CN111004778A

CN111004778A - 一种细胞无血清培养基添加物、培养基及用途

Info

Publication number: CN111004778A
Application number: CN201911295417.4A
Authority: CN
Inventors: 刘会杰; 杨美家; 尹鸿萍; 张军华; 刘永军; 王岩
Original assignee: Jiangsu Elt Pharmaceutical Research Institute Co ltd; Jiangsu Elt Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Elt Pharmaceutical Research Institute Co ltd; Jiangsu Elt Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2020-04-14
Also published as: WO2021120613A1

Abstract

本发明公开了一种细胞无血清培养基添加物、培养基及用途，本发明的细胞无血清培养基添加物富含细胞因子、生长因子，替代了血清中含有的生长因子、贴壁因子等，实现了在未添加血清的情况下，保证间充质干细胞的正常生长。经实验证明能替代多种市售的间充质干细胞培养基，对间充质干细胞的培养有极佳表现效果。加入该添加物的培养基能使间充质干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化(至少在10代以内)。

Description

一种细胞无血清培养基添加物、培养基及用途

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞无血清培养基添加物、培养基及用途。

背景技术

目前干细胞的潜在市场商机庞大，干细胞研究将有不可估量的医学价值。干细胞的发现和干细胞技术的发展不仅为人类疾病的治疗提供了独特的视角、方法和手段，也为人类疾病治疗提供了新的希望和曙光。间充质干细胞是成体干细胞的一种，具有干细胞的共性和很强的自我增殖能力。间充质干细胞具有很好的分化潜能，可用于特定组织器官的损伤修复；能够参与构成支持造血的微环境，促进造血恢复，与造血干细胞共同移植能够降低GVHD的发生率；具有免疫调节和易化移植的作用，免疫原性低，用于人体安全可靠；因此，间充质干细胞在临床的应用研究也越来越受关注，在组织工程、细胞替代疗法和基因疗法等方面有着广阔的应用前景。

目前，间充质干细胞培养过程中一般使用胎牛血清，用量较大，细胞培养过程中的费用较高，胎牛血清组分复杂，有150多种已知组分，还有多种未知组分。另外，不同个体的血清，组分差别极大，这使得不同批号血清性能有差异，产品批次间稳定性较差，容易造成异种物质的免疫排斥问题。因此，急需一种无动物源、无血清的间充质干细胞培养添加物。

专利申请号为20181015233的发明专利公开一种CHO细胞无血清培养基的添加物，所述添加物为维生素B1、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素H、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、叶酸中的任意一种或几种的混合物；该发明对无血清培养基中的重要添加物维生素进行研究，调控细胞生长代谢和产物表达，并针对不同细胞系及不同产品，调整培养基中营养成分及各个营养成分含量，从而提高细胞的存活率以及增殖等生理活动，调节细胞生长状态，进而提高产品产量，节约成本，获得较大经济效益，但是该专利并不是专门适用于间充质干细胞的培养。

发明内容

为了克服以上现有技术中存在的问题，提供一种细胞无血清培养基添加物，富含多种细胞因子、生长因子等，替代了血清中含有的生长因子、贴壁因子等，实现了在未添加血清的情况下，保证间充质干细胞的正常生长。

一种细胞无血清培养基添加物，所述添加物包含白蛋白、生长因子、葡萄糖、钠离子、甘油三酯、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸根离子中一种或几种的混合物，所述白蛋白浓度为6-14㎎/ml、生长因子浓度为160-220ng/ml、葡萄糖2-4㎎/ml、钠离子0.1-0.2mol/L、甘油三酯0.5-2mg/ml、钙离子0.4-0.9mg/ml、镁离子15-25ug/ml、氯离子3-6mmol/L、磷酸根离子4-15mmol/L。

优选的是，所述添加物包含白蛋白、生长因子、葡萄糖、钠离子、甘油三酯、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸根离子。

上述任一方案中优选的是，所述添加物由白蛋白、生长因子、葡萄糖、钠离子、甘油三酯、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸根离子组成。

上述任一方案中优选的是，所述白蛋白浓度为6㎎/ml、生长因子浓度为160ng/ml、葡萄糖2㎎/ml、钠离子0.1mol/L、甘油三酯0.5mg/ml、钙离子0.4mg/ml、镁离子15ug/ml、氯离子3mmol/L、磷酸根离子4mmol/L。

上述任一方案中优选的是，所述白蛋白浓度为8㎎/ml、生长因子浓度为180ng/ml、葡萄糖2.5㎎/ml、钠离子0.12mol/L、甘油三酯0.8mg/ml、钙离子0.6mg/ml、镁离子20ug/ml、氯离子4.5mmol/L、磷酸根离子8mmol/L。

上述任一方案中优选的是，所述白蛋白浓度为10㎎/ml、生长因子浓度为191.78ng/ml、葡萄糖3㎎/ml、钠离子0.15mol/L、甘油三酯1.0mg/ml、钙离子0.7mg/ml、镁离子22ug/ml、氯离子4.9mmol/L、磷酸根离子9mmol/L。

上述任一方案中优选的是，所述白蛋白浓度为14㎎/ml、生长因子浓度为220ng/ml、葡萄糖4㎎/ml、钠离子0.2mol/L、甘油三酯2mg/ml、钙离子0.9mg/ml、镁离子25ug/ml、氯离子6mmol/L、磷酸根离子15mmol/L。

上述任一方案中优选的是，生长因子包括血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子中的一种或几种。

上述任一方案中优选的是，所述血小板衍生生长因子浓度为60-70ng/ml、血管内皮生长因子浓度为5-15ng/ml、表皮生长因子浓度为3-6ng/ml、成纤维细胞生长因子浓度为6-12ng/ml、转化生长因子浓度为100-110ng/ml。

上述任一方案中优选的是，所述血小板衍生生长因子浓度为60ng/ml、血管内皮生长因子浓度为5ng/ml、表皮生长因子浓度为3ng/ml、成纤维细胞生长因子浓度为6ng/ml、转化生长因子浓度为100ng/ml。

上述任一方案中优选的是，所述血小板衍生生长因子浓度为64ng/ml、血管内皮生长因子浓度为10ng/ml、表皮生长因子浓度为4.75ng/ml、成纤维细胞生长因子浓度为8.88ng/ml、转化生长因子浓度为104.15ng/ml。

上述任一方案中优选的是，所述血小板衍生生长因子浓度为70ng/ml、血管内皮生长因子浓度为15ng/ml、表皮生长因子浓度为6ng/ml、成纤维细胞生长因子浓度为12ng/ml、转化生长因子浓度为110ng/ml。

本发明还提供一种培养基采用上述任意一项所述的添加物制成。

本发明还提供上述添加物在制备间充质干细胞培养基中的应用。基础培养基为LG-DMEM、DMEM/F12、α-MEM中的任意一种。间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等。

有益效果

本发明提供一种细胞无血清培养基添加物，所述添加物包含白蛋白、生长因子、葡萄糖、钠离子、甘油三酯、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸根离子中一种或几种的混合物，白蛋白(Albumin)10mg/ml，血小板衍生生长因子(PDGF)64ng/ml，血管内皮生长因子(VEGF)10ng/ml，表皮生长因子(EGF)4.75ng/ml，成纤维细胞生长因子(FGF)8.88ng/ml，转化生长因子-β1(TGF-β1)104.15ng/ml，葡萄糖(Glucose)3mg/ml，钠离子(Sodium)0.15mol/L，甘油三酯(Triglyceride)1.0mg/ml，钙离子(Calcium)0.7mg/ml，镁离子(Magnesium)22ug/ml，氯离子(Chloride)4.9mmol/L，磷酸根离子(PO₄ ^3-)10mmol/L。该添加物含有丰富的营养成份，能够促进细胞的生长，特别是所含的营养物质，更适于间充质干细胞的生长。

(1)本发明的细胞无血清培养基添加物是在长期间充质干细胞研究过程中经过不断优化实验条件，针对各类间充质干细胞的营养需求研发的专用培养产品。特别添加能有效改善细胞生长状态的营养物质，适用于各种间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等等的初代培养及继代培养。

(2)本发明的细胞无血清培养基添加物富含细胞因子、生长因子，替代了血清中含有的生长因子、贴壁因子等，实现了在未添加血清的情况下，保证间充质干细胞的正常生长。经实验证明能替代多种市售的间充质干细胞培养基，对间充质干细胞的培养有极佳表现效果。加入该添加物的培养基能使间充质干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化(至少在10代以内)。

(3)本发明是间充质干细胞培养过程中所使用的胎牛血清完美的替代品。用量仅5％左右，即可获得比20％FBS更快生长速度，极大减少了细胞培养过程中的费用，性价比很高。

(4)本发明的细胞无血清培养基添加物成分明确，不含任何未知组分，无动物来源成分，无血清来源成分，避免了异种物质的免疫排斥问题，产品批次间稳定性较好。

(5)本发明的添加物外观呈现黄色或浅黄色液体，总蛋白含量:6-14mg/ml；内毒素:≤10EU/ml；渗透压:275-355mOsm/KG，pH:7.2-7.8，无菌、无病毒、无支原体。该产品含有支持细胞增值生长的多种细胞因子，如PDGF,VEGF，EGF、FGF等，能够促进细胞健康、快速增值。细胞培养倍增时间短(<24小时)，并且支持细胞低密度(3000细胞/cm²)。

附图说明

图1用于脐带间充质干细胞培养计数结果；

图2用于脐带间充质干细胞培养平均倍增时间；

图3用于骨髓间充质干细胞培养计数结果；

图4用于骨髓间充质干细胞培养平均倍增时间；

图5用于脂肪间充质干细胞培养计数结果；

图6用于脂肪间充质干细胞培养平均倍增时间；

图7用于培养人类间充质干细胞电镜图；

图8用于培养细胞维持其脂肪分化能力电镜图；

图9用于培养细胞維持其成骨分化能力电镜图；

图10用于培养细胞維持其软骨分化能力；

图11培养间充质干细胞进行多代扩增图谱。

具体实施方式

为了更好理解本发明的技术方案和优点，以下通过具体实施方式，并结合附图对本发明做进一步说明。

实施例1

一种细胞无血清培养基添加物，所述添加物包含白蛋白、生长因子、葡萄糖、钠离子、甘油三酯、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸根离子。

白蛋白浓度为10㎎/ml、生长因子浓度为191.78ng/ml、葡萄糖3㎎/ml、钠离子0.15mol/L、甘油三酯1.0mg/ml、钙离子0.7mg/ml、镁离子22ug/ml、氯离子4.9mmol/L、磷酸根离子9mmol/L。

生长因子包括血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子。血小板衍生生长因子浓度为64ng/ml、血管内皮生长因子浓度为10ng/ml、表皮生长因子浓度为4.75ng/ml、成纤维细胞生长因子浓度为8.88ng/ml、转化生长因子浓度为104.15ng/ml。其制备方法为本领域技术人员的公知常识在此不再赘述。

1.1采用接种密度(5×10³/cm²,1×10,4/cm²,2×10⁴/cm²,4×10⁴/cm²)、首次换液时间(2、3、4、5、6、7天首次换液)、不同的基础培养基(LG-DMEM、DMEM/F12、α-MEM)、蛋白质、细胞激素、生长因子等成分的配比对脐血中的间充质干细胞原代培养过程的影响，培养已去除外膜及血管并剪碎的脐带组织块,采用流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达情况；油红O染色及茜素红染色法检测细胞的多向分化能力；比较各种测试条件下组织块的细胞迁出情况及细胞增殖能力。最终筛选出本申请的细胞无血清培养基添加物。以下实施例中各个培养条件等均为本领域公知常识。

培养条件：将间充质干细胞以4×10³/cm²的密度接种于T75的瓶子，加入15ml含5％添加物的完全培养基中，放于37℃、5％CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中培养，3-4天换一次液，待细胞汇合度达到80％时，用0.05％胰酶/EDTA进行消化传代。

1.2本发明的添加物用于脐带间充质干细胞培养

结果如图1所示，细胞总数結果，相较于20％DefinedFBS(P3-P4)，采用本发明的5％添加物高出3X。平均倍增时间25h，如图2所示。本发明的添加物仅5％的使用浓度，即可获得比20％FBS更快的生长速度。

1.3添加物用于骨髓间充质干细胞培养

细胞总数結果，相较于20％DefinedFBS(P2-P3)，采用本发明的5％营养添加物高出2X，如图3所示。平均倍增时间28h，如图4所示。

1.4添加物用于脂肪间充质干细胞培养

细胞总数結果，相较于20％DefinedFBS(P3-P4)，5％细胞营养添加物高出74X，如图5所示，平均倍增时间26h，如图6所示。

1.5添加物培养人类间充质干细胞，细胞型态正常

培养结果如图7所示。细胞标记符合ISCT标准且维持其免疫型态表征，如表1所示：

表1

1.6添加物培养细胞维持其脂肪分化能力，明显高于对照(FBS)，如图8所示。

1.7添加物培养细胞維持其成骨分化能力，明显高于对照(FBS)，如图9所示。

1.8添加物培养细胞維持其软骨分化能力，明显高于对照(FBS)，如图10所示。

1.9加入该添加物的培养基能使间充质干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化(至少在10代以内)，实现了在未添加血清的情况下，保证间充质干细胞的正常生长，如图11所示。

实施例2

一种细胞无血清培养基添加物，和实施例相似，不同的是，白蛋白浓度为6㎎/ml、生长因子浓度为191.78ng/ml、葡萄糖2㎎/ml、钠离子0.1mol/L、甘油三酯0.5mg/ml、钙离子0.4mg/ml、镁离子15ug/ml、氯离子3mmol/L、磷酸根离子4mmol/L。

实施例3

一种细胞无血清培养基添加物，和实施例相似，不同的是，所述白蛋白浓度为8㎎/ml、生长因子浓度为191.78ng/ml、葡萄糖2.5㎎/ml、钠离子0.12mol/L、甘油三酯0.8mg/ml、钙离子0.6mg/ml、镁离子20ug/ml、氯离子4.5mmol/L、磷酸根离子8mmol/L。

实施例4

一种细胞无血清培养基添加物，和实施例相似，不同的是，所述白蛋白浓度为14㎎/ml、生长因子浓度为191.78ng/ml、葡萄糖4㎎/ml、钠离子0.2mol/L、甘油三酯2mg/ml、钙离子0.9mg/ml、镁离子25ug/ml、氯离子6mmol/L、磷酸根离子15mmol/L。

实施例5

一种细胞无血清培养基添加物，和实施例相似，不同的是，生长因子浓度为174ng/ml，所述血小板衍生生长因子浓度为60ng/ml、血管内皮生长因子浓度为5ng/ml、表皮生长因子浓度为3ng/ml、成纤维细胞生长因子浓度为6ng/ml、转化生长因子浓度为100ng/ml。

实施例6

一种细胞无血清培养基添加物，和实施例相似，不同的是，生长因子浓度为213ng/ml，所述血小板衍生生长因子浓度为70ng/ml、血管内皮生长因子浓度为15ng/ml、表皮生长因子浓度为6ng/ml、成纤维细胞生长因子浓度为12ng/ml、转化生长因子浓度为110ng/ml。

需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种细胞无血清培养基添加物，特征在于：所述添加物包含白蛋白、生长因子、葡萄糖、钠离子、甘油三酯、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸根离子中一种或几种的混合物，所述白蛋白浓度为6-14㎎/ml、生长因子浓度为160-220ng/ml、葡萄糖2-4㎎/ml、钠离子0.1-0.2mol/L、甘油三酯0.5-2mg/ml、钙离子0.4-0.9mg/ml、镁离子15-25ug/ml、氯离子3-6mmol/L、磷酸根离子4-15mmol/L。

2.如权利要求1所述的一种细胞无血清培养基添加物，其特征在于：所述白蛋白浓度为6㎎/ml、生长因子浓度为160ng/ml、葡萄糖2㎎/ml、钠离子0.1mol/L、甘油三酯0.5mg/ml、钙离子0.4mg/ml、镁离子15ug/ml、氯离子3mmol/L、磷酸根离子4mmol/L。

3.如权利要求1所述的一种细胞无血清培养基添加物，其特征在于：所述白蛋白浓度为10㎎/ml、生长因子浓度为191.78ng/ml、葡萄糖3㎎/ml、钠离子0.15mol/L、甘油三酯1.0mg/ml、钙离子0.7mg/ml、镁离子22ug/ml、氯离子4.9mmol/L、磷酸根离子9。

4.如权利要求1所述的一种细胞无血清培养基添加物，其特征在于：所述白蛋白浓度为14㎎/ml、生长因子浓度为220ng/ml、葡萄糖4㎎/ml、钠离子0.2mol/L、甘油三酯2mg/ml、钙离子0.9mg/ml、镁离子25ug/ml、氯离子6mmol/L、磷酸根离子15mmol/L。

5.如权利要求1-4中任一项所述的一种细胞无血清培养基添加物，其特征在于：生长因子包括血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子中的一种或几种。

6.如权利要求5所述的一种细胞无血清培养基添加物，其特征在于：所述血小板衍生生长因子浓度为60-70ng/ml、血管内皮生长因子浓度为5-15ng/ml、表皮生长因子浓度为3-6ng/ml、成纤维细胞生长因子浓度为6-12ng/ml、转化生长因子浓度为100-110ng/ml。

7.如权利要求5所述的一种细胞无血清培养基添加物，其特征在于：所述血小板衍生生长因子浓度为64ng/ml、血管内皮生长因子浓度为10ng/ml、表皮生长因子浓度为4.75ng/ml、成纤维细胞生长因子浓度为8.88ng/ml、转化生长因子浓度为104.15ng/ml。

8.一种培养基采用权利要求1-7中任意一项所述的添加物制成。

9.权利要求1-8中任意一项所述的添加物在制备间充质干细胞培养基中的应用。