JP6348848B2 - 間葉系幹細胞の増殖 - Google Patents

Description

本発明は、そのいくつかの実施形態において、間葉系幹細胞を増殖させる方法およびそれにより生成された細胞集団に関する。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、神経組織、肝組織、膵臓組織、筋肉組織、および線維性結合組織などの特定の型の間葉系または結合組織に分化することができる非造血細胞である。これらの細胞が進入する特定の分化経路は、機械的影響および／または内因性生物活性因子、例えば、成長因子、サイトカイン、および／または宿主組織により確立される局部微小環境条件からの様々な影響に依存する。

ＭＳＣは、成体生物を通して多様な宿主の組織中に存在し、これらの組織に特異的な細胞型を「再生」する能力を有する。これらの組織の例としては、脂肪組織、臍帯血、骨膜、滑膜、筋肉、真皮、周皮細胞、血液、骨髄および骨梁が挙げられる。

間葉系幹細胞は、その多能性により、細胞治療戦略および遺伝子治療戦略の双方を背景とした様々な臨床応用において役割を果たすことができる、魅力的な治療手段および移植候補になっている。間葉細胞は、結合組織及び骨格組織中への人工器官の埋込みのための移植後の造血細胞の生着の増強や骨および軟骨の遺伝的および後天的な障害の矯正、および遺伝子治療のためのビヒクルとして使用されうる。

培養物中で、増殖したＭＳＣはＣＤ１０５（エンドグリン、ＳＨ２）、ＣＤ７３（エクト−５’ヌクレオチダーゼ、ＳＨ３、ＳＨ４）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、ＣＤ２９（β１−インテグリン）、ＣＤ４４（Ｈ−ＣＡＭ）、およびＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）などの重要なマーカーのパネルを発現する。造血幹細胞とは対照的に、ＭＳＣはＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ１３３の発現を欠く。

ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのコロニー形成単位−線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）形成能力によって同定することができる。しかしながら、ＭＳＣは増殖および分化能力が不均一である。サイズだけでなく、細胞分裂速度および分化能力においても異なる少なくとも２つの形態的に異なるＭＳＣ集団が同定されている。さらに、成体骨髄に由来する単一の細胞に由来するＭＳＣコロニーの分析により、骨細胞分化、脂質細胞分化、および軟骨細胞分化を受けるコロニーの能力の相違が示された。

多くの場合、非分画骨髄由来細胞がＭＳＣ培養のための出発集団として用いられる。この単離方法は、線維芽細胞様細胞のプラスチック表面への接着および非接着造血細胞の除去に依存する。得られる細胞は明確に定まっておらず、不均一なＭＳＣ集団だけでなく、骨芽細胞および／または骨前駆細胞、脂肪細胞、網膜細胞、マクロファージ、および内皮細胞を含む。出発集団をより正確に区別するために、ＭＳＣを濃縮するためのＳＨ２（ＣＤ１０５）、ＳＨ３／ＳＨ４（ＣＤ７３）、ＳＳＥＡ−４および低親和性神経成長因子受容体（ＣＤ２７１）などの表面マーカーが用いられてきた（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、Liu PG, (2005)、非特許文献４、非特許文献５）。

間葉系幹細胞の均一な集団を単離することを目的としていた細胞表面抗原の別の例は、間質前駆体抗原−１（ＳＴＲＯ−１）である。ＳＴＲＯ−１抗原は、ＣＦＵ−Ｆ、グリコホリン−Ａ有核赤血球、およびＣＤ１９ Ｂ細胞の小サブセットの全部を含むヒト成人ＢＭの約１０〜２０％の表面上で発現されるが、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）上では発現されない（Simmons and Torok-Storb, 1991）。ＳＴＲＯ−１は、間葉細胞のクローン形成能、可塑性、および他の前駆細胞特性と強く関連していたため、初期間葉／間質前駆細胞のマーカーとして広く見なされている（非特許文献６）。ＳＴＲＯ−１（ＳＴＲＯ−１Ｂｒｉｇｈｔ）と、ＣＤ１０６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ１４６またはＳＴＲＯ−３などの他の表面マーカーとの高い同時発現は、ＢＭ ＭＮＣのクローニング効率を大きく増加させることが示された（非特許文献７）。新鮮に単離されたＳＴＲＯ−１^{Ｂｒｉｇｈｔ}ＢＭ ＭＮＣはまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの休眠、高いテロメラーゼ活性、および未分化表現型などの、多能性幹細胞に特徴的な他の特徴も有する。さらに、この細胞集団は、造血幹細胞（ＣＤ３４）、白血球（ＣＤ４５）、および赤血球（グリコホリン−Ａ）に関連するマーカーを欠く。

より最近では、血小板由来成長因子受容体−β（ＰＤＧＦ−ＲＢ；ＣＤ１４０ｂ）が、クローン形成性ＭＳＣの単離のための選択マーカーとして同定された（非特許文献８）。他の報告により、顕著なアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する骨髄細胞におけるＭＳＣの９．５倍の濃縮が示された（非特許文献９）。

ＭＳＣがｉｎ ｖｉｔｒｏで比較的容易に増殖するとしても、その増殖能力およびその幹細胞特性は長期培養の間に継続的に低下する。例えば、培養物中での増殖は、早期の老化（継続的な形態的および機能的変化を特徴とする加齢プロセス）を誘導することが示されている。細胞は、不規則で平らな形状になると共にはるかに大きくなり、細胞質はより粒状になった。これらの老化関連効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養の開始から継続的に獲得される（非特許文献１０）。結果として、培養物中での増殖後にもその特徴を保つ均一なＭＳＣの一人のドナーからの大規模バッチの商業化のための製造の成功は、依然として課題である。

間葉系幹細胞上ではＭＨＣ分子、特に、クラスＩＩの発現が低いか、または存在しないため、これらの細胞は免疫特権を持つと考えられるため、様々な障害の治療のためのそのような細胞の同種移植に道を開くものである。従って、間葉系幹細胞バンクを増殖させる方法は、その使用を商業化するための重要な因子になってきている。

ＭＳＣの増殖および生存を増加させる際の成長因子の役割は、過去数年にわたって広く研究されており、これらの細胞の増殖効率を増加させるために多くの因子が提唱されている。

例えば、ＭＳＣの増殖に関する多くのプロトコルは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）の存在下で培養させることを含む（非特許文献１１）。ｂ−ＦＧＦはＭＳＣ増殖能力を維持するだけでなく、初期細胞分裂周期を通して骨細胞、脂肪細胞および軟骨細胞への分化能力も保持することが示されている。

血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）も、ＭＳＣ増殖を増加させることが示されている（非特許文献１２）。

ＭＳＣ集団への肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の外因的添加は、増殖、移動および分化に影響することが示されている（非特許文献１３）。

ＭＳＣの増殖を増加させるための他の提唱成長因子は、ＭＳＣの強力な分裂促進因子であることが示された血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である（非特許文献１４）。

上皮成長因子（ＥＧＦ）およびヘパリン結合性ＥＧＦは両方とも、任意の特異的系列への分化を誘発することなくＭＳＣのｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を促進することが示されている（非特許文献１５、非特許文献１６）。ＭＳＣに対するその細胞分裂効果に加えて、ＥＧＦはまた、コロニー形成単位数を２５％増加させる（非特許文献１７）。

その他にも、ＭＳＣにおけるＷｎｔシグナル伝達増殖を研究する実験に基づいてＭＳＣを増殖させるためのＷｎｔシグナル伝達アゴニストの使用が提唱されている。標準Ｗｎｔシグナル伝達は、幹細胞を、未分化であるものの自己再生状態に維持することが示された。標準Ｗｎｔ経路を活性化することによるＷｎｔ３ａの付加は、ＭＳＣにおける骨芽細胞系への分化を防止しながら、増殖と生存の両方を増加させた（非特許文献１８）。

ＭＳＣに対して用いられる成長因子の選択は、当初、細胞形態に対する特定の成長因子の効果に関する従前から知られた知識に基づいて決定された。これは、ＭＳＣを増殖させること、および、ＭＳＣが好んで分化することが知られている系列へのＭＳＣの分化を引き起こすことの２つを追求することと共に行われた。トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの軟骨形成系列に由来する細胞に影響することが知られ、最終的な分化を阻害しながら、間充織凝縮、前軟骨細胞増殖、細胞外マトリックスの産生および軟骨特異的分子沈着の初期段階を促進することが知られている。ＭＳＣに適用された場合、細胞は増殖の増加および軟骨形成系列への偏りを示す（非特許文献１９、非特許文献２０）。

骨分化を増強することが知られる、トランスフォーミング成長因子ベータファミリーの別のメンバーであるＢＭＰ−３は、ＭＳＣの増殖を３倍に増加させることが示された（非特許文献２１）。

ナイアシン（ビタミンＢ３）のアミドであるニコチンアミド（ＮＡ）は、塩基交換基質であり、モノ−およびポリ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有するＮＡＤ（＋）依存的酵素の強力な阻害剤である。ＡＤＰ−リボシル化は、多様な生物学的プロセスの改変に関与する（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７）。

特許文献１は、造血幹細胞および／または前駆細胞集団の増殖のためのニコチンアミドの使用を開示する。

特許文献２は、幹細胞および前駆細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させる際の分化の阻害のための、ニコチンアミド、およびＣＤ３８の他の阻害剤の使用を開示する。しかしながら、特許文献２は、特定の時間間隔についてのニコチンアミドの投与は教示していない。

特許文献３は、低濃度のカルシウムの存在下でのニコチンアミドを用いる間葉系幹細胞の単離および増殖を教示する。

さらなる背景技術としては、非特許文献２８が挙げられる。

国際公開第２００７／０６３５４５号公報 国際公開第２００３／０６２３６９号公報 米国特許出願公開第２００５／０２６０７４８号明細書 国際公開第２００５／００７７９９号公報 米国特許出願公開第２０１０／００２１４３４号明細書 米国特許出願公開第２００９／０２５７９８７号明細書 米国特許第４，６６６，８２８号明細書 米国特許第４，６８３，２０２号明細書 米国特許第４，８０１，５３１号明細書 米国特許第５，１９２，６５９号明細書 米国特許第５，２７２，０５７号明細書 米国特許第３，７９１，９３２号明細書 米国特許第３，８３９，１５３号明細書 米国特許第３，８５０，７５２号明細書 米国特許第３，８５０，５７８号明細書 米国特許第３，８５３，９８７号明細書 米国特許第３，８６７，５１７号明細書 米国特許第３，８７９，２６２号明細書 米国特許第３，９０１，６５４号明細書 米国特許第３，９３５，０７４号明細書 米国特許第３，９８４，５３３号明細書 米国特許第３，９９６，３４５号明細書 米国特許第４，０３４，０７４号明細書 米国特許第４，０９８，８７６号明細書 米国特許第４，８７９，２１９号明細書 米国特許第５，０１１，７７１号明細書 米国特許第５，２８１，５２１号明細書

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本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、ニコチンアミドと線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）とを含む培地中で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を培養することによってＭＳＣを培養する工程を含む、ＭＳＣを培養する方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、間葉系幹細胞の集団を増殖させる方法であって、細胞増殖にとって十分な期間にわたって間葉系幹細胞の播種された集団を培養する工程を含み、前記期間の少なくとも一部については、ニコチンアミドを含まない培地中で培養を行い；前記期間の少なくとも第２の部分については、ニコチンアミドとＦＧＦ４とを含む培地中で培養を行うことによって、間葉系幹細胞の増殖された集団を生成する、方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、対象への移植にとって有用な細胞を生成する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の方法に従って間葉系幹細胞を培養して、培養間葉系幹細胞の集団を生成する工程と、
（ｂ）培養間葉系幹細胞の集団を、分化剤と接触させることによって、対象への移植にとって有用な細胞を生成する工程と
を含む、方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、移植にとって有用な細胞を生成する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の方法に従って間葉系幹細胞を増殖させる工程と、
（ｂ）間葉系幹細胞を、分化剤と接触させることによって、移植にとって有用な細胞を生成する工程と
を含む、方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、本明細書に記載の方法に従って生成された間葉系幹細胞の単離された集団が提供される。

本明細書に記載の方法に従って生成された分化した細胞の単離された集団。

本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、疾患または障害を治療する方法であって、治療上有効量の本明細書に記載の細胞の単離された集団を、治療を必要とする対象に移植することによって、前記疾患または障害を治療する工程を含む、方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、間葉系幹細胞と、ニコチンアミドおよびＦＧＦ４を含む培地とを含む細胞培養物が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、培地はＤＭＥＭを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、培地は血清または血小板溶解物を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、胎盤および臍帯血からなる群から選択される組織から誘導される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドは、ニコチンアミド、ニコチンアミド類似体、ニコチンアミド代謝物、ニコチンアミド類似体代謝物およびそれらの誘導体からなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、培養はプラスチック表面上で行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣの集団は、不均一な細胞集団中に含まれる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、不均一な細胞集団の少なくとも７０％がＭＳＣである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、培地のカルシウム濃度は、１．８ｍＭより高い。

本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は少なくとも１週間行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は少なくとも３回の継代にわたって行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドの濃度は１〜２０ｍＭである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、培地は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含まない。

本発明のいくつかの実施形態によれば、増殖は、間葉系幹細胞の分化を誘導しない条件下で行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、間葉系幹細胞の播種された集団は、ニコチンアミドの非存在下で播種された。

本発明のいくつかの実施形態によれば、間葉系幹細胞の播種された集団は、ニコチンアミドの存在下で播種された。

本発明のいくつかの実施形態によれば、培地は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含まない。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドを含まない培地は、ＦＧＦ４を含まない。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドを含まない培地は、ＦＧＦ４を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドを含む培地中での培養は、ニコチンアミドを含まない培地中での培養の前に行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドを含まない培地中での培養は、ニコチンアミドを含む培地中での培養の前に行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドを含む培地中での培養は、少なくとも１日間行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドを含む培地中での培養は、少なくとも１週間行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドを含まない培地中での培養は、少なくとも１日間行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドを含まない培地中での培養は、少なくとも１週間行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドを含む培地中での培養は、カルシウム濃度が１．８ｍＭより高い、カルシウムを含む培地中で行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドを含まない培地中での培養は、カルシウム濃度が１．８ｍＭより高い、カルシウムを含む培地中で行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、分化剤は成長因子を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、分化剤は、分化剤をコードするポリヌクレオチドを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）をコードする。

本発明のいくつかの実施形態によれば、間葉系幹細胞の単離された集団は、実質的に均一である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、前記細胞の少なくとも４０％がＶＣＡＭ１／ＣＤ１６を発現する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、前記細胞の少なくとも９０％が２０μｍ未満の直径を有する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、間葉系幹細胞の単離された集団は、同一の条件下であるが、ニコチンアミドの非存在下で生成された間葉系幹細胞よりも粒度が低い。

本発明のいくつかの実施形態によれば、３０％未満の前記細胞がＣＤ４５を発現し、９５％を超える前記細胞がＣＤ９０を発現し、９０％を超える前記細胞がＣＤ１０５およびＣＤ４４を発現する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、前記疾患または障害は、骨または軟骨の疾患、神経変性疾患、心疾患、肝疾患、がん、神経損傷、自己免疫疾患、ＧｖＨＤ、創傷治癒および組織再生からなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドおよび／またはニコチンアミドとＦＧＦ４と共に培養された間葉系幹細胞は、増加したレベルの成長因子、および低下したレベルの前炎症因子を培地中に分泌する。

別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業界の通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。さらに、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。

別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業界の通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。さらに、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。

本特許または出願ファイルは、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含む。色付きの図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な料金の支払い時にＯｆｆｉｃｅにより提供される。

本発明のいくつかの実施形態は、ほんの一例に過ぎないが、添付の図面および画像を参照して本明細書に記載される。ここで図面を詳細に具体的に参照すれば、示される項目が例によるものであり、本発明の実施形態の例示的考察のためのものであることが強調される。これに関連して、図面と共に取られる説明により、本発明の実施形態をどのように実施することができるかが当業者には明らかとなる。

塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が間葉系幹細胞の増殖を増加させるニコチンアミドの能力に対する負の効果を有することを示す棒グラフである。 ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が、２つの異なるバッチの間葉系幹細胞の増殖を増加させるニコチンアミドの能力に対する負の効果を有することを例示する図である。 間葉系幹細胞の増殖に対するニコチンアミド（ＮＡＭ）とＦＧＦ４の相乗的活性を例示する棒グラフである。４つの異なるバッチのＭＳＣ培養物を、ＦＧＦ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＡＭ（５ｍＭ）またはＦＧＦ４＋ＮＡＭの組合せで処理した。示された継代での累積細胞計数を示す。 ニコチンアミド（ＮＡＭ）がＦＧＦ４と共に培養されたＭＳＣの未分化状態を保つことを例示するグラフである。２つの異なるバッチのＭＳＣ培養物を、ＦＧＦ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＡＭ（５ｍＭ）またはＦＧＦ４＋ＮＡＭの組合せで処理した。細胞のサイズを、Ｃｅｄｅｘ細胞計数装置により分析した。 ＮＡＭ＋ＦＧＦ４の組合せを用いて増殖させた細胞が未分化のＭＳＣ（ＣＤ１０５＋ＣＤ４５−）であることを例示するグラフである。４つの異なるバッチのＭＳＣ培養物を、ＦＧＦ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＡＭ（５ｍＭ）またはＦＧＦ４＋ＮＡＭの組合せで処理した。ＭＳＣ（ＣＤ１０５＋ＣＤ４５−）の％をＦＡＣＳにより分析した。 ＮＡＭ＋ＰＤＧＦ−ＢＢを用いるＭＳＣの増殖後に得られた一貫性のない結果を例示する棒グラフである。４つの異なるバッチのＭＳＣ培養物を、ＰＤＧＦ−ＢＢ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＡＭ（５ｍＭ）またはＰＤＧＦ−ＢＢ＋ＮＡＭの組合せで処理した。示された継代での累積細胞計数を示す。 ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢ＋ＮＡＭの組合せで処理したＭＳＣ培養物がＰＤＧＦ−ＢＢの非存在下で培養されたＭＳＣと比較して、培養物を汚染するＭＳＣ以外の細胞画分をより多く含むことを例示するグラフである。４つの異なるバッチのＭＳＣ培養物を、ＰＤＧＦ−ＢＢ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＡＭ（５ｍＭ）またはＰＤＧＦ−ＢＢ＋ＮＡＭの組合せで処理した。ＭＳＣ（ＣＤ１０５＋ＣＤ４５−）の％を、ＦＡＣＳにより分析した。 ＦＧＦ４とＰＤＧＦ−ＢＢとの相乗的または付加的効果の非存在下とは対照的に、ＮＡＭとＦＧＦ４との一貫した相乗効果を例示する棒グラフである。さらに、ＮＡＭ、ＦＧＦ４およびＰＤＧＦ−ＢＢの組合せは、ＭＳＣ増殖に対する有害な効果を有していた。ＭＳＣ培養物を、示されたように、ＰＤＧＦ−ＢＢ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ４（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＮＡＭ（５ｍＭ）または２つもしくは３つの因子の組合せで処理した。示された継代での累積細胞計数を示す。 ＰＤＧＦ−ＢＢがＭＳＣ培養物中のＭＳＣ以外の細胞の増殖を支援することを例示するグラフである。この効果は、ＮＡＭおよび／またはＦＧＦ４によって軽減されない。ＭＳＣ培養物を、示されたように、ＰＤＧＦ−ＢＢ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ４（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＮＡＭ（５ｍＭ）または２つもしくは３つの因子の組合せで処理した。ＭＳＣ（ＣＤ１０５＋ＣＤ４５−）の％をＦＡＣＳにより分析した。 ＰＤＧＦ−ＢＢがＭＳＣ培養物中のＭＳＣ以外の細胞の増殖を支援することを例示する３４日目のＭＳＣ培養物の写真である。この効果は、ＮＡＭおよび／またはＦＧＦ４によって軽減されない。ＭＳＣ培養物を、示されたように、ＰＤＧＦ−ＢＢ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ４（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＮＡＭ（５ｍＭ）または２つもしくは３つの因子の組合せで処理した。 １回目の継代の前に、ＮＡＭを播種した／播種しない培養物中で間葉系幹細胞マーカーを発現するＢＭ由来接着細胞の％を例示する棒グラフである。単核細胞を、ニコチンアミドの存在下または非存在下でＦｉｃｏｌｌおよび「プラスチック接着」方法を用いて骨髄から単離した。非接着細胞を３〜４日後に洗浄除去し、培地を３〜４日毎に置きかえた。ＦＡＣＳ分析を行って、１回目の継代の前（播種の８日後）に表面分子の発現レベルを得た。 様々な濃度のニコチンアミド中での６回の継代後の脂肪組織由来間葉系幹細胞の表現型キャラクタライゼーションを例示するグラフである。 様々な濃度のニコチンアミドで処理したまたは処理しなかった培養物の１回目の継代後の骨髄由来間葉系幹細胞の表現型キャラクタライゼーションを例示する棒グラフである。単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌおよび「プラスチック接着」方法を用いて骨髄から単離した。非接着細胞を３〜４日後に洗浄除去し、培地を３〜４日毎に置きかえた。ＦＡＣＳ分析を行って、１回目の継代の前（播種の８日後）に表面分子の発現レベルを得た。 ６回目の継代時のＭＳＣ数に対する様々な濃度のニコチンアミド（３回目の継代時、およびその後の各回の継代時に添加）の効果を例示する棒グラフである。ニコチンアミドは、培養物中での脂肪由来間葉系幹細胞増殖を実質的に改善した。 骨髄由来間葉系幹細胞増殖に対するニコチンアミドの効果を例示するグラフである。ニコチンアミドを、培養の開始から、およびその後の各継代時に添加した。 脂肪由来間葉系幹細胞増殖に対する様々な濃度のニコチンアミドの効果を例示するグラフである。ニコチンアミドを、３回目の継代から、およびその後の各継代時に添加した。 ニコチンアミド中で培養された間葉系幹細胞が、同一の条件下であるが、ニコチンアミドの非存在下で培養された間葉系幹細胞よりも迅速に増殖することを例示する図である。 大規模バッチ中で培養された間葉系幹細胞の累積細胞計数に対するニコチンアミドの効果を例示するグラフである。 間葉系幹細胞の累積細胞計数に対するニコチンアミドの効果が、用いられた特定のバッチの血清に依存しないことを例示する、実施された２つの実験のうちの一方の結果を例示する棒グラフである。 細胞のサイズおよび粒度に対する、ニコチンアミドの存在下での培養の有益な効果を例示するグラフおよびプロットである。図２０Ｃは、ニコチンアミドの存在下で増殖した細胞は、より小さく、より粒度が低い（多くの細胞が赤丸中にある）が、それとは反対に、ニコチンアミドなしに増殖した細胞はより大きく、より粒度が高い（黒丸）ことを示す。図２０Ａについては、用いられたニコチンアミドの濃度は５ｍＭであった。 ニコチンアミドの存在下で増殖した間葉系幹細胞が、同一の条件下でニコチンアミドの非存在下で増殖した間葉系幹細胞よりも粒度が低いことを例示するグラフおよびプロットである。 ニコチンアミド（５ｍＭ）の存在下でのＭＳＣの培養が累積ＣＦＵ−Ｆ計数を増加させることを例示するグラフである。 ニコチンアミドが間葉系幹細胞の老化の量を減少させることを例示する写真である。骨髄由来間葉系幹細胞を、５ｍＭのＮＡＭを用いて／用いずに５回継代にわたって培養した。細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌ染色を行って、老化細胞を検出した（青色の染色）。 ニコチンアミドが間葉系幹細胞上での表面マーカー（ＶＣＡＭ１／ＣＤ１０６（図２４Ａ）およびＣＤ５４（図２４Ｂ））の発現を調節することを例示する棒グラフである。ニコチンアミドの存在下で増殖した細胞中でのＶＣＡＭ１／ＣＤ１０６の発現の増強およびＣＤ５４の発現の低下に留意されたい。 ３回目の継代時にニコチンアミドを用いて（図２５Ｂ）または用いずに（図２５Ａ）培養したＭＳＣについて実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷治癒アッセイの結果を例示する写真である。創傷治癒は、創傷形成の４日後に観察された。 骨髄由来間葉系幹細胞の倍加時間に対するニコチンアミドの効果を例示するグラフである。ニコチンアミドを、培養の開始から、およびその後の各継代時に添加した。 ５回の継代の培養を通じた、骨髄由来ＭＳＣ増殖に対する、ＦＧＦ４を用いる、および用いないニコチンアミドの効果を例示するグラフである。骨髄由来間葉系幹細胞を、Ｆｉｃｏｌｌおよびプラスチック接着方法を用いて単離し、ウシ胎仔血清と共に数回の継代にわたって培養した。−ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝対照（明青色の丸）、−ＮＡＭ＋ＦＧＦ４＝５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４と共に培養（暗青色の丸）、＋ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭと共に培養（ピンク色の丸）、＋ＮＡＭ＋ＦＧＦ４＝５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４および５ｍＭのＮＡＭと共に培養（赤色の丸）。全継代のＭＳＣ増殖を通じて一緒に添加されたニコチンアミドおよびＦＧＦ４の相乗効果に留意されたい。 ニコチンアミドおよびＦＧＦ４で処理されたＭＳＣ培養物に由来する条件化培地の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）含量の増強を例示する棒グラフである。骨髄間葉系幹細胞を、Ｆｉｃｏｌｌおよびプラスチック接着方法を用いて単離し、ウシ胎仔血清と共に、ニコチンアミドおよびＦＧＦ４を添加して（＋ＮＡＭ＋ＦＧＦ４）、ニコチンアミドを添加して（＋ＮＡＭ−ＦＧＦ４）、およびニコチンアミドまたはＦＧＦを添加せずに（−ＮＡＭ−ＦＧＦ４）、数回の継代にわたって培養した。４回目の継代の２４時間前に、培地を交換し、ウシ胎仔血清またはＦＧＦ４を含まない新鮮な培地を添加した。４回目の継代の培養物から培養培地を採集し、ＥＬＩＳＡによってＨＧＦ含量についてアッセイした。−ＮＡＭ、−ＦＧＦ４＝対照；＋ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭ、＋ＮＡＭ＋ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭ＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４。ＨＧＦ分泌に対する、ＦＧＦ４とニコチンアミドの組合せの有意な効果に留意されたい。 ニコチンアミドおよびＦＧＦ４で処理されたＭＳＣ培養物に由来する条件化培地のトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦβ）含量の増強を例示する棒グラフである。骨髄間葉系幹細胞を、上記の図２８に記載のように単離および培養した。４回目の継代の２４時間前に、培養培地を、ウシ胎仔血清またはＦＧＦ４を含まない培地に交換し、４回目の継代の培養物から採集し、ＥＬＩＳＡによってＴＧＦβ含量についてアッセイした。−ＮＡＭ、−ＦＧＦ４＝対照；＋ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭ、＋ＮＡＭ＋ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭ＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４。ＴＧＦβ分泌に対する、ＦＧＦ４とニコチンアミドの組合せの有意な効果に留意されたい。 ニコチンアミドおよびＦＧＦ４で処理されたＭＳＣ培養物に由来する条件化培地のケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）含量の増強を例示する棒グラフである。骨髄間葉系幹細胞を、上記の図２８に記載のように単離および培養した。４回目の継代の２４時間前に、培養培地を、ウシ胎仔血清またはＦＧＦ４を含まない培地に交換し、４回目の継代の培養物から採集し、ＥＬＩＳＡによってＫＧＦ含量についてアッセイした。−ＮＡＭ、−ＦＧＦ４＝対照；＋ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭ、＋ＮＡＭ＋ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭ＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４。ＫＧＦ分泌に対する、ＦＧＦ４とニコチンアミドの組合せの有意な効果に留意されたい。 ニコチンアミドおよびＦＧＦ４で処理されたＭＳＣ培養物に由来する条件化培地のサイトカインＩＬ−６（ＩＬ−６）含量の低下を例示する棒グラフである。骨髄間葉系幹細胞を、上記の図２８に記載のように単離および培養した。４回目の継代の２４時間前に、培養培地を、ウシ胎仔血清またはＦＧＦ４を含まない培地に交換し、４回目の継代の培養物から採集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−６含量についてアッセイした。−ＮＡＭ、−ＦＧＦ４＝対照；＋ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭ、＋ＮＡＭ＋ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭ＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４。ＩＬ−６分泌に対する、ＦＧＦ４とニコチンアミドの組合せによる有意な低下に留意されたい。 ４回の継代の培養を通じた、脂肪由来ＭＳＣ増殖に対する、ＦＧＦ４を用いる、および用いないニコチンアミドの効果を例示するグラフである。脂肪由来間葉系幹細胞を、コラゲナーゼ消化およびプラスチック接着方法を用いて単離し、ウシ胎仔血清と共に数回の継代にわたって培養した。−ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝対照（青色の菱形）、＋ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭと共に培養（赤色の四角）、＋ＮＡＭ＋ＦＧＦ４＝５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４および５ｍＭのＮＡＭと共に培養（緑色の三角）。脂肪由来ＭＳＣ増殖に対する、一緒に添加されたニコチンアミドとＦＧＦ４の相乗効果に留意されたい。 ４回目の継代時の脂肪由来ＭＳＣ増殖における有核細胞増殖に対する、ＦＧＦ４を用いる、および用いないニコチンアミドの効果を詳述するグラフである。脂肪由来間葉系幹細胞を、図３２に記載のように単離および培養した。−ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝対照、＋ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝５ｍＭのＮＡＭと共に培養、＋ＮＡＭ＋ＦＧＦ４＝５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４および５ｍＭのＮＡＭと共に培養。培養物中の全有核細胞の増殖に対する、ニコチンアミドとＦＧＦ４との相乗効果に留意されたい。 培養された間葉系幹細胞のサイズに対する、ニコチンアミドとＦＧＦ４の存在下で脂肪由来ＭＳＣを培養する有益な効果を例示する棒グラフである。脂肪由来間葉系幹細胞を、図３２に記載のように単離および培養した。細胞のサイズをＣｅｄｅｘ細胞計数装置により分析した。−ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝対照、＋ＮＡＭ−ＦＧＦ４＝５ｍＭ／ｍｌのＮＡＭと共に培養、＋ＮＡＭ＋ＦＧＦ４＝５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４および５ｍＭ／ｍｌのＮＡＭと共に培養。ニコチンアミドの存在下で増殖したＭＳＣ細胞のサイズはより小さく、ニコチンアミドとＦＧＦ４と共に増殖したＭＳＣはさらにより小さいことに留意されたい。 ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させた造血細胞の分化に対する、ＦＧＦ４を用いる、および用いないニコチンアミドの効果を示す棒グラフである。臍帯由来初期前駆（ＣＤ１３３＋）造血細胞を、ＣＤ１３３マイクロビーズおよびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｍｉｌｅｎｔｙｉ，Ｉｎｃ）を用いて単離し、５０ｎｇ／ｍｌの初期作用サイトカインおよびウシ胎仔血清、±２．５または５ｍＭのニコチンアミド（ＮＡＭ）、±１０、５０または２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４を添加したＭＥＭα中で３週間培養した。３週間の培養後、ＣＤ３８−ＣＤ１３３＋細胞を染色し、ＦＡＣＳにより計数した。カラム１＝対照：−ＮＡＭ、−ＦＧＦ４、カラム２＝＋２．５ｍＭのＮＡＭ、カラム３＝＋５ｍＭのＮＡＭ、カラム４＝＋１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４、カラム５＝＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４、カラム６＝＋２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４、カラム７＝＋２．５ｍＭのＮＡＭ、＋１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４、カラム８＝＋２．５ｍＭのＮＡＭ、＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４、カラム９＝＋２．５ｍＭのＮＡＭ、＋２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４、カラム１０＝＋５ｍＭのＮＡＭ、＋１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４、カラム１１＝＋５ｍＭのＮＡＭ、＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４、カラム１２＝＋５ｍＭのＮＡＭ、＋２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４。ニコチンアミド処理された培養物中の未分化初期前駆細胞（ＣＤ３８−ＣＤ１３３＋）の画分が有意により多い（カラム２および３）、ＦＧＦ４のみの有意な効果がない（カラム４〜６）、および造血前駆細胞分化のニコチンアミド媒介性阻害に対するＦＧＦ４の有意な効果がない（カラム７〜１２）ことに留意されたい。 ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させた造血細胞の分化に対する、ＦＧＦ４を用いる、および用いないニコチンアミドの効果を示す棒グラフである。臍帯由来前駆（ＣＤ１３３＋）造血細胞を単離し、図３５に記載のようにニコチンアミドおよびＦＧＦ４を用いて、および用いずに培養した。３週間の培養後、ＣＤ３８＋細胞を染色し、ＦＡＣＳにより計数した。カラム１〜１２は図３５と同様である。ニコチンアミド処理された培養物における分化（ＣＤ３８＋細胞）の有意な阻害（カラム２および３）、分化に対するＦＧＦ４のみの有意な効果がないこと（カラム４〜６）および造血前駆細胞分化のニコチンアミド媒介性阻害に対するＦＧＦ４の有意な効果がないこと（カラム７〜１２）に留意されたい。 ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させた造血細胞の骨髄系列分化に対する、ＦＧＦ４を用いる、および用いないニコチンアミドの効果を示す棒グラフである。臍帯由来前駆（ＣＤ１３３＋）造血細胞を単離し、図３５に記載のようにニコチンアミドおよびＦＧＦ４を用いて、および用いずに培養した。３週間の培養後、骨髄系列に分化した（ＣＤ３３＋）細胞を染色し、ＦＡＣＳにより計数した。カラム１〜１２は図３５と同様である。ニコチンアミド処理された培養物における骨髄系列分化（ＣＤ３３＋細胞）の有意な阻害（カラム２および３）、ＦＧＦ４のみによる骨髄系列分化の中程度の増強（カラム４〜６）および骨髄系列造血細胞分化のニコチンアミド媒介性阻害に対するＦＧＦ４の有意な効果がないこと（カラム７〜１２）に留意されたい。 ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させた造血細胞のリンパ系列分化に対する、ＦＧＦ４を用いる、および用いないニコチンアミドの効果を示す棒グラフである。臍帯由来前駆（ＣＤ１３３＋）造血細胞を単離し、図３５に記載のように、ニコチンアミドおよびＦＧＦ４を用いて、および用いずに培養した。３週間の培養後、リンパ系列に分化した（ＣＤ１９＋）細胞を染色し、ＦＡＣＳにより計数した。カラム１〜１２は図３５と同様である。ニコチンアミド処理された培養物におけるリンパ系列分化（ＣＤ１９＋細胞）の顕著な阻害（カラム２および３）、ＦＧＦ４のみによるリンパ系列分化に対する有意な効果がないこと（カラム４〜６）、およびリンパ系列造血細胞分化のニコチンアミド媒介性阻害に対するＦＧＦ４の有意な効果がないこと（カラム７〜１２）に留意されたい。

本発明は、そのいくつかの実施形態において、間葉系幹細胞を増殖させる方法およびそれによって生成された細胞集団に関する。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、以下の説明に記載されるか、または実施例により例示される詳細にその適用を必ずしも限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態を可能にするか、または様々な方法で実施もしくは実行することができる。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の多能性により、これらの細胞は、細胞および遺伝子治療戦略の両方の文脈における様々な臨床適用において役割を果たすことができる、魅力的な治療手段および移植のための候補になっている。例えば、間葉系幹細胞を、移植後の造血生着の増強、組織再生の補助、創傷治癒の促進、多種多様な他の遺伝的および後天的障害の矯正のために用いてもよい。細胞の分化能力および標的組織生着能力に対する有害な効果を有さない効率的な間葉系幹細胞増殖プロトコルは、これらの全ての戦略の成功にとって重要である。

さらに、ＭＳＣは、分化能、栄養サポート能、および自然免疫応答の調節能のため、再生医療および炎症状態の臨床治療に魅力的である。ＭＳＣの治療能力は、骨および軟骨修復、心臓再生、重症肢虚血、急性虚血状態、糖尿病、クローン病および移植片対宿主疾患などの適応症について複数の臨床試験において試験されている。

ＭＳＣは、免疫特権を有し、ドナーとレシピエントとのＨＬＡマッチングを必要とせずに移植することができるため、大規模に製造し、市販の細胞製品として販売することができる。一人のドナーからの大規模バッチ生産の成功は、ドナーおよび血清の選択、培養物中での増殖の延長のための播種された細胞の能力ならびに製造の持続期間に高度に依存する。ＭＳＣがｉｎ ｖｉｔｒｏで比較的容易に増殖するとしても、その増殖能力は継続的に低下し、その倍加時間は培養中に増大する。結果として、一人のドナーからの均一なＭＳＣの大規模バッチの商業化のための製造の成功は依然として課題である。

ＭＳＣ増殖に対する成長因子の効果を研究しながら、本発明者らは、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＨＢ−ＥＧＦまたは血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの成長因子が、ニコチンアミドの存在下で培養した場合、間葉系幹細胞増殖に対する、非再現性の、またはさらには負の効果を有することを見出した（図１、２、６）。

対照的に、驚くべきことに、ＦＧＦ４は、間葉系幹細胞増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ／ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に対して、ニコチンアミドと一緒になって再現性のある相乗的活性を示した。

図３Ａ〜Ｄに例示されるように、本発明者らは、ニコチンアミドが間葉系幹細胞の増殖に対するＦＧＦ４の効果を強化することを示した。

さらに、本発明者らは、ＦＧＦ４と共に培養した間葉系幹細胞の細胞サイズに対するニコチンアミドの予想外の効果を示した。

図４Ａ〜Ｂに例示されるように、ニコチンアミドおよびＦＧＦ４中で培養することにより生成されたＭＳＣは、同一の方法によるが、ＦＧＦ４のみの存在下で培養された間葉系幹細胞よりも小さく、ニコチンアミドのみと共に培養されたＭＳＣと同様である。例えば、１０〜３２日目では、ニコチンアミドおよびＦＧＦ４中で培養された間葉系幹細胞は直径約２０μｍ未満であるが、ＦＧＦ４の存在下であるが、ニコチンアミドの非存在下で増殖した細胞は直径２０μｍより大きい。かくして、ニコチンアミドは、ＦＧＦ４と共に培養されたＭＳＣを未分化状態にした。

本発明をさらに実施に移しながら、本発明者らは、ＭＳＣマーカーであるＣＤ１０５＋ＣＤ４５−を発現する細胞（％）が、ニコチンアミドおよびＦＧＦ４で処理された培養物中で保存されることを示した（図５Ａ〜Ｄ）。

さらに、本発明者らは、選択および発現プロトコルの特定の段階の間でのニコチンアミドの使用が間葉系幹細胞集団にとって有利であることを見出した。かくして、例えば、ニコチンアミドおよび高濃度のカルシウムの存在下での間葉系幹細胞の播種は、細胞のマーカー表現型を分析することによって示されるように、その播種効率を増加させた（図１１〜１３）。細胞の表面マーカー組成により例示されるように、分化を誘導することなく、ニコチンアミドの存在下で少なくとも６回の継代にわたって間葉系幹細胞を上手く増殖させることができた（図１２Ａ〜Ｃ）。さらに、ニコチンアミドは、ＭＳＣのより均一な、より粒度の低い集団の増殖を促進することが示された（図２０Ａ〜Ｃおよび図２１Ａ〜Ｂ）。

本発明者らは、ニコチンアミドと共に培養したＭＳＣがより急速に増殖し、結果として、その倍加時間（図２６を参照されたい）が減少し、培養物が実質的により短い期間でコンフルエントに達することを実験的に示した（図１４〜１７、２６および２７）。ニコチンアミドの増殖効果は、ＭＳＣの大規模培養物中でも示された（図１８）。さらに、その効果は選択されたバッチの血清に限定されなかったが（図１９）、これはより大きなバッチのＭＳＣの製造にとって実質的な利点である。さらに、本発明者らは、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）と組み合わせたニコチンアミドの増殖効果が、非間葉起源の幹細胞、例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、ＣＤ１３３＋）について観察されないことを示した（本明細書の実施例１０、および図３５〜３８を参照されたい）。実際、ＦＧＦ４単独またはニコチンアミドと組み合わせたＦＧＦ４は、ｅｘ ｖｉｖｏで培養された造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または分化に対する効果はなかった（図３５〜３８、レーン１および４〜１２を参照されたい）。

かくして、本発明の一態様によれば、ニコチンアミドと線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）とを含む培地中でＭＳＣの集団を培養することを含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養する方法が提供される。

さらに、本発明者らは、ニコチンアミドの存在下での間葉系幹細胞の混合集団の培養が間葉系幹細胞表現型を増強し、間葉系幹細胞マーカーを用いるその後の選択または予備選択が間葉系幹細胞のより均一な集団を提供し、それによって間葉系幹細胞サブセットの濃縮された集団を取得する方法を提供することをここで見出した。これは、本発明者らが、ニコチンアミドの存在下でのＭＳＣの培養が特定の接着分子−血管細胞接着タンパク質１（ＶＣＡＭ１／ＣＤ１０６；図２４Ａを参照されたい）の発現を増加させることを示した時に本発明者らによって実証された。逆に、本発明者らは、ニコチンアミドの存在下でのＭＳＣの培養が、細胞老化のマーカー（ＣＤ５４；図２４Ｂを参照されたい）の発現を低下させることによって、細胞集団から非関連細胞を枯渇させることにより間葉系幹細胞の濃縮された集団を取得する方法を提供することを示した。

選択または選別ステップの使用は、ＭＳＣの選別および選択特異性の厳密さをさらに増強し、出発材料からの汚染の可能性をさらに潜在的に低下させる。

かくして、本発明の一態様によれば、混合細胞集団から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離する方法であって、
（ａ）ニコチンアミドを含む培地中で混合細胞集団を培養する工程と、
（ｂ）混合細胞集団から細胞表面分子の発現に基づいて細胞を選択することによって、混合細胞集団からＭＳＣを選択する工程と
を含む、方法が提供される。

用語「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、最終分化しておらず、分裂して幹細胞である細胞になることができるか、またはサイトカインなどの生物活性因子からの様々な影響に応じて、不可逆的に分化して、間葉細胞系列の細胞、例えば、脂肪組織；骨組織；軟骨組織；弾性結合組織；線維性結合組織；筋芽細胞、および、胚体中胚葉を起源とするもの（例えば、神経細胞）以外の組織を生じる成体細胞について互換的に用いられる。

本発明のいくつかの実施形態により用いられるＭＳＣ培養物は、好ましくは形態学的特徴により定義される３つの群の細胞：小さく無顆粒の細胞（以後、ＲＳ−１と呼ぶ）、小さく顆粒状の細胞（以後、ＲＳ−２と呼ぶ）および大きく中程度に顆粒状の細胞（以後、成熟ＭＳＣと呼ぶ）を含む。培養物中のそのような細胞の存在および濃度を、例えば、免疫蛍光アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、および活性アッセイを用いることにより、様々な細胞表面マーカーの有無を同定することによってアッセイすることができる。

ＭＳＣを本発明のいくつかの実施形態の培養条件下で培養する場合、それらは造血幹細胞マーカーＣＤ３４、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ４３およびＣＤ４５について陰性染色を示す。少量の細胞（１０％未満）がＣＤ３１および／またはＣＤ３８マーカーについて薄く陽性であってもよい。さらに、成熟ＭＳＣは、造血幹細胞マーカー、ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）について薄く陽性であってもよく、骨形成ＭＳＣマーカー、Ｓｔｒｏ−１について中程度に陽性であってもよく（非特許文献２９）、胸腺細胞および末梢Ｔリンパ球マーカー、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）について陽性であってもよい。他方、ＲＳ−１細胞は、ＣＤ１１７およびＳｔｒｏ１マーカーについて陰性であり、ＣＤ９０マーカーについて薄く陽性であり、ＲＳ−２細胞はこれらのマーカーの全部について陰性である。

本発明のいくつかの実施形態の培養条件下で培養された間葉細胞は、培地中に生物活性因子を分泌することができる。本発明者らは、ニコチンアミドと共に培養された間葉細胞から収集された培地が上昇したレベルの成長因子およびサイトカイン（例えば、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、トランスフォーミング成長因子ベータ）ならびに低下したレベルの前炎症因子（例えば、ＩＬ６）を含むことを観察した（実施例８および図２８〜３１を参照されたい）。培地へのＦＧＦ４の添加は、培養培地中のＩＬ６のレベルをさらに低下させながら、培地中の成長因子のレベルをさらに増加させた。単離された培養培地は、強力な抗炎症効果を有し、ならびに培養物中での細胞の増殖を増強することが観察された。かくして、前記培養条件下で培養された間葉細胞は、培地中に、抗炎症活性および細胞増殖増強活性を有する生物活性因子を分泌する。

本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞は、ヒト由来である。

本発明のこの態様の別の実施形態によれば、間葉系幹細胞は、ヒト新生児から単離される。

間葉系幹細胞を、限定されるものではないが、骨髄、末梢血、血液、胎盤（例えば、胎盤の胎児側）、臍帯血、臍帯、羊水、胎盤および脂肪組織などの様々な組織から単離することができる。

末梢血から間葉系幹細胞を単離する方法は、非特許文献３０に記載されている。胎盤組織から間葉系幹細胞を単離する方法は、非特許文献３１に記載されている。脂肪組織、胎盤および臍帯血間葉系幹細胞を単離および培養する方法は、非特許文献３２に記載されている。

骨髄を、吸引により個体の腸骨稜から単離することができる。低密度ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を、ＦＩＣＯＬ−ＰＡＱＵＥ密度勾配、またはＨｅｔａｓｔａｒｃｈ（ヒドロキシエチルスターチ）を用いる赤血球の除去により分離することができる。好ましくは、等量のハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いてＢＭ吸引液（通常２０ｍｌ）を希釈し、希釈された細胞を約１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌカラム（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）上に重ねることにより、間葉系幹細胞を生成する。２，５００ｘｇで３０分間の遠心分離後に、単核細胞層を境界面から取り出し、ＨＢＳＳ中に懸濁する。次いで、細胞を１，５００ｘｇで１５分間遠心分離し、完全培地（ＭＥＭ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含まないα培地；ＧＩＢＣＯ）；ＭＳＣの迅速な成長のために選択されたロットに由来する２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）；１００単位／ｍｌのペニシリン（ＧＩＢＣＯ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）；および２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）中に再懸濁する。

脂肪組織由来ＭＳＣを、任意の脂肪含有組織、例えば副睾丸脂肪から、または脂肪吸引により取得し、単核細胞を、脂肪および脂肪細胞の除去により手動で、またはＭＳＣの調製について上記されたものと同じ手順に従ってＣｅｌｕｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏｒｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を用いて単離することができる。

記載のように、前記方法は、ニコチンアミドとＦＧＦ４とを含む培地中で間葉系幹細胞を培養すること（すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）により行われる。

本発明のこの態様によれば、細胞は、分化を誘導しない条件下で（例えば、分化因子の非存在下で、または非分化量の分化因子の存在下で）培養される。

本発明は、間葉系幹細胞の供給源から単離するか、または間葉系幹細胞について予備選択された細胞の集団を培養した後、前記細胞を直接培養することを意図する。かくして、本発明は、ＭＳＣを含む不均一な細胞集団と、７０％を超えるもの、８０％を超えるもの、９０％を超えるもの、または９５％を超えるもの、９８％を超えるものがＭＳＣである、ＭＳＣについて濃縮されたより均一な細胞集団との両方を培養することを意図する。また、以下にさらに記載されるように培養すると同時にＭＳＣを濃縮することも意図される。

不均一な細胞集団の組成は、細胞の供給源に依存することが理解されるであろう。かくして、例えば、胎盤を細胞供給源として選択する場合、不均一な細胞集団は胎盤細胞ならびに間葉系幹細胞を含むであろう。骨髄を細胞供給源として選択する場合、不均一な細胞集団は血液細胞を含むであろう。しかしながら、実施例１０に示されるように、本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の培養条件下での間葉系幹細胞の培養（例えば、ニコチンアミドとＦＧＦ４と共に）は、非間葉系幹細胞集団に対する同時的増殖効果を有することなく、間葉系幹細胞集団の選択的増殖をもたらす。

１つの方法によれば、細胞集団をポリスチレンプラスチック表面上で（例えば、フラスコ中で）培養して（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ）、非接着細胞（すなわち、非間葉系幹細胞）を除去することにより、間葉系幹細胞について濃縮する。ＭＳＣについて濃縮するこの方法は、ニコチンアミドとＦＧＦ４の中で培養する前に、ニコチンアミドとＦＧＦ４の中で培養すると同時に、および／またはニコチンアミドとＦＧＦ４の中で培養した後に行うことができる。

例えば、間葉系幹細胞マーカーに対する陽性選択および／または造血幹細胞および前駆細胞マーカー、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ８などに対する陰性選択を含む、ＭＳＣを選択する他の方法は当業界で公知である。タンパク質の細胞表面発現を決定する方法は、当業界で周知である。例としては、ＦＡＣＳ分析などの免疫学的方法ならびに生化学的方法（細胞表面標識、例えば、放射活性、蛍光、アビジン−ビオチン）が挙げられる。

選択段階を、ニコチンアミドとＦＧＦ４の中で培養した後に実施することもできることが理解されるであろう。これは、予備選択段階と同時に、または予備選択段階の代わりに行ってもよい。

本明細書で用いられる「ニコチンアミド」は、ニコチンアミドならびにニコチンアミドから誘導される生成物、その類似体およびニコチンアミドの代謝物またはニコチンアミド類似体、例えば、ＮＡＤ、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨなどをいう。

本明細書で用いられる語句「ニコチンアミド類似体」とは、ニコチンアミドと同様に作用することが知られる任意の分子をいう。ニコチンアミド類似体の代表的な例としては、限定されるものではないが、ベンズアミド、ニコチンチオアミド（ニコチンアミドのチオール類似体）、ニコチン酸、α−アミノ−３−インドールプロピオン酸、およびサーチュインファミリーのヒストン／タンパク質デアセチラーゼの阻害剤が挙げられる。

ニコチンアミド類似体誘導体の例としては、限定されるものではないが、置換ベンズアミド、置換ニコチンアミドおよびニコチンチオアミドならびにＮ−置換ニコチンアミドおよびニコチンチオアミドが挙げられる。

特定の実施形態においては、ニコチンアミドは少なくとも約１ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で供給される。他の実施形態においては、ニコチンアミド濃度は、少なくとも約１ｍＭ〜１０ｍＭ、例えば、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約７．５ｍＭの濃度で供給される。

線維芽細胞成長因子４、ＦＧＦ４（遺伝子座１１ｑ１３．３）遺伝子産物、ＦＧＦ−４／ＨＢＧＦ−４／ＫＦＧＦは、前駆体タンパク質のＮ末端の３０アミノ酸の切断により誘導される１７６アミノ酸長のタンパク質である。ＦＧＦ−４は、単一のＮ結合グリコシル化部位を含有する。無グリコシル化ＦＧＦ−４は、２つのＮＨ２−末端トランケート型ペプチド（１３および１５ｋＤａ）に切断され、これらは野生型タンパク質よりも活性が高く、高いヘパリン親和性を有する。

特定の実施形態によれば、ＦＧＦ４はヒトＦＧＦ４である。

組換えＦＧＦ４タンパク質は市販されている（バキュロウイルス中で産生され、Ｎ末端で切断された１４８アミノ酸のタンパク質（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生されたもの（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）など）。

特定の実施形態においては、ＦＧＦ４は、少なくとも約１〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で培養物に供給される。他の実施形態においては、ＦＧＦ４濃度は、少なくとも約１０〜２００ｎｇ／ｍｌ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される。

特定の実施形態によれば、ニコチンアミドとＦＧＦ４の両方を含む培養培地は、ＰＤＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦまたはｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）などのさらなる成長因子を含まない。

特定の成分を含まない培地に言及する場合、本発明は、培地がこの成分を含むが、その最小活性より低い濃度で含むことを意図することが理解されるであろう。かくして、例えば、特定の培地は、微量の上記成長因子を含んでもよいが、本発明の方法は、市販の培地の処方に含まれるものを超える外因的に添加される成長因子を含まない培地、または培地成分濃度の全体的な調整の結果得られるものに関する。かくして、特定の実施形態によれば、ニコチンアミドとＦＧＦ４とを含む培地は、上記のさらなる成長因子のいずれか１つを含んでもよいが、その濃度は１ｎｇ／ｍｌ未満である。

ニコチンアミドとＦＧＦ４とを添加することができる典型的な細胞培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）である。あるいは、細胞培地はＨａｍのＦ１２であってもよい。他の意図される培地としては、ＨＥＭ ＲＰＭＩ、Ｆ−１２などが挙げられる。

例えば、ＭＥＭα（８．１９μＭのニコチンアミド）、ＲＰＭＩ（８．１９μＭのニコチンアミド）、ＤＭＥＭ（３２．７８μＭのニコチンアミド）およびＧｌａｓｃｏｗ培地（１６．３９μＭのニコチンアミド）などの、多くの培養培地がビタミン補給物質としてニコチンアミドを含有するが、本発明の方法は、培地の処方に含まれる任意のニコチンアミドおよび／もしくはニコチンアミド部分を補給する外因的に添加されるニコチンアミド、または培地成分濃度の全体的な調整の結果生じるものに関することに留意されたい。

本発明のある実施形態においては、細胞培養培地は、約１．８ｍＭを超える、約２ｍＭを超える、または約５ｍＭを超える高いカルシウム濃度を有する。カルシウム濃度は、培養培地中に既に存在するものを含む全カルシウム濃度として算出される。

よって、例えば、培地がＤｕｌｂｅｃｃｏ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）（約１．８ｍＭのカルシウムイオン濃度を既に有する）である場合、追加のカルシウムを添加する必要はない。細胞培地が約０．９ｍＭのカルシウムイオン濃度を有するＨａｍのＦ１２である場合、追加のカルシウムを添加するべきであり、全カルシウム濃度は１．８ｍＭを超える。一実施形態においては、追加のカルシウムの供給源は血清であってもよい。

培養の間に、培地は、グルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、鉱物およびトランスフェリンなどの有用なタンパク質などの細胞代謝にとって必要な補給物質を含有してもよい。培地はまた、酵母、細菌、および真菌の汚染を防ぐための抗生物質、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどを含有してもよい。細胞を培養しようとする場合、条件は生理的条件に近いものであるべきである（好ましくは、約６〜約８のｐＨ、および約３０℃〜約４０℃の温度）。

酸素正常状態または低酸素状態も意図される。

一実施形態によれば、培養培地は血清を含まず（すなわち、無血清培地）、限定されるものではないが、血小板溶解物などの血清代替物を含む（播種および／または増殖の間）。

さらに別の実施形態によれば、培地は約１０％のウシ胎仔血清を含む。ヒト血清も意図される。

本発明のこの態様による培養を、発現が起こらないような限られた期間にわたって行う（例えば、播種段階のみの間）か、または間葉系幹細胞の増殖（すなわち、細胞増殖）を可能にするためにより長時間にわたって行うことによって、間葉系幹細胞の量を増加することができる。

増殖の各ラウンドについて、接着細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて、または細胞剥離により収穫し、狭いパスツールプラスチックピペットを通過させることにより解離させ、好ましくは、約１００〜約１０，０００個の細胞／ｃｍ^２の密度で再塗布することができる。

本発明のこの態様によれば、細胞増殖にとって十分な期間は、少なくとも１個の細胞が分裂するのに必要とされる時間の長さを意味するものと取ることができる。

一実施形態によれば、培養は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間または少なくとも５週間行われる。

別の実施形態によれば、培養は、１０週間を超えて行われない。

さらに別の実施形態によれば、細胞を、少なくとも２回の集団倍加、少なくとも４回の集団倍加、少なくとも６回の集団倍加、少なくとも８回の集団倍加、少なくとも１０回の集団倍加、少なくとも１５回の集団倍加、少なくとも２０回の集団倍加、少なくとも２５回の集団倍加、少なくとも３０回の集団倍加、少なくとも３５回の集団倍加、少なくとも４０回の集団倍加、または少なくとも４５回の集団倍加にわたって増殖させる。

別の実施形態によれば、細胞を、５０回を超える集団倍加にわたって増殖させない。

本発明は、間葉系幹細胞増殖ならびに（またはその代わりに）ニコチンアミドとＦＧＦ４の中での培養のさらなる方法を意図する。

本発明者らは、増殖プロセスの時間の少なくとも一部がニコチンアミドの存在下で行われる場合、増加した数の間葉系幹細胞が得られることを見出したため、増殖のさらなる方法はニコチンアミドの存在下で培養することを含むのが好ましい。

かくして、本発明の別の態様によれば、間葉系幹細胞の集団を増殖させる方法であって、細胞増殖にとって十分な期間にわたって間葉系幹細胞の播種された集団を培養する工程を含み、前記期間の少なくとも一部については、ニコチンアミドを含まない培地中で培養を行い；前記期間の少なくとも第２の部分については、ニコチンアミドとＦＧＦ４とを含む培地中で培養を行うことによって、間葉系幹細胞の増殖させた集団を生成する、方法が提供される。

本明細書で用いられる用語「増殖させる」とは、細胞複製により細胞集団中の細胞数を増加させることを指す。

本発明のこの態様によれば、細胞を、分化を誘導しない条件下で（例えば、分化因子の非存在下で）増殖させる。

未分化間葉系幹細胞の播種された集団は、上記にさらに記載されたように、不均一な細胞集団または間葉系幹細胞の精製された集団であってもよい。

記載のように、ニコチンアミドを含まない培地とは、最小有効量未満（例えば、０．５ｍＭ未満、またはより好ましくは、０．０５ｍＭ未満）のニコチンアミドを含む培地を指す。かくして、微量のニコチンアミドを含む培地（上記のような）を、本発明のこの態様のために用いることができる。かくして、特定の実施形態によれば、外因的に添加されたニコチンアミドを含まない培地は、補給物質としての外因性ニコチンアミドの添加の前に、０．５ｍＭ未満またはより好ましくは、０．０５ｍＭ未満の濃度でニコチンアミドを含んでもよい。

一実施形態によれば、ＭＳＣは、少なくとも５０％精製される、少なくとも７５％精製される、または少なくとも９０％精製される。

間葉系幹細胞の集団を、上記のもの、または参照により本明細書に援用する特許文献３に開示されたものなどの任意の培地中に播種する（および／または培養する）ことができる。

ニコチンアミドとＦＧＦ４の存在下での培養の時間比：ニコチンアミドの非存在下での培養は、変化してもよく、１：９９；２：９８；３：９７；４：９６、５：９５；６：９４；７：９３；８：９２；９：９１；１０：９０；１１：８９；１２：８８；１３：８７；１４：８６；１５：８５；１６：８４；１７：８３；１８：８２；１９：８１；２０：８０；２１：７９；２２：７８；２３：７７；２４：７６；２５：７５；２６：７４ ２７：７３；２８：７２；２９：７１；３０：７０；３１：６９；３２：６８；３３：６７；３４：６６；３５：６５；３６：６４；３７：６３；３８：６２；３９：６１；４０：６０；４１：５９；４２：５８；４３：５７；４４：５６；４５：５５；４６：５４；４７：５３；４８：５２；４９：５１；５０：５０；５１：４９；５２：４８；５３：４７；５４：４６；５５：４５；５６：４４；５７：４３；５８：４２；５９：４１；６０：４０；６１：３９；６２：３８；６３：３７；６４：３６；６５：３５；６６：３４；６７：３３；６８：３２；６９：３１；７０：３０；７１：２９；７２：２８；７３：２７；７４：２６；７５：２５；７６：２４；７７：２３；７８：２２；７９：２１；８０：２９；８１：１９；８２：１８；８３：１７；８４：１６；８５：１５；８６：１４；８７：１３；８８：１２；８９：１１；９０：１０；９１：９；９２：８；９３：７；９４：６；９５：５；９６：４；９７：３；９８：２；９９：１からの全ての比を含んでもよい。

一実施形態によれば、少なくとも１回の完全なラウンドの増殖を、ニコチンアミドの存在下で行う。

ニコチンアミドを含む培地中での培養を、ニコチンアミドを含まない培地中での培養の前または後に行うことができるが理解されるだろう。

本発明の実施形態によれば、ニコチンアミドを含まない培地は、（ニコチンアミドを含む培地と同じか、または異なる濃度で）ＦＧＦ４を含む。

本発明の他の実施形態によれば、ニコチンアミドを含まない培地は、ＦＧＦ４をさらに含まない。

さらに、本発明者らは、ニコチンアミドとＦＧＦ４の存在下での２以上の培養段階の間に、ニコチンアミドの非存在下での培養段階を行うこと、およびその逆を意図する。

一実施形態によれば、ニコチンアミドとＦＧＦ４の存在下での培養を、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間または少なくとも５週間にわたって行う。

別の実施形態によれば、ニコチンアミドの非存在下での培養を、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間または少なくとも５週間にわたって行う。

上述のとおり、精製プロセスの第２のステップは、間葉系幹細胞表面マーカーの発現に基づいてＭＳＣを選択することである。選択または選別ステップは、１つまたは複数のそのような表面マーカーを用いて混合細胞集団から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を選択することを含んでもよい。選択または選別ステップを行うことにより、ＭＳＣに対する選別および選択の特異性が更に厳密となり、出発材料からの汚染の可能性をさらに低下させうる。

選別の前に、典型的には、混合細胞集団を、細胞分散剤を用いて分散させる。好ましくは、単一の細胞集団が得られる。細胞の分散に用いることができる薬剤の例としては、限定されるものではないが、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、アキュターゼ、トリプシン（例えば、トリプシン−ＥＤＴＡ）、パパインが挙げられる。あるいは、またはさらに、磨砕を用いて、細胞の分散を増加させることもできる。

特定の実施形態によれば、選択は、所定のレベルを超えてＶＣＡＭ−１／ＣＤ１０６（ＮＰ＿００１０６９．１）を発現する細胞を選択することにより行われる。

別の実施形態によれば、選択は、所定のレベルを超えてＣＤ１０５（ＳＨ２）、ＣＤ７３（ＳＨ３／４）、ＣＤ４４、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）、ＣＤ７１、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ２９、ＣＤ１６６、ＣＤ１４６、ＣＤ１０６およびＣＤ２７１のうちの少なくとも１つを発現する細胞を選択することにより行われる。

特定の実施形態によれば、表面マーカーは、間質前駆体抗原−１（ＳＴＲＯ−１）、ＣＤ１０５またはＶＣＡＭ（ＣＤ１０６）である。

さらに別の実施形態によれば、選択は、所定のレベルより少なくＣＤ３４、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ４３およびＣＤ４５のうちの少なくとも１つを発現する細胞を選択することにより行われる。

抗原発現に基づく選択または選別のためのいくつかの方法が公知であり、これらのいずれかを、本明細書で記載される選択または選別ステップにおいて用いることができる。特に好ましい実施形態においては、分析はフローサイトメトリーを用いて達成され、続いて、細胞は、各細胞の特異的光散乱および蛍光特性に基づいて選別される。かくして、選択または選別を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて達成することができる。

当業界で公知のように、ＦＡＣＳは、細胞により発現される抗原に結合し、これを標識する蛍光標識抗体などのリポーターに細胞を曝露することを含む。抗体を産生し、それを標識してリポーターを形成させるための方法は当業界で公知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅに記載されている。ＦＡＣＳ分析のために用いることができる抗体は、非特許文献３３に教示されており、広く市販されている。次いで、細胞を、標識に基づいて互いに細胞を選別するＦＡＣＳ装置に通過させる。

あるいは、またはさらに、磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）またはイムノパンニングを用いて細胞を選別することができる。

上記のように、混合細胞集団を、レーザー走査Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒなどのフローサイトメーターにより分析する。フローサイトメーターは、典型的には、レーザー光源、フロー測定チャンバ、ならびにレンズ、フィルター、および光検出器からなる光学系からなる。レーザーに対して１つは１８０度および１つは９０度の、２つの光電子増倍管（光検出器）を用いて、それぞれ、前方（ＦＳＣ）および右角散乱（ＳＳＣ）を測定する。それぞれフィルターおよび光電子増倍管からなる３つの蛍光検出器を用いて、蛍光を検出する。３つの検出器は、緑色蛍光（ＦＬ１−−５３０ｎｍ）、橙色蛍光（ＦＬ２−−５８５ｎｍ）、および赤色蛍光（ＦＬ３−−６５０ｎｍ）を感知する。コンピュータを用いて全部で５つの検出器シグナル（ＦＳＣ、ＳＳＣ、ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３）に適用された選別ロジックにより、細胞を同定する。

本発明のこの態様において用いることができる例示的なフローサイトメーターは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＵＳＡ）、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（ＵＳＡ）、Ｐａｒｔｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）などの会社により製造されている。

ＦＡＣＳ装置を、特定の前方散乱および／または側方散乱の細胞が選択されるように設定することができる。前方散乱光（ＦＳＣ）は、細胞の表面積またはサイズに比例する。ＦＳＣは、主に回折光の測定値であり、光ダイオードにより前方における入射レーザービームの軸から外れてすぐ検出される。ＦＳＣは、その蛍光とは無関係に所与のサイズよりも大きい粒子を検出する好適な方法を提供する。

側方散乱光（ＳＳＣ）は、細胞の粒度または内部の複雑さに比例する。ＳＳＣは、主に屈折光および反射光の測定値であり、屈折率の変化が存在する細胞内の任意の接触面で生じる。ＳＳＣは、コレクションレンズによりレーザービームに対して約９０度で集束され、次いで、ビームスプリッタにより適切な検出器に向かって方向を変えられる。

かくして、例えば、本発明は、特定の前方散乱でゲーティングすることにより約２０μｍを下回る直径を有し、特定の側方散乱でゲートすることにより特定の粒度を有する細胞を選択することを意図する。

本発明は、細胞表面発現のレベルに基づいて特定の細胞集団を選択することを意図する。かくして、ＦＡＣＳの場合、細胞集団が約２０〜１００（薄暗い）、約１００〜５００（中程度）または約５００〜２０００以上（明るい）の蛍光強度で染色された事象についてゲーティングされるように装置が設定されうる。以下の細胞集団が、本発明によって意図される：
ＶＣＡＭ１明るい細胞；
ＶＣＡＭ１中程度の細胞；
ＶＣＡＭ１薄暗い細胞；
ＳＴＲＯ−１明るい細胞；
ＳＴＲＯ−１中程度の細胞；
ＳＴＲＯ−１薄暗い細胞；
ＣＤ１０５明るい細胞；
ＣＤ１０５中程度の細胞；
ＣＤ１０５薄暗い細胞。

２以上の上記マーカー、例えば、少なくとも２つの上記マーカーまたは少なくとも３つの上記マーカーの発現に基づいて、細胞集団を選択することができることが理解されるであろう。

上記の細胞集団は、典型的には、ＣＤ４５を発現しない細胞について濃縮される。かくして、別の実施形態によれば、上記細胞集団中の１０％未満の細胞がＦＡＣＳにより測定された場合、ＣＤ４５を発現する。

さらに別の実施形態によれば、上記細胞集団中の９０％を超える細胞が、ＦＡＣＳにより測定された場合、ＣＤ９０を発現する。

さらに別の実施形態によれば、上記細胞集団中の９５％を超える細胞が、ＦＡＣＳにより測定された場合、ＣＤ９０を発現する。

さらに別の実施形態によれば、上記細胞集団中の９０％を超える細胞が、ＦＡＣＳにより測定された場合、ＣＤ４４を発現する。

さらに別の実施形態によれば、上記細胞集団中の９５％を超える細胞が、ＦＡＣＳにより測定された場合、ＣＤ４４を発現する。

記載のように、追加のステップが、本明細書に記載の２ステッププロトコルの前、間または後に本発明者らによって意図される。そのような追加のステップは、上記のようにプラスチック表面上で培養することを含んでもよく、および／または追加の増殖ステップは、例えば、本明細書に記載のように、ニコチンアミド中で再培養することを含んでもよい。

いくつかの実施形態においては、細胞を、例えば、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ排除およびグラフ分析に基づく細胞計数器により、細胞サイズに従って選択する。好適な細胞計数器としては、限定されるものではないが、Ｃｅｄｅｘ計数器（Ｒｏｃｈｅ Ｉｍｎｏｖａｔｉｓ）が挙げられる。本発明の方法のいずれかに従って培養することができる細胞数は、小さいバッチ、例えば、１００ｘ１０^４個の細胞からより大きいバッチ、例えば、１００ｘ１０^１２または１００ｘ１０^１３個の細胞などの任意の数であってもよい。

大きいバッチが必要な場合、典型的には、バイオリアクタ（または多レベル工業用フラスコ）中で細胞を培養し、そのサイズを培養される細胞数に従って選択する。

商業的な量でＭＳＣを増殖させるために用いることができるフラスコおよびプレートの例としては、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｖｅｓｓｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（商標）Ｃｈａｍｂｅｒｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｖｅｓｓｅｌ、４０スタックチャンバおよびＮＵＮＣ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒが挙げられる。

本明細書で用いられる用語「バイオリアクタ」とは、生物学的および／または生化学的プロセスが、例えば、ｐＨ、温度、圧力、栄養供給および廃棄物除去などのモニタリングおよび制御された環境および運転条件下で生じる任意の装置を指す。本発明の一実施形態によれば、本発明と共に使用するのに好適な基本的なクラスのバイオリアクタとしては、参照によりその内容が本明細書に援用される特許文献４にさらに記載された、静的バイオリアクタ、撹拌フラスコバイオリアクタ、回転壁バイオリアクタ、中空繊維バイオリアクタおよび直接かん流バイオリアクタが挙げられる。

本明細書に記載の方法を用いて生成された培養細胞集団を、培養後にさらに処理するか、または凍結保存剤の存在下で保存（例えば、凍結保存）することができる。そのような凍結保存剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールなどが挙げられる。

本発明の培養および／または増殖方法後に生成された細胞集団を、その分化に影響する薬剤をスクリーニングするため、および治療的使用のための研究などの様々な目的のために用いることができる。さらに、またはあるいは、細胞集団を必要となるまで保存（例えば、凍結）することができる。

一実施形態によれば、本明細書に開示された方法を用いて生成された間葉系幹細胞集団を、さらなる分化プロトコルのために用いることができる。

様々な細胞系列に向かって間葉系幹細胞を分化させる方法は、当業界で公知である。

所望の表現型を有する細胞、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞などについて濃縮する成長環境においてＭＳＣを培養するか、または分化させることにより、分化している細胞を取得することができる。培養物は、特定の系列への分化を増強する薬剤を含んでもよい。

細胞を塗布し、コンフルエントまで培養した後、β−グリセロールリン酸、アスコルビン酸およびレチノイン酸を含む培地中で培養することにより、骨形成分化を実施することができる（非特許文献３４を参照されたい）。

脂肪細胞分化を誘導するために、分離された細胞を２４穴プレートに再播種し（７ｘ１０^４細胞／ｍｌ）、脂肪生成培地で３週間処理することができる。２つの例示的脂肪生成培地が提供される：製造業者の説明書の通り、０．０５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％ＦＢＳ、０．５μＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ）、０．５μＭのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）および６０μＭのインドメタシン（Ｓｉｇｍａ）、またはＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したＭＳＣ脂肪生成刺激補給物質を添加したＤＭＥＭ。脂肪細胞分化を、オイルレッド染色により評価することができる：細胞を、−２０℃で１０分間、メタノールで固定し、６０％のイソプロパノールで３分間処理する。プレートをオイルレッド−Ｏ（Ｓｉｇｍａ）中で１０分間染色し、水道水中で洗浄することができる。洗浄後、プレートをＭａｙｅｒヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で１分間対抗染色し、水道水中で洗浄することができる。

細胞を塗布し、コンフルエントまで培養した後、ウマ血清、デキサメタゾン、およびヒドロコルチゾン（非特許文献３５を参照されたい）；または５−アザシチジン（非特許文献３６を参照されたい）を含む培地中で培養することにより、筋細胞分化を実施することができる。

細胞を塗布し、コンフルエントまで培養した後、ＴＧＦ−β_１を含むか、または含まない、デキサメタゾン、アスコルビン酸２−リン酸、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸を含む培地中で培養することにより、軟骨細胞分化を実施することができる（非特許文献３７を参照されたい）。

神経分化は当業界で公知である。例えば、間葉系幹細胞からのニューロンおよび またはオリゴデンドロサイトの生成を、特許文献５および特許文献６に記載のように行うことができる。

あるいは、またはさらに、間葉系幹細胞を遺伝子改変して、疾患を治療するのに有用であるか、またはあるいは、特定の系列に向かうその分化を誘導する薬剤（例えば、ポリペプチド、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を発現させることができる。

かくして、例えば、間葉系幹細胞を遺伝子改変して、骨形態形成因子２（ＢＭＰ２）を発現させて、骨への分化を促進することができる。

あるいは、間葉系幹細胞を遺伝子改変して、Ｐｄ−ｘを発現させて、膵臓細胞への分化を促進することができる。

間葉系幹細胞は創傷に向かってホーミングし、移動することが知られるため、その細胞を、有用な分子を損傷部位に輸送する担体として用いることができる。有用な分子は、間葉系幹細胞の内部に本質的に見出される分子（例えば、成長因子）であってもよく、または前記細胞の内部に人工的に配置されていてもよい（例えば、前記細胞中にトランスフェクトされたタンパク質もしくはポリヌクレオチド）。

本明細書に記載の分化した、および分化していない間葉系幹細胞集団の両方を用いて、前記細胞の分化状態に従って選択される特定の多種多様な障害を治療することができる。

かくして、本発明の別の態様によれば、疾患または障害を治療する方法であって、治療上有効量の単離された本発明の細胞集団を、それを必要とする対象に移植することを含む、方法が提供される。

一実施形態によれば、疾患または障害は、骨または軟骨の疾患、神経変性疾患、心疾患、肝疾患、がん、神経損傷、創傷治癒、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、脊髄損傷および組織再生からなる群から選択される。

本発明の細胞を用いる治療にとって好適な骨の欠陥としては、限定されるものではないが、骨形成不全症、骨折、先天性骨形成不全などが挙げられる。

さらに、本発明の間葉系幹細胞を対象中に埋込んで、関節置換および／または歯のインプラントなどの、整形外科用および他の（例えば、歯科用）人工器官の骨および結合組織の支援を提供することができる。

本発明の間葉系幹細胞を用いて、ＣＮＳ疾患を治療することができる。

本明細書に記載の細胞で有益に治療することができるＣＮＳ疾患または障害の代表例としては、限定されるものではないが、疼痛障害、運動障害、解離性障害、気分障害、情動障害、神経変性疾患または障害および痙攣性障害が挙げられる。

そのような状態のより特定の例としては、限定されるものではないが、パーキンソン病、ＡＬＳ、多発性硬化症、ハンチントン病、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、黄斑変性、動作時振戦および遅発性ジスキネジー、パニック、不安、抑鬱症、アルコール依存症、不眠症、躁病的行動、アルツハイマー病およびてんかんが挙げられる。

記載のように、ＭＳＣは軟骨に分化することができるため、本発明の間葉系幹細胞は、限定されるものではないが、変形性関節症、関節リウマチ、炎症性関節炎、軟骨軟化症、虚血壊死、外傷性関節炎などの関節状態の治療にとって好適であってもよい。

骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、造血幹細胞（ＨＳＣ）および免疫細胞と相互作用し、同種異系造血生着を増強するための潜在的な細胞治療を示し、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を防止することが知られている。造血幹細胞の数が限られていた場合、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのヒト生着は、マウス間葉細胞系の同時注入ではなく、非関連ヒトＭＳＣの同時注入後にのみ観察された。非関連ヒトＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞活性化を惹起せず、用量依存的様式でツベルクリンおよび非関連同種異系リンパ球によりＴ細胞活性化を抑制した。無細胞ＭＳＣ培養上清、マウス間質細胞およびヒト真皮線維芽細胞は、この効果を惹起しなかった。これらの前臨床データは、非関連の、ヒト骨髄由来の培養物中で増殖させたＭＳＣが、造血生着を促進し、ＧＶＨＤを制限することによって同種異系移植の結果を改善することができることを示唆する（非特許文献３８）。

ＭＳＣを梗塞心臓中に導入した場合、それらは有害な再モデリングを防止し、回復を改善することができることが知られている。ＭＳＣを梗塞中に直接注入したか、またはそれらを静脈内投与したところ、それらは損傷部位にホーミングすることがわかった。同種異系ＭＳＣと免疫系の細胞との相互作用の検査は、Ｔ細胞による拒絶がわずかであることを示している。ｉｎ ｖｉｖｏでの同種異系ＭＳＣの持続性は、複数のレシピエントのためのその潜在的な「すぐに入手可能な」治療的使用を示唆する（非特許文献３９）。

移植のためのｅｘ ｖｉｖｏで増殖させた間葉細胞の使用は、以下の利点を有する：
それは、レシピエント成体組織系の再構成に必要とされる血液または他の組織の量を軽減する。

それは、将来の使用の可能性のために、例えば、臍帯血または末梢血からの増殖しなかった少数の間葉細胞の保存を可能にする。

悪性腫瘍を有するレシピエントの自己移植の場合、自己注入における腫瘍細胞の汚染は、疾患の再発の原因となることが多い。間葉細胞の選択および増殖は、最終的な移植片中への腫瘍細胞の負荷を軽減するであろう。

組織再生：本発明の間葉細胞集団を、組織再生の促進のために用いることができる。間葉系幹細胞の移植は、再生医療、自己免疫疾患、炎症状態、急性および慢性虚血状態再建手術、組織工学、再生新組織および疾患または損傷臓器の自然治癒における利益にとって大きな将来性がある。

遺伝子治療：長期的な遺伝子治療の成功のためには、そのゲノム内に安定に組込まれたトランスジーンによる高頻度の遺伝子改変細胞が必須の要件である。現在、新鮮な幹細胞および／または前駆細胞への遺伝子導入は、非常に非効率的である。ｅｘ ｖｉｖｏで間葉細胞の選択された集団を保存および加工し、そのホーミングおよび生着能力を増強する能力は、遺伝子改変された細胞移植の使用の成功確率の上昇を提供する（非特許文献４０）。

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、前記細胞を、自己、半自己または非自己（すなわち、同種異系または異種）のヒトドナーまたは胚または臍帯／胎盤から取得することができる。例えば、細胞を、ヒトの死体またはドナー対象から単離することができる。

用語「半自己」とは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩ遺伝子座においてレシピエント細胞と部分的に不一致であるドナー細胞を指す。

本発明の細胞を、性質が移植部位に依存する様々な移植手法を用いて、治療個体に投与することができる。

一実施形態によれば、前記細胞を、ニコチンアミドを含む培地中で体内に移植しない。

前記細胞を、組織の損傷した、または健康な領域に移植することができる。ある場合、損傷した組織領域の正確な位置は未知であってもよく、細胞を健康な領域に意図せずに移植してもよい。他の場合、細胞を健康な領域に投与することによって、その領域へのさらなる損傷を回避することが好ましい。いずれの場合でも、移植後、細胞は損傷した領域に移動するのが好ましい。

用語または語句「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「細胞置換」または「移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）」は、本明細書では互換的に用いられ、本発明の細胞の標的組織への導入を指す。記載のように、細胞は、レシピエントから、または同種異系、半同種異系もしくは異種ドナーから誘導することができる。他の異種起源も意図される。

本発明の細胞を、臓器への直接注入、血流への注入、腹腔内注入、リンパ器官への直接注入などにより移植することができる。好適な移植方法を、埋込まれた細胞の所望の臓器へのホーミングおよび生着、所望の臓器特異的遺伝子またはマーカーの発現、ならびに対象の誘導される臓器の機能をモニタリングすることにより決定することができる。膵臓においては、例えば、正常血糖値の維持、インスリンおよび／またはＣペプチドの分泌が、本明細書の以後に開示される細胞置換療法後の糖尿病宿主動物に対する機能の回復の尺度であり得る。肝臓においては、例えば、アルブミン合成をモニタリングすることができる。

ＭＳＣは、典型的には、ＭＨＣクラス２をダウンレギュレートするため、免疫原性が低い。臍帯血、臍帯のＷａｒｔｏｎのゼリーまたは胎盤から得られる胚または新生細胞は、特に、そのような細胞ははじめから免疫抑制性であり、免疫調節性であるため、免疫原性が高い可能性がさらに低く、従って、拒絶される可能性が低い。

それにも拘らず、非自己細胞は体内に投与された場合に免疫反応を誘導し得るため、非自己細胞の拒絶の可能性を軽減するためには、いくつかの手法を取ることができる。これらのものとしては、特権部位への細胞の投与、またはあるいは、レシピエントの免疫系の抑制、はじめから自己免疫障害を制御することが示され得る抗炎症治療の提供および／もしくは移植前の免疫単離性半透過膜中への非自己／半自己細胞の封入が挙げられる。封入技術は一般に、小さい球状ビヒクルを含むマイクロカプセル化ならびにより大きい平面および中空繊維膜を含むマクロカプセル化として分類される（非特許文献４１）。

マイクロカプセルを調製する方法は、当業界で公知であり、例えば、非特許文献４２、非特許文献４３および非特許文献４４に開示されたものが挙げられる。

例えば、マイクロカプセルは、修飾コラーゲンを、２−ヒドロキシエチルメチルアクリレート（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメチルメタクリレート（ＭＭＡ）のｔｅｒ−ポリマーシェルと複合体化させて、２〜５μｍのカプセル厚さを得ることにより調製する。そのようなマイクロカプセルを、さらなる２〜５μｍのｔｅｒ−ポリマーシェルを用いてさらにカプセル封入して、負に荷電した平滑な表面を得て、血漿タンパク質吸収を最小化することができる（非特許文献４５）。

他のマイクロカプセルは、アルギネート、海洋多糖（非特許文献４６）またはその誘導体に基づくものである。例えば、塩化カルシウムの存在下での、ポリアニオンであるナトリウムアルギネートおよびナトリウムセルロースサルフェートとポリカチオンであるポリ（メチレン−コ−グアニジン）ヒドロクロリドとの高分子電解質複合体化により、マイクロカプセルを調製することができる。

細胞カプセル化は、より小さいカプセルを用いる場合に改善されることが理解されるであろう。かくして、カプセル封入された細胞の品質制御、機械的安定性、拡散特性、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性は、カプセルサイズを１ｍｍから４００μｍに低下させた場合に改善した（非特許文献４７）。さらに、７ｎｍほどの小ささに良好に制御された孔径、調整された表面化学物質および正確な微細構造を有するナノ多孔性バイオカプセルは、細胞の微小環境を上手く免疫単離することがわかった（非特許文献４８、非特許文献４９）。

免疫抑制剤の例としては、限定されるものではないが、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、エタネルセプト、ＴＮＦアルファ遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物製剤、および非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。ＮＳＡＩＤの例としては、限定されるものではないが、アセチルサリチル酸、コリンマグネシウムサリチレート、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサレート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダック、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤およびトラマドールが挙げられる。

本発明の細胞集団を、それ自体で、それを含有する培養培地と共に、培養培地から単離して、および薬学的に許容される担体ならびに細胞生着および／または臓器機能を促進することができるさらなる薬剤（例えば、免疫抑制剤、抗生物質、成長因子）と共に提供することができる。従って、本発明の細胞集団を、滅菌塩水および水性緩衝溶液などの薬学的に許容される担体または希釈剤中に投与することができる。そのような担体および希釈剤の使用は、当業界で周知である。

必要に応じて、本発明の組成物を、活性成分（例えば、細胞）を含有する１つまたは複数の単位剤形を含んでもよい、ＦＤＡに認可されたキットなどのパックまたはディスペンサー装置中で提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの、金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書を添付してもよい。また、パックまたはディスペンサー装置に、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により処方された形態の通知書であって、ヒトまたは動物への投与のための組成物の形態の機関による認可を反映する通知書を添付してもよい。そのような通知書は、例えば、処方薬に関する、または認可された製品の挿入物の米国食品医薬品局により認可された標識を含んでもよい。薬学的に許容される担体中で製剤化された本発明の調製物を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、上記でさらに詳細に説明されたように、指示された状態の治療のために標識してもよい。

本発明の方法に従って調製された細胞を、そのまま対象に投与し、足場および／またはそれが好適な担体もしくは賦形剤と混合される医薬組成物中に播種することができる。

本明細書で用いられる「医薬組成物」とは、生理的に好適な担体および賦形剤などの他の化学的成分を含む、１つまたは複数の本明細書に記載の活性成分の調製物を指す。医薬組成物の目的は、ある化合物のある生物への投与を容易にすることである。

以後、互換的に用いることができる語句「生理的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は、生物に対して有意な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物活性および特性を無効化しない担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの語句に含まれる。

本明細書において、用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプンの種類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが挙げられる。

薬物の製剤化および投与のための技術を、参照により本明細書に完全に援用される非特許文献５０の最新版に見出すことができる。

好適な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に、経鼻、腸、または非経口送達、例えば、筋肉内、皮下、および髄内注射、ならびに鞘内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射が挙げられる。

あるいは、当業者であれば、例えば、患者の組織領域中への医薬組成物の直接注入により、全身様式よりもむしろ局部様式で医薬組成物を投与することができる。

かくして、本発明に従う使用のための医薬組成物を、薬学的に用いることができる調製物中での活性成分のプロセッシングを容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理的に許容される担体を用いて従来の様式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。

注射のために、医薬組成物の活性成分を、水性溶液中で、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理的塩バッファーなどの生理的に適合するバッファー中で製剤化することができる。経粘膜投与のために、浸透させようとする障壁にとって適切な浸透剤を、製剤中で用いる。そのような浸透剤は、当業界で一般に公知である。

本発明の文脈における使用にとって好適な医薬組成物は、活性成分が意図される目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。より特には、「治療上有効量」は、障害（例えば、虚血）の症状を防止、軽減、改善、または治療する対象の生存を延長するのに有効な活性成分（例えば、核酸構築物）の量を意味する。

治療上有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳細な開示を考慮すると、当業者の能力の範囲内にある。

本発明の方法において用いられる任意の調製物に関して、用量または治療上有効量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。例えば、用量を動物モデルにおいて調剤して、所望の濃度または力価を達成することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。

本明細書に記載の活性成分の毒性および治療効果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイおよび動物試験においてこれらのものから得られたデータを、ヒトにおける使用のための用量の範囲を調剤するのに用いることができる。用量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に応じて変化してもよい。正確な製剤、投与経路、および用量を、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる（例えば、非特許文献５１を参照されたい）。

治療しようとする状態の重症度および応答性に応じて、投薬は１回または複数回の投与のものであってもよく、治療の過程は数日から数週間、または治癒が得られるか、もしくは疾患状態の縮小が達成されるまで続いてもよい。

投与しようとする組成物の量は、勿論、治療対象、苦痛の重症度、投与の様式、処方する医師の判断などに依存するであろう。

本明細書で用いられる用語「方法」とは、限定されるものではないが、化学、薬学、生物学、生化学および医学業界の実務者にとって公知であるか、または彼らによって公知の様式、手段、技術および手順から容易に開発される、様式、手段、技術および手順などの、所与の仕事を達成するための様式、手段、技術および手順を指す。

本明細書で用いられる用語「治療」は、ある状態の進行を無効化すること、実質的に阻害すること、遅延させること、もしくは逆転させること、ある状態の臨床的もしくは美的症状を実質的に改善すること、またはある状態の臨床的もしくは美的症状の出現を実質的に防止することを含む。

上記で説明された、および以下の特許請求の範囲に記載される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的支援を得る。

本発明のさらなる課題、利点、および新規特徴は、限定されることを意図するものではない以下の実施例の検査時に当業者には明らかとなるであろう。さらに、上記で説明された、および以下の特許請求の範囲に記載される本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、以下の実施例において実験的支援を得る。

ここで、上記説明と一緒に、非限定的様式で本発明を例示する、以下の実施例に対する参照を行う。

一般に、本明細書で用いられる命名法および本発明において用いられる実験室手順は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、非特許文献５２、非特許文献５３、非特許文献５４、非特許文献５５、非特許文献５６、非特許文献５７；特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０および特許文献１１に記載の方法；非特許文献５８、非特許文献５９、非特許文献６０、非特許文献６１を参照されたい；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に広く記載されており、例えば、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６および特許文献２７；非特許文献６２、非特許文献６３、非特許文献６４、非特許文献６５、非特許文献６６、非特許文献６７、非特許文献６８、非特許文献６９、非特許文献７０（これらは全てその全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。他の一般的な参考文献は、本明細書を通して提供される。その中の手順は当業界で周知であると考えられ、読者の利便性のために提供される。その中に含まれる全ての情報は、参照により本明細書に援用される。

（実施例）
方法および実験手順
間葉系幹細胞の単離：骨髄由来および脂肪組織由来間葉細胞を、０．０５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を添加した高グルコースＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）を含有する増殖培地中でのそのプラスチック接着能力に基づいて単離した。細胞を３〜４日間接着させ、非接着細胞を培地交換を用いて洗浄除去した。さらに、培地を３〜４日毎に新鮮な培地と交換した。

造血幹細胞および前駆細胞：臍帯由来造血幹細胞を、ＣＤ１３３マイクロビーズおよびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）分離機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｉｎｃ．Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて単離し、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、ＩＬ６、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ウシ胎仔血清、±２．５または５ｍＭのニコチンアミド、および／または１０、５０もしくは２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４を添加したＭＥＭα中で３週間培養した。培養物中で３週間後、細胞を表面マーカー（ＣＤ３８、ＣＤ１３３、ＣＤ３３、ＣＤ１９）について染色し、ＦＡＣＳ分析により細胞集団を決定した（以下を参照されたい）。結果を、アッセイされた全細胞集団のパーセンテージとして表す。

維持および増殖：接着細胞が約８０〜９０％コンフルエントに達したら、それらを０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）で単離させ、４００ｇで５分間遠心分離しながらＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎仔血清中で２回洗浄し、同じ培養条件下で１：２〜１：１０００の希釈率で再びプレートした。

細胞サイズの測定：Ｃｅｄｅｘ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）を用いて、細胞サイズを測定した。細胞をＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ）中で１：２に希釈し、細胞サイズを顕微鏡下で自動的に測定した。

粒度の測定：トリプシン処置の後、細胞を、側方散乱ＦＡＣＳにより粒度について分析した。

培養物中の細胞数の測定：Ｃｅｄｅｘ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）を用いて、細胞数を測定した。細胞をＴｒｙｐｎ Ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ）中で１：２に希釈し、細胞数を顕微鏡下で自動的に測定した。

表面抗原分析：様々な時点で、細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて分離した。細胞を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液で洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート化抗体：１０５ＰＥ、１０５ＦＩＴＣ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）、４５ＦＩＴＣ、１４ＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＤＲ ＦＩＴＣ、１０６ＰＥ、３１ＰＥ（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）、３４ＰＥ（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、７３ＰＥ、ＨＬＡクラス１ＰＥ、４９ｂＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、２９ＰＥ、４４ＰＥ、５４ＦＩＴＣ、５９ＰＥ、９０ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣＤ１３３−（ＡＣ１４１）ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）、ＣＤ３８ ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＣＤ１９ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）、ＣＤ３３ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）で染色した（４℃で３０分間）。

次いで、細胞を上記バッファー中で洗浄し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）を用いて分析した。励起のための光源として４８８ｎｍのアルゴンレーザービームを用いて、最大１０００個の細胞／秒の速度で細胞を通過させた。１００００個の細胞の放出を対数増幅を用いて測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。ＦＩＴＣ−およびＰＥ−コンジュゲート化アイソタイプ対照抗体で染色した細胞を用いて、バックグラウンド蛍光を決定した。

ＣＦＵ−Ｆアッセイ：培養されたＭＳＣを、５０〜１００個の細胞／ｃｍ^２の密度で６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳと共に維持した。１４日後、細胞を、１０％冷ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）を用いて固定し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で染色した。クローン（明確な中心点を有する５０個を超える細胞のクラスター）は青紫色に染色され、顕微鏡を用いて計数した。

老化評価アッセイ：培養されたＭＳＣを、老化ベータ−ガラクトシダーゼ染色キット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて染色した。細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌを用いてｐＨ６でベータ−ガラクトシダーゼ活性の検出のために染色し、乾燥インキュベータ中、３７℃で一晩インキュベートした。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷治癒アッセイ：創傷を、２００μｌまたは１０００μｌのチップを用いて約７０％コンフルエントでＭＳＣ培養物中で実施した。４日後、細胞を、１０％冷ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）を用いて固定し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で染色した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの創傷治癒プロセスを、顕微鏡を用いて評価した。

ニコチンアミドを用いる間葉培養物の処理：間葉培養を上記のように開始し、ニコチンアミド１〜１５ｍＭのみ、もしくは成長因子と共に、または成長因子のみを添加し、空気中の５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。それぞれの継代で、およびそれぞれの培地交換で、培養物に間葉培地、ニコチンアミドおよび成長因子を添加した。

いくつかの実験において、接着細胞をニコチンアミドおよび指示された因子を用いて、または用いずに培養し、４回目の継代の２４時間前に、培地を、ウシ胎仔血清またはＦＧＦ４を含まない培地で置きかえた。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ移動アッセイ：１００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ（０．６ｍｌ）を、Ｃｏｓｔａｒ ２４穴「トランスウェル」培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）の下側チャンバに入れた。１００μｌの培地中の細胞（２ｘ１０^５個）を、多孔膜（孔径、５μｍ）上で、上側チャンバに導入した。４時間後、両チャンバから細胞を採集し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｓｏｒｔ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により計数した。下側チャンバ中でＣＸＣＬ１２を含まない対照として自発的移動を実施した。

ｉｎ ｖｉｖｏでのホーミングの分析：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（８〜１０週齢）（Ｈａｒｌａｎ Ｌｔｄ．、Ｉｓｒａｅｌ）を致死量以下で照射し（６７ｃＧｙ／分で３７５ｃＧｙ）、２４時間後、ニコチンアミドの存在下で培養されたＣＦＳＥ標識間葉系幹細胞またはニコチンアミドの非存在下で培養されたＣＦＳＥ標識間葉系幹細胞を尾静脈を介して接種した。注射の２４時間後にマウスを犠牲にし、骨髄または他の組織試料を取得した。ヒト細胞のホーミングを、未標識のマウス細胞のバックグラウンド上でのＣＦＳＥ染色細胞の可視化を介するフローサイトメトリーにより検出した。ＣＦＳＥの明るい蛍光は、少なくとも１ｌｏｇで未標識のマウス細胞から標識されたヒト細胞を分離するのに十分である。ヒト前駆細胞のホーミングを定量するために、骨髄細胞をＡＰＣコンジュゲート化抗ヒト細胞マーカーモノクローナル抗体で染色し、ＣＦＳＥ^＋／細胞マーカー細胞を数えた。それぞれの試料につき、１００，０００の事象を記録し、分析した。

ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの間葉細胞の移植：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、無菌内部通気ケージ（Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔ、Ｂｕｇｕｇｉａｔｔｅ、Ｉｔａｌｙ）中で育種および維持した。８週齢のマウスを、上記のように致死量以下で照射した。マウスに、ニコチンアミドの存在下または非存在下で培養した間葉細胞を尾静脈を介して接種した。ドナーの変動性を回避するために、いくつかの単位に由来する間葉細胞をプールし、増殖培養物ならびに群注入のために用いた。マウスを第４週で犠牲にし、４℃でＩＭＤＭを用いてその大腿骨および脛骨を洗い流すことにより、骨髄試料を取得した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤの骨髄細胞のフローサイトメトリー分析を、ヒト細胞表面分化抗原に対するモノクローナル抗体を用いて、上記のように実施して、ヒト細胞生着を同定した。

遅延型過敏症アッセイ：ＢＡＬＢ／Ｃマウスをオキサゾロン（４−エトキシメチレン−２−フェニルオキサゾール−５−オン）で感作し、６日後、オキサゾロンでチャレンジし、耳に注入した。示されるような、候補組成物による免疫調節を、その局所投与の２４時間後に、カリパスで耳の厚さを測定することにより決定した。

成長因子分泌：４回目の継代の２４時間前に、示されたように培養され、ウシ胎仔血清およびＦＧＦ４を枯渇させたＭＳＣから培地を回収し、培地中に分泌された成長因子および免疫関連因子（ヒト成長因子ＨＧＦ、トランスフォーミング成長因子ベータＴＧＦ−β、ケラチノサイト成長因子ＫＧＦおよびインターロイキン６ＩＬ−６）についてＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＥＬＩＳＡを、ヒトＫＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＫＧ００）、ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｄ６０５０）、ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＢ１００Ｂ）、ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＨＧ００）に特異的な固相サンドイッチＥＬＩＳＡキットを用いて実行した。

ケラチノサイト増殖アッセイ：正常ヒト上皮ケラチノサイト（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ケラチノサイト成長培地中で１回の継代にわたって培養し、分離させ、ＭＳＣ条件化培地で示されたように希釈されたケラチノサイト成長培地（５０％Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｉｘを含有する）中に再播種した。培地を週に２回交換し、９０％コンフルエントに達した後、ケラチノサイトを分離させ、計数した。

混合リンパ球反応様アッセイ：５０％を超えるＴ細胞を含有する、末梢血由来単核細胞（ＭＮＣ）を、浮遊密度遠心分離により単離し、３μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で活性化した。活性化後、細胞を、ＭＳＣ培養物に由来する条件化培地および他の因子を用いて、または用いずに培養した。ＰＨＡによる活性化に対するＰＢＭＮ細胞の応答を、初期活性化の７２時間後に、ＥＬＩＳＡにより培地細胞へのＴＮＦ−アルファ分泌の程度（ｐｇ／ｍｌ）に基づいて測定した。

統計：非パラメータＷｉｌｃｏｘｏｎ順位検定を、試験群間の差異を検定するために適用した。適用された全ての検定は両側であり、５％以下のｐ値を統計的に有意であると考えた。データを、ＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて分析した。

（実施例１）
成長因子の存在下で培養した間葉系幹細胞に関するニコチンアミドの分析
材料および方法
間葉系幹細胞を、３回または４回の継代にわたって、ニコチンアミドの存在下および非存在下で特定の成長因子（塩基性線維芽細胞成長因子−ｂＦＧＦ、ヘパリン結合上皮成長因子−ＨＢ−ＥＧＦ、線維芽細胞成長因子４−ＦＧＦ４および血小板由来成長因子、ホモ二量体、サブユニットＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ）の存在下で選択および培養し、細胞の数およびサイズを算出した。

以下の因子のそれぞれ１つにつき２つの濃度（１０および５０ｎｇ／ｍｌ）を検査した。

実験群は以下の通りであった：
群１：Ｃｔｒｌ
群２：１０ｎｇ／ｍｌの成長因子
群３：５０ｎｇ／ｍｌの成長因子
群４：５ｍＭのＮＡＭ
群５：５ｍＭのＮＡＭ＋１０ｎｇ／ｍｌの成長因子
群６：５ｍＭのＮＡＭ＋５０ｎｇ／ｍｌの成長因子。

さらに、組合せ：５ｍＭのＮＡＭ＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４＋５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢの影響を、個々の補給物質と比較して検査した。

結果
図１は、塩基性ＦＧＦが間葉系幹細胞の増殖を増加させるニコチンアミドの能力に対する負の効果を有することを示す。

図２Ａ〜Ｂは、ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が間葉系幹細胞の増殖を増加させるニコチンアミドの能力に対する負の効果を有することを示す。

図３〜５は、ニコチンアミドが間葉系幹細胞の増殖を増加させるＦＧＦ４の能力に対する強化効果を有することを示す。

図６Ａ〜Ｄは、ＰＤＧＦ−ＢＢが間葉系幹細胞の増殖を増加させるニコチンアミドの能力に対する一貫性のない効果を有することを示す。

図７Ａ〜Ｄは、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢ＋ＮＡＭの組合せで処置されたＭＳＣ培養物が、ＰＤＧＦ−ＢＢで処理されていない培養物と比較して、より多くのＭＳＣ以外の細胞画分で汚染されていることを示す。

図８Ａ〜Ｂ、９Ａ〜Ｂおよび１０Ａ〜Ｈは、３つの因子−ＦＧＦ４、ニコチンアミドおよびＰＤＧＦ−ＢＢの組合せは、ＰＤＧＦ−ＢＢの非存在下でのＦＧＦ４およびニコチンアミドの効果と比較して、間葉系幹細胞の増殖に対する有害な効果を有することを示す。

図２７は、５回の継代にわたる増殖（累積細胞計数）に対するニコチンアミドとＦＧＦ４の組合せの一貫した相乗効果を例示する。

（実施例２）
骨髄由来間葉系幹細胞培養物に対するニコチンアミドの効果
本発明者らは、ニコチンアミドが骨髄由来ＭＳＣの播種効率（選択）を増加させることを示した。ニコチンアミド中での１回の継代後のこれらの細胞の表現型キャラクタライゼーションを、図１１および図１３に示す。図１５、図１７Ａ〜Ｂ、図２２および図２６は、骨髄由来ＭＳＣの増殖速度に対するニコチンアミドの効果を示す。低濃度のニコチンアミド（例えば、０．１ｍＭ）は、骨髄由来ＭＳＣの増殖速度に対する有意でない効果を有していた（図面は示さない）。図２０Ａ〜Ｃおよび図２１Ａ〜Ｂは、ニコチンアミドの存在下で増殖させた間葉系幹細胞が、同一の条件下でニコチンアミドの非存在下で増殖させた間葉系幹細胞よりも小さく、粒度が低いことを示す。

（実施例３）
ニコチンアミドは培養された脂肪組織由来間葉細胞の増殖を増加させる
脂肪組織由来ＭＳＣの表現型キャラクタライゼーションを、図１２に示す。図１４および図１６に示されるように、ニコチンアミドは培養物中での脂肪由来間葉系幹細胞増殖を実質的に改善した。

（実施例４）
ニコチンアミドは培養間葉細胞の組織ホーミングを増加させる
培養間葉細胞のホーミングに対するニコチンアミドの効果を評価するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、非培養間葉細胞、またはサイトカインと共に培養した３週間後のその全子孫を、ニコチンアミドと共に、またはそれなしに移植する。移植前に、細胞をＣＦＳＥで標識する。移植の２４時間後、レシピエントマウスのマウス骨髄にホーミングした全ＣＦＳＥ標識細胞およびＣＦＳＥ標識間葉細胞を、ＦＡＣＳにより定量する。

ニコチンアミドで処理された間葉細胞のホーミングが、ニコチンアミドにかけなかった非培養間葉細胞のホーミングよりも有意に高い場合、結果は、間葉細胞の組織ホーミングに対するニコチンアミドの効果を示す。

（実施例５）
ニコチンアミドはケモカイン受容体および接着分子の機能を増加させる
細胞のホーミングおよび生着のニコチンアミド媒介性増強における接着分子および関連分子の役割を決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの移動および接着分子の機能に対するニコチンアミドの効果を試験することができる。

トランスウェル移動アッセイを用いて、非培養および培養間葉細胞のＣＸＣＬ１２誘導性移動を試験し、インテグリンおよび接着分子機能に対するニコチンアミドの効果を評価する。ニコチンアミドなしに培養された細胞または非培養細胞と比較した、ニコチンアミドで処理された細胞における移動の刺激の増強は、ニコチンアミドによる間葉細胞の処理が接着分子のそのリガンドに対する応答性を潜在的に増加させ、ニコチンアミドで処理された細胞の生着およびホーミング能力の増強をもたらすことを示唆する。

接着分子に結合する細胞の機能的品質を、剪断流動アッセイを用いて調査することもできる。接着分子媒介性結合に対するニコチンアミドの強力な効果および基質接着分子上での保持を、ニコチンアミドで処理された間葉細胞において明らかな剪断ストレスによる除去に抵抗する初期定着細胞の割合の有意な増強により証明することができる。

（実施例６）
ニコチンアミドは培養細胞のＳＣＩＤ再増殖能力を増加させる
ニコチンアミド処理を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでの再増殖により移植細胞のホーミングおよび生着を増強する能力について試験する。再増殖能を評価するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、間葉細胞が準最適の移植となり、かつ、サイトカインによる３週間の増殖後に少数のマウスまたはその子孫において間葉細胞が生着しないことを意図した用量範囲にわたって、非培養間葉細胞を移植する（ｎ＝１２）。ヒト細胞の生着を、移植４週間後に評価する。レシピエント骨髄細胞の０．５％がヒトＣＤ４５抗原（ＣＤ４５＋）を発現した場合、マウスを生着陽性として評価する。培養物中のニコチンアミドの存在が所定の用量範囲でマウス中の間葉細胞の優れた、明確な生着をもたらすが、未処理の細胞が生着できないか、またはあまり生着しない場合においては、移植された間葉細胞の生着およびホーミングの増強にニコチンアミドが有効であると結論付けることができる。

（実施例７）
間葉系幹細胞に対するニコチンアミドの効果に関するさらなる分析
材料および方法
間葉系幹細胞を、上記のようにプラスチック接着方法を用いて単離し、ウシ胎仔血清、±ＮＡＭと共に数回の継代にわたって培養した。細胞を、ＮＡＭの存在下で選択した。

約８０％コンフルエントで、トリプシン処理後に接着細胞を採集・計数・特性解析し、１ｘ１０^３個の細胞／ｃｍ^２の濃度で再播種した。

ＶＣＡＭ１／ＣＤ１０６の測定：トリプシン処理の後、抗ヒトＣＤ１０６ＰＥ抗体を用いるＦＡＣＳにおいてＣＤ１０６発現について細胞を分析した。

ＣＤ５４の測定：トリプシン処理の後、抗ヒトＣＤ５４抗体を用いるＦＡＣＳにおいてＣＤ５４発現について細胞を分析した。

結果
図１８では、細胞計数に対するニコチンアミドの効果が大きいバッチの間葉系幹細胞に関して明らかであり、大規模商業バッチのＭＳＣを少ない継代で製造することができることを示す。これにより、短い培養時間およびニコチンアミドによる幹細胞特性の保存のおかげで、治療的細胞のより良好な品質が確保される。

図１９は、ニコチンアミドの効果が特定のバッチの血清に依存せず、実施される２つの実験のうちの１つの結果を提供することを示す。これらの実験における培養物を個々に処理した（各群を、コンフルエントに達した時点で継代した）。

老化細胞の量は、ニコチンアミド中での培養後に減少した（図２３Ａ〜Ｄ）。

図２４Ａは、ニコチンアミドの存在下で増殖させた間葉系幹細胞が、同一の条件下でニコチンアミドの非存在下で増殖させた間葉系幹細胞よりも多くのＶＣＡＭ１／ＣＤ１０６接着分子を発現することを示す。

図２４Ｂは、ニコチンアミドの存在下で増殖させた間葉系幹細胞が、同一の条件下でニコチンアミドの非存在下で増殖させた間葉系幹細胞よりも少ないＣＤ５４を発現することを示す。

図２５は、ニコチンアミドの存在下で増殖させた間葉系幹細胞が、同一の条件下でニコチンアミドの非存在下で増殖させた間葉系幹細胞よりも高い創傷閉鎖を行う能力を有することを示す。

（実施例８）
培養間葉系幹細胞における成長因子の発現に対する、ニコチンアミドとＦＧＦ４との組合せの効果
ニコチンアミドとＦＧＦ４との存在下での間葉系幹細胞の培養は、未分化状態に細胞を維持しながら、間葉系幹細胞の増殖能力を相乗的に増加させる（図３Ａ〜Ｄ、図４Ａ〜４Ｂ、図５Ａ〜５Ｄおよび図２７を参照されたい）。これらの培養物中で増殖させたＭＳＣをさらに特性解析するために、培養培地中へのサイトカインの分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。

図２８〜３１は、ニコチンアミドのみと比較した、ＦＧＦ４とニコチンアミドとの組合せを用いた場合の肝細胞成長因子（ＨＧＦ、図２８）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β、図２９）およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ、図３０）の有意な増加を示す。図３１は、分泌された前炎症性インターロイキン６（ＩＬ−６）のニコチンアミドによる低下、およびＦＧＦ４を添加した場合のＩＬ６のさらなる低下を示す。

ニコチンアミドまたはニコチンアミドとＦＧＦ４と共に培養された間葉系幹細胞に由来する培地を、ｉｎ ｖｉｖｏでの遅延型過敏症試験における炎症に対する効果についてアッセイした場合、感作アレルゲン（オキサゾロン）によるチャレンジに対する炎症応答の低下が明確に観察された（データは示さない）。ｅｘ ｖｉｖｏ混合リンパ球反応型アッセイにおけるさらなる分析により、ＰＨＡによる活性化に応答する末梢血単核細胞によるＴＮＦαの分泌の低下におけるニコチンアミドおよびニコチンアミドとＦＧＦ４とに由来するＭＳＣ培養培地の抗炎症能力が明確に証明された（データは示さない）。

ニコチンアミドまたはニコチンアミドとＦＧＦ４と共に培養された間葉系幹細胞に由来する培地を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでケラチノサイト増殖に対する効果についてアッセイした場合、ケラチノサイト増殖の有意な誘導が明確に観察された（データは示さない）。

かくして、ニコチンアミドと共に、およびＦＧＦ４と組み合わせたニコチンアミドと共に培養された接着間葉系幹細胞は、抗炎症活性および増殖誘導活性を有する因子などの生物活性因子を培地中に放出する。

（実施例９）
培養物中の脂肪由来間葉系幹細胞に対するニコチンアミドとＦＧＦ４との組合せの効果
追加のＦＧＦ４を含む、または含まないニコチンアミドと共に培養された脂肪由来間葉系幹細胞における増殖および細胞サイズ分布を、最大４回の継代の培養物中で評価した。

図３２〜３３は、対照ならびにニコチンアミド処理された培養物と比較した、培養物中の全有核細胞の数として表した、脂肪由来接着細胞増殖に対するニコチンアミドとＦＧＦ４との組合せの顕著な効果を示す。

培養物中の間葉系幹細胞のサイズは、ＭＳＣの分化の程度の指標として用いられることが多く、未分化状態ではサイズの小さい細胞が多い。図３４は、ニコチンアミドに曝露された脂肪由来ＭＳＣの培養物中には小さいサイズの細胞が多く、ニコチンアミドとＦＧＦ４に曝露された脂肪由来ＭＳＣのうちでは小さいサイズの細胞がさらに多いことを示す。

かくして、これらの結果は、ニコチンアミドとＦＧＦ４との組合せが、未分化状態に細胞を効率的に維持しながら、脂肪由来間葉細胞の増殖の速度を相乗的に増加させることを示している。

（実施例１０）
造血幹細胞分化に対するニコチンアミドとＦＧＦ４の効果
間葉系幹細胞に対するニコチンアミドとＦＧＦ４との組合せの効果が特異的な、または一般化された現象であるか否かを決定するために、造血幹細胞をＦＧＦ４およびニコチンアミドと共に、およびそれらなしに培養し、成分の亜集団の分化の程度を細胞表面マーカーにより評価した。

材料および方法
臍帯血由来ＣＤ１３３＋造血幹細胞を単離し、初期作用成長因子およびウシ胎仔血清、ニコチンアミドおよび／またはＦＧＦ４を添加した培地中で３週間培養した。培養物中で３週間後、細胞を表面マーカー（ＣＤ３８、ＣＤ１３３、ＣＤ１９）について染色し、ＦＡＣＳ分析により細胞集団を決定した。３週間での全細胞を計数することにより、細胞増殖を評価した。

結果：
ＦＧＦ４は培養物中の造血幹細胞の分化に影響しない：
２．５または５ｍＭのニコチンアミドの存在下で３週間、造血初期前駆細胞（ＣＤ１３３＋）を培養した場合、分化した細胞の割合は有意に低下し、幹細胞および前駆細胞画分の増加が明確に観察される（図３５、カラム１、２および３を参照されたい）。他方、１０〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４への細胞の曝露は、ＣＤ３８およびＣＤ１３３を発現する細胞の画分により示されるように、３週間の培養で分化の程度に対するいかなる効果もない（図３５および図３６、カラム１および４〜６を参照されたい）。ニコチンアミドを用いるか、または用いないＦＧＦ４の添加も、培養物中の全細胞増殖に対するいかなる認識できる効果もなかった（結果は示さない）。

ニコチンアミドと共に培養した細胞へのＦＧＦ４の添加は、いずれのＦＧＦ４濃度においても、造血幹細胞分化のニコチンアミドによる阻害を改善も減少もさせなかった（図３５〜３６、レーン１および７〜１２を参照されたい）。

ＦＧＦ４は骨髄またはリンパ系列へのＨＳＣの分化に影響しない：
コミットした造血幹細胞が培養中のＦＧＦ４への曝露により影響されたかどうかを決定するために、それぞれ、分化し、コミットした骨髄系列およびリンパ系細胞を表す、ＣＤ３３およびＣＤ１９を発現する細胞の存在量を、３週間の培養において測定した。ニコチンアミドはコミットした細胞画分を一貫して減少させたが（図３７および図３８、レーン１〜３および７〜１２を参照されたい）、ＦＧＦ４のみ、またはニコチンアミドと組み合わせたＦＧＦ４の添加は、コミットした骨髄細胞またはリンパ系細胞の存在量に対するいかなる効果もなかった（図３７および図３８、レーン１、４〜６および７〜１２を参照されたい）。

かくして、これらの結果は、間葉系幹細胞培養物中で観察されたＦＧＦ４の増殖増強効果、およびニコチンアミドとＦＧＦ４との組合せへの間葉系幹細胞の曝露の相乗効果が、一般的な現象ではなく、ｅｘ ｖｉｖｏでの造血幹細胞培養物中では観察されないことを明確に示している。

（実施例１１）
間葉系幹細胞の選択および増殖のための、ニコチンアミド±ＦＧＦ４の組み合わせた使用、次いで、ＶＣＡＭ１／ＣＤ１０６、ＣＤ１０５またはＳＴＲＯ−１を用いる選択
材料および方法
単離：骨髄由来および脂肪組織由来間葉細胞を、高グルコースＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）、０．０５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を含有する増殖培地中でのそのプラスチック接着能力に基づいて単離する。細胞を、ニコチンアミド±ＦＧＦ４の存在下で３〜４日間接着させ、非接着細胞を培地交換すると共に洗浄除去した。

間葉系幹細胞を、ウシ胎仔血清、＋ＮＡＭ、±ＦＧＦ４と共に数回の継代（１〜３回）にわたって培養する。細胞を、プラスチック接着プレート上で培養することができる。

約８０％コンフルエントで、接着細胞を、トリプシン処理後に採集・計数・特性解析し、直接または間接コンジュゲート化マウス抗ヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）および磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いてＣＤ１０５、ＣＤ１０６またはＳＴＲＯ−１発現により選択し、再播種してさらに増殖させる。

ＶＣＡＭ１／ＣＤ１０６、ＣＤ１０５またはＳＴＲＯ−１の測定：トリプシン処理後、細胞を、抗ヒトＣＤ１０６ＰＥ抗体、抗ヒトＣＤ１０５抗体または抗ＳＴＲＯ−１抗体を用いるＦＡＣＳにおいてＣＤ１０６発現、ＳＴＲＯ−１発現またはＣＤ１０５について分析する。

（実施例１２）
間葉系幹細胞の選択のためのＶＣＡＭ１／ＣＤ１０６、ＣＤ１０５またはＳＴＲＯ−１を用いる選択の前のニコチンアミド±ＦＧＦ４の組み合わせた使用
材料および方法
骨髄由来および脂肪組織由来ＭＳＣの選択：骨髄由来および脂肪組織由来間葉細胞を、直接または間接コンジュゲート化マウス抗ヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）および磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いたＣＤ１０５、ＣＤ１０６またはＳＴＲＯ−１発現により選択する。選択された細胞を、高グルコースＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）、０．０５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を含有する増殖培地中に６ｘ１０^３個の細胞／ｃｍ^２の濃度で播種する。細胞を３〜４日間接着させ、非接着細胞を培地交換すると共に洗浄除去した。

ＮＡＭ±ＦＧＦ４中の選択されたＭＳＣ集団の培養：間葉系幹細胞を、ウシ胎仔血清、＋ＮＡＭ、±ＦＧＦ４と共に数回の継代にわたって培養する。

明確性のために、別々の実施形態の文脈において説明される本発明のある特定の特徴を、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔性のために、単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴を、別々に、または任意の好適なサブコンビネーションにおいて提供することもできる。

本発明をその特定の実施形態と共に説明してきたが、多くの代替物、改変および変更が当業者には明らかであることが明白である。従って、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内にある全てのそのような代替物、改変および変更を包含することが意図される。本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許または特許出願またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号が具体的および個別に参照により本明細書に援用されたと同程度まで、全体が参照により本明細書に援用される。さらに、本明細書中の任意の参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明にとって先行技術として利用可能であるとの許諾と解釈されるべきではない。

Claims (12)

1. １〜２０ｍＭのニコチンアミドと１０〜１００ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）とを含む培地中で、未分化の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むＭＳＣの集団を培養することによって、増殖された未分化のＭＳＣの集団を生成する工程を含み、
   前記培地は追加で添加された塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、および内皮成長因子（ＥＧＦ）を含まない、未分化のＭＳＣを増殖させる方法。
2. 前記培地のカルシウム濃度が１．８ｍＭより高い、請求項１に記載の方法。
3. 前記培養が、少なくとも１週間行われる、および／または少なくとも３回の継代にわたって行われる、請求項１に記載の方法。
4. 前記未分化のＭＣＳには、ニコチンアミドとＦＧＦ４とを含む前記培地中で前記培養を行う前に、ニコチンアミドを含まない培地中で培養された間葉系幹細胞の播種された集団が存在する、請求項１に記載の方法。
5. ニコチンアミドおよびＦＧＦ４を含む前記培地中での前記培養が、少なくとも１週間行われる、請求項４に記載の方法。
6. ニコチンアミドを含まない前記培地中での前記培養が、少なくとも１日間行われる、請求項４または５に記載の方法。
7. ニコチンアミドおよびＦＧＦ４を含む前記培地中、またはニコチンアミドを含まない前記培地中での前記培養が、カルシウムを含む培地中で行われ、前記カルシウムの濃度が１．８ｍＭより高い、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 分化したＭＳＣを生成する方法であって、
   （ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法に従って間葉系幹細胞を増殖させて、未分化の間葉系幹細胞の増殖された集団を生成する工程と、
   （ｂ）未分化間葉系幹細胞の前記増殖された集団を、分化剤と接触させることによって、分化したＭＳＣの増殖された集団を生成する工程と
   を含む、方法。
9. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法に従って生成される間葉系幹細胞の単離された増幅された集団であって、
   （ａ）前記単離された増幅された間葉系幹細胞は、同一の条件下であるが、ニコチンアミドの非存在下で生成される間葉系幹細胞よりも粒度が低い、および
   （ｂ）前記単離された増幅された間葉系幹細胞は、下記の条件（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも１種によって特徴付けられる：
   （ｉ）少なくとも４０％の細胞がＶＣＡＭ１／ＣＤ１０６を発現する、
   （ｉｉ）少なくとも９０％の細胞が２０μｍ未満の直径を有する、または
   （ｉｉｉ）３０％未満の細胞がＣＤ４５を発現し、９５％を超える細胞がＣＤ９０を発現し、９０％を超える細胞がＣＤ１０５およびＣＤ４４を発現する。
10. 実質的に均一である、請求項９に記載の間葉系幹細胞の単離された増幅された集団。
11. 移植を必要とする対象への移植用の、移植可能な増幅されたＭＳＣ集団の製造のための、請求項９または１０に記載の単離された増殖細胞集団の使用。
12. 移植を必要とする前記対象は、骨または軟骨の疾患、神経変性疾患、心疾患、肝疾患、がん、神経損傷、自己免疫疾患、ＧｖＨＤ、創傷治癒および組織再生からなる群から選択される疾患または障害を患っている、請求項１１の使用。