CN104087558A - 一种杂交瘤细胞无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞无血清培养基，通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、微量元素及生物碱、脂肪酸和激素等补充因子，使该培养基能使杂交瘤细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，既能满足杂交瘤细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行杂交瘤细胞的高密度大规模培养。

Description

一种杂交瘤细胞无血清培养基
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞无血清培养基。
背景技术
传统的含血清培养基中的血清给生产与科研带来多种不利因素。血清的主要作用在于给细胞提供生长增值所需的激素、生长因子、转移蛋白和其他营养物质，但其存在很多缺点：具有批间差异、需要大量验证工作、使用不方便、成分不明确、有抑制生长的成分、尤其不利于疫苗和单克隆抗体等目的产物的分离纯化、容易被病毒和支原体感染；血清昂贵可能发生供应紧张，血清的来源不稳定等问题。
杂交瘤细胞是在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B细胞融合而成的细胞。杂交瘤细胞是一种能分泌单一独特抗体的无限传代细胞，杂交瘤细胞技术首先由英国的Kohler和Mistein在1975年通过小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合建立的。杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体在诊断、免疫、纯化、疫苗生产、治疗和基础研究等方面有着广泛的应用，已成为生物工程发面的重要产品。单克隆抗体用于体内诊断和治疗之后，对单克隆抗体产品的纯度提出了更高的要求，而杂交瘤细胞培养时使用的血清中的各种蛋白是单克隆抗体纯化的主要障碍。目前，国外已有杂交瘤细胞商业无血清培养基上市，如Gibco公司的CD Hybridoma培养基、Hybridoma-SAM培养基、PFHM-Protein-Free培养基，Hyclone公司的HyQCCMI等等。上述杂交瘤细胞无血清培养基都有各自的优点，但因为价格昂贵不适合大规模生产，同时有些培养基没有针对细胞进行优化，所支持的细胞密度较低，导致生产过程产量不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞无血清培养基，通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、微量元素及表皮生长因子、血清胺等补充因子替代血清蛋白成分，使该培养基能使杂交瘤细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，既能满足杂交瘤细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行杂交瘤细胞的高密度大规模培养。
本发明的技术方案为：
一种杂交瘤细胞无血清培养基，其中，包括下列重量份的组分：
基础培养基 13000-16000；
微量元素组合物 10073-10100；
氨基酸组合物 523-1275；
无菌水 900-1100；
其中所述基础培养基由DMEF和F12培养基按照0.8-1.2∶0.8-1.2的重量比混合而成。
优选的是，所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述氨基酸组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：
谷氨酰胺125.24-250.59、组氨酸30.48-105.98、异亮氨酸53.41-131.25、亮氨酸58.94-167.23、赖氨酸91.25-193.26、甲硫氨酸15.26-61.42、苯丙氨酸34.12-83.56、脯氨酸17.34-35.41、丝氨酸27.31-95.15、苏氨酸54.16-97.24和色氨酸8.27-52.41。
优选的是，所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述微量元素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：氯化镍0.00003-0.00031、氯化锡0.00002-0.00023、亚硒酸钠0.00005-0.0005、碳酸氢钠2440-2451、氯化钠6995.50-7031.20、氯化钾312.81-313.90、氯化镁29.65-30.42、硫酸镁48.85-49.21、一水磷酸二氢钠62.51-62.53、磷酸氢二钠71.03-72.15、硫酸锌0.431-0.445、氯化钙116.60-117.32、五水硫酸铜0.0014-0.0016和七水硫酸铁0.062-0.071。
优选的是，所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括11-14重量份的维生素组合物，所述维生素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：维生素B6 0.01-0.2、维生素B12 0.02-0.42、维生素C9-10、维生素E0.30-0.31、D-泛酸钙0.004-0.005、叶酸0.062-0.081、肌醇0.83-1.43和生物素0.4-1.21。
优选的是，所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括230-560重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：表皮生长因子0.025-0.05、血清胺0.06-0.03、硫代甘油0.00001-0.0001、乙醇胺3.50-4.50、羟丙基-B-环状糊精235.34-543.12、谷胱甘肽0.45-1.26和卵磷脂1.25-2.86。
优选的是，所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括1100-2500重量份的糖类物质组合物，所述糖类物质组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：果糖1000-2000和海藻糖100-500。
本发明具有以下有益效果：通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、微量元素及表皮生长因子、血清胺等补充因子替代血清蛋白成分，使该培养基能使杂交瘤细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，既能满足杂交瘤细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行杂交瘤细胞的高密度大规模培养。通过对比试验检验，杂交瘤细胞在本发明所述的杂交瘤细胞无血清培养基中的细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基的培养效果相当，并优于国外商品化的杂交瘤细胞无血清培养基。
附图说明
图1为杂交瘤细胞在本发明所述的杂交瘤细胞无血清培养基和Hyclone公司的HyQPF-Mab培养基中生长曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。
一种杂交瘤细胞无血清培养基，其中，包括下列重量份的组分：
基础培养基 13000-16000；
微量元素组合物 10073-10100；
氨基酸组合物 523-1275；
无菌水 900-1100；
其中所述基础培养基由DMEF和F12培养基按照0.8-1.2∶0.8-1.2的重量比混合而成。
所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述氨基酸组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：
谷氨酰胺125.24-250.59、组氨酸30.48-105.98、异亮氨酸53.41-131.25、亮氨酸58.94-167.23、赖氨酸91.25-193.26、甲硫氨酸15.26-61.42、苯丙氨酸34.12-83.56、脯氨酸17.34-35.41、丝氨酸27.31-95.15、苏氨酸54.16-97.24和色氨酸8.27-52.41。
所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述微量元素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：氯化镍0.00003-0.00031、氯化锡0.00002-0.00023、亚硒酸钠0.00005-0.0005、碳酸氢钠2440-2451、氯化钠6995.50-7031.20、氯化钾312.81-313.90、氯化镁29.65-30.42、硫酸镁48.85-49.21、一水磷酸二氢钠62.51-62.53、磷酸氢二钠71.03-72.15、硫酸锌0.431-0.445、氯化钙116.60-117.32、五水硫酸铜0.0014-0.0016和七水硫酸铁0.062-0.071。
所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括11-14重量份的维生素组合物，所述维生素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：维生素B6 0.01-0.2、维生素B12 0.02-0.42、维生素C9-10、维生素E0.30-0.31、D-泛酸钙0.004-0.005、叶酸0.062-0.081、肌醇0.83-1.43和生物素0.4-1.21。
所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括230-560重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：表皮生长因子0.025-0.05、血清胺0.06-0.03、硫代甘油0.00001-0.0001、乙醇胺3.50-4.50、羟丙基-B-环状糊精235.34-543.12、谷胱甘肽0.45-1.26和卵磷脂1.25-2.86。
所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括1100-2500重量份的糖类物质组合物，所述糖类物质组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：果糖1000-2000和海藻糖100-500。
所述杂交瘤细胞无血清培养基是在参考现有的文献基础上经过大量实验验证而设计出的培养基配方，通过选择适当的微量元素和氨基酸代替血清蛋白成分，应用Plackett-Burman实验设计，对培养基添加成分进行了评价，采用响应面分析法优化各个组分的最佳使用剂量得到所述的杂交瘤细胞无血清培养基。
具体实施中，本发明所述的杂交瘤细胞无血清培养基以重量比为1∶1的DMEF和F12的基础培养基，添加以下组分：
(1)表皮生长因子：促进多种类型细胞有丝分裂；
(2)血清胺：广泛存在于哺乳细胞组织中的血管收缩剂，具有促进体外细胞黏附和生长的作用；
(3)微量元素：Cu、Fe、Se、Ze和Mg等微量元素，主要为酶的辅基参与代谢的调节；
(4)金精三羧基：金属螯合剂，具有结合并运输Fe2+，部分替代转铁蛋白的功能，同时也能通过结合和运输Ca2+及Mg2+促进细胞的黏合和伸展；
(5)氨基酸：蛋白合成的前体和合成其他生物大分子的中间体，是细胞提供的必要营养成分；
(6)生物素：参与羧化、糖原异生和蛋白质合成等生化反应，对体外培养细胞的生长和黏附具有一定的促进作用；
(7)乙醇胺：磷脂和细胞膜合成的前体物质，对细胞生长具有一定的促进作用；
(8)单糖和双糖：可作为细胞代谢的能源物质，并对细胞具有非特异性保护作用；
(9)羟丙基-B-环状糊精：储存和运送生物大分子，提高生物活性物质的稳定性和生物利用度；
(10)维生素：细胞组成成分；
(11)谷胱甘肽：具有保护细胞膜免受自由基损伤的作用；
(12)卵磷脂：做为细胞膜的重要组成部分。
本发明所述的杂交瘤细胞无血清培养基的制备方法十分简单，称取配方量的各组分，加入1000ml无热源超纯水溶解并混匀，室温下搅拌20-30min，使其溶解。用0.32um微孔滤膜过滤除菌，无菌保存。
本发明可用于杂交瘤细胞传代培养或杂交瘤细胞高密度连续灌注悬浮培养，具有以下优点：
(1)无任何蛋白质添加物，化学成分确定；
(2)无需适应而杂交瘤细胞生长旺盛、维持活力时间长，在产物表达方面与血清培养基接近或相当；
(3)支持细胞长期传代培养；
(4)所有化学结构已知，有利于产物的分离纯化，提高产品的品质；
(5)成分均为小分子物质、成本低、易于分离纯化，适合大规模工业化生产。
实施例1
按照下列配方称取个组分，本发明所有原料均采购Sigma细胞培养级的原料，并按照相关要求储存。
组成 含量(mg/L)
DMEF/F12(1∶1) 15000
表皮生长因子 0.025
血清胺 0.06
氯化镍 0.00004
氯化锡 0.00002
亚硒酸钠 0.00005
硫代甘油 0.0001
谷氨酰胺 125.24
组氨酸 30.48
异亮氨酸 53.41
亮氨酸 58.94
赖氨酸 91.25
甲硫氨酸 15.26
苯丙氨酸 34.12
脯氨酸 17.34
丝氨酸 27.31
苏氨酸 54.16
色氨酸 8.27
果糖 1000
海藻糖 300
维生素B6 0.01
维生素B12 0.02
维生素C 10
维生素E 0.31
D-泛酸钙 0.004
叶酸 0.062
肌醇 0.83
生物素 1.21
碳酸氢钠 2440
氯化钠 6995.50
氯化钾 312.81
氯化镁 29.65
硫酸镁 48.85
一水磷酸二氢钠 62.51
磷酸氢二钠 72.15
硫酸锌 0.445
氯化钙 117.32
五水硫酸铜 0.0016
七水硫酸铁 0.062
乙醇胺 3.50
羟丙基-B-环状糊精 235.34
谷胱甘肽 0.45
卵磷脂 1.25
采用本发明所述杂交瘤细胞无血清培养基通过以下方法进行杂交瘤细胞培养并计数：
将由ATCCA获得的HB58按常规方法无血清悬浮复苏细胞到T25方瓶，细胞长成致密单层后离心、重悬无血清基础培养基传代培养，培养至少3代以上，待细胞至对数生长期后逐级扩增至500ml三角瓶中，当细胞密度4×106cells/ml，体积40ml。取相同数量细胞，按照细胞密度1×106cells/ml，体积40ml，离心、重悬接种500ml三角瓶中，每组3个重复对照，含6％的CO2的摇床中37℃、转速为120rpm振荡培养，每天取样计数，按规定流加，待细胞活率低于80％，收获细胞液。一次性接种细胞至培养基，培养数天，每天取样计数，并用台盼蓝染色计算细胞活率。
与国外公司的同类培养基进行比较如下：
按照上述的方法驯化HB58到Hyclone公司的HyQPF-Mab培养基中，取各自驯化好的细胞株，将HB58细胞每毫升的密度接种至500ml三角瓶中，将所有三角瓶置于含6％的CO2的摇床中37℃，转速为120rpm，每天取样计数，并用台盼蓝染色计算细胞活率。
如图1所示，处于上方的曲线为本发明所述无血清培养基培养的杂交瘤细胞的生长曲线，处于下方的曲线为Hyclone公司的HyQPF-Mab培养基培养的杂交瘤细胞的生长曲线，整个培养过程持续8天，培养第7天，本发明无血清培养基与Hyclone公司的HyQPF-Mab培养基活细胞密度分别达到203.7×104cells/ml和189.4×104cells/ml，本发明所述无血清培养基的培养效果优于国外厂家生产的同类培养基的培养效果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，包括下列重量份的组分：
基础培养基 13000-16000；
微量元素组合物 10073-10100；
氨基酸组合物 523-1275；
无菌水 900-1100；
其中所述基础培养基由DMEF和F12培养基按照0.8-1.2∶0.8-1.2的重量比混合而成。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：
谷氨酰胺125.24-250.59、组氨酸30.48-105.98、异亮氨酸53.41-131.25、亮氨酸58.94-167.23、赖氨酸91.25-193.26、甲硫氨酸15.26-61.42、苯丙氨酸34.12-83.56、脯氨酸17.34-35.41、丝氨酸27.31-95.15、苏氨酸54.16-97.24和色氨酸8.27-52.41。
3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，所述微量元素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：氯化镍0.00003-0.00031、氯化锡0.00002-0.00023、亚硒酸钠0.00005-0.0005、碳酸氢钠2440-2451、氯化钠6995.50-7031.20、氯化钾312.81-313.90、氯化镁29.65-30.42、硫酸镁48.85-49.21、一水磷酸二氢钠62.51-62.53、磷酸氢二钠71.03-72.15、硫酸锌0.431-0.445、氯化钙116.60-117.32、五水硫酸铜0.0014-0.0016和七水硫酸铁0.062-0.071。
4.如权利要求3所述的杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，所述培养基中还包括11-14重量份的维生素组合物，所述维生素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：维生素B6 0.01-0.2、维生素B12 0.02-0.42、维生素C9-10、维生素E0.30-0.31、D-泛酸钙0.004-0.005、叶酸0.062-0.081、肌醇0.83-1.43和生物素0.4-1.21。
5.如权利要求4所述的杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，所述培养基中还包括230-560重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：表皮生长因子0.025-0.05、血清胺0.06-0.03、硫代甘油0.00001-0.0001、乙醇胺3.50-4.50、羟丙基-B-环状糊精235.34-543.12、谷胱甘肽0.45-1.26和卵磷脂1.25-2.86。
6.如权利要求5所述的杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，所述培养基中还包括1100-2500重量份的糖类物质组合物，所述糖类物质组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种：果糖1000-2000和海藻糖100-500。
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