於4℃下以500×g離心5分鐘並去除上清。放入5 mL的染色緩衝液並於4℃下以500×g離心5分鐘而清洗兩次。
於2 mL的染色緩衝液（BD公司製造）中進行再懸浮，並計數活細胞數。進行再離心（500×g、5分鐘、4℃），以細胞數成為1×107 個/mL的方式於染色緩衝液（BD公司製造）中進行再懸浮，以20 μL（細胞數2×105 個）為單位分注至1.5 mL的管中，從而各製備非染色對照、CD29、CD44、CD90共計4根。
將1 μL的小鼠愛麗莎福路（Alexa Fluor）647小鼠抗豬CD29（BD公司製造）、4 μL的抗CD44,小鼠(MEM-263), PE（GeneTex公司製造）、1 μL的PE小鼠抗人CD90（BD公司製造）（與豬具有交叉性）添加至各個管中，於遮光冰上培育45分鐘。非染色對照亦於冰上進行保管。
以1 mL為單位將染色緩衝液（BD公司製造）放入各管中，並於4℃下以500×g離心5分鐘而清洗兩次。敲擊細胞團塊並解開，於500 μL的染色緩衝液（BD公司製造）中進行再懸浮，於即將分析前通過過濾器而移至流動觀察孔用的試管中。於直至分析的期間於遮光冰上進行保管，使用流式細胞術進行分析。
將CD29的結果示於圖8A～圖8D中，將CD44的結果示於圖9A～圖9D中，將CD90的結果示於圖10A～圖10D中。圖8A、圖9A、圖10A表示樣品11（從胰島製備後不久未冷凍）的結果；圖8B、圖9B、圖10B表示樣品12（從胰島製備後不久有冷凍）的結果；圖8C、圖9C、圖10C表示樣品13（從胰島製備後培養第3日未冷凍）的結果；圖8D、圖9D、圖10D表示樣品14（從胰島製備後培養第3日有冷凍）的結果。
如圖8A～圖10D所示，關於任一樣品中作為間葉系幹細胞的標記的CD29、CD44及CD90，亦觀察到高的陽性率。另外，認為不取決於初期培養時的冷凍的有無，可建立目標間葉系幹細胞。
參照特定的實施方式而對本發明進行了詳細說明，但對於本領域技術人員而言明確可於不脫離本發明的精神與範圍的情況下進行各種變更及修正。再者，本申請案基於2017年9月8日申請的美國臨時申請案（US62/555,913）並藉由引用將其整體援用至此。另外，引用至此的所有參照是作為整體被組入本發明中。
無
圖1A是表示培養本發明的幹細胞時的特定的培養時期（日）的總細胞量的圖。圖1B是表示培養本發明的幹細胞時的特定的培養時期（日）的總細胞增殖率的圖。圖1A及圖1B中，虛線及黑圓點表示幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（naive pig bone marrow-mesenchymal stem cells，npBM-MSC），實線及白圓點表示人骨髓由來間葉系幹細胞（human bone marrow-mesenchymal stem cells，hBM-MSC）。 圖2A及圖2B是分別表示關於人骨髓由來間葉系幹細胞（hBM-MSC）及幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）分化為脂肪細胞的圖。 圖3A及圖3B是分別表示關於人骨髓由來間葉系幹細胞（hBM-MSC）及幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）分化為骨細胞的圖。 圖4A及圖4B是分別表示關於人骨髓由來間葉系幹細胞（hBM-MSC）及幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）分化為骨細胞的圖。 圖5A及圖5B是表示關於幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）分化為軟骨細胞的圖。 圖6是表示使用作為間葉系幹細胞的標記的CD44來進行幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的細胞表面抗原分析的結果的圖。 圖7是表示使用作為間葉系幹細胞的標記的CD90來進行幼豬骨髓由來間葉系幹細胞（npBM-MSC）的細胞表面抗原分析的結果的圖。 圖8A～圖8D是表示使用作為間葉系幹細胞的標記的CD29來進行幼豬胰島由來間葉系幹細胞（npISLET-MSC）的細胞表面抗原分析的結果的圖。圖8A表示樣品11（從胰島製備後不久未冷凍）的結果，圖8B表示樣品12（從胰島製備後不久有冷凍）的結果，圖8C表示樣品13（從胰島製備後培養第3日未冷凍）的結果，圖8D表示樣品14（從胰島製備後培養第3日有冷凍）的結果。 圖9A～圖9D是表示使用作為間葉系幹細胞的標記的CD44來進行幼豬胰島由來間葉系幹細胞（npISLET-MSC）的細胞表面抗原分析的結果的圖。圖9A表示樣品11（從胰島製備後不久未冷凍）的結果，圖9B表示樣品12（從胰島製備後不久有冷凍）的結果，圖9C表示樣品13（從胰島製備後培養第3日未冷凍）的結果，圖9D表示樣品14（從胰島製備後培養第3日有冷凍）的結果。 圖10A～圖10D是表示使用作為間葉系幹細胞的標記的CD90來進行幼豬胰島由來間葉系幹細胞（npISLET-MSC）的細胞表面抗原分析的結果的圖。圖10A表示樣品11（從胰島製備後不久未冷凍）的結果，圖10B表示樣品12（從胰島製備後不久有冷凍）的結果，圖10C表示樣品13（從胰島製備後培養第3日未冷凍）的結果，圖10D表示樣品14（從胰島製備後培養第3日有冷凍）的結果。

Claims (15)

  1. 一種幹細胞，其是自幼豬分離。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的幹細胞，其平均直徑為17 μm以下。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的幹細胞，其中對數增殖期中的加倍時間為36小時以下。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的幹細胞，其為間葉系幹細胞。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的幹細胞，其中幼豬為可對人進行細胞移植的幼豬。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的幹細胞，其是自幼豬的骨髓或胰島中分離。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的幹細胞，其為移植用的幹細胞。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的幹細胞，其為對人移植用的幹細胞。
  9. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的幹細胞，其為餵養細胞用的幹細胞。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的幹細胞，其為用以使人移植用的幹細胞增殖的餵養細胞用的幹細胞。
  11. 一種幹細胞的製備方法，其包括自幼豬分離細胞的步驟。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的幹細胞的製備方法，其包括對幹細胞接種後3日～12日後進行傳代的步驟。
  13. 如申請專利範圍第11項或第12項所述的幹細胞的製備方法，其中自幼豬分離的細胞為單核細胞組分的細胞。
  14. 如申請專利範圍第11項至第13項中任一項所述的幹細胞的製備方法，其中自幼豬的細胞的分離為自幼豬的骨髓或胰島的細胞的分離。
  15. 如申請專利範圍第13項或第14項所述的幹細胞的製備方法，其包括將經分離的單核細胞組分的細胞冷凍的步驟。
TW107131628A 2017-09-08 2018-09-07 幼豬由來幹細胞及其製備方法 TW201920658A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762555913P 2017-09-08 2017-09-08
US62/555,913 2017-09-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201920658A true TW201920658A (zh) 2019-06-01

Family

ID=65634872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107131628A TW201920658A (zh) 2017-09-08 2018-09-07 幼豬由來幹細胞及其製備方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20200291358A1 (zh)
EP (1) EP3680324A4 (zh)
JP (2) JPWO2019049957A1 (zh)
KR (1) KR102503086B1 (zh)
CN (1) CN111094550A (zh)
AU (1) AU2018329882A1 (zh)
BR (1) BR112020004517A2 (zh)
CA (1) CA3074582A1 (zh)
SG (1) SG11202002047QA (zh)
TW (1) TW201920658A (zh)
WO (1) WO2019049957A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3046169C (en) 2016-12-14 2022-08-16 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. Mammalian cell cryopreservation liquid
US20220233599A1 (en) * 2019-04-24 2022-07-28 Fukuoka University Pharmaceutical composition

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2429502A1 (en) * 2000-07-26 2002-01-31 Scimed Life Systems, Inc. Therapeutic angiogenesis by bone marrow-derived cell transplantation in myocardial ischemic tissue and skeletal muscle ischemic tissue
FR2853663B1 (fr) * 2003-04-14 2007-08-31 Aventis Pharma Sa Procede d'obtention de lignees de mastocytes a partir de tissus de porcs et procede de production de molecules de type heparine
US20090004661A1 (en) * 2003-05-26 2009-01-01 Reliance Life Sciences Pvt Ltd. Method of growing mesenchymal stem cells from bone marrow
JP2006230316A (ja) * 2005-02-25 2006-09-07 Japan Health Science Foundation 瘢痕のない創傷治癒能を有する細胞およびその調製方法
BRPI0708039A2 (pt) * 2006-02-08 2011-05-17 Univ Keio células alimentadoras derivadas de células-tronco de tecido
WO2008071074A1 (fr) * 2006-12-13 2008-06-19 Songling Wang Utilisation de cellules souches mésenchymateuses, et procédé pour isoler des cellules couches dans des tissus humains et les conserver
US9301975B2 (en) * 2009-05-01 2016-04-05 Biocardia, Inc. Method of preparing autologous cells and method of use for therapy
BR112015030374A2 (pt) 2013-06-28 2017-07-25 Otsuka Pharma Factory Inc solução contendo trealose e dextrana para transplante de células mamíferas
US10786536B2 (en) * 2013-10-29 2020-09-29 Vestion, Inc. Cardiac neural crest cells and methods of use thereof
CN105018430B (zh) * 2015-02-06 2018-08-31 华南农业大学 一种长白仔猪骨髓间充质干细胞永生系的建立方法
CN114717183A (zh) * 2015-08-31 2022-07-08 爱平世股份有限公司 多能干细胞制造系统和生产诱导多能干细胞的方法
JP6373241B2 (ja) * 2015-10-05 2018-08-15 有限会社ジーエヌコーポレーション 細胞の保存方法
CN105441386A (zh) * 2015-12-25 2016-03-30 江苏省苏北人民医院 一种猪极小胚胎样干细胞培养与鉴定方法
US10815456B2 (en) * 2016-10-04 2020-10-27 Transwell Biotech Co., Ltd. Composition, kit and method for cryopreserving cells

Also Published As

Publication number Publication date
KR102503086B1 (ko) 2023-02-23
WO2019049957A1 (ja) 2019-03-14
CN111094550A (zh) 2020-05-01
US20200291358A1 (en) 2020-09-17
EP3680324A4 (en) 2021-06-16
SG11202002047QA (en) 2020-04-29
BR112020004517A2 (pt) 2020-09-08
CA3074582A1 (en) 2019-03-14
JP2023096192A (ja) 2023-07-06
EP3680324A1 (en) 2020-07-15
JPWO2019049957A1 (ja) 2020-10-15
KR20200047565A (ko) 2020-05-07
AU2018329882A1 (en) 2020-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chong et al. Human peripheral blood derived mesenchymal stem cells demonstrate similar characteristics and chondrogenic differentiation potential to bone marrow derived mesenchymal stem cells
US10358629B2 (en) Regulating stem cells
JP6348848B2 (ja) 間葉系幹細胞の増殖
US20220110979A1 (en) Fibroblast regenerative cells
JP2023096192A (ja) 幼若ブタ由来幹細胞およびその調製方法
AU2017202192A1 (en) Mesenchymal Stromal Cell Populations and Methods of Making Same
Melero‐Martin et al. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis
Helmy et al. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile
WO2020217652A1 (ja) 医薬用組成物
JP2014040485A (ja) 筋肉誘導前駆体組成物を利用した骨格筋の強化およびその処置
Xu et al. Immunoregulatory effect of neuronal-like cells in inducting differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
US20220079991A1 (en) Method for improving visual acuity
Abou-Easa et al. Characterization of Behavior and Niche of Bovine Marrow Stem Cells In Vitro
Rojphaisarn Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from umbilical cord, placenta and amnion
IL193947A (en) Cells cultured as cd31brigi: it, a method for stimuli to differentiate into a congenital / precursor cell population (pcp), use of the same drug preparation population, and implantation device that includes it