CN1229851A - 杂交瘤细胞无血清培养基 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域,公开了一种杂交瘤细胞无血清培养基。所说的培养基是以培养基RPMI 1640为基础,添加了转铁蛋白、甾体激素、微量元素、维生素、乙醇胺、β－巯基乙醇和对羟基苯甲酸等物质所组成的一种新的能使杂交瘤细胞可以旺盛地生长、细胞密度和单抗生产可与有血清培养基相媲美的低蛋白无血清培养基,完全可以替代有血清的培养基用于WuT3杂交瘤细胞的培养。

Description

杂交瘤细胞无血清培养基

本发明属于生物技术领域，涉及一种无血清培养基，尤其涉及一种用于由骨髓瘤细胞和淋巴细胞融合的杂交瘤细胞培养的无血清培养基。

杂交瘤细胞是一种能分泌单一独特抗体的无限传代细胞。杂交瘤细胞技术首先由英国的Kohler和Mistein在1975年通过小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合而建立的。杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体在诊断、免疫、纯化、疫苗生产、治疗和基础研究等方面有着广泛的应用，已成为生物工程方面的重要产品。

杂交瘤细胞的培养通常是在有血清培养基中进行的，虽然细胞密度和产物的浓度均较高，但由于血清中蛋白和其它大分子物质太复杂，影响了单克隆抗体的分离和纯化，使单克隆抗体的收率和纯度降低，限制了单克隆抗体的体内应用；同时，由于血清的添加也使生产成本大大提高。因此，许多科研工作者致力于开发无血清或低血清培养基。

Darfler等开发的CITTL无血清培养基以DMEM/F12(1∶1)为基础培养基，添加了5mg/L的过氧化氢酶，1.5mg/L的胰岛素，1.5～3.0mg/L转铁蛋白，2nmol/L睾酮，0.5mg/L的二亚油酰磷脂胆碱和1.5mg/L的β-甘油磷酸。这一培养基可支持s49细胞的克隆化生长，也可用于杂交瘤细胞的培养；

文献“Chang TH,Steplewski Z and Koprowski H.Production of Mabin SFM.J.Immunol.Methods.1980,39:369”所报导的无血清培养基成功地培养了几株杂交瘤细胞，其基本培养基是MEM或RPMI 1640，并添加了0.6mg/L的谷氨酰胺，1％MEM的非必需氨基酸，5mg/L的胰岛素和5mg/L转铁蛋白；

Murakami等开发的无血清培养基以DMEM/F12为基础，添加了5mg/L的胰岛素，2～35mg/L转铁蛋白，20μmol/L乙醇胺和1nmol/L亚硒酸钠等物质，这就是现在被广泛使用的DMEM/F12-ITES配方，可培养多种杂交瘤细胞。

Kover和Frank开发的无血清培养基以RPMI 1640为基础培养基，并添加了10mg/L胰岛素，5mg/L转铁蛋白，20μmol/L乙醇胺，5mg/L亚油酸，1g/L牛血清蛋白；3mg/L抗坏血酸，2μg/L氢化可的松和12种微量元素，这一培养基也可使多种骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞得以生长。

美国专利U.S.P.4927762公开了一种含有抗氧化剂的培养基，阐明了细胞在还原性介质中能更好地生长，同时指出了N-乙酰半胱氨酸、硫乳酸、巯基乙醇等物质的添加可以起到抗氧化作用。

美国专利U.S.P.4767704公开的培养基就微量元素的添加进行了研究，开发了一种无蛋白培养基，该专利最主要的贡献在于使人们认识到微量元素的作用。

上述的培养基都具有各自的特点，但是各个培养基均只适合于一种或一类细胞的生长，而且蛋白含量仍较高，一般可达每升几十毫克至几克，不利于产物的分离纯化，生产成本也较高。

为了满足人们的需要，研究开发新的低蛋白无血清培养基将是很有意义的。

本发明的目的在于公开一种低蛋白无血清培养基，用于培养鼠-鼠杂交细胞瘤，特别是由骨髓瘤细胞NS1和经免疫的Balb/c小鼠脾细胞融合而成的WuT3杂交瘤细胞，分泌抗人T淋巴细胞CD3抗原的单克隆抗体，该培养基具有蛋白含量低，分离纯化容易，易于工业化生产的特点。

本发明的构思是：一个培养基，除了无机盐、糖、氨基酸和维生素外，还需添加结合蛋白、激素、生长因子、低分子量营养物质等，故本发明在配方中加入了：

(1)转铁蛋白，结合铁的糖蛋白，与细胞表面专一受体作用，传递铁离子，协助铁的吸收，可络合有害离子，起解毒作用，同时还有生长因子的作用。

(2)甾体激素，如地塞米松，对细胞的生理代谢有复杂的调节作用

(3)微量元素，如Cu、Fe、Zn、Se、Co、Mo、Sn、Si等，主要起细胞生理过程调节和控制作用，例如：

        Fe：酶和血红素的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分。

        Cu：超氧化物歧化酶的辅基。

        Mg：对ATP酶、激酶等起活化作用。

        Zn：酶的辅基。

        Co:B₁₂的组成部分。

        Se：是谷胱甘肽氧化酶的组成部分，具有抗氧化作用。

(4)维生素：在细胞生长代谢过程中，维生素不作为能源，它是细胞组成成分，细胞的各种代谢活动，离开了维生素都无法进行，因此它是必需的。

(5)乙醇胺：是无血清培养基的重要组成部分，与磷脂的合成有关。

(6)β-巯基乙醇：促进胱氨酸的吸收，还可使谷胱甘肽处于还原状态，从而保护免受过氧化氢的损害。

(7)对羟基苯甲酸：是氨基酸和糖代谢的中间体，有利于细胞生长代谢。

此外，脂肪酸等对细胞的生长均有一定的促进作用，因此，本发明在培养基RPMI 1640的基础上添加了上述物质，使杂交瘤细胞可以旺盛地生长，细胞密度和单抗生产可与有血清培养基相媲美。

本发明所说的培养基为一个组合物，是由培养基RPMI 1640和下例添加物所组成，添加量均为mg/L：L-精氨酸    100～300      CuSO₄·5H₂O     0.0005～0.005L-天门冬酰胺25～75        MnCl₂·4H₂O     0.00005～0.0005L-天门冬氨酸10～30        Na₂MoO₄·2H₂O  0.00002～0.0002L-谷氨酸    10～30        Ni(NO₃)₂·6H₂O 0.00002～0.0002L-谷氨酰胺  0～500        ZnSO₄·7H₂O     0.06～0.6甘氨酸      5～15         CoCl₂·6H₂O     0.001～0.008L-组氨酸    10～30        NaSiO₃·9H₂O    0.001～0.01L-异亮氨酸  25～75        Na₃VO₄·12H₂O  0.0005～0.005L-赖氨酸盐酸20～60        SnCl₂·2H₂O     0.00001～0.0001L-蛋氨酸    10～30        Na₂SeO₃         0.002～0.01L-苯丙氨酸  10～30        FeSO₄·7H₂O     0.2～1.6L-脯氨酸    10～30        葡萄糖            1000～4000L-丝氨酸    15～45        维生素C           0.176～0.704L-苏氨酸    10～30        对羟基苯甲酸      0.5～1.5L-色氨酸    5～15         丙酮酸钠          55～550L-缬氨酸    10～30        亚油酸            0.01～0.05L-亮氨酸    25～75        β-巯基乙醇       0.8～4.0二水L-酪氨酸二钠144～432  乙醇胺            1～5L-胱氨酸二盐酸25～75    地塞米松0.001～0.005人转铁蛋白    5～50

以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一步的说明。

                            实施例1

在500ml细胞培养瓶中，加入20ml如下所示的培养基，然后再加入在该培养基中适应的WuT3杂交瘤细胞，接种密度为1.5×10⁵cells/ml，培养时间为4天，细胞密度(▲)最大为1.5×10⁶cells/ml，单抗浓度(Δ)为65mg/L。L-精氨酸        400        Ca(NO₃)·4H₂O     100L-天门冬酰胺    100        CoCl₂·6H₂O       0.00238L-天门冬氨酸    40         CuSO₄·5H₂O       0.0025L-胱氨酸二盐酸  100        FeSO₄·7H₂O       0.834L-谷氨酸        40         KCl                 400L-谷氨酰胺      600        MgSO₄              48.84L-组氨酸        30         MnCl₂·4H₂O       0.0001甘氨酸          20         Na₂HPO₄           800L-异亮氨酸      100        Na₂MoO₄·2H₂O    0.00012L-亮氨酸        100        Na₂SeO₃           0.00864L-赖氨酸盐酸    80         Na₃VO₄·12H₂O    0.001L-蛋氨酸        30         NaCl                 6000L-苯丙氨酸      30         NaHCO₃              2000L-脯氨酸        40         NaSiO₃·9H₂O      0.0522L-丝氨酸        60         Ni(NO₃)₂·6H₂O   0.00007L-苏氨酸        40         SnCl₂·2H₂O       0.000056L-色氨酸        10         ZnSO₄·7H₂O       0.2875二水L-酪氨酸二钠576        地塞米松             0.002L-缬氨酸        40         葡萄糖               4000β-巯基乙醇     1.58       乙醇胺               3人转铁蛋白      10         还原型谷胱甘肽       1.0亚油酸      0.028    丙酮酸钠        110酚红        5.0      对羟基苯甲酸    1.0维生素C     0.352    生物素(Biotin)  0.20泛酸钙      0.25     氯化胆碱        3.0叶酸        1.0      肌醇            35.0烟酰胺      1.0      对氨基苯甲酸    1.0盐酸吡哆醇  1.0      核黄素          0.20硫胺素      1.0      维生素B₁₂      0.005

                          对比例

采用与实施例1相同的培养方法，所用的培养基为添加了5％(wt％)血清的RPMI 1640，其细胞密度(■)最大为1.1×10⁶cells/ml，单抗浓度(口)为52mg/l。

由上述实施例和对比例可见，本发明所说的培养基无论在细胞密度和单抗浓度上都优于有血清的培养基，因此完全可以替代有血清的培养基用于WuT3杂交瘤细胞的培养。图1为

本发明所说的无血清培养基还可以用于其它鼠-鼠杂交瘤细胞的培养，是一种低蛋白、低成本的无血清培养基。

图1为实施例1和对比例的试验结果示意图。图中：——采用无血清培养基的细胞密度1×10⁵cells/ml

——采用有血清培养基的细胞密度1×10⁵cells/ml

——采用无血清培养基的单抗浓度mg/l

——采用有血清培养基的单抗浓度mg/l

Claims (1)

1．一种杂交瘤细胞无血清培育基，其特征在于所说的培养基为一个组合物，是由培养基RPMI 1640和下例添加物所组成，添加量均为mg/L：

L-精氨酸    100～300      CuSO₄·5H₂O      0.0005～0.005

L-天门冬酰胺25～75        MnCl₂·4H₂O      0.00005～0.0005

L-天门冬氨酸10～30        Na₂MoO₄·2H₂O   0.00002～0.0002

L-谷氨酸    10～30        Ni(NO₃)₂·6H₂O  0.00002～0.0002

L-谷氨酰胺  0～500        ZnSO₄·7H₂O      0.06～0.6

甘氨酸      5～15         CoCl₂·6H₂O      0.001～0.008

L-组氨酸    10～30        NaSiO₃·9H₂O     0.001～0.01

L-异亮氨酸  25～75        Na₃VO₄·12H₂O   0.0005～0.005

L-赖氨酸盐酸20～60        SnCl₂·2H₂O      0.00001～0.0001

L-蛋氨酸    10～30        Na₂SeO₃          0.002～0.01

L-苯丙氨酸  10～30        FeSO₄·7H₂O      0.2～1.6

L-脯氨酸    10～30        葡萄糖             1000～4000

L-丝氨酸    15～45        维生素C            0.176～0.704

L-苏氨酸    10～30        对羟基苯甲酸       0.5～1.5

L-色氨酸    5～15         丙酮酸钠           55～550

L-缬氨酸    10～30        亚油酸             0.01～0.05

L-亮氨酸    25～75        β-巯基乙醇        0.8～4.0

二水L-酪氨酸二钠144～432  醇胺               1～5

L-胱氨酸二盐酸25～75      地塞米松           0.001～0.005

人转铁蛋白    5～50。