CN112961825A - 一种无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体的，本发明涉及一种无血清培养基及其制备方法。本发明的无血清培养基，以成分无血清培养及的添加剂代替血清、血小板裂解液等动物源成分，无血清培养基的成分来源明确、批次间重复性好、临床安全性高，能够提供间充质干细胞快速生长、增殖所需的各类物质成分，并保持其干细胞特性，满足脂肪、骨髓、脐带、脐血、胎盘等不同来源的间充质干细胞体外培养的需求。

Description

一种无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体的，本发明涉及一种无血清培养基及其制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)广泛存在于成体骨髓、脂肪、牙髓及围产期脐血、脐带、胎盘等多种人体组织器官中，是具有多向分化潜能、良好的体外扩增能力以及免疫调节功能的成体干细胞，间充质干细胞多次传代扩增后仍具有干细胞特性，并且表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格，是自体、异体细胞移植与治疗的理想种子细胞。

间充质干细胞最早发现于骨髓，还可从脂肪、脐血、胎盘、脐带、羊水、牙体等组织中分离出来。由于其具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞，在外科烧伤、软组织填充、终末期肝病、心肌梗死、糖尿病等疾病的治疗中展现出良好的安全性和有效性。

细胞培养技术是细胞生物学研究方法常用技术，通过在体外模拟体内环境，促使间充质干细胞能生长、增殖，从而实现细胞大规模培养。体外培养所需要的营养物质与体内基本相同，需要糖类、氨基酸、无机盐、生长因子、激素、微量元素等，浆细胞所需要的物质按其种类和含量严格配置培养基来培养细胞，目前，传统用于培养间充质干细胞的培养基是一种含有动物源成分的液体培养基，常用的是以人血清和血小板裂解液(PL)为基础的支持干细胞体外扩增，传代培养。然而，血清的组分复杂、存在较多不确定成分，各批次之间的质量差别较大，难以保证间充质干细胞的标准化培养；人工PL同样存在成分不明确，各批次之间质量差异大的问题，影响体外培养间充质干细胞的表型和功能，不利于间充质干细胞的标准化培养。

发明内容

发明要解决的问题

鉴于现有技术中存在的问题，例如，以血清或血小板裂解液(PL)为基础的间充质干细胞培养基存在成分不明确，不同批次之间质量差异大，影响间充质干细胞标准化培养的缺陷。为此，本发明提供了一种无血清培养基，其不含血清、血小板裂解液等成分，无血清培养基的来源明确、批次间差异小，能够实现对间充质干细胞的高效培养。

用于解决问题的方案

本发明提供了一种间充质干细胞的无血清培养基，其中，所述无血清培养基包括：

基础培养基和无血清培养基的添加剂，所述基础培养基与所述无血清培养基的添加剂的质量比为(5-15)：1；

其中，所述无血清培养基的添加剂包括：含有基础代谢类物质的第一组分、含有细胞因子类物质的第二组分，以及含有氧化还原类物质的第三组分；以所述添加剂的总质量为100％计，所述第一组分为6％-22％，所述第二组分为35％-47％，所述第三组分为43％-47％。

在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基，其中，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、无机盐和脂类；

优选地，所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述无机盐包括氯化钙、氯化钾、硫酸铜、碳酸氢钠、硝酸铁、氯化钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、氯化镁、磷酸氢钠、硫酸镁、硫酸锌中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述脂类包括花生四烯酸、胆固醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温和F-68中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述维生素包括生物素、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B₁₂、肌醇中的一种或两种以上的组合。

在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基，其中，所述氨基酸的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：甘氨酸5.25-131.25mg/L，丙氨酸2.67-66.75mg/L，精氨酸54.78-1369.5mg/L，天冬酰胺4.14-103.5mg/L，天门冬氨酸3.99-99.75mg/L，半胱氨酸3.512-87.8mg/L，胱氨酸11.058-276.45mg/L，谷氨酸4.41-110.25mg/L，L-组氨酸14.696-367.4mg/L，异亮氨酸21.374-534.35mg/L，亮氨酸22.29-557.25mg/L，赖氨酸32.75-818.75mg/L，甲硫氨酸6.468-161.7mg/L，苯丙氨酸13.696-342.4mg/L，脯氨酸5.75-143.75mg/L，丝氨酸7.35-183.75mg/L，苏氨酸20.21-505.25mg/L，色氨酸3.844-96.1mg/L，酪氨酸18.358-458.95mg/L，缬氨酸19.93-498.25mg/L，谷氨酰胺100-300mg/L；

所述无机盐的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：氯化钙23.32-583mg/L，硫酸铜0.00026-0.0065mg/L，硝酸铁0.01-0.25mg/L，硫酸亚铁0.0834-2.085mg/L，氯化镁5.728-143.2mg/L，硫酸镁9.768-244.2mg/L，氯化钾62.36-1559mg/L，碳酸氢钠240-6000mg/L，氯化钠1416.1-35402.5mg/L，磷酸氢二钠14.204-355.1mg/L，磷酸氢钠12.5-312.5mg/L，硫酸锌0.0864-2.16mg/L；

所述维生素的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：生物素0.0007-0.0175mg/L，氯化胆碱1.996-49.9mg/L，泛酸钙0.648-16.2mg/L，叶酸0.73-18.25mg/L，烟酰胺0.604-15.1mg/L，盐酸吡哆醇0.6-15mg/L，核黄素0.0638-1.595mg/L，硫胺素0.634-15.85mg/L，维生素B₁₂ 0.136-3.4mg/L，肌醇2.92-73mg/L；

所述脂类的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：花生四烯酸0.0004-0.01mg/L，胆固醇0.044-1.1mg/L，肉豆蔻酸0.002-0.05mg/L，油酸0.002-0.05mg/L，棕榈酸0.002-0.05mg/L，棕榈油酸0.002-0.05mg/L，硬脂酸0.002-0.05mg/L，吐温0.44-11mg/L，F-68 18-82.64mg/L。

在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基，其中，所述无血清培养基还包括具有如下所示浓度的组分：葡萄糖1000-5000mg/L，次黄嘌呤2-10mg/L，丙酮酸钠50-100mg/L，胸苷0.2-1mg/L。

在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基，其中，所述添加剂的第一组分包括维生素、脂类、L-谷氨酰胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、β-巯基乙醇、地塞米松和氢化可的松中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述第一组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述维生素的浓度为8.3-95mg/L，所述脂类的浓度为18.4-95mg/L，所述L-谷氨酰胺的浓度为100-300mg/L，所述L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为10-100mg/L，所述β-巯基乙醇的浓度为1-10mg/L，所述地塞米松的浓度为1-5ng/ml，所述氢化可的松的浓度为1-5ng/ml。

在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基，其中，所述第二组分包括bFGF、EGF、PDGF-BB、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、重组人纤连蛋白和人血清白蛋白中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述第二组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述bFGF的浓度为1-20ng/ml，所述EGF的浓度为1-20ng/ml，所述PDGF-BB的浓度为1-20ng/ml，所述TTR的浓度为1-20ng/ml，所述IGF的浓度为1-20ng/ml，所述VEGF的浓度为1-20ng/ml，所述LIF的浓度为1-20ng/ml，所述HGF的浓度为1-20ng/ml，所述CTGF的浓度为1-20ng/ml，所述β细胞素的浓度为1-10ng/ml，所述IL-8的浓度为1-5ng/ml，所述重组人纤连蛋白的浓度为1-20μg/ml，所述人血清白蛋白的浓度为1-4mg/ml。

在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基，其中，所述第三组分包括左旋肉碱、乙醇胺、半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、生育酚、生育酚乙酸酯、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物酶、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和过氧化氢酶中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述第三组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述左旋肉碱的浓度为0.4-10μg/ml，所述乙醇胺的浓度为0.2-5μg/ml，所述半乳糖的浓度为3-45μg/ml，所述腐胺的浓度为3-50μg/ml，所述亚硒酸钠的浓度为0.003-0.07μg/ml，所述皮质酮的浓度为0.004-0.1μg/ml，所述亚油酸的浓度为0.2-5μg/ml，所述亚麻酸的浓度为0.2-5μg/ml，所述硫辛酸的浓度为0.009-0.24μg/ml，所述黄体酮的浓度为0.001-0.03μg/ml，所述生育酚的浓度为0.02-0.5μg/ml，所述生育酚乙酸酯的浓度为0.02-0.5μg/ml，所述谷胱甘肽的浓度为0.2-5μg/ml，所述胰岛素的浓度为0.8-20μg/ml，所述超氧化物酶的浓度为0.5-12.5μg/ml，所述转铁蛋白的浓度为1-25μg/ml，所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为0.0004-0.01μg/ml，所述过氧化氢酶的浓度为0.5-12.5μg/ml。

在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基，其中，所述无血清培养基的添加剂为浓缩液或所述浓缩液的冻干粉剂。

在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基的制备方法，其中，包括将所述基础培养基与所述无血清培养基的添加剂混合的步骤。

在一些实施方式中，本发明所述的制备方法，其中，所述无血清培养基的添加剂为冻干粉剂，所述冻干粉剂由所述第一组分、第二组分和第三组分的溶解液混合后冻干得到。

发明的效果

在一些实施方案中，本发明的无血清培养基，以成分无血清培养及的添加剂代替血清、血小板裂解液等动物源成分，无血清培养基的成分来源明确、批次间重复性好、临床安全性高，能够提供间充质干细胞快速生长、增殖所需的各类物质成分，并保持其干细胞特性，满足脂肪、骨髓、脐带、脐血、胎盘等不同来源的间充质干细胞体外培养的需求。

在一些实施方案中，本发明的无血清培养基的制备方法，该方法简单易行，原料成本低、易于获取，易于满足量产需求。

附图说明

图1显示P0代脂肪间充质干细胞的细胞形态观察结果；

图2显示P3代脂肪间充质干细胞的细胞形态观察结果；

图3显示对脂肪干细胞的阳性指标CD73的检测结果；

图4显示对脂肪干细胞的阳性指标CD90的检测结果；

图5显示对脂肪干细胞的阳性指标CD105的检测结果；

图6显示对脂肪干细胞的阳性指标HLA-ABC的检测结果；

图7显示对脂肪干细胞的阴性指标HLA-G的检测结果；

图8显示对脂肪干细胞的阴性指标CD14的检测结果；

图9显示对脂肪干细胞的阴性指标CD19的检测结果；

图10显示对脂肪干细胞的阴性指标HLA-DR DP DQ的检测结果。

具体实施方式

以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，所述“常温”、“室温”，其温度可以是10-40℃。

另外，本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等本领域能够使用的任何可行的水。

第一方面

本发明的第一方面提供了一种无血清培养基，包括：

基础培养基和无血清培养基的添加剂，所述基础培养基与所述无血清培养基的添加剂的质量比为(5-15)：1；

其中，所述无血清培养基的添加剂包括含有基础代谢类物质的第一组分、含有细胞因子类物质的第二组分，以及含有氧化还原类物质的第三组分；

以所述添加剂的总质量为100％计，所述第一组分为6％-22％，所述第二组分为35％-47％，所述第三组分为43％-47％。

本发明的无血清培养基，其中基础培养基可提供间充质干细胞培养所需的氨基酸、维生素、脂类、无机盐等成分，无血清培养基的添加剂可代替血清、血小板裂解液等动物源成分，在维持细胞生物学特性的同时促进其代谢、增殖。无血清培养基通过两种成分的协同作用，具有成分来源明确、批次间重复性好、临床安全性高的优势，适合脂肪、骨髓、脐带、脐血、胎盘等不同来源的间充质干细胞的大规模培养，能在长期培养、传代的过程中维持干细胞的形态不发生变化，维持干细胞的自我更新能力和多向分化潜能。

<基础培养基>

基础培养基提供间充质干细胞生长、代谢、增殖所需的基础营养成分。具体的，基础培养基与无血清培养基的添加剂的质量比为(5-15)：1。示例性的，基础培养基与添加剂的质量比为5:1、6:1、6.7:1、8:1、10:1、12:1、15:1等等。进一步的，所述基础培养基的浓度为3.6-89g/L。当基础培养基为上述浓度范围时，能够平衡无血清培养基内的大量元素和微量元素，有利于形成细胞生长和维持所需的基础营养环境。

进一步的，基础培养基包括氨基酸、维生素、无机盐、脂类。基础培养基的各成份明确，且来源丰富、成本低，有利于降低无血清培养基的生产成本，并提供干细胞培养所需的基础营养环境。

在本发明中，氨基酸、脂类可以作为细胞的能量来源，参与间充质干细胞的蛋白、核酸、脂类等物质的代谢过程，维持细胞的生长、代谢。

在一些具体的实施方式中，氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合。作为优选，氨基酸包括上述所有种类的氨基酸成分。

进一步的，所述氨基酸的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：甘氨酸5.25-131.25mg/L，丙氨酸2.67-66.75mg/L，精氨酸54.78-1369.5mg/L，天冬酰胺4.14-103.5mg/L，天门冬氨酸3.99-99.75mg/L，半胱氨酸3.512-87.8mg/L，胱氨酸11.058-276.45mg/L，谷氨酸4.41-110.25mg/L，L-组氨酸14.696-367.4mg/L，异亮氨酸21.374-534.35mg/L，亮氨酸22.29-557.25mg/L，赖氨酸32.75-818.75mg/L，甲硫氨酸6.468-161.7mg/L，苯丙氨酸13.696-342.4mg/L，脯氨酸5.75-143.75mg/L，丝氨酸7.35-183.75mg/L，苏氨酸20.21-505.25mg/L，色氨酸3.844-96.1mg/L，酪氨酸18.358-458.95mg/L，缬氨酸19.93-498.25mg/L，谷氨酰胺100-300mg/L。

在一些具体的实施方式中，脂类包括花生四烯酸、胆固醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温和F-68中的一种或两种以上的组合。作为优选，脂类包括上述所有种类的脂质成分。

进一步的，所述脂类的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：花生四烯酸0.0004-0.01mg/L，胆固醇0.044-1.1mg/L，肉豆蔻酸0.002-0.05mg/L，油酸0.002-0.05mg/L，棕榈酸0.002-0.05mg/L，棕榈油酸0.002-0.05mg/L，硬脂酸0.002-0.05mg/L，吐温0.44-11mg/L，F-68 18-82.64mg/L。

在本发明中，F-68具体地为Pluronic F68，作为细胞膜的稳定剂，用于防止细胞膜剪切并额外起到消泡剂的作用。

氨基酸和脂类的具体成分及浓度通过大量筛选得到，实现了对间充质干细胞的量化培养，减少批次之间误差。

在本发明中，无机盐有利于维持培养基的渗透压平衡，参与细胞重要的生理代理活动，对于维持细胞状态的稳定具有重要意义。具体的，无机盐包括酸氯化钙、氯化钾、硫酸铜、碳酸氢钠、硝酸铁、氯化钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、氯化镁、磷酸氢钠、硫酸镁、硫酸锌中的一种或两种以上的组合。作为优选，无机盐包括上述所有种类的无机盐成分。

在一些具体的实施方式中，所述无机盐的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：氯化钙23.32-583mg/L，硫酸铜0.00026-0.0065mg/L，硝酸铁0.01-0.25mg/L，硫酸亚铁0.0834-2.085mg/L，氯化镁5.728-143.2mg/L，硫酸镁9.768-244.2mg/L，氯化钾62.36-1559mg/L，碳酸氢钠240-6000mg/L，氯化钠1399.1-34977.5mg/L，磷酸氢二钠14.204-355.1mg/L，磷酸氢钠12.5-312.5mg/L，硫酸锌0.0864-2.16mg/L。

在本发明中，基础培养基中还包括促进细胞生长的维生素。具体的，维生素包括生物素、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12、肌醇中的一种或两种以上的组合。作为优选，维生素包括上述所有种类的无机盐成分。

在一些具体的实施方式中，维生素的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：生物素0.0007-0.0175mg/L，氯化胆碱1.996-49.9mg/L，泛酸钙0.648-16.2mg/L，叶酸0.73-18.25mg/L，烟酰胺0.604-15.1mg/L，盐酸吡哆醇0.6-15mg/L，核黄素0.0638-1.595mg/L，硫胺素0.634-15.85mg/L，维生素B12 0.136-3.4mg/L，肌醇2.92-73mg/L。

在一些优选地实施方式中，所述无血清培养基还包括具有如下所示浓度的组分：葡萄糖1000-5000mg/L，次黄嘌呤2-10mg/L，丙酮酸钠50-100mg/L，胸苷0.2-1mg/L。优选地，葡萄糖为3151mg/L。

<无血清培养基的添加剂>

本发明的无血清培养基的添加剂包括含有基础代谢类物质的第一组分、含有细胞因子类物质的第二组分，以及含有氧化还原类物质的第三组分；以所述添加剂的总质量为100％计，所述第一组分为6％-22％，所述第二组分为35％-47％，所述第三组分为43％-47％。

本发明的无血清培养基的添加剂，其中的第一组分可以提供间充质干细胞代谢所需物质，提高细胞代谢活性；第二组分提供细胞增殖、生长所需要的各类因子，促进细胞增殖；第三组分能够为间充质干细胞提供维持其细胞形态、生物学特性所需的氧化还原体系，防止细胞变形以及干细胞特性的丧失。无血清培养基的添加剂通过三种成分的协同作用，可代替血清、血小板裂解液等动物源成分。添加剂的成分明确、不同批次之间重复性好、临床安全性高，满足脂肪、骨髓、脐带、脐血、胎盘等不同来源的间充质干细胞体外培养的需求。

进一步的，本发明的无血清培养基的添加剂为包含上述组分的浓缩液，或者是所述浓缩液的冻干粉剂，浓缩液或冻干粉剂的添加剂具适合加入基础培养基中，代替间充质干细胞的培养基中的人血清、人血小板裂解液等成分。

在一些优选的实施方案中，无血清培养基的添加剂为冻干粉剂。本发明在实验中发现，现有的无血清培养基中在储存和运输中存在稳定性不高的问题，其中的谷氨酰胺、脂肪酸酯等活性成分易失活，各类蛋白成分在2-8℃的温度下也无法长期存储。针对上述问题，本发明将浓缩液型的添加剂冻干为冻干粉剂，其稳定性大大提高，各组分活性不易丧失，适合长期的贮存、运输；且冻干粉剂具有良好的可复溶性，在添加于基础培养基后，各组分仍具有高的物质活性。

第一组分

第一组分包含基础代谢类物质，提供间充质干细胞生长、代谢所需的能量来源。具体的，以所述添加剂的总质量为100％计，所述第一组分的含量为6％-22％，优选为6.4％-20.9％。有利于提高间充质干细胞的代谢活性，促进间充质干细胞的快速贴壁，促进其增殖能力和活性的维持。

在一些具体的实施方案中，第一组分包括维生素、脂类、L-谷氨酰胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、β-巯基乙醇、地塞米松和氢化可的松的一种或两种以上的组合。作为优选，第一组分包括上述所有组分，各组分协同配合，提供细胞生长、代谢的必要养分。

在本发明中，维生素作细胞培养基的生长补充剂，以增加间充质干细胞的生长和活力。第一组分中的维生素可以是由维生素B₁₂、维生素E、维生素C等不同种类的维生素配制得到，也可以是市售的混合维生素成分。脂类为细胞的生长和繁殖提供所需营养物质，有利于提高细胞生长密度，显著改善细胞性能。第一组分中的脂类可以是由胆固醇、棕榈酸、花生四稀酸等不同种类的脂类成分配制得到，也可以是市售的混合脂类成分。L-谷氨酰胺可提高细胞内环境的稳定性，改善间充质干细胞的活性和生长。L-抗坏血酸-2-磷酸是一种高稳定性的维生素C衍生物，具有强抗氧化性，具有抗凋亡的作用并参与干细胞的生长增殖等。β-巯基乙醇兼具乙二醇(HOCH₂CH₂OH)和乙二硫醇(HSCH₂CH₂SH)的官能团，可用于二硫键的还原，从而使蛋白质不被氧化掉而失活。地塞米松、氢化可的松属于糖皮质激素，参与间充质干细胞的糖类、脂类等成分的代谢，并参与干细胞免疫抑制。

具体的，所述第一组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述维生素的浓度为8.3-95mg/L，所述脂类的浓度为18.4-95mg/L，所述L-谷氨酰胺的浓度为100-300mg/L，所述L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为10-100mg/L，所述β-巯基乙醇的浓度为1-10mg/L，所述地塞米松的浓度为1-5ng/ml，所述氢化可的松的浓度为1-5ng/ml。当第一组分包含物质的所需含量在上述范围内时，能满足细胞的基本生长，当其缺乏时，细胞的生长发育受阻。

在一些具体的实施方式中，第一组分的含量为54.3mg。进一步的，无血清培养基中，第一组分包含的维生素、脂类、L-谷氨酰胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、β-巯基乙醇、地塞米松和氢化可的松的物质的浓度分别为93.1mg/L、92.6mg/L、292mg/L、50mg/L、4.3mg/L、4ng/ml、3.62ng/ml。

第二组分

第二组分包括经筛选得到的各类细胞因子、生长素、白细胞介素、重组人纤连蛋白、人血清白蛋白等蛋白成分，能够促进间充质干细胞增殖。具体的，以所述添加剂的总质量为100％计，第二组分的含量为35％-47％，优选为35.4％-46.7％。示例性的，第二组分的含量为35％、35.4％、38％、41％、44％、46.7％、47％。当第二组分含量为35％-47％时，能够使间充质干细胞保持高的生长速度，提高细胞培养效率，并保持间充质干细胞的分化潜能。

在一些具体的实施方案中，第二组分包括bFGF、EGF、PDGF-BB、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、重组人纤连蛋白和人血清白蛋白中的一种或两种以上的组合。作为优选，第二组分为bFGF、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、重组人纤连蛋白和人血清白蛋白的组合，上述组分协同配合，提供细胞增殖所需营养。

在本发明中，bFGF(basic fibroblast growth factor，bFGF)为碱性成纤维细胞生长因子，是传递发育信号，能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽，能够促进细胞的增殖、迁移。EGF为表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor)，可促进细胞分裂。PDGF-BB(Platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)为血小板衍生生长因子-BB，是低分子量促细胞分裂素，能够促进多种细胞进入分裂增殖周期。TTR为转甲状腺素蛋白，对于影响干细胞增殖和分化功能的维生素A活性的发挥有重要作用。IGF(insulin like growthfactor，IGF)是一组具有促生长作用的多肽类物质。VEGF(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是血管内皮生长因子，具有诱导细胞存活、增殖、迁移等功能。LIF(LeukemiaInhibitory Factor)为白血病抑制因子，可维持间充质干细胞的未分化状态。HGF为肝细胞生长因子，可调节多种细胞生长、运动和形态发生。CTGF为结缔组织生长因子，是一种由349个氨基酸组成，分子量为34～38KD的富含半胱氨酸的分泌肽，具有促细胞增殖、迁移及分化等作用。β细胞素也即Betacellulin，是表皮生长因子家族的一员，可调节细胞的生长、增殖，抑制干细胞分化以维持干细胞的分化潜能。IL-8(Interleukin-8，IL-8)为白细胞介素-8，是趋化因子家族的一种细胞因子，能够诱导细胞增殖。

进一步的，所述第二组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述bFGF的浓度为1-20ng/ml，所述EGF的浓度为1-20ng/ml，所述PDGF-BB的浓度为1-20ng/ml，所述TTR的浓度为1-20ng/ml，所述IGF的浓度为1-20ng/ml，所述VEGF的浓度为1-20ng/ml，所述LIF的浓度为1-20ng/ml，所述HGF的浓度为1-20ng/ml，所述CTGF的浓度为1-20ng/ml，所述β细胞素的浓度为1-10ng/ml，所述IL-8的浓度为1-5ng/ml，所述重组人纤连蛋白的浓度为1-20μg/ml，所述人血清白蛋白的浓度为1-4mg/ml。当第二组分包含物质的含量在上述范围内时，干细胞能够保持高的生长活性，当其缺乏时，干细胞形态不正常并增殖缓慢甚至不增殖。

在本发明中，重组人纤连蛋白(Fn)是一类高活性蛋白，是细胞黏连的机体结构得以维持、细胞生长完成的必要条件，重组人纤连蛋白可以促进细胞的黏连生长，使多种细胞的贴壁率显著提高，细胞形态结构良好，细胞的代谢率增强，遗传物质(DNA、RNA)等合成速度变快，细胞的集落率升高，原代培养的成活率明显提高，细胞生长时间缩短。具体的，重组人纤连蛋白在无血清培养基中的浓度为1-20μg/ml，例如，重组人纤连蛋白的浓度为5μg/ml、7μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、15μg/ml、18μg/ml、20μg/ml等等。当重组人纤连蛋白的含量在上述范围内时，干细胞易于快速贴壁生长。

在本发明中，人血清白蛋白(HSA)是细胞生长代谢的重要营养物质，人血清白蛋白分解产生的氨基酸可用于细胞合成组织蛋白，氧化分解以供应能量或转变成其他含氮物质。此外，人血清白蛋白可以提供合适的培养基渗透压，满足细胞生长的渗透压平衡，避免细胞遭受机械损伤，还与培养基中许多难溶性的小分子有机物和无机离子可逆地结合形成易溶性复合物，成为这些物质在培养基中的存在方式。具体的，人血清白蛋白在无血清培养基中的浓度为1～4mg/ml，例如，人血清白蛋白的浓度为1mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml、2.2mg/ml、2.5mg/ml、2.8mg/ml、3mg/ml、3.2mg/ml、3.4mg/ml、3.6mg/ml、3.8mg/ml等等。当人血清白蛋白的含量在上述范围内时，维持干细胞生长环境体系的稳定。

在一些具体的实施方式中，无血清培养基中，第二组份包含的bFGF、EGF、PDGF-BB、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、重组人纤连蛋白和人血清白蛋白的物质的浓度分别为10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、5μg/ml、2mg/ml。

第三组分

第三组分包含氧化还原类物质以及其他类物质，形成干细胞培养体系的微环境，此微环境能够提供间充质干细胞所需的氧化还原体系，维持间充质干细胞的三维立体形态，防止细胞发生形变，保持其自我更新和多项分化的干细胞特性，维持细胞生理代谢。具体的，以所述添加剂的总质量为100％计，所述第三组分的含量为43％-47％，优选为43.7％-46.9％。示例性的，第三组分的含量为43％、43.7％、44％、45％、46.9％、47％等等。当第三组分的含量为43％-47％时，能够维持使间充质干细胞的细胞形态，保持其干细胞特性。

在一些具体的实施方案中，第三组分包括左旋肉碱、乙醇胺、半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、生育酚、生育酚乙酸酯、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物酶、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和过氧化氢酶中的一种或两种以上的组合。作为优选，第三组分包括上述全部组分，通过各组分的协同作用，提供维持间充质干细胞形态所需的干细胞微环境体系。

在本发明中，左旋肉碱可促进脂肪和脂肪酸类代谢。乙醇胺和腐胺可延长细胞的周期，提高细胞的增殖密度以及抗凋亡作用。半乳糖是合成细胞内及表面糖蛋白的重要原料。亚硒酸钠作微量元素为细胞生长代谢不可缺少的一部分。皮质酮一种肾上腺皮质激素，对于间充质干细胞的免疫抑制具有重要作用。亚油酸在细胞内直接合成脂肪酸。亚麻酸是体内必须脂肪酸，细胞体内难以合成。硫辛酸属于B族维生素中的一类化合物，是一种存在于线粒体的辅酶，能消除导致加速老化与致病的自由基。黄体酮能有效的促进细胞增殖。生育酚和生育酚乙酸酯是是细胞内不可缺少的维生素E，并具有抗氧化剂和抗细胞凋亡的作用。谷胱甘肽并具有抗氧化作用。胰岛素同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成，在细胞生长、代谢中不可缺少。超氧化物酶具有清楚氧自由基的作用，可减少氧自由基的积累对细胞产生毒害。转铁蛋白是人血清中主要的结合铁蛋白质，在铁转运中有重要作用，为细胞代谢提供所需的铁。此外，转铁蛋白还具有抗菌、作为细胞增殖、分化中的生长因子等功能。三碘甲状腺原氨酸是一种含碘的酪氨酸，它是以碘和酪氨酸为原料在甲状腺腺细胞内合成，用于调控细胞内外调控钙离子浓度，维持细胞膜电位稳定，氧化氢酶能清除细胞的代谢废物过氧化氢的作用，起到为细胞解毒的作用。

进一步的，所述第三组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述左旋肉碱的浓度为0.4-10μg/ml，所述乙醇胺的浓度为0.2-5μg/ml，所述半乳糖的浓度为3-45μg/ml，所述腐胺的浓度为3-50μg/ml，所述亚硒酸钠的浓度为0.003-0.07μg/ml，所述皮质酮的浓度为0.004-0.1μg/ml，所述亚油酸的浓度为0.2-5μg/ml，所述亚麻酸的浓度为0.2-5μg/ml，所述硫辛酸的浓度为0.009-0.24μg/ml，所述黄体酮的浓度为0.001-0.03μg/ml，所述生育酚的浓度为0.02-0.5μg/ml，所述生育酚乙酸酯的浓度为0.02-0.5μg/ml，所述谷胱甘肽的浓度为0.2-5μg/ml，所述胰岛素的浓度为0.8-20μg/ml，所述超氧化物酶的浓度为0.5-12.5μg/ml，所述转铁蛋白的浓度为1-25μg/ml，所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为0.0004-0.01μg/ml，所述过氧化氢酶的浓度为0.5-12.5μg/ml。

在一些具体的实施方式中，无血清培养基中，第三组分包含的左旋肉碱、乙醇胺、半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、生育酚、生育酚乙酸酯、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物酶、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和过氧化氢酶的物质浓度分别为2μg/ml、1μg/ml、15μg/ml、16.181μg/ml、0.01435μg/ml、0.02μg/ml、1μg/ml、1μg/ml、0.152μg/ml、0.0063μg/ml、0.1μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、4μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、0.002μg/ml、2.5μg/ml。

上述的无血清培养基的添加剂，其中第一组分、第二组分、第三组分的组分和浓度经特定筛选得到，通过各组分之间的协同作用，为间充质干细胞提供生长、代谢、增殖刺激、维持细胞形态及干细胞特性所需的营养成分，可代替人血清、血小板裂解液等成分不明确的添加剂，有利于实现间充质干细胞的标注化培养。无血清培养基的添加剂具有来源明确、成本低的优势，可以添加于基础培养基中，作为脂肪、脐血、脐带、胎盘、骨髓等多种组织来源的间充质干细胞的无血清培养基。特别地，无血清培养基用于脂肪间充质干细胞的培养，能够获得优异的培养效果。

第二方面

本发明的第二方面中，提供了一种第一方面的无血清培养基的制备方法，包括将所述基础培养基与所述无血清培养基的添加剂混合的步骤。

进一步的，无血清培养基的制备方法包括制备基础培养基的溶解液，和制备无血清培养基的添加剂的溶解液；然后将基础培养基的溶解液与无血清培养基的添加剂的溶解液混匀后过滤，得到无血清培养基。

在一些具体的实施方案中，无血清培养基的添加剂的制备方法包括如下步骤：

将所述第一组分、第二组分和第三组分的溶解液混合后过滤，得到混合的溶解液；

所述混合的溶解液经预冻、升华和干燥处理，得到冻干粉剂的添加剂。

制备混合的溶解液

在本发明中，为了有效减少添加剂的各组分混合时发生聚集成团的现象，将第一组分、第二组分和第三组分分别溶解后，混合三种组分的溶解液，过滤后得到混合的溶解液。

对于第一组分的溶解液，可以是将包含L-抗坏血酸-2-磷酸、β-巯基乙醇、地塞米松和氢化可的松混合后得到。

对于第二组分的溶解液，可以是将bFGF、EGF、PDGF、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、人血清白蛋白、重组人纤连蛋白中的一种或多种溶解于溶剂中得到。本发明对溶解第二组分的溶剂不作特别限定，可以是适用于细胞培养的各类溶剂成分。

对于第三组分的溶解液，可以是将左旋肉碱、乙醇胺、半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、生育酚、生育酚乙酸酯、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物酶、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和过氧化氢酶中的一种或多种溶解于溶剂中得到。本发明对溶解第三组分的溶剂不作特别限定，可以是适用于细胞培养的各类溶剂成分。

制备冻干粉剂

在本发明中，为保留各物质组分的活性，将混有三种组分的混合的溶解液依次经预冻、升华和干燥处理，得到冻干粉剂的添加剂。

对于预冻处理，是在-35～-45℃的温度下，保持3～5小时。

对于升华处理，首先将温度降低到-45～-55℃以下，然后对整个工作系统抽真空；当真空度控制到10pa以下后，在19～25℃的温度下，升华干燥24小时。

对于干燥处理，是在7～9℃的温度下，干燥3～5小时。

干燥处理结束后，向工作系统中输入空气，使工作系统的压力达到0.9～1.1个标准大气压，得到冻干粉剂的添加剂。

以上述方法制备的添加剂的冻干粉剂，制备过程中对组分的活性损耗少，冻干粉剂质量稳定性高、具有良好的复溶性，用无菌水复溶后，可用于间充质干细胞培养、扩增和传代。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下表1中示出了若干实施例中添加剂涉及试剂的来源及工作浓度：

实施例1

本实施例提供一种基础培养基，基础培养基的制备步骤如下：

将表2中氨基酸各组分、表3中维生素各组分、表4中无机盐各组分、表5中各脂类组分，以及表6中其他组分溶解于1L注射用水，充分溶解后混匀，过滤，得到基础培养基。

基础培养基：17.4g；1L

表2氨基酸

试剂名称	工作浓度(mg/L)	试剂名称	工作浓度(mg/L)
				甘氨酸	26.25	亮氨酸	111.45
丙氨酸	13.35	赖氨酸	163.75
				精氨酸	273.9	蛋氨酸	32.34
天冬酰胺	20.7	苯丙氨酸	68.48
				天门冬氨酸	19.95	脯氨酸	28.75
半胱氨酸	17.56	丝氨酸	36.75
				胱氨酸	55.29	苏氨酸	101.05
谷氨酸	22.05	色氨酸	19.22
				谷氨酰胺	265	酪氨酸	91.79
组氨酸	73.48	缬氨酸	99.65
				异亮氨酸	106.87

表3维生素

试剂名称	工作浓度(mg/L)	试剂名称	工作浓度(mg/L)
				生物素	0.0035	盐酸吡哆醇	3
氯化胆碱	9.98	核黄素	0.319
				泛酸钙	3.24	盐酸硫胺素	3.17
叶酸	3.65	维生素B<sub>12</sub>	0.68
				烟酰胺	3.02	肌醇	14.6

表4无机盐

试剂名称	工作浓度(mg/L)	试剂名称	工作浓度(mg/L)
				氯化钙	116.6	氯化钾	311.8
硫酸铜	0.0013	碳酸氢钠	1200
				硝酸铁	0.05	氯化钠	6995.5
硫酸亚铁	0.417	磷酸氢二钠	71.02
				氯化镁	28.64	磷酸氢钠	62.5
硫酸镁	48.84	硫酸锌	0.432

表5脂类

试剂名称	工作浓度(mg/L)	试剂名称	工作浓度(mg/L)
				花生四烯酸	0.002	棕榈油酸	0.01
胆固醇	0.22	F-68	90
				肉豆蔻酸	0.01	硬脂酸	0.01
油酸	0.01	吐温80	2.2
				棕榈酸	0.01

表6其它

试剂名称	工作浓度(mg/L)	试剂名称	工作浓度(mg/L)
				葡萄糖	3151	胸苷	0.365
次黄嘌呤	2.39	HEPES	3574.5
				丙酮酸钠	55	Phenol Red	8.1

实施例2

按照表7中提供的组分制备无血清培养基的添加剂，添加剂具体为冻干粉剂。添加剂的制备方法包括如下步骤：

(1)分别溶解表7中第一组分、第二组分和第三组分，混合三类组分的溶解液，充分混匀后过滤

(2)预冻：箱内温度降至-45℃，保持3小时

(3)升华：将冷凝器的温度降到-55℃以下，对整个系统抽真空；

控制真空度在10pa以下，隔板温度控制在25℃，升华干燥24小时。

(4)干燥：提高板层温度至7℃，干燥5小时；

(5)冷冻干燥完成后，往冻干箱中输入混合气体，使箱内压力达到期1.1个标准大气压，然后出塞，出箱。

表7

实施例3

本实施例提供一种无血清培养基的制备方法，具体步骤如下：

将实施例2中制备的冻干粉剂加入到实施例1中制备的基础培养基中，充分溶解后混匀，过滤，得到无血清培养基。

细胞培养效果评价实验

1、脂肪干细胞原代分离培养

每一个T175培养瓶分装脂肪组织为50ml。向T175培养瓶中加入100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。

加入等量新配制的预热的胶原酶I溶液，封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5～10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化60分钟，每隔15分钟剧烈晃动培养瓶5～10秒，直到看起来较为平滑。将消化后的组织用无菌40目滤网分装到50ml的离心管中，室温400g离心10分钟，得到的沉淀即为SVF。离心后，SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。注意：在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g，10分钟离心。离心完毕，小心吸去上清液，不能直接倒掉。吸取时移液管头应该置于离心管的上部以便于彻底的除去油。10ml培养基悬浮细胞，然后将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次室温300g，10分钟离心。

离心后加20ml培养基充分混匀。基于组织块法：根据培养瓶的面积进行细胞种植。按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量。即每100ml脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶。进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞。

平置培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：37℃，二氧化碳体积分数为6％。

原代培养第24小时，进行全量换液。此后每隔3天半量换液，放置二氧化碳培养箱进行培养。

7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70％～80％时，消化收获。

原代细胞收获：在培养瓶中加入消化酶(消化酶为0.125％Trypsin～0.01％EDTA溶液，每75cm²加入2ml消化酶溶液)，消化时间为1.5～2.5min，加入培养基2～3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落,移入50ml离心管中，原培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射-液冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，移液管吹打悬浮后，100目无菌滤网过滤，过滤液收集到50ml离心管中，1000rpm，10min离心洗涤。细胞培养结果如图1所示。

2、脂肪干细胞传代培养

观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数。计数后1000rpm，10min二次离心。去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000～6000个/cm²，即(3.75～4.5)×10⁵个cells/T75，按照4.5×10⁵个cells/T75进行传代。在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息。将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱。条件：37℃，二氧化碳体积分数为6％。培养至细胞融合达85％～90％。传到P3时检测脂肪间充质干细胞表面标记物。细胞培养结果如图2所示。

由图1和图2结果可知，以本申请中无血清培养基对脂肪干细胞进行原代和传代培养，细胞存活率高，且在培养过程中细胞形态不发生改变。

3、以流式细胞仪检测脂肪干细胞的四个阳性指标：CD73，CD90，CD105，HLA-ABC；以流式细胞仪检测脂肪干细胞的四个阴性指标：HLA-G，CD14，CD19，HLA-DR DP DQ。图3-图6分别显示对脂肪干细胞的阳性指标CD73，CD90，CD105，HLA-ABC的检测结果，图7-10分别显示对脂肪干细胞的阴性指标HLA-G，CD14，CD19，HLA-DR DP DQ的检测结果。图3-图10结果可知，本发明的无血清培养剂可以保持ADSCs的特性不发生改变。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞的无血清培养基，其中，所述无血清培养基包括：

基础培养基和无血清培养基的添加剂，所述基础培养基与所述无血清培养基的添加剂的质量比为(5-15)：1；

其中，所述无血清培养基的添加剂包括：含有基础代谢类物质的第一组分、含有细胞因子类物质的第二组分，以及含有氧化还原类物质的第三组分；以所述添加剂的总质量为100％计，所述第一组分为6％-22％，所述第二组分为35％-47％，所述第三组分为43％-47％。

2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其中，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、无机盐和脂类；

优选地，所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述无机盐包括氯化钙、氯化钾、硫酸铜、碳酸氢钠、硝酸铁、氯化钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、氯化镁、磷酸氢钠、硫酸镁、硫酸锌中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述脂类包括花生四烯酸、胆固醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温和F-68中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述维生素包括生物素、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B₁₂、肌醇中的一种或两种以上的组合。

3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其中，所述氨基酸的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：甘氨酸5.25-131.25mg/L，丙氨酸2.67-66.75mg/L，精氨酸54.78-1369.5mg/L，天冬酰胺4.14-103.5mg/L，天门冬氨酸3.99-99.75mg/L，半胱氨酸3.512-87.8mg/L，胱氨酸11.058-276.45mg/L，谷氨酸4.41-110.25mg/L，L-组氨酸14.696-367.4mg/L，异亮氨酸21.374-534.35mg/L，亮氨酸22.29-557.25mg/L，赖氨酸32.75-818.75mg/L，甲硫氨酸6.468-161.7mg/L，苯丙氨酸13.696-342.4mg/L，脯氨酸5.75-143.75mg/L，丝氨酸7.35-183.75mg/L，苏氨酸20.21-505.25mg/L，色氨酸3.844-96.1mg/L，酪氨酸18.358-458.95mg/L，缬氨酸19.93-498.25mg/L，谷氨酰胺100-300mg/L；

所述无机盐的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：氯化钙23.32-583mg/L，硫酸铜0.00026-0.0065mg/L，硝酸铁0.01-0.25mg/L，硫酸亚铁0.0834-2.085mg/L，氯化镁5.728-143.2mg/L，硫酸镁9.768-244.2mg/L，氯化钾62.36-1559mg/L，碳酸氢钠240-6000mg/L，氯化钠1416.1-35402.5mg/L，磷酸氢二钠14.204-355.1mg/L，磷酸氢钠12.5-312.5mg/L，硫酸锌0.0864-2.16mg/L；

所述维生素的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：生物素0.0007-0.0175mg/L，氯化胆碱1.996-49.9mg/L，泛酸钙0.648-16.2mg/L，叶酸0.73-18.25mg/L，烟酰胺0.604-15.1mg/L，盐酸吡哆醇0.6-15mg/L，核黄素0.0638-1.595mg/L，硫胺素0.634-15.85mg/L，维生素B₁₂ 0.136-3.4mg/L，肌醇2.92-73mg/L；

所述脂类的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：花生四烯酸0.0004-0.01mg/L，胆固醇0.044-1.1mg/L，肉豆蔻酸0.002-0.05mg/L，油酸0.002-0.05mg/L，棕榈酸0.002-0.05mg/L，棕榈油酸0.002-0.05mg/L，硬脂酸0.002-0.05mg/L，吐温0.44-11mg/L，F-68 18-82.64mg/L。

4.根据权利要求2或3所述的无血清培养基，其中，所述无血清培养基还包括具有如下所示浓度的组分：葡萄糖1000-5000mg/L，次黄嘌呤2-10mg/L，丙酮酸钠50-100mg/L，胸苷0.2-1mg/L。

5.根据权利要求1-4任一项所述的无血清培养基，其中，所述添加剂的第一组分包括维生素、脂类、L-谷氨酰胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、β-巯基乙醇、地塞米松和氢化可的松中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述第一组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述维生素的浓度为8.3-95mg/L，所述脂类的浓度为18.4-95mg/L，所述L-谷氨酰胺的浓度为100-300mg/L，所述L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为10-100mg/L，所述β-巯基乙醇的浓度为1-10mg/L，所述地塞米松的浓度为1-5ng/ml，所述氢化可的松的浓度为1-5ng/ml。

6.根据权利要求1-5任一项所述的无血清培养基，其中，所述第二组分包括bFGF、EGF、PDGF-BB、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、重组人纤连蛋白和人血清白蛋白中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述第二组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述bFGF的浓度为1-20ng/ml，所述EGF的浓度为1-20ng/ml，所述PDGF-BB的浓度为1-20ng/ml，所述TTR的浓度为1-20ng/ml，所述IGF的浓度为1-20ng/ml，所述VEGF的浓度为1-20ng/ml，所述LIF的浓度为1-20ng/ml，所述HGF的浓度为1-20ng/ml，所述CTGF的浓度为1-20ng/ml，所述β细胞素的浓度为1-10ng/ml，所述IL-8的浓度为1-5ng/ml，所述重组人纤连蛋白的浓度为1-20μg/ml，所述人血清白蛋白的浓度为1-4mg/ml。

7.根据权利要求1-6任一项所述的无血清培养基，其中，所述第三组分包括左旋肉碱、乙醇胺、半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、生育酚、生育酚乙酸酯、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物酶、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和过氧化氢酶中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述第三组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述左旋肉碱的浓度为0.4-10μg/ml，所述乙醇胺的浓度为0.2-5μg/ml，所述半乳糖的浓度为3-45μg/ml，所述腐胺的浓度为3-50μg/ml，所述亚硒酸钠的浓度为0.003-0.07μg/ml，所述皮质酮的浓度为0.004-0.1μg/ml，所述亚油酸的浓度为0.2-5μg/ml，所述亚麻酸的浓度为0.2-5μg/ml，所述硫辛酸的浓度为0.009-0.24μg/ml，所述黄体酮的浓度为0.001-0.03μg/ml，所述生育酚的浓度为0.02-0.5μg/ml，所述生育酚乙酸酯的浓度为0.02-0.5μg/ml，所述谷胱甘肽的浓度为0.2-5μg/ml，所述胰岛素的浓度为0.8-20μg/ml，所述超氧化物酶的浓度为0.5-12.5μg/ml，所述转铁蛋白的浓度为1-25μg/ml，所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为0.0004-0.01μg/ml，所述过氧化氢酶的浓度为0.5-12.5μg/ml。

8.根据权利要求1-7任一项所述的无血清培养基，其中，所述无血清培养基的添加剂为浓缩液或所述浓缩液的冻干粉剂。

9.一种根据权利要求1-8任一项所述的无血清培养基的制备方法，其中，包括将所述基础培养基与所述无血清培养基的添加剂混合的步骤。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述无血清培养基的添加剂为冻干粉剂，所述冻干粉剂由所述第一组分、第二组分和第三组分的溶解液混合后冻干得到。

Images