CN110117573A - 一种无血清细胞培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，具体公开一种无血清细胞培养基及其应用，培养基中各组分含量为：碳水化合物、氨基酸、核苷酸、维生素、无机盐、添加物和去离子水。本发明的无血清细胞培养基组分明确、配方成本低，细胞增殖速度快、活性高，得到的细胞产物产量和纯度高，可完全替代传统含血清的细胞培养基。

Description

一种无血清细胞培养基及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种无血清细胞培养基及其应用。
背景技术
细胞培养技术已经经历了几十年的发展，其广泛应用于生物、医疗和药品等技术领域，具有较高的应用价值，且随着产品分类越来越细化，对细胞培养基的分类和要求也越来越精细，其中通过细胞培养来获得蛋白药物和抗体已经成为医药行业发展的重要方向，而细胞培养基的选择不仅影响细胞的生长和增殖速度，还影响着细胞产物的合成和分离。目前细胞培养用的培养基都普遍添加有动物血清，而动物血清中的成分复杂并且含有外源IgG，导致目标产物分离纯化困难，对产物的品质产生影响，且增加目标产物的生产成本。
发明内容
针对现有细胞培养基细胞增殖速度慢、目标产物合成效率低以及因添加动物血清影响目标产物品质等问题，本发明提供一种无血清细胞培养基及其应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基，培养基中各组分含量为：2000-5500mg/L的碳水化合物、300-4800mg/L的氨基酸、0.1-55mg/L的核苷酸、8-150mg/L维生素、1060-23000mg/L无机盐、2100-11200mg/L添加物和去离子水；
所述添加物包括酚红、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸、重组胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺。
相对于现有技术，本发明提供的无血清细胞培养基组分明确、配方成本低，细胞培养过程中，细胞体外增殖速度快、活性高，得到的细胞产物产量和纯度高，可完全替代传统含血清的细胞培养基，同时又避免了因血清的加入而导致得到的细胞产物无法分离进而影响产物品质及增加产物的分离成本。
添加剂中重组胰岛素、转铁蛋白和乙醇胺结合配合添加物中的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和亚硒酸钠可代替培养基中血清提供的营养物质，其细胞培养中的细胞增殖效果和产物合成效率甚至优于血清的加入。
优选地，所述碳水化合物中包含的组分及各组分在培养基中的含量为：D-葡萄糖2000-5000mg/L、丙酮酸钠5-300mg/L、亚油酸0.01-20mg/L。
D-葡萄糖作为主要的碳源，配合加入少量的丙酮酸钠和亚油酸，可以加快细胞的增殖速度，保持细胞的生长活性。
优选地，所述氨基酸包含的种类及各种类在培养基中的含量为：甘氨酸10-100mg/L、L-丙氨酸1-20mg/L、L-精氨酸盐酸盐10-500mg/L、L-天冬酰胺1-20mg/L、L-天冬氨酸1-20mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐10-100mg/L、L-胱氨酸10-100mg/L、L-谷氨酸1-20mg/L、L-谷氨酰胺100-2000mg/L、L-组氨酸盐酸盐10-100mg/L、L-异亮氨酸20-200mg/L、L-亮氨酸20-200mg/L、L-赖氨酸盐酸盐20-200mg/L、L-蛋氨酸10-100mg/L、L-苯丙氨酸20-200mg/L、L-脯氨酸10-100mg/L、L-丝氨酸10-100mg/L、L-苏氨酸20-200mg/L、L-色氨酸1-30mg/L、L-酪氨酸二钠盐20-200mg/L、L-缬氨酸20-200mg/L。
上述氨基酸的种类和含量的设置，可使细胞在培养基中高效合成活性产物。
优选地，所述核苷酸包含的种类及各种类在培养基中的含量为：腺嘧啶脱氧核苷酸0.001-1mg/L、次黄嘌呤钠0.1-50mg/L。
优选地，所述维生素包含的种类及各种类在培养基中的含量为：生物素0.001-1mg/L、氯化胆碱1-20mg/L、D-泛酸钙1-20mg/L、叶酸1-20mg/L、烟酰胺1-20mg/L、盐酸吡哆醇1-20mg/L、核黄素0.001-1mg/L、盐酸硫胺素1-20mg/L、维生素B12 0.001-1mg/L、肌醇1-20mg/L。
优选地，所述无机盐包含的组分及各组分在培养基中的含量为：氯化钙10-500mg/L、硫酸铜0.001-1mg/L、硝酸铁0.001-1mg/L、硫酸亚铁0.001-1mg/L、氯化镁10-500mg/L、硫酸镁10-500mg/L、氯化钾10-500mg/L、碳酸氢钠500-10000mg/L、氯化钠500-10000mg/L、磷酸氢二钠10-500mg/L、磷酸二氢钠10-500mg/L、硫酸锌0.001-1mg/L。
优选地，所述添加物中各组分在培养基中的含量为：酚红1-50mg/L、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸2000-8000mg/L、重组胰岛素1-50mg/L、转铁蛋白1-50mg/L、牛血清白蛋白50-3000mg/L、亚硒酸钠1-50μg/L、乙醇胺1-30mg/L。
本发明还提供所述的无血清细胞培养基在促进细胞产生单克隆抗体中的应用。
相对于现有技术，本发明提供的无血清细胞培养基在瘤细胞培养过程中，可保证瘤细胞增殖的稳定性，促进瘤细胞短时间内产生大量单克隆抗体。
优选地，所述无血清细胞培养基用于培养骨髓瘤细胞以促进其产生单克隆抗体。
优选地，所述无血清细胞培养基用于培养杂交瘤细胞以促进其产生单克隆抗体。
附图说明
图1是本发明实施例1的无血清细胞培养基培养5H2细胞过程中培养不同天数检测的抗体浓度；
图2是本发明实施例2的无血清细胞培养基培养5H2细胞过程中培养不同天数检测的抗体浓度；
图3是本发明实施例3的无血清细胞培养基培养5H2细胞过程中培养不同天数检测的抗体浓度；
图4是对比例1中H-SFM无血清细胞培养基培养5H2细胞过程中培养不同天数检测的抗体浓度。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
配置1L无血清细胞培养基，分别加入2000mg的碳水化合物、300mg的氨基酸、0.1mg的核苷酸、8mg维生素、1060mg无机盐、2100mg添加物和余量的去离子水。
其中碳水化合物中D-葡萄糖2000mg、丙酮酸钠5mg、亚油酸0.01mg；
氨基酸中甘氨酸10mg、L-丙氨酸1mg、L-精氨酸盐酸盐10mg、L-天冬酰胺1mg、L-天冬氨酸1mg、L-半胱氨酸盐酸盐10mg、L-胱氨酸10mg、L-谷氨酸1mg、L-谷氨酰胺100mg、L-组氨酸盐酸盐10mg、L-异亮氨酸20mg、L-亮氨酸20mg、L-赖氨酸盐酸盐20mg、L-蛋氨酸10mg、L-苯丙氨酸20mg、L-脯氨酸10mg、L-丝氨酸10mg、L-苏氨酸20mg、L-色氨酸1mg、L-酪氨酸二钠盐20mg、L-缬氨酸20mg；
核苷酸中腺嘧啶脱氧核苷酸0.001mg、次黄嘌呤钠0.1mg；
维生素中生物素1mg/L、氯化胆碱1mg、D-泛酸钙1mg、叶酸1mg、烟酰胺1mg、盐酸吡哆醇1mg、核黄素0.001mg、盐酸硫胺素1mg、维生素B120.001mg、肌醇1mg；
无机盐中氯化钙10mg、硫酸铜0.001mg、硝酸铁0.001mg、硫酸亚铁0.001mg、氯化镁10mg、硫酸镁10mg、氯化钾10mg、碳酸氢钠500mg、氯化钠500mg、磷酸氢二钠10mg、磷酸二氢钠10mg、硫酸锌0.001mg；
添加物中酚红1mg、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸2000mg、重组胰岛素1mg、转铁蛋白50mg、牛血清白蛋白50mg、亚硒酸钠1μg、乙醇胺1mg。
将上述各组分混合均匀并充分溶解，得到无血清细胞培养基。
将生长状态良好、处于对数期的杂交瘤细胞株(5H2)以3×105个/ml接种浓度分别接种到实施例1的无血清细胞培养基中，初始接种体积为100ml，培养于37℃、5％CO2培养箱中，2天后补充培养基50ml，4天后补充培养基50ml，7天收取全部培养基，每天取样用细胞计数仪进行细胞数量和活力的分析，同时测定培养基上清中抗体含量。
其中，抗体含量的测定方法为：
(1)准备待测样品：用缓冲溶液将待测样品稀释200倍，每孔加入100μl，37℃放置45min；
(2)加酶标二抗：每孔加入100μl的l:10000稀释的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG，37℃放置30min；
(3)显色：每孔加底物显色液100μl，37℃保温避光反应15min；
(4)终止反应：每孔加入50μl终止液；
(5)测定OD450nm值：用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值，根据标准曲线来确定待测样品的抗体含量，培养不同天数得到的抗体浓度折线图如图1所示。
检测具体结果如下表所示：
实施例2
配置1L无血清细胞培养基，分别加入2610mg的碳水化合物、2100mg的氨基酸、25.5mg的核苷酸、71.5mg维生素、11200mg无机盐、7090mg添加物和余量的去离子水。
其中碳水化合物中D-葡萄糖2500mg、丙酮酸钠100mg、亚油酸10mg；
氨基酸中甘氨酸50mg、L-丙氨酸10mg、L-精氨酸盐酸盐50mg、L-天冬酰胺10mg、L-天冬氨酸10mg、L-半胱氨酸盐酸盐50mg、L-胱氨酸50mg、L-谷氨酸10mg、L-谷氨酰胺1000mg、L-组氨酸盐酸盐50mg、L-异亮氨酸100mg、L-亮氨酸100mg、L-赖氨酸盐酸盐50mg、L-蛋氨酸50mg、L-苯丙氨酸100mg、L-脯氨酸50mg、L-丝氨酸50mg、L-苏氨酸100mg、L-色氨酸10mg、L-酪氨酸二钠盐100mg、L-缬氨酸100mg；
核苷酸中腺嘧啶脱氧核苷酸0.5mg、次黄嘌呤钠25mg；
维生素中生物素0.5mg/L、氯化胆碱10mg、D-泛酸钙10mg、叶酸10mg、烟酰胺10mg、盐酸吡哆醇10mg、核黄素0.5mg、盐酸硫胺素10mg、维生素B12 0.5mg、肌醇10mg；
无机盐中氯化钙200mg、硫酸铜0.5mg、硝酸铁0.5mg、硫酸亚铁0.5mg、氯化镁200mg、硫酸镁200mg、氯化钾200mg、碳酸氢钠5000mg、氯化钠5000mg、磷酸氢二钠200mg、磷酸二氢钠200mg、硫酸锌0.5mg；
添加物中酚红25mg、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸5000mg、重组胰岛素25mg、转铁蛋白25mg、牛血清白蛋白2000mg、亚硒酸钠25μg、乙醇胺15mg。
将上述各组分混合均匀并充分溶解，得到无血清细胞培养基。
用实施例1中的细胞培养方法和检测方法对实施例2得到的无血清细胞培养基培养的杂交瘤细胞株(5H2)的细胞活性及培养基中抗体含量进行检测，培养不同天数得到的抗体浓度折线图如图2所示，检测具体结果如下表所示：
发酵时间d 细胞数10<sup>5</sup>个/ml 细胞活率 抗体浓度ug/ml
0 3 93.71％ 0
1 5.81 89.40％ 5.17
2 12.11 88.79％ 12.36
3 12.95 87.44％ 14.88
4 18.97 84.01％ 21.43
5 19.09 74.15％ 29.92
6 20.07 65.44％ 40.96
7 19.86 54.27％ 59.16
实施例3
配置1L无血清细胞培养基，分别加入5320mg的碳水化合物、4710mg的氨基酸、51mg的核苷酸、143mg维生素、23000mg无机盐、11130mg添加物和余量的去离子水。
其中碳水化合物中D-葡萄糖5000mg、丙酮酸钠300mg、亚油酸20mg；
氨基酸中甘氨酸100mg、L-丙氨酸20mg、L-精氨酸盐酸盐500mg、L-天冬酰胺20mg、L-天冬氨酸20mg、L-半胱氨酸盐酸盐100mg、L-胱氨酸100mg、L-谷氨酸20mg、L-谷氨酰胺2000mg、L-组氨酸盐酸盐100mg、L-异亮氨酸200mg、L-亮氨酸200mg、L-赖氨酸盐酸盐200mg、L-蛋氨酸100mg、L-苯丙氨酸200mg、L-脯氨酸100mg、L-丝氨酸100mg、L-苏氨酸200mg、L-色氨酸30mg、L-酪氨酸二钠盐200mg、L-缬氨酸200mg；
核苷酸中腺嘧啶脱氧核苷酸1mg、次黄嘌呤钠50mg；
维生素中生物素1mg/L、氯化胆碱20mg、D-泛酸钙20mg、叶酸20mg、烟酰胺20mg、盐酸吡哆醇20mg、核黄素1mg、盐酸硫胺素20mg、维生素B12 1mg、肌醇20mg；
无机盐中氯化钙500mg、硫酸铜1mg、硝酸铁1mg、硫酸亚铁1mg、氯化镁500mg、硫酸镁500mg、氯化钾500mg、碳酸氢钠10000mg、氯化钠10000mg、磷酸氢二钠500mg、磷酸二氢钠500mg、硫酸锌1mg；
添加物中酚红50mg、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸8000mg、重组胰岛素50mg、转铁蛋白1mg、牛血清白蛋白3000mg、亚硒酸钠50μg、乙醇胺30mg。
将上述各组分混合均匀并充分溶解，得到无血清细胞培养基。
用实施例1中的细胞培养方法和检测方法对实施例2得到的无血清细胞培养基培养的杂交瘤细胞株(5H2)的细胞活性及培养基中抗体含量进行检测，培养不同天数得到的抗体浓度折线图如图3所示，检测具体结果如下表所示：
发酵时间d 细胞数10<sup>5</sup>个/ml 细胞活率 抗体浓度ug/ml
0 3.29 91.44％ 0
1 5.33 82.61％ 5.11
2 10.88 84.66％ 11.36
3 13.10 85.97％ 12.33
4 18.98 82.01％ 22.51
5 19.39 72.58％ 35.22
6 19.87 65.35％ 40.28
7 16.17 50.17％ 58.31
实施例4
用实施例1中的无血清细胞培养基和购买的CDM4、EX-CELL、H-SFM三种培养基来对5H2细胞进行无血清培养，在这4种培养基中均无胎牛血清的加入，将生长状态良好、处于对数期的5H2细胞以1.5×105个/ml接种浓度接种到含上述四种培养基的细胞培养板中，培养于37℃、5％CO2培养箱中。用细胞计数仪进行细胞增殖活力的分析，结果见下表：
从表中数据可以看出，在不加血清时，细胞不能在EX-CELL培养基中正常存活，其他3种培养基均能支持5H2细胞的生长与增殖，但实施例1的无血清细胞培养基的效果在4种培养基中是最好的，细胞的密度最大，经过6天培养细胞密度可达到12.88×105个/ml。
对比例1
用实施例1中的检测方法对目前常用的H-SFM无血清细胞培养基培养的杂交瘤细胞株(5H2)的细胞活性及培养基中抗体含量进行检测，培养不同天数得到的抗体浓度折线图如图4所示，检测具体结果如下表所示：
以上培养结果表明，本发明实施例1-3的无血清细胞培养基培养的杂交瘤细胞株(5H2)的细胞增殖速度、细胞活性以及产生的抗体含量都明显高于H-SFM培养基，达到甚至优于含血清的细胞培养基。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种无血清细胞培养基，其特征在于：培养基中各组分含量为：2000-5500mg/L的碳水化合物、300-4800mg/L的氨基酸、0.1-55mg/L的核苷酸、8-150mg/L维生素、1060-23000mg/L无机盐、2100-11200mg/L添加物和去离子水；
所述添加物包括酚红、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸、重组胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺。
2.如权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于：所述碳水化合物中包含的组分及各组分在培养基中的含量为：D-葡萄糖2000-5000mg/L、丙酮酸钠5-300mg/L、亚油酸0.01-20mg/L。
3.如权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于：所述氨基酸包含的种类及各种类在培养基中的含量为：甘氨酸10-100mg/L、L-丙氨酸1-20mg/L、L-精氨酸盐酸盐10-500mg/L、L-天冬酰胺1-20mg/L、L-天冬氨酸1-20mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐10-100mg/L、L-胱氨酸10-100mg/L、L-谷氨酸1-20mg/L、L-谷氨酰胺100-2000mg/L、L-组氨酸盐酸盐10-100mg/L、L-异亮氨酸20-200mg/L、L-亮氨酸20-200mg/L、L-赖氨酸盐酸盐20-200mg/L、L-蛋氨酸10-100mg/L、L-苯丙氨酸20-200mg/L、L-脯氨酸10-100mg/L、L-丝氨酸10-100mg/L、L-苏氨酸20-200mg/L、L-色氨酸1-30mg/L、L-酪氨酸二钠盐20-200mg/L、L-缬氨酸20-200mg/L。
4.如权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于：所述核苷酸包含的种类及各种类在培养基中的含量为：腺嘧啶脱氧核苷酸0.001-1mg/L、次黄嘌呤钠0.1-50mg/L。
5.如权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于：所述维生素包含的种类及各种类在培养基中的含量为：生物素0.001-1mg/L、氯化胆碱1-20mg/L、D-泛酸钙1-20mg/L、叶酸1-20mg/L、烟酰胺1-20mg/L、盐酸吡哆醇1-20mg/L、核黄素0.001-1mg/L、盐酸硫胺素1-20mg/L、维生素B12 0.001-1mg/L、肌醇1-20mg/L。
6.如权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于：所述无机盐包含的组分及各组分在培养基中的含量为：氯化钙10-500mg/L、硫酸铜0.001-1mg/L、硝酸铁0.001-1mg/L、硫酸亚铁0.001-1mg/L、氯化镁10-500mg/L、硫酸镁10-500mg/L、氯化钾10-500mg/L、碳酸氢钠500-10000mg/L、氯化钠500-10000mg/L、磷酸氢二钠10-500mg/L、磷酸二氢钠10-500mg/L、硫酸锌0.001-1mg/L。
7.如权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于：所述添加物中各组分在培养基中的含量为：酚红1-50mg/L、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸2000-8000mg/L、重组胰岛素1-50mg/L、转铁蛋白1-50mg/L、牛血清白蛋白50-3000mg/L、亚硒酸钠1-50μg/L、乙醇胺1-30mg/L。
8.权利要求1-7所述的无血清细胞培养基在促进细胞产生单克隆抗体中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述无血清细胞培养基用于培养骨髓瘤细胞以促进其产生单克隆抗体。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述无血清细胞培养基用于培养杂交瘤细胞以促进其产生单克隆抗体。
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