CN112516169A - 一种用于治疗肠炎的间充质干细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗肠炎的间充质干细胞及其制备方法，在培养间充质干细胞的过程中通过添加上皮细胞生长因子，血管内皮细胞生长因子，前列腺素E2提高间充质干细胞的组织修复能力，在培养间充质干细胞过程中通过添加成纤维细胞生长因子，血小板衍生生长因子B，前列腺素E2提高间充质干细胞的免疫调控能力。本发明中采用阶段性加入细胞因子可有效的增强间充质干细胞的组织修复能力，并可有效提高间充质干细胞的免疫调控能力。采用组合因子诱导的间充质干细胞进行肠炎的治疗，这种方法简单经济，易于产业化操作，易于向临床转化应用。
Description
技术领域
本发明属于软骨细胞培养领域，尤其涉及一种用于治疗肠炎的间充质干细胞及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，广泛存在于脐带、骨髓、牙髓、脂肪或胎盘组织中，具有易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议、刺激组织再生、调节免疫功能等诸多优点。
结肠炎的治疗药物主要聚集在中药，益生菌类的药物，这些药物的主要作用在于调节胃肠菌群等作用抑制炎症，但对于重症炎症的治疗效果甚微，且未从根本上提高机体的抗炎能力。目前，间充质干细胞在软骨再生、脑缺血性疾病、糖尿病、类风湿性关节炎等动物模型和临床研究中有良好的治疗效果，显示出广阔的应用前景。此外，间充质干细胞在治疗结肠炎具有一定的效果，但是其在重症结肠炎的治疗方面，在抗炎及调节机体免疫功能方面效果甚微。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于治疗肠炎的间充质干细胞及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
本发明提供一种用于治疗肠炎的间充质干细胞，所述间充质干细胞为经组合因子诱导培养的间充质干细胞，所述组合因子包括成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B、上皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子。
本发明提供一种用于治疗肠炎的间充质干细胞，所述间充质干细胞为经组合因子诱导培养的间充质干细胞，所述组合因子包括成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B、上皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、前列腺素E或前列腺素E2。
本发明提供一种用于治疗肠炎的间充质干细胞制剂，包括上述间充质干细胞和辅助成分，所述辅助成分包括药学上接受的辅料、载体和添加剂中的至少一种。
本发明提供一种用于治疗肠炎的间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
（1）取P1代间充质干细胞，加入添加成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子B的培养液中进行培养；
（2）培养获得P2代间充质干细胞，加入添加成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子B的培养液中进行培养；
（3）培养获得P3代间充质干细胞，加入添加上皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子和前列腺素E2的培养液中进行培养；
（4）培养获得P4代间充质干细胞，加入培养液中进行培养；
（5）待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P5代间充质干细胞。
优选地，步骤（4）为培养获得P4代间充质干细胞，步骤（4）为培养获得P4代间充质干细胞，加入添加成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B和前列腺素E的培养液中进行培养。
在细胞扩增的P1-P3代间充质干细胞的培养过程中，通过在培养液中添加成纤维细胞生长因子，血小板衍生生长因子B提高细胞的干性。
在细胞扩增的P4代间充质干细胞的培养过程中，通过在培养液中添加上皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、前列腺素E2，可提高间充质干细胞的组织修复能力。
在细胞扩增的P5代间充质干细胞的培养过程中，通过在培养液中添加成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B、前列腺素E，可提高间充质干细胞的免疫调控能力。
优选地，步骤（1）和步骤（2）中纤维细胞生长因子浓度均为1ng/mL～30ng/mL，血小板衍生生长因子B浓度均为1ng/mL～30ng/mL。
优选地，步骤（3）中上皮细胞生长因子浓度为1ng/mL～50ng/mL，血管内皮细胞生长因子浓度为1ng/mL～50ng/mL，前列腺素E2浓度为1mg/mL～10mg/mL。
优选地，步骤（4）中纤维细胞生长因子浓度为1ng/mL～30ng/mL，血小板衍生生长因子B浓度为1ng/mL～30ng/mL，前列腺素E浓度为1mg/mL～10mg/mL。
本发明提供一种上述间充质干细胞在制备治疗肠炎药物中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明公开了一种用于治疗肠炎的间充质干细胞及其制备方法，在培养间充质干细胞过程中添加成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B和前列腺素E2可提高间充质干细胞的免疫调控能力，在培养间充质干细胞的过程中添加上皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子和前列腺素E提高间充质干细胞的组织修复能力。首次提出组合因子诱导间充质干细胞，采用阶段性加入细胞因子可有效的增强间充质干细胞的组织修复能力，提高间充质干细胞的免疫调控能力。这种方法经济，易于操作，可用于进行肠炎的临床治疗。
附图说明
图1为本发明实施例4中组合因子诱导后的间充质干细胞形态照片；
图2为本发明实施例4中组合因子诱导前后间充质干细胞的组织修复因子的检测结果对比图；
图3为本发明实施例4中组合因子诱导前后间充质干细胞的免疫调控能力检测结果对比图；
图4为本发明实施例4中不同组别动物的生存曲线对比图；
图5为本发明实施例4中不同组别动物的IL-6检测结果对比图；
图6为本发明实施例4中不同组别动物的TNFa检测结果对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种用于治疗肠炎的间充质干细胞，所述间充质干细胞为经组合因子诱导培养的间充质干细胞，所述组合因子包括成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B、上皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子。
在一些实施例中，成纤维细胞生长因子浓度为1ng/mL～30ng/mL，例如为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、30ng/mL。血小板衍生生长因子B浓度均为1ng/mL～30ng/mL，例如为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、30ng/mL。
在一些实施例中，上皮细胞生长因子浓度为1ng/mL～50ng/mL，例如为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、30ng/mL。血管内皮细胞生长因子浓度为1ng/mL～50ng/mL，例如为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、30ng/mL、45ng/mL、50ng/mL。
实施例2
本实施例提供一种用于治疗肠炎的间充质干细胞，所述间充质干细胞为经组合因子诱导培养的间充质干细胞，所述组合因子包括成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B、上皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、前列腺素E或前列腺素E2。
在一些实施例中，成纤维细胞生长因子浓度为1ng/mL～30ng/mL，例如为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、30ng/mL。血小板衍生生长因子B浓度均为1ng/mL～30ng/mL，例如为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、30ng/mL。
在一些实施例中，上皮细胞生长因子浓度为1ng/mL～50ng/mL，例如为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、30ng/mL。血管内皮细胞生长因子浓度为1ng/mL～50ng/mL，例如为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、30ng/mL、45ng/mL、50ng/mL。
在一些实施例中，前列腺素E2浓度为1mg/mL～10mg/mL，例如为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、10mg/mL。前列腺素E浓度为1mg/mL～10mg/mL，例如为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、10mg/mL。
实施例3
本实施例提供一种用于治疗肠炎的间充质干细胞制剂，所述间充质干细胞制剂包括间充质干细胞和辅助成分，所述辅助成分包括体积分数为94.5%生理盐水，体积分数为5%的葡萄糖注射液，体积分数为0.5%的低分子量肝素钙注射液。
所述间充质干细胞为经组合因子诱导培养的间充质干细胞，所述组合因子包括成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B、上皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、前列腺素E或前列腺素E2。
在一些实施例中，成纤维细胞生长因子浓度为1ng/mL～30ng/mL，例如为1ng/mL、3ng/mL、9ng/mL、12ng/mL、30ng/mL。血小板衍生生长因子B浓度均为1ng/mL～30ng/mL，例如为1ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、18ng/mL、30ng/mL。
在一些实施例中，上皮细胞生长因子浓度为1ng/mL～50ng/mL，例如为1ng/mL、5ng/mL、7ng/mL、25ng/mL、30ng/mL。血管内皮细胞生长因子浓度为1ng/mL～50ng/mL，例如为1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL。
在一些实施例中，前列腺素E2浓度为1mg/mL～10mg/mL，例如为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、6mg/mL、10mg/mL。前列腺素E浓度为1mg/mL～10mg/mL，例如为1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL。
实施例4
一、用于治疗肠炎的间充质干细胞的制备
（1）采用37度水浴锅，复苏P0代间充质干细胞，离心后获得P1代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液，在培养液中添加5ng/mL成纤维细胞生长因子及5ng/mL血小板衍生生长因子B，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
（2）培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P2代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液，在培养液中添加5ng/mL成纤维细胞生长因子及5ng/mL血小板衍生生长因子B，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
（3）培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P3代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液，在培养液中添加50ng/mL上皮细胞生长因子，50ng/mL血管内皮细胞生长因子，1mg/mL前列腺素E2，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
（4）培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P4代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液，在培养液中添加30ng/mL成纤维细胞生长因子，30ng/mL血小板衍生生长因子B，1mg/mL前列腺素E，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
（5）培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P5代间充质干细胞。
如图1所示，为组合因子诱导后的间充质干细胞形态照片，由图可知，细胞成长梭形，贴壁生长，符合间充质干细胞的基本形态。
表1 组合因子诱导前后间充质干细胞的表面分子检测结果
采用流式检测法进行细胞的鉴定，表1为组合因子诱导前后间充质干细胞表面分子检测结果，均符合国际细胞治疗协会的要求，CD73，CD90，CD105均高于95%，CD14，CD19，CD34，CD45，HLA-DR的均低于2%，说明组合因子诱导支持细胞的表面分子表达。
如图2所示，为组合因子诱导前后间充质干细胞的组织修复因子检测结果对比图，组合因子诱导后的间充质干细胞的组织修复因子的表达高于未处理组，说明组合因子诱导后的间充质干细胞的组织修复能力增强。
如图3所示，为组合因子诱导前后间充质干细胞的免疫调控结果，组合因子诱导后的间充质干细胞的与免疫细胞共同培养，可抑制TH1，TH17细胞的增殖，促进TH2和Treg细胞的分化，说明组合因子诱导后的间充质干细胞的免疫调控能力增强。
二、效果验证过程
（1）取40只雄性SD大鼠，随机分为对照组（Ctrol组）、假手术组（Sham组）、UC组和PGE2+UC组，假手术组、UC和PGE2+UC组采用3%浓度为3mg/100mL的葡聚糖硫酸钠盐水溶液每天自由饮用7天。
（2）在饮用3%葡聚糖硫酸钠盐水溶液后第3天，将未加因子诱导细胞的间充质干细胞和上述获得的用于治疗肠炎的间充质干细胞分别采用生理盐水重悬，调整细胞密度至1E7/mL，分别尾经脉注射间充质干细胞500uL细胞入UC和PGE2-UC组大鼠体内。
如图4所示，为不同组别动物的生存曲线对比图，PGE+UC组的治疗后动物的存活率高于UC组，说明组合因子诱导后细胞对肠炎的治疗结果优于未诱导组。
如图5所示，为不同组别动物的IL-6检测结果对比图，PGE+UC组的治疗后动物IL-6低于UC组，说明组合因子诱导后细胞可以降低肠炎模型的炎症因子，证明组合因子诱导后细胞对肠炎的治疗结果优于未诱导组。
如图6所示，为不同组别动物的TNFa检测结果对比图，PGE+UC组的治疗后动物TNF-a低于UC组，说明组合因子诱导后细胞可以降低肠炎模型的炎症因子，证明组合因子诱导后细胞对肠炎的治疗结果优于未诱导组。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种用于治疗肠炎的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为经组合因子诱导培养的间充质干细胞，所述组合因子包括成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B、上皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子。
2.一种用于治疗肠炎的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为经组合因子诱导培养的间充质干细胞，所述组合因子包括成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B、上皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、前列腺素E或前列腺素E2。
3.一种用于治疗肠炎的间充质干细胞制剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的间充质干细胞和辅助成分，所述辅助成分包括药学上接受的辅料、载体和添加剂中的至少一种。
4.一种用于治疗肠炎的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取P1代间充质干细胞，加入添加成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子B的培养液中进行培养；
（2）培养获得P2代间充质干细胞，加入添加成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子B的培养液中进行培养；
（3）培养获得P3代间充质干细胞，加入添加上皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子和前列腺素E2的培养液中进行培养；
（4）培养获得P4代间充质干细胞，加入培养液中进行培养；
（5）待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P5代间充质干细胞。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）为培养获得P4代间充质干细胞，加入添加成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B和前列腺素E的培养液中进行培养。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中成纤维细胞生长因子浓度均为1ng/mL～30ng/mL，血小板衍生生长因子B浓度均为1ng/mL～30ng/mL。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中上皮细胞生长因子浓度为1ng/mL～50ng/mL，血管内皮细胞生长因子浓度为1ng/mL～50ng/mL，前列腺素E2浓度为1mg/mL～10mg/mL。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中成纤维细胞生长因子浓度为1ng/mL～30ng/mL，血小板衍生生长因子B浓度为1ng/mL～30ng/mL，前列腺素E浓度为1mg/mL～10mg/mL。
9.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述培养液为含有10%胎牛血清的aMEM培养液。
10.一种如权利要求1或2所述的间充质干细胞在制备治疗肠炎药物中的应用。
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