CN112300985A - 一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞增殖效率的增殖培养基及增殖培养方法 - Google Patents

一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞增殖效率的增殖培养基及增殖培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞(Bone marrow‑derived meschymal stem cells,BM‑MSCs)增殖效率的增殖培养基及增殖培养方法，所述培养基包括：氨基酸、维生素、无机盐、碳源、缓冲液和指示剂。本发明的增殖培养基可用于哺乳类动物骨髓间充质干细胞BM‑MSCs临床应用前的大量扩充。采用本发明无异源血清的增殖培养基培养哺乳类动物BM‑MSCs，24小时之内可以获得1010个左右细胞，大于临床细胞治疗通常所需要的剂量109；增殖率高出常规BGjB培养基70倍左右；采用本发明增殖培养方法培养的哺乳类动物骨髓间充质干细胞保持了完整的干细胞性和更优的增殖活力，从数量和质量上均能满足临床要求。

Description

一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞增殖效率的增殖 培养基及增殖培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞增殖效率的增殖培养基及增殖培养方法。
背景技术
国内外研究证明，体外培养获取的哺乳类动物BM-MSCs具有多向或跨胚层分化潜能，可分化为多种用于修复的功能细胞，例如分化为肝、胆、胰、肺、肾、软骨、脑、视网膜、肠、脾、血液、皮肤等功能细胞。说明BM-MSCs在适当培养环境下，可被诱导多向功能分化，进而促进修复再生。目前已有临床案例证明，BM-MSCs可以被移植到患者体内，成功修复损伤性疾病，如用于诱导骨缺损再生[1]和梗塞心肌再生[3]等，尤其在治疗移植物抗宿主反应(Graft-Versus-Host-Reaction GVHR)方面效果甚佳[4]。由于BM-MSCs具有易培养，免疫调节和促进内源性修复等特性，故成为治疗各种疾病的优选细胞。在细胞治疗和组织工程上拥有越来越广阔的前景。然而，目前学术界体外培养BM-MSCs面临的难题主要有2点：(1)动 物源性血清的必须性。目前学术界体外培养BM-MSCs均需要胎牛或小牛血清((FCS或FBS)，而小(肽)牛血清为动物源性，其异源和未知毒性限制了临床应用；(2)临床所需BM-MSCs的 高剂量性。BM-MSCs临床治疗通常需要约109个左右高剂量细胞,体外培养一次性获取此剂量成本较高。如果采用干细胞库中冻存复苏的BM-MSCs，因需含特殊成分培养基保持细胞活性和后期使用所需剂量，成本更高。因此，如何克服动物异源性血清影响，改进BM-MSCs培养方法，提高其扩增效率和同时保持其良好干性，是达到提升临床疗效的关键。
培养基是构成细胞体外培养环境的重要因素，虽然基础培养基加适量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞包括BM-MSCs培养的要求，但由于上述毒副作用，限制了临床应用。无血清培养基是不需要添加血清即可维持干细胞体外长时间生长的合成培养基，其工作基础是用合适的无害有效成分如激素、营养物和促贴壁物质的组合置换培养基的成分。例如在无血清培养基中添加细胞因子如IL-3,SCF，Fit3-L,IL-6等[1，2],营养蛋白如白蛋白，人转铁蛋白等[3，4]和血小板替代品[5]等技术。在某些培养方案中，细胞直接进入无血清培养，可以消除来自血清的不均一性。
在BM-MSCs的快速扩增和扩增效率等方面，寻找更合适的培养基及培养方法，达到BM-MSCs数量级增殖的要求，是医疗科研工作者们一直力求突破的关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种维持良好生长、抑制分化(走向衰老)、维持干性、促进快速大量扩增和快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)增殖率的增殖培养基及增殖培养方法。
为达到上述目的，本发明提供一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞BM-MSCs增殖率的增殖培养基(ZEzh培养基),所述培养基包括：氨基酸、维生素、无机盐、碳源、缓冲液和指示剂，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐，L-天冬酰胺-H2O，半胱氨酸，L-组氨酸盐酸盐-H2O，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸盐酸盐，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，脯氨酸，L-丝氨酸，苏氨酸，L-色氨酸，酪氨酸和缬氨酸；所述维生素包括：氯化胆碱，D-泛酸钙，叶酸，烟酰胺，盐酸吡醛，核黄素，盐酸硫胺素，维生素B12和肌醇；所述无机盐包括：无水氯化钙，硝酸铁，无水氯化镁，氯化钾，碳酸氢钠，氯化钠，磷酸二氢钠和硫酸锌；所述碳源包括：葡萄糖和丙酮酸钠，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液；所述指示剂为：酚红。
进一步，所述氨基酸包括：甘氨酸27-33mg/L、丙氨酸1-4mg/L、L-精氨酸盐酸盐75-92mg/L，L-天冬酰胺-H2O 0.80-0.86mg/L，半胱氨酸30-33mg/L，L-组氨酸盐酸盐-H2O 41-45mg/L，L-异亮氨酸101-109mg/L，L-亮氨酸102-107mg/L，L-赖氨酸盐酸盐142-148mg/L，L-蛋氨酸27-33mg/L，L-苯丙氨酸62-68mg/L，脯氨酸7.02-7.82/L，L-丝氨酸40-45mg/L，苏氨酸92-97mg/L，L-色氨酸14-18mg/L，酪氨酸70-74mg/L和缬氨酸91-96mg/L；所述维生素包括：氯化胆碱3-5mg/L，D-泛酸钙3-6mg/L，叶酸3-6mg/L，烟酰胺3-7mg/L，盐酸吡醛3-7mg/L，核黄素0.3-0.7mg/L，盐酸硫胺素3-6mg/L，维生素B12 0.0065-0.0071mg/L和肌醇6.6-7.4mg/L；所述无机盐包括：无水氯化钙198-202mg/L，硝酸铁0.05-0.15mg/L，无水氯化镁75.3-78.1mg/L，氯化钾398-404mg/L，碳酸氢钠2198-2206mg/L，氯化钠3992-4006mg/L，磷酸二氢钠121-130mg/L和硫酸锌0.191-0.196mg/L；所述碳源包括：葡萄糖4490-4504mg/L和丙酮酸钠23-27mg/L，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液2593-2604mg/L；所述指示剂为：酚红7.8-8.5mg/L。
进一步，所述氨基酸包括：甘氨酸30mg/L、丙氨酸2mg/L、L-精氨酸盐酸盐84mg/L，L-天冬酰胺-H2O 0.83mg/L，半胱氨酸31.5mg/L，L-组氨酸盐酸盐-H2O 42.0mg/L，L-异亮氨酸105mg/L，L-亮氨酸105mg/L，L-赖氨酸盐酸盐146mg/L，L-蛋氨酸30mg/L，L-苯丙氨酸66mg/L，脯氨酸7.76/L，L-丝氨酸42mg/L，苏氨酸95mg/L，L-色氨酸16mg/L，酪氨酸72mg/L和缬氨酸94mg/L；所述维生素包括：氯化胆碱4mg/L，D-泛酸钙4mg/L，叶酸4mg/L，烟酰胺4mg/L，盐酸吡醛4mg/L，核黄素0.4mg/L，盐酸硫胺素4mg/L，维生素B12 0.0068mg/L和肌醇7.2mg/L；所述无机盐包括：无水氯化钙200mg/L，硝酸铁0.1mg/L，无水氯化镁77.3mg/L，氯化钾400mg/L，碳酸氢钠2200mg/L，氯化钠4000mg/L，磷酸二氢钠125mg/L和硫酸锌0.194mg/L；所述碳源包括：葡萄糖4500mg/L和丙酮酸钠25mg/L，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液2600mg/L；所述指示剂为：酚红8.1mg/L。
本发明还提供所述增殖培养基的配制方法,所述配制方法包括：取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上述中任一项培养基，调节pH值至7.0～7.4，即得。
本发明还提供所述增殖培养基用于哺乳类动物BM-MSCs的培养方法，所述培养方法包括：1)哺乳类动物骨髓间充质干细胞的获取；2)原代培养；3)传代培养；4)增殖培养；所述增殖培养是以1-1.5x106的接种密度将传代中的干细胞接种于所述增殖培养基中，在37℃，5％CO2培养箱中进行24小时增殖培养。
本发明的有益效果在于：
1.本发明的增殖培养基可用于哺乳类动物BM-MSCs培养，生长良好，维持干性和解除动物源性(FCS、FBS)培养的BM-MSCs临床应用安全性的担忧。
2.本发明的增殖培养基可用于哺乳类动物BM-MSCs临床应用前短时间(24小时)内的大量扩充。采用上述无异源血清的增殖培养基培养哺乳类动物BM-MSCs，短时间内(24小时之内)可以获得常规BGjb-FCS培养基的70倍左右。
3.采用本发明增殖培养方法培养的哺乳类动物BM-MSCs从数量和质量上均能够满足临床要求。
4.在本发明无血清的增殖培养基中也可以较好维持BM-MSCs生长、抑制其分化(走向衰老)、维持干细胞特性和促进快速大量扩增,提升BM-MSCs数量级和临床疗效。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1：在常规培养基(BGjb+10％FCS培养基,Gibco)中，从骨髓中原代(P0)到6代(P6)培养的BM-MSCs；
图2：在本发明所述的增殖培养基中24小时培养哺乳类动物BM-MSCs得到的照片；图中：实验1和实验2是重复的两次实验；
图3：同样的哺乳类动物P2-P4代BM-MSCs在BGjb+10％FBS培养基和本发明增殖培养基(ZEzh)中细胞数量及增殖率的对比；
图4：同样的哺乳类动物P2-P4代BM-MSCs分别培养在BGjb+10％FBS培养基和本发明增殖培养基中细胞增殖活力测定结果对比；
图5：诱导验证经本发明增殖培养的哺乳类动物P2-P4代骨髓间充质干细胞BM-MSCs具有成骨、成脂和成软骨分化潜能力；
图中：A指示BGjb+10％FBS培养基；B指示本发明增殖培养基(ZEzh)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1：配制BGJb培养基：
按照如下成分含量：甘氨酸(800mg/L)、L-丙氨酸(250mg/L)、L-精氨酸(175mg/L)，L-天冬氨酸(150mg/L)，L-半胱氨酸(101mg/L)，L-谷氨酰胺(200mg/L)，L-组氨酸(150mg/L)，L-异亮氨酸(30mg/L)，L-亮氨酸(50mg/L)，L-赖氨酸(240mg/L)，L-蛋氨酸(50mg/L)，L-苯丙氨酸(50mg/L)，L-脯氨酸(400mg/L)，L-丝氨酸(200mg/L)，L-苏氨酸(75mg/L)，L-色氨酸(40mg/L)，L-酪氨酸二钠盐(58mg/L)和L-缬氨酸(65mg/L)；维生素C(50mg/L),生物素(0.2mg/L)氯化胆碱(50mg/L)，泛酸钙(0.2mg/L)，DL-α-生育酚(1.0mg/L)叶酸(0.2mg/L)，烟酰胺(20mg/L)，对氨基苯甲酸(2.0mg/L)盐酸吡哆醛(0.2mg/L)，核黄素(0.2mg/L)，盐酸硫胺素(4mg/L)，维生素B12(0.04mg/L)和肌醇(0.2mg/L)；硫酸镁(98mg/L)氯化钾(400mg/L)，磷酸二氢钾(160mg/L)，碳酸氢钠(3500mg/L)，氯化钠(5300mg/L)和一水磷酸二氢钠(90mg/L)；所述碳源包括：D-葡萄糖(10000mg/L)；其他成分包括：乳酸钙(555mg/L)，乙酸钠(50mg/L)；所述指示剂为：酚红(20mg/L)。
取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.0-7.4，即得。
实施例2：配制增殖培养基(ZEzh培养基)
培养基成分为：甘氨酸(30mg/L)、丙氨酸(2mg/L)、L-精氨酸盐酸盐(84mg/L)，L-天冬酰胺-H2O(0.83mg/L)，半胱氨酸(31.5mg/L)，L-组氨酸盐酸盐-H2O(42.0mg/L)，L-异亮氨酸(105mg/L)，L-亮氨酸(105mg/L)，L-赖氨酸盐酸盐(146mg/L)，L-蛋氨酸(30mg/L)，L-苯丙氨酸(66mg/L)，脯氨酸(7.76/L)，L-丝氨酸(42mg/L)，苏氨酸(95mg/L)，L-色氨酸(16mg/L)，酪氨酸(72mg/L)和缬氨酸(94mg/L)；氯化胆碱(4mg/L)，D-泛酸钙(4mg/L)，叶酸(4mg/L)，烟酰胺(4mg/L)，盐酸吡醛(4mg/L)，核黄素(0.4mg/L)，盐酸硫胺素(4mg/L)，维生素B12(0.0068)和肌醇(7.2)；氯化钙(无水)(200mg/L)，硝酸铁(0.1mg/L)，氯化镁(无水)(77.3mg/L)，氯化钾(400mg/L)，碳酸氢钠(2200mg/L)，氯化钠(4000mg/L)，磷酸二氢钠(125mg/L)和硫酸锌(0.194mg/L)；所述碳源包括：葡萄糖(4500mg/L)和丙酮酸钠(25mg/L)，所述缓冲液为：HEPES(缓冲液)(2600mg/L)；所述指示剂为：酚红(8.1mg/L)。
取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.0～7.4，即得。
实施例3：哺乳类动物BM-MSCs的获取：
大(猪等)小(大、小鼠)动物骨髓BM-MSCs的获取：
C57BL/6纯系小鼠脱臼处死后，75％乙醇浸泡1-3min后，无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器(配4.5号针头)抽取磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。依次用7号针头和4.5号针头(或依次过21、23、25号)反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培养基或PBS充分洗涤(500g离心5min或180g离心10min)2次，去上清，用10％FBS的培养基悬浮细胞(用0.83％氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞)。
人类骨髓BM-MSCs的获取：
抽取捐献者骨髓50-100ml(或正常人手术肋骨取骨髓3-5ml)，每毫升骨髓加100u肝素抗凝，充分混匀后，保存于4℃冰箱，24小时内分离骨髓MNC。骨髓先加入等量PBS或Hanks液(或培养液)混匀后，以1份淋巴细胞分离液上面加2份稀释骨髓的比例，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上(密度1.077)，水平离心机20℃条件下500g(2000r/min)，离心25-30分钟。从界面上取出的MNC用PBS液洗涤2-3次后，加适量培养液计数。
实施例4：原代培养
实施例2中获取的骨髓MNC，数细胞数量，达到106-107/ml后即进行原代培养，按5×106/ml浓度接种于50ml培养瓶中(1×106/cm2培养瓶)，每瓶含5ml L-DMEM+20％FCS完全培养液。在体积分数为5％的CO2和37℃条件下静止培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每3-4d半量换液1次，10-12d细胞达90％融合时进行传代。
实施例5：传代培养(参见图1)
传代培养时先全部吸出培养液后，用无Ca2+、Mg2+PBS液洗涤二次，加入37℃预热的0.25％(2.5g/L，0.25％)胰蛋白酶(含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制)消化3-5分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶继续消化，倒置显微镜下观察，细胞开始皱缩时(细胞开始变圆)加入完全培养液(3ml左右)终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中，1500r/min离心10分钟后弃上清，再用PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。将细胞再悬浮于培养液中，按2-5×105/ml再次接种传代于新的培养瓶中。当这些细胞生长接近融合层时，即得到BM-MSCs。以此类推传至3-8代。
实施例6：增殖培养(参见图2)
传代培养的的哺乳类动物BM-MSCs，以2-5×105/ml的接种密度接种于本发明无血清增殖培养基(ZEzh)中，在37℃，5％CO2中培养24小时。
试验例1：BM-MSCs分组及干预:
将p2-p4代在BGjb+10％FBS培养基中培养的BM-MSCs，采用胰酶/EDTA消化后分为2组：(1)对照组：BM-MSCs+BGjB+10％FBS培养基；(2)实验组：BM-MSCs+本发明无血清增殖培养基(ZEzh)。
结论：本发明增殖培养获得的BM-MSCs数量是对照组的70倍左右。(参见图3)
试验例2：经本发明增殖培养的骨髓间充质干细胞增殖活力测定:
哺乳类动物P2-P4代BM-MSCs分别培养在BGB+10％FBS培养基和本发明增殖培养基中细胞增殖活力测定结果对比；
结论：在本发明增殖培养中培养的BM-MSCs增殖活力明显高于对照组(BGjB+10％FBS)培养基。(参见图4)
试验例3：经本发明增殖培养后的骨髓间充质干细胞诱导验证哺乳类动物骨髓间充质干细胞成骨、成脂、成软骨分化能力：
诱导验证经本发明增殖培养的哺乳类动物P2-P4代骨髓间充质干细胞BM-MSCs具有成骨、成脂和成软骨的分化潜能(参见图5)
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞BM-MSCs增殖率的增殖培养基,其特征在于，所述培养基包括：氨基酸、维生素、无机盐、碳源、缓冲液和指示剂，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐，L-天冬酰胺-H2O，半胱氨酸，L-组氨酸盐酸盐-H2O，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸盐酸盐，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，脯氨酸，L-丝氨酸，苏氨酸，L-色氨酸，酪氨酸和缬氨酸；所述维生素包括：氯化胆碱，D-泛酸钙，叶酸，烟酰胺，盐酸吡醛，核黄素，盐酸硫胺素，维生素B12和肌醇；所述无机盐包括：无水氯化钙，硝酸铁，无水氯化镁，氯化钾，碳酸氢钠，氯化钠，磷酸二氢钠和硫酸锌；所述碳源包括：葡萄糖和丙酮酸钠，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液；所述指示剂为：酚红。
2.按照权利要求1所述的增殖培养基,其特征在于，所述氨基酸包括：甘氨酸27-33mg/L、丙氨酸1-4mg/L、L-精氨酸盐酸盐75-92mg/L，L-天冬酰胺-H2O 0.80-0.86mg/L，半胱氨酸30-33mg/L，L-组氨酸盐酸盐-H2O 41-45mg/L，L-异亮氨酸101-109mg/L，L-亮氨酸102-107mg/L，L-赖氨酸盐酸盐142-148mg/L，L-蛋氨酸27-33mg/L，L-苯丙氨酸62-68mg/L，脯氨酸7.02-7.82/L，L-丝氨酸40-45mg/L，苏氨酸92-97mg/L，L-色氨酸14-18mg/L，酪氨酸70-74mg/L和缬氨酸91-96mg/L；所述维生素包括：氯化胆碱3-5mg/L，D-泛酸钙3-6mg/L，叶酸3-6mg/L，烟酰胺3-7mg/L，盐酸吡醛3-7mg/L，核黄素0.3-0.7mg/L，盐酸硫胺素3-6mg/L，维生素B12 0.0065-0.0071mg/L和肌醇6.6-7.4mg/L；所述无机盐包括：无水氯化钙198-202mg/L，硝酸铁0.05-0.15mg/L，无水氯化镁75.3-78.1mg/L，氯化钾398-404mg/L，碳酸氢钠2198-2206mg/L，氯化钠3992-4006mg/L，磷酸二氢钠121-130mg/L和硫酸锌0.191-0.196mg/L；所述碳源包括：葡萄糖4490-4504mg/L和丙酮酸钠23-27mg/L，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液2593-2604mg/L；所述指示剂为：酚红7.8-8.5mg/L。
3.按照权利要求2所述的增殖培养基,其特征在于，所述氨基酸包括：甘氨酸30mg/L、丙氨酸2mg/L、L-精氨酸盐酸盐84mg/L，L-天冬酰胺-H2O 0.83mg/L，半胱氨酸31.5mg/L，L-组氨酸盐酸盐-H2O 42.0mg/L，L-异亮氨酸105mg/L，L-亮氨酸105mg/L，L-赖氨酸盐酸盐146mg/L，L-蛋氨酸30mg/L，L-苯丙氨酸66mg/L，脯氨酸7.76/L，L-丝氨酸42mg/L，苏氨酸95mg/L，L-色氨酸16mg/L，酪氨酸72mg/L和缬氨酸94mg/L；所述维生素包括：氯化胆碱4mg/L，D-泛酸钙4mg/L，叶酸4mg/L，烟酰胺4mg/L，盐酸吡醛4mg/L，核黄素0.4mg/L，盐酸硫胺素4mg/L，维生素B12 0.0068mg/L和肌醇7.2mg/L；所述无机盐包括：无水氯化钙200mg/L，硝酸铁0.1mg/L，无水氯化镁77.3mg/L，氯化钾400mg/L，碳酸氢钠2200mg/L，氯化钠4000mg/L，磷酸二氢钠125mg/L和硫酸锌0.194mg/L；所述碳源包括：葡萄糖4500mg/L和丙酮酸钠25mg/L，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液2600mg/L；所述指示剂为：酚红8.1mg/L。
4.按照权利要求1所述增殖培养基的配制方法,其特征在于，取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如权利要求1-3中任一项所述，调节pH值至7.0-7.4，即得。
5.采用权利要求1-3所述增殖培养基的哺乳类动物BM-MSCs培养方法，所述培养方法包括：1)哺乳类动物骨髓间充质干细胞的获取；2)原代培养；3)传代培养；4)增殖培养；其特征在于，所述增殖培养是以1-1.5x106的接种密度将传代中的干细胞接种于所述增殖培养基中，在37℃，5％CO2培养箱中进行24小时增殖培养。
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