CN108699529B

CN108699529B - 用于培养含癌症干细胞(csc)的细胞群的化学成分确定的培养基

Info

Publication number: CN108699529B
Application number: CN201780011737.5A
Authority: CN
Inventors: 哈根·维兰德
Original assignee: Prosil Ltd
Current assignee: Prosil Ltd
Priority date: 2016-02-17
Filing date: 2017-02-17
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2037-02-17
Also published as: WO2017140876A1; US11584917B2; EP3417053B1; EP3208331A1; EP3417053A1; PL3417053T3; DK3417053T3; JP2019506878A; US20190153396A1; CN108699529A; ES2843073T3; JP6990659B2

Abstract

本发明涉及一种用于真核细胞培养的化学成分确定的培养基，包括水、至少一种碳源、一种或更多种维生素、一种或更多种盐、一种或更多种生长因子、一种或更多种脂肪酸、一种或更多种缓冲成分、硒和一种或更多种其它微量元素，本发明还涉及该培养基在癌症干细胞的培养中的用途，尤其是癌症干细胞的肿瘤球培养。

Description

用于培养含癌症干细胞(CSC)的细胞群的化学成分确定的培养基

技术领域

本发明涉及用于真核细胞培养的化学成分确定的培养基，和该培养基在癌症干细胞的增殖和/或维持(maintenance)中的用途。

背景技术

所有类型的干细胞具有相同的自我更新特点和分化为不同终末成熟细胞类型的能力。由于这些机制在正常干细胞中被严格控制，因此在干细胞向终末分化成熟细胞的渐进多级分化过程中该潜能逐步丧失[1]。

在1863年，病理学家Rudolf Virchow首次提出癌症干细胞(CSC)模型，声明“未成熟细胞”表示癌症起源[2]。在1997年，Bonnet将CSC的特异性亚群描述为骨髓性白血病的“癌症驱动细胞”[3]。最近，已经在包括造血系统恶性肿瘤和一系列实体瘤在内的各种癌症中识别了CSC[4]。

在肿瘤的癌症干细胞模型中，CSC被定义为抗失巢凋亡恶性细胞的小的子集，具有自我更新和维持肿瘤的独特能力。它们能够分化为非致瘤性癌细胞类型的异质性团块，其通常构成大多数肿瘤[5]。在此上下文中，清楚的是：尽管CSC具有恶性表型，但是CSC具有共同的正常干细胞特点，赋予这些细胞特别的生物学潜能。

CSC能够与原发性肿瘤分开，在体内移动并扩散，在体内它们可在远隔器官形成继发性肿瘤(转移性肿瘤)。在看似成功治疗原发性肿瘤之后，转移性肿瘤可能很快就发生，或者在数年之后才发生。传统的治疗方法目的在于依靠手术、照射、化疗和生物制剂尽可能地清除肿瘤团块。然而，越来越多的证据表明这些措施以肿瘤的较无害、快速分裂的细胞团块作为目标，并没有根除疾病的公认根源-CSC。

人们认为，复发是由静止状态的CSC引起的，静止状态的CSC能够通过使用由它们的干细胞性能介导的保护机制来规避当前的治疗方案。因此，现在重新调整了癌症研究，尤其在探索治疗恶性肿瘤的新的临床策略时。CSC被认为是新的治疗靶标，并且人们认为，清除它们能够带来永久的缓解甚至治愈。这可能通过下述方式实现：通过直接根除CSC或者通过由不对称向对称的CSC细胞分裂的特异性适应，从而借助阻断它们的自我更新能力来消除CSC细胞群[5,6]。为了实现这一目标，需要能实现CSC的复杂表征的生物学相关培养系统。

通常，对于所有类型的人源干细胞，由于伦理道德原因，对它们的功能的评价和表征需要依赖于间接方法。

今天，各种类型的干细胞被很好地表征，并且已经研发了可靠地识别这些细胞的技术。例如，对于多能干细胞，免疫功能低下小鼠中畸胎瘤的体内形成或者向所有三胚层分化的拟胚体的体外形成被用作多能性检验的替代方法[7]。多能性标记物表达模式的检验，例如，Oct-3/4、Nanog、SSEA和Tra抗原，当前也被广泛视为多能性状态的间接证明(参见[8]，供审阅)。多亏高度确定和优化的培养系统的新发展，今天科学家们能够实现多能干细胞的完全定义的/人化的来源和无限制生长。

相反，用于持久维持CSC的生物相关培养系统(作为探索CSC生物学以及它们可靠表征的工具)仍然有待研发。因此，如对多种类型的正常干细胞所成功证明的，已经基于标记物检测从事了各种各样的方法来表征CSC。这些包括细胞内分子和细胞外分子染色，以及测量某些细胞酶的活性，诸如乙醛脱氢酶(ALDH1)或小分子转运体如ABC转运系统[9-11]。然而，不同癌症中CSC的异质性[5,12]，以及确定的标记物与功能性CSC特征(诸如肿瘤发生)缺少特异性、一致性和相关性[5,13]，这都阻碍了研究。因此，稳健、可靠且尤其是整体性的用于CSC检测和表征的基于标记物的方法似乎前景很遥远。结果是，目前CSC研究中最大的障碍是分离并纯化足够数目的功能性同源CSC细胞群。缺少有生物学意义的体外培养系统加剧了这些困难，这与可用于大部分其它类型干细胞的技术可能性形成了鲜明对比。

目前，CSC只能通过它们遵循持续生长肿瘤的传代的能力来用实验方法定义。至今，CSC分析最可接受的策略通常是基于对它们基本功能特征的检测。这些包括典型的干细胞特征，诸如自我更新和多能性，以及癌症的特殊标志，诸如连续转移的致瘤潜能和抗失巢凋亡。然而，再一次地，缺少初级模型系统意味着研究被迫依赖于由替代模型系统和测试产生的间接读出。功能性的体内测定CSC的黄金标准是连续移植至免疫功能低下小鼠的原位位点。然而，这是需要耗费大量劳动的，并且结果可能难以解释[5]。在专门的功能基础上选择性利用CSC固有特征组合的最重要的体外方法之一是在3D悬浮培养中形成连续传代肿瘤球[5]。

相比于恶性肿瘤，已建立的癌细胞系的主要细胞团块或多或少由具有组织特异性的功能性终末分化细胞组成，取决于癌症的类型和它们起源的组织。因此，癌细胞系而非原代细胞在研究中广泛用作普遍接受、定义明确的模型系统，原因是费用和持续的细胞来源避免了正常原代细胞存活期有限带来的限制。

的确，这些细胞系含有小但稳定的CSC亚群(驱动细胞)，赋予了培养物无限的寿命和增殖潜力。因此，今天，癌细胞系也代表了用于癌症研究(包括CSC-靶向方法)的最重要的体外模型和定义明确的细胞来源[14-19；27-28]。

用于这些细胞系的两个最卓越的培养技术是：

1)贴壁2D培养，主要在标准基础培养基中，例如，DMEM或者补充有各种量的胎牛血清和最终附加补充物的DMEM-Ham F12营养混合物[16]。

2)第二种重要的培养方法是3D悬浮培养比如球(肿瘤球)，采用基于DMEM-Ham F12营养混合物的成分不确定但主要是无血清的培养基[18-20]。

就CSC而言，使用成分不确定的培养基的贴壁2D培养技术具有若干缺陷：

a)如若干类型的干细胞证实的，这些培养基的成分不确定的性质会干扰干细胞的特性并优先支持干细胞(包括CSC)的分化[21]。因此，成分不确定的培养基中的2D培养是获得分化细胞作为原代细胞替代物的合适培养方法，但是如果CSC亚群(在这种条件下通常<1％)是感兴趣的目标，那么该方法是较差的培养方法。

b)成分不确定的培养基是实验误差的有效来源。上述培养基不能提供确定且可控的培养环境。实验过程，如细胞分离或对靶标CSC的药物筛选，可能由于培养基的不确定成分的影响而产生虚假结果。此外，细胞可能会被这种培养条件显著改变[22]。

肿瘤球的3D悬浮培养技术取自于最初为培养原代神经细胞以及脑癌细胞(例如恶性胶质瘤如所谓的“神经球培养物”[23]，其可连续传代或扩增同时还维持它们的干细胞池(自我更新)和分化潜能)而研发的方法。因此，该培养方法已经证实是培养多能神经元(癌症)细胞的强大体外模型，其有助于显著加快对这种类型细胞的探索。

为这些神经球培养物建立的培养基在该应用中效果好，并且几乎仅仅基于DMEM-Ham F12营养混合物及其补充有专有

补剂(生命技术公司(Life Technologies))、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF、FGF-2)作为核心培养基的变型[23]。最后，进一步添加有例如白蛋白、氢化可的松和/或肝素。由于3D神经球培养技术选择性地仅在功能水平利用了神经元(癌症)干细胞的固有生物特性，例如抗失巢凋亡和自我更新能力，因此明显的是该培养方法对于培养具有相同生物特性的其它类型癌症的CSC也可能证明是有用的。

结果是，试图采用用于其它癌细胞培养的神经球培养系统作为称作“肿瘤球培养”的3D肿瘤模型系统[18,19]。由于肿瘤球在结构上类似于小肿瘤-类似的结构和干细胞-以及致瘤性可在这种类型的培养中得到增强[20]，因此研究者的目的是使用肿瘤球来源的癌细胞代替来自2D标准培养的细胞。

然而，尽管球培养方法在神经(癌症)干细胞培养中能够利用所有前述技术的和生物学的优势，但是其它癌细胞类型的肿瘤球培养仍然受该培养系统中若干缺点的影响：

1)并非所有类型的癌细胞培养物在这些“神经球培养条件”下都能形成肿瘤球[24]。

2)与神经球培养形成鲜明对比，肿瘤球培养物的连续传代能力通常仅被支持到有限程度(3-5代连续传代)或者连续传代能力甚至是缺少的。

这意味着，作为不想要的结果，驱动细胞即CSC在这些培养条件下以某些方式丧失。尽管有这些存在的限制，就其作为体外肿瘤模型的有利属性而言，研究需要利用肿瘤球培养的独特优势。因此，科学家们常常被迫使用源自如下肿瘤球的癌细胞：由2D培养新建立的或者处于非常低连续传代的肿瘤球。然而，源自这种退化的肿瘤球的细胞也许已经耗尽了功能性CSC。此外，有可能新建立的肿瘤球培养物中的细胞不能与来自连续传代10代的肿瘤球培养物的细胞相比，即，低传代的新建立的肿瘤球会展示来自原始含血清的2D标准培养物的细胞的特性，而来自传代10代的连续传代肿瘤球的细胞将通过该复杂培养技术获得介导给干细胞群的所有独特性质。

由于他们追溯到经典肿瘤球培养基的配方，就支持广泛范围的癌细胞类型/CSC的培养和维持而言，已建立的市场可购买并公布的CSC培养基仍具有这些强的局限性。

CSC是一组异质且微妙的潜在慢循环细胞[25]。除了它们的干细胞特性之外，癌细胞固有的遗传和代谢异常可能是它们对扩展培养基的需求的部分原因。的确，已知，经历了转化为癌细胞的细胞广泛地适应了它们的代谢[26]。

用于已建立的CSC培养基的DMEM-Ham F12营养混合物传统上用作研发用于若干细胞类型的无血清培养基以及甚至一些化学成分确定的配方的基础。然而，如在肿瘤球培养中观察到的，DMEM-Ham F12营养混合物在更多确定的配方中不能可靠地满足异质组癌细胞的广泛可变的要求。

因此，本发明的一个目的是提供化学成分确定的细胞培养基，用于培养含CSC的细胞群为连续传代肿瘤球。

发明内容

该目的由本发明的主题所解决。本发明提供了一种用于真核细胞培养的化学成分确定的培养基，包括水、至少一种碳源、一种或更多种维生素、一种或更多种盐、一种或更多种脂肪酸、一种或更多种缓冲成分、硒和一种或更多种其它微量元素。该化学成分确定的培养基可以包括一种或更多种生长因子。可选地，该化学成分确定的培养基可以不包括生长因子。

本发明的发明人已经确定了一种化学成分确定的培养基中的必要成分，所述化学成分确定的培养基允许在标准培养环境中的广泛范围的含CSC癌细胞系的3D肿瘤球培养。根据本发明的化学成分确定的培养基优选包括多种脂肪酸和多种微量元素。根据本发明的化学成分确定的培养基使3D肿瘤球培养物能够持续增殖和连续传代，指示CSC自我更新。一旦建立了完全适应的肿瘤球培养物，细胞能够持续传代。

化学成分确定的培养基使得能够开发肿瘤球培养技术作为维持CSC的体外工具以及作为肿瘤形成模型的全部潜在的和生物学上的意义。

本发明还提供了化学成分确定的培养基用于培养癌症干细胞的用途。

附图说明

图1显示了在CSC培养基1(三角形)中相对于在用于肿瘤球培养的比较CSC培养基(菱形)中的3D肿瘤球培养的连续传代过程中MCF-7乳腺癌细胞的累积细胞群体倍增数的图。使用6-孔悬浮培养板，一式三份地按照每孔四万MCF-7细胞(10,000/ml)将MCF-7细胞铺板于各自的培养基中。根据方案每9天进行一次通过酶解法的连续传代。在培养过程中维持肿瘤球形成和增殖，10代之后没有生长率抑制的迹象，中断培养。

图2显示了在化学成分确定的培养基中的肿瘤球培养的连续传代过程中在不同代次的MCF-7细胞的肿瘤球形成效率(TFE)。将MCF-7细胞铺板于96孔u-底悬浮培养板中，每孔单一细胞。10天之后，检查所有孔的肿瘤球存在情况。对已经形成肿瘤球的所有铺板细胞的百分比进行计算(TFE，以％计)。在化学成分确定的培养基中培养成肿瘤球的MCF-7细胞的TFE在第1代(P1)是2％，但是在P4增至14％且在P9增至28％(条状)。

图3显示了在PromoCell CSC培养基2中培育的MCF-7细胞的3D培养物中第三(第3代)肿瘤球的显微图像。细胞放大倍数是100倍。

具体实施方式

为了提供对说明书和权利要求书以及术语涵盖的范围的清楚、一致的理解，提供了如下定义。

本文所用的术语“组分”(ingredient)是指能够用于细胞培养基以维持或促进细胞生长或增殖的任何化合物，不管是化学来源的还是生物来源的。术语“成分”(component)、“营养物”和“组分”能够互换使用，都意在指代此种化合物。用于细胞培养基的典型的组分包括氨基酸、盐、金属、糖、脂类、核酸、激素、维生素、脂肪酸和蛋白质等。促进或维持离体细胞生长的其它组分可以由本领域技术人员根据特定需要来进行选择。

本文所用的术语“培养基”(medium)、“细胞培养基”、“培养基”(culture medium)和“培养基配方”是指用于培养或生长细胞的营养液。

本文所用的“细胞培养物”意指在人工、体外环境中维持、培养或生长的细胞或组织。术语“培育”(cultivating)和“培养”(culturing)意思相同。

本文所用的“化学成分确定的培养基”是其中所有的组分和浓度是已知的培养基。它尤其是“无血清的”，即该培养基不含有血清(例如，胎牛血清(FBS)、人血清、马血清、山羊血清，等)。

“培养皿”是指能够为生长细胞提供无菌环境的各种尺寸的玻璃容器、塑料容器或者其它容器。例如，可以使用烧瓶、单孔或多孔平板、单孔或多孔盘或者多孔微板。

本文所用的术语“饲养”(feeding)和“培养基改变”是指替换其中培养细胞的培养基。本文所用的术语“传代”(passage)和“传代”(passaging)意指将来自先前的培养物的一些或全部的细胞转移至新鲜的细胞培养基。

本文所用的术语“微量元素”是指仅以微量存在于细胞培养基中的部分。在本发明中，该术语尤其是指诸如Se、Cu、Zn、Fe、Ag、Al、Ba、Cd、Co、Cr、Ge、Se、Br、I、Mn、F、Si、V、Mo、Ni、Rb、Sn或Zr的元素，但是也可以指包括这些元素不同氧化状态的各自的盐。

本文所用的术语“盐”或“无机盐”是指以超过微量的量存在于细胞培养基中的元素的盐。

本文所用的“微量”尤其是指浓度低于1mg/L。

术语“无血清培养条件”和“无血清条件”是指不包括任何类型的血清的细胞培养条件。

与本领域中的定义一致，根据本发明，术语“生长因子”涉及能够刺激细胞生长、增殖、愈合和细胞分化的天然存在的物质，尤其是名称中具有该术语的生长因子类诸如表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或转化生长因子(TGF)，以及细胞因子类诸如白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)。

本发明提供了一种用于真核细胞培养的化学成分确定的培养基，包括水、至少一种碳源、一种或更多种维生素、一种或更多种盐、一种或更多种生长因子、一种或更多种脂肪酸、一种或更多种缓冲成分、硒和一种或更多种其它微量元素。

根据本发明的化学成分确定的培养基是用于肿瘤球培养的有价值的工具。如实施例所示，根据本发明的化学成分确定的培养基支持3D肿瘤球形式的癌细胞培养物的连续传代。此外，它普遍适用于不同的癌细胞类型。

在肿瘤的形成过程中，当比较不同类型的癌症时，可能形成最终导致恶性肿瘤发展的异常细胞的事件/突变的异质性体现在癌细胞中发现的相同遗传和生理异质性-甚至是在单一肿瘤内的细胞中。所有主要类型的癌症的已建立的细胞系也显示可变的培养基需求。这些细胞系代表这些不同类型的恶性肿瘤的广泛接受的体外模型。化学成分确定的培养基覆盖了不同类型和组织来源(表1)的癌症中一系列可变的代谢需求。

此外，采用根据本发明的化学成分确定的培养基有可能在常规悬浮培养塑料器皿中生长癌细胞培养物。昂贵的低附着塑料器皿并不是必需的。

根据一种实施方案，化学成分确定的培养基的成分各自以足以支持癌症干细胞增殖和/或维持的浓度存在。任何组分的浓度是基于化学成分确定的培养基的总体积。

类似于用于真核细胞培养的每种培养基，根据本发明的化学成分确定的培养基含有水、至少一种碳源、一种或更多种维生素、一种或更多种盐和硒。这些成分在本文中也称作“基本培养基组分”。在制备根据本发明的化学成分确定的培养基时，基本培养基组分可以由基础培养基来提供。术语“基础培养基”是指以下的任何培养基：支持真核细胞生长的培养基，和通过添加其它组分能够用于形成根据本发明的用于细胞培养的培养基。基础培养基提供盐(例如，镁、钙、钠和钾的盐，以及可选地，微量元素的盐)以及维生素、葡萄糖、缓冲系统和必需氨基酸。能够用于本发明的基础培养基包括但不限于杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、最小必需培养基(MEM)、Eagle基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、Ham F-12、α最小必需培养基(αMEM)、Glasgow最小必需培养基(G-MEM)和伊斯科夫改良杜尔贝科培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)。

相应地，化学成分确定的培养基包括至少一种碳源。碳源优选是选自如下组的己糖：葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖。糖尤其是D-葡萄糖。碳源的浓度优选在0.45g/L至4.5g/L的范围。

另外，化学成分确定的培养基包括一种或更多种盐。盐优选自由如下构成的组：四水合硝酸钙、氯化钙、六水合二氯化镁、硫酸镁、氯化镁、氯化钾、硝酸钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠和乙酸钠。

盐优选以足以支持癌症干细胞增殖和/或维持的浓度存在。例如，盐以如下浓度包括在培养基中：范围是12mg/L至120mg/L的四水合硝酸钙，范围是9mg/L至90mg/L的六水合二氯化镁，范围是4mg/L至40mg/L的无水硫酸镁，范围是80mg/L至800mg/L的氯化钾，范围是1g/L至10g/L的氯化钠,范围是50mg/L至500mg/L的无水磷酸氢二钠，和范围是4mg/L至40mg/L无水磷酸二氢钠。

其它的基本培养基组分是一种或更多种维生素。一种或更多种维生素优选地选自D-生物素、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、生育酚醋酸酯、视黄醛、胆钙化醇、维生素K1/2和抗坏血酸(包括抗坏血酸磷酸盐)。

维生素以足以支持癌症干细胞增殖和/或维持的浓度存在。例如，维生素以如下浓度包括在培养基中：范围是0.04mg/L至0.4mg/L的D-生物素，范围是0.3mg/L至3mg/L的D-泛酸钙，范围是0.3mg/L至3mg/L的叶酸，范围是0.3mg/L至3mg/L的烟酰胺，范围是0.1mg/L至1mg/L的盐酸吡哆醛，范围是0.09mg/L至0.9mg/L的盐酸吡哆醇，范围是0.07mg/L至0.7mg/L的核黄素，范围是0.6mg/L至6mg/L的盐酸硫胺素，范围是8μg/L至80μg/L的生育酚醋酸酯，范围是0.1mg/L至1mg/L的维生素B12。

化学成分确定的培养基包括一种或更多种氨基酸。一种或更多种“氨基酸”是指氨基酸或它们的衍生物(例如氨基酸类似物)以及它们的D-型和L-型。一种或更多种氨基酸优选地选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-羟基-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸。更优选地，化学成分确定的培养基含有所有这些氨基酸。

氨基酸优选以如下限定的浓度范围包括在培养基中：范围是2mg/L至20mg/L的甘氨酸、范围是0.5mg/L至5mg/L的L-丙氨酸、范围是230mg/L至2.3g/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、范围是13mg/L至130mg/L的L-精氨酸盐酸盐、范围是15mg/L至150mg/L的L-精氨酸游离碱、范围是1.2mg/L至12mg/L的L-一水合天门冬酰胺、范围是6mg/L至60mg/L的L-无水天门冬酰胺、3mg/L至30mg/L的L-天门冬氨酸、范围是1.2mg/L至12mg/L的L-一水合半胱氨酸单盐酸盐、范围是5.5mg/L至55mg/L的L-胱氨酸二盐酸盐、范围是2mg/L至20mg/L的L-谷氨酸、范围是2.5mg/L至25mg/L的L-一水合组氨酸盐酸盐、范围是3.5mg/L至35mg/L的L-羟基-L-脯氨酸、范围是16mg/L至160mg/L的L-异亮氨酸、范围是7mg/L至70mg/L的L-亮氨酸、范围是11mg/L至110mg/L的L-赖氨酸单盐酸盐、范围是1.8mg/L至18mg/L的L-蛋氨酸、范围是7mg/L至70mg/L的L-苯丙氨酸、范围是6mg/L至60mg/L的L-脯氨酸、范围是4mg/L至40mg/L的L-丝氨酸、范围是5mg/L至50mg/L的L-苏氨酸、范围是2mg/L至20mg/L的L-色氨酸、范围是10mg/L至100mg/L的L-二水合酪氨酸二钠盐、范围是6mg/L至60mg/L的L-缬氨酸。

根据一种实施方案，化学成分确定的培养基还包括一种或更多种二肽，选自L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和甘氨酰-L-谷氨酰胺和N-乙酰-L-谷氨酰胺构成的组。

一种或更多种维生素可选自D-生物素、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、生育酚醋酸酯、维生素B12。

根据本发明，微量元素硒是基本成分。优选地，含硒的盐以40nM至400nM范围的浓度存在。化学成分确定的培养基还可包括选自铜(Cu)、铁(Fe)、锌(Zn)的标准微量元素。化学成分确定的培养基优选包括Fe。例如，化学成分确定的培养基可包括标准微量元素Cu和Fe。可选地，化学成分确定的培养基可包括Fe和Zn。更优选地，化学成分确定的培养基包括Cu、Fe和Zn。

标准微量元素优选以足以支持癌症干细胞增殖和/或维持的浓度存在。Zn优选以80nM至800nM的范围存在于化学成分确定的培养基。Cu优选以0.3nM至3.0nM的范围存在于化学成分确定的培养基。Fe优选以150nM至1.5μM的范围存在于化学成分确定的培养基。

发明人观察到除标准微量元素以外的至少一种其它微量元素的存在对于培养物中3D肿瘤球的生长是必需的。这些一种或更多种其它微量元素可选自如下构成的组：铝(Al)、钡(Ba)、溴(Br)、镉(Cd)、铬(Cr)、钴(Co)、锗(Ge)、碘(I)、锰(Mn)、镍(Ni)、氟(F)、钼(Mo)、铷(Rb)、硅(Si)、银(Ag)、锡(Sn)、钒(V)和锆(Zr)。

发明人还确定超过一种其它微量元素的存在引起3D肿瘤球的生长改善。根据一种实施方案，化学成分确定的培养基包括至少三种其它微量元素。采用至少5种其它微量元素会得到甚至更好的结果。优选地，它包括至少五种其它微量元素，更优选至少八种其它微量元素。采用含有全部如下其它微量元素的培养基可观察到3D肿瘤球培养的最好结果：Al、Ba、Br、Cd、Cr、Co、Ge、I、Mn、Ni、F、Mo、Rb、Ag、Si、Sn、V和Zr。因此，根据一种实施方案，它包括其它微量元素Al、Ba、Br、Cd、Cr、Co、Ge、I、Mn、Ni、F、Mo、Rb、Ag、Si、Sn、V和Zr。

微量元素优选作为它们的涉及的水溶性盐被引入至化学成分确定的培养基。例如，铝作为氯化铝、硝酸铝或硫酸铝。钡作为碳酸钡、氯化钡或醋酸钡。溴作为溴化镁、溴化钾或溴化钠。镉作为氯化镉、硝酸镉或硫酸镉。铬作为氯化铬、硝酸铬或硫酸铬。钴作为氯化钴、硝酸钴或硫酸钴。铜作为氯化铜、硝酸铜或硫酸铜。氟作为氟化镁、氟化钾或氟化钠。锗作为氧化锗。碘作为碘化镁、碘化钾或碘化钠。铁作为氯化铁、柠檬酸铁、硝酸铁或硫酸铁。锰作为氯化锰、硝酸锰或硫酸锰。钼作为氯化钼、钼酸铵或钼酸钠。镍作为氯化镍、硝酸镍或硫酸镍。铷作为氯化铷、硝酸铷或硫酸铷。银作为碳酸银、硝酸银或硫酸银。硒作为亚硒酸钠、硒酸钠或硒代蛋氨酸。硅作为硅酸钾或硅酸钠。锡作为氯化锡或焦磷酸锡。钒作为氯化钒、硫酸氧钒或钒酸铵。锌作为氯化锌、硝酸锌或硫酸锌。锆作为氯氧化锆。

微量元素优选以足以支持癌症干细胞增殖和/或维持的浓度存在于化学成分确定的培养基。其它微量元素的优选浓度范围在下面给出。

Se优选以40nM至400nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Mn优选以0.1nM至1nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Si优选以130nM至1.3μM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Mo优选以0.7nM至7nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。V优选以2nM至22nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Ni优选以0.2nM至2nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Sn优选以0.1nM至1nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Al优选以1.5nM至15nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Ag优选以0.3nM至3nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Ba优选以1.5nM至15nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Br优选以0.4nM至4nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Cd优选以4nM至40nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Co优选以1nM至10nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Cr优选以0.5nM至5nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。F优选以12nM至120nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Ge优选以2nM至20nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。I优选以0.25nM至2.5nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Rb优选以4nM至40nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。Zr优选以3.5nM至35nM的范围存在于化学成分确定的培养基中。

不受理论的约束，一种或更多种脂肪酸应通过促进在严格生长的癌细胞中脂质相关的细胞成分的产生来对肿瘤球培养产生影响。在成分不确定的培养基中，这些化合物传统上通过添加血清来大量提供。

根据本发明的一种或更多种脂肪酸可选自饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。例如，一种或更多种脂肪酸可选自如下构成的组：花生四烯酸、亚麻酸、亚油酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻油酸、棕榈油酸、皂酸(sapienic acid)、反油酸、异油酸、反式亚油酸、二十碳五烯酸、芥酸、辛酸、癸酸、月桂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸。化学成分确定的培养基中使用任何这些脂肪酸，应该都能实现3D肿瘤球培养。

发明人发现采用含有脂肪酸花生四烯酸、亚麻酸、油酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸的化学成分确定的培养基能够获得3D肿瘤球生长的好的结果。因此，根据一种实施方案，一种或更多种脂肪酸选自花生四烯酸、亚麻酸、油酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸构成的组。

如实施例所示，采用多于一种脂肪酸获得了3D肿瘤球培养的优异结果。根据一种实施方案，化学成分确定的培养基包括至少两种脂肪酸。优选地，它包括至少三种脂肪酸，更优选至少四种脂肪酸。根据一种实施方案，它包括花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸。

脂肪酸优选以足以支持癌症干细胞增殖和/或维持的浓度存在于化学成分确定的培养基中。脂肪酸的总浓度优选在1至100μg/L的范围。单独脂肪酸的合适浓度范围在下面给出。花生四烯酸优选以0.8μg/L至8μg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，亚油酸优选以3μg/L至30μg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，亚麻酸优选以1.2μg/L至12μg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，肉豆蔻酸优选以2.5μg/L至25μg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，油酸优选以3μg/L至30μg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，棕榈酸优选以2.5μg/L至25μg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，硬脂酸优选以3.8μg/L至38μg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中。

根据本发明的化学成分确定的培养基可尤其含有其它微量元素Al、Ba、Br、Cd、Cr、Co、Ge、I、Mn、Ni、F、Mo、Rb、Si、Ag、Sn、V和Zr以及脂肪酸花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸。

根据本发明的化学成分确定的培养基可包括适合于降低3D悬浮培养的剪切力的一种或更多种试剂。这类试剂例如是表面活性剂诸如

F-68、

188和泊洛沙姆188，或者大分子诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙二醇(PEG)。

根据一种实施方案，根据本发明的化学成分确定的培养基还包括至少一种表面活性剂。表面活性剂改善脂肪酸的溶解性。表面活性剂可进一步降低3D悬浮培养的剪切力。表面活性剂优选是非离子的。非离子型表面活性剂具有如下优点：它们使亲脂性物质溶解于水基溶液中，例如细胞培养基，以将这些亲脂性物质以生物可利用的形式提供给细胞。

表面活性剂(尤其非离子型表面活性剂)的总浓度优选在1mg/L至1g/L的范围，更优选在50mg/L至500mg/L的范围，更优选在100至300mg/L的范围。

非离子型表面活性剂可选自聚山梨醇酯、

F-68、

188和泊洛沙姆188构成的组。根据一种实施方案，表面活性剂是

F-68。该表面活性剂对细胞是无毒的，并且具有能够有效降低剪切力并抑制悬浮培养中细胞附着于培养器皿表面的有益效果。

F-68优选以40至400mg/L的浓度范围存在。

根据一种实施方案，表面活性剂是

80。该表面活性剂具有如下有益效果：它在应用的浓度对细胞是无毒的，对水基溶液(例如细胞培养基)中的亲脂性物质具有强的乳化/分散作用。

80优选以1至10mg/L的浓度范围存在。

根据一种实施方案，化学成分确定的培养基包括这两种非离子型表面活性剂

80和

F-68。

根据一种实施方案，化学成分确定的培养基可以是无生长因子的。也就是，它不含有用作生长因子或者细胞因子的任何成分，生长因子诸如表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或转化生长因子(TGF)，细胞因子诸如白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)。

如实施例所示，特别是因为微量元素和脂肪酸的存在，根据本发明的化学成分确定的培养基的组成在生理上是非常均衡的以至于它即使在没有任何生长因子的情况下仍能支持3D肿瘤球生长。就肿瘤球培养来说，缺少生长因子对于特定实验问题而言是有利的。

根据替代实施方案，化学成分确定的培养基包括一种或更多种生长因子。一种或更多种生长因子存在于培养基中会带来增强的增殖(参见实施例)。化学成分确定的培养基中的一种或更多种生长因子可选自如下构成的组：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、白血病抑制因子(LIF)。根据一种实施方案，化学成分确定的细胞培养基中的一种或更多种生长因子是EGF和bFGF。

根据一种实施方案的化学成分确定的培养基还包括胰岛素或胰岛素替代物、转铁蛋白或转铁蛋白替代物、和/或白蛋白或白蛋白替代物。这些成分中的每一种都优选以足以支持癌症干细胞增殖和/或维持的浓度存在于化学成分确定的培养基中。

术语“白蛋白替代物”是指白蛋白的任何功能等同物。例子包括但不限于牛垂体提取物、植物水解产物(例如，大米/大豆水解产物)、胎球蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白(HSA)、或者其它动物来源的白蛋白、雏鸡提取物、牛胚胎提取物、

I和

II。白蛋白替代物的其它例子是聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG)。

术语“转铁蛋白替代物”是指在补充物中的转铁蛋白的任何功能等同物。转铁蛋白替代物的例子包括但不限于铁螯合化合物。可被使用的铁螯合化合物包括但不限于如下物质的铁螯合物：乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA)、甲磺酸去铁胺、二巯基丙醇、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)和反式-1,2-环己二胺-N,N,N′,N′-四乙酸(CDTA)、金精三羧酸，以及柠檬酸铁螯合物和硫酸亚铁螯合物或

术语“胰岛素替代物”是指胰岛素的功能等同物。胰岛素替代物的例子包括但不限于胰岛素样生长因子(IGF)组的生长因子，例如，IGF-1、IGF-2、

R3IGF-I，以及微量金属胰岛素类似物，例如Zn²⁺。

化学成分确定的细胞培养基的其它成分优选以如下浓度范围使用：腐胺二盐酸盐优选以0.015mg/L至0.15mg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，丙酮酸钠优选以3.14mg/L至31.4mg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，硫辛酸优选以0.015mg/L至0.15mg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，胸苷优选以0.025mg/L至0.25mg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，白蛋白优选以1.2g/L至12g/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，胰岛素优选以0.1mg/L至1.0mg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，转铁蛋白优选以9mg/L至90mg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，次黄嘌呤优选以0.16mg/L至1.6mg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，对氨基苯甲酸优选以0.05mg/L至0.5mg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，肌醇优选以7.5mg/L至75mg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中，氯化胆碱优选以0.7mg/L至7.0mg/L的范围存在于化学成分确定的培养基中。

优选地，根据本发明的化学成分确定的培养基包括白蛋白、胰岛素和转铁蛋白。

根据一种实施方案，化学成分确定的培养基包括缓冲成分，选自HEPES、无机碳酸氢盐、无机磷酸盐、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)。

根据一种实施方案，化学成分确定的培养基含有至少三种缓冲成分。三种缓冲成分优选是HEPES、无机碳酸氢盐和无机磷酸盐。已发现，这些缓冲成分的组合能够改善pH稳定性(在通过细胞代谢抑制培养基酸化方面)，从而允许不做代次之间培养基的改变同时保持细胞健康。这对于有效维持3D悬浮培养物来说是显著的技术优点并有利于规模扩大和自动化。

根据本发明的化学成分确定的培养基优选额外地包括一种或更多种自由基清除剂。此类自由基清除剂的例子是谷胱甘肽、生育酚醋酸酯、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、维生素L-抗坏血酸或其稳定的磷酸盐形式。

根据一种实施方案，化学成分确定的培养基的其它组分是生育酚醋酸酯，优选采用足以支持癌症干细胞增殖和/或维持的浓度。生育酚醋酸酯优选以范围是0.0084mg/L至0.084mg/L的浓度存在于化学成分确定的培养基中。生育酚醋酸酯作为自由基清除剂具有使有害的脂质过氧化作用最小化的优点。根据一种实施方案，化学成分确定的培养基含有浓度是2.14mg/L至21.42mg/L的谷胱甘肽。

根据一种实施方案，化学成分确定的培养基的其它组分是胆固醇，优选采用足以支持癌症干细胞增殖和/或维持的浓度。依据特定类型细胞的生长率和生物合成能力，胆固醇可以是生长限制营养素。特别严格生长的细胞(例如癌细胞)可以得益于胆固醇的补充，实现依靠高效细胞膜合成的快速细胞团块生产。在成分不确定的传统培养基中，附加的胆固醇由血清补充来提供。胆固醇优选以范围是0.07mg/L至0.75mg/L的浓度存在于化学成分确定的培养基中。

根据本发明的化学成分确定的培养基优选不含复杂的成分不确定的专有补充剂，诸如

此外，根据一种实施方案，根据本发明的化学成分确定的培养基不含氢化可的松。据建议，氢化可的松可促进干细胞分化。根据一种实施方案，细胞培养基不含肝素，肝素是不明确的动物源性物质。

本发明的一种优选实施方案是包括如下成分的化学成分确定的培养基。四水合硝酸钙、六水合二氯化镁、无水硫酸镁、氯化钾、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钠、Zn、Cu、Fe、Se、Mn、Si、Mo、V、Ni、Sn、M、Al、Ag、Ba、Br、Cd、Co、Cr、F、Ge、I、Rb、Zr、甘氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-精氨酸盐酸盐、L-精氨酸游离碱、L-一水合天门冬酰胺、L-无水天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-一水合半胱氨酸单盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、L-一水合组氨酸单盐酸盐、L-羟基-L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸单盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-二水合酪氨酸二钠盐、L-缬氨酸、D-生物素、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、生育酚醋酸酯、维生素B12、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、腐胺二盐酸盐、丙酮酸钠、硫辛酸、胸苷、白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、次黄嘌呤、对氨基苯甲酸、肌醇、氯化胆碱、HEPES、L-还原型谷胱甘肽、D-无水葡萄糖、胆固醇、

80、

F-68、苯酚红钠盐、碳酸氢钠、水至最终体积。

另一优选实施方案含有相同的组分，但额外地含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。

优选地，成分以如下浓度存在：四水合硝酸钙6.18 10¹mg/L、六水合二氯化镁4.1810¹mg/L、无水硫酸镁2.09 10¹mg/L、氯化钾4.06 10²mg/L、氯化钠5.56 10³mg/L、无水磷酸氢二钠2.48 10²mg/L、无水磷酸二氢钠2.06 10¹mg/L、Zn 4.13 10²nM、Cu 1.56nM、Fe7.31 10²nM、Se 1.95 10²nM、Mn 5.53 10^-1nM、Si 6.4 10²nM、Mo 3.48nM、V 1.08 10¹nM、Ni9.64 10^-1nM、Sn 5.70 10^-1nM、Al 7.46nM、Ag 1.40nM、Ba 7.99nM、Br 1.82nM、Cd 2.1110¹nM、Co 5.50nM、Cr 2.83nM、F 6.00 10¹nM、Ge 9.88nM、I1.33nM、Rb 1.90 10¹nM、Zr 1.8010¹nM、甘氨酸9.56mg/L、L-丙氨酸2.54mg/L,L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1.14 10³mg/L、L-精氨酸盐酸盐6.31 10¹mg/L、L-精氨酸游离碱7.6010¹mg/L、L-一水合天门冬酰胺6.06mg/L、L-无水天门冬酰胺2.85 10¹mg/L、L-天门冬氨酸1.65 10¹mg/L、L-一水合半胱氨酸单盐酸盐5.84mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐2.75 10¹mg/L、L-谷氨酸1.04 10¹mg/L、L-一水合组氨酸单盐酸盐1.32 10¹mg/L、L-羟基-L-脯氨酸1.85 10¹mg/L、L-异亮氨酸7.94 10¹mg/L、L-亮氨酸3.36 10¹mg/L、L-赖氨酸单盐酸盐5.61 10¹mg/L、L-蛋氨酸9.19mg/L、L-苯丙氨酸3.3610¹mg/L、L-脯氨酸3.01 10¹mg/L、L-丝氨酸2.14 10¹mg/L、L-苏氨酸2.44 10¹mg/L、L-色氨酸9.32mg/L、L-二水合酪氨酸二钠盐5.23 10¹mg/L、L-缬氨酸3.11 10¹mg/L、D-生物素1.8810^-1mg/L、D-泛酸钙1.42mg/L、叶酸1.56mg/L、烟酰胺1.58mg/L、盐酸吡哆醛5.70 10^-1mg/L、盐酸吡哆醇4.41 10^-1mg/L、核黄素3.58 10^-1mg/L、盐酸硫胺素2.86mg/L、生育酚醋酸酯4.20 10^-2mg/L、维生素B12 5.21 10^-1mg/L、花生四烯酸3.80 10^-3mg/L、亚油酸1.62 10^-2mg/L、亚麻酸6.00 10^-3mg/L、肉豆蔻酸1.30 10^-2mg/L、油酸1.60 10^-2mg/L、棕榈酸1.2010^-2mg/L、硬脂酸1.90 10^-2mg/L、腐胺二盐酸盐7.50 10^-2mg/L、丙酮酸钠1.57 10¹mg/L、硫辛酸7.4810^-2mg/L、胸苷1.21 10^-1mg/L、白蛋白6.00 10³mg/L、胰岛素4.97 10^-1mg/L、转铁蛋白4.4510¹mg/L、次黄嘌呤7.98 10^-1mg/L、对氨基苯甲酸2.61 10^-1mg/L、肌醇3.84 10¹mg/L、氯化胆碱3.41mg/L、HEPES 4.56 10³mg/L、L-还原型谷胱甘肽1.07 10¹mg/L、D-无水葡萄糖2.2510³mg/L、胆固醇3.74 10^-1mg/L、

80 3.96mg/L、

F-68 1.90 10²mg/L、苯酚红钠盐5.93mg/L、碳酸氢钠2.39 10³mg/L、水至最终体积。具有生长因子的细胞培养基的实施方案含有浓度是1.10 10^-2mg/L的表皮生长因子和浓度是3.60 10^-2mg/L的碱性成纤维细胞生长因子。

化学成分确定的培养基的组分可采用本领域任何已知方法来组合。

根据本发明的化学成分确定的培养基可按照如下方案制备。首先，将90％最终体积的细胞培养级水置于混合容器中。随后在持续搅拌条件下加入称重量的或合适量的涉及的物质的储备液。最后，调整体积并使用0.22μm过滤装置对培养基进行过滤消毒。

本发明还提供了化学成分确定的培养基用于培养CSC的用途，尤其是包括CSC的癌细胞培养物。可采用根据本发明的化学成分确定的培养基进行培养的癌细胞系的例子是U-87MG、MCF-7、HT-29、HT 1080、HepG2、A-549、Panc-1、LNCaP和A-431。

根据一种实施方案，CSC培养按照3D悬浮培养执行。

CSC培养可采用含生长因子的化学成分确定的培养基和无生长因子的化学成分确定的培养基。

本发明还涉及包括癌细胞(尤其包括癌症干细胞)和根据本发明的化学成分确定的培养基的细胞培养系统。根据细胞培养系统的一种实施方案，癌细胞是原发性肿瘤细胞。根据细胞培养系统的另一种实施方案，癌细胞是源自选自如下组织的癌细胞系：脑、乳房、结肠、结缔组织、肝、肺、胰腺、前列腺和皮肤。癌细胞系尤其选自U-87MG、MCF-7、HT-29、HT1080、HepG2、A-549、Panc-1、LNCaP和A-431。根据优选实施方案，癌细胞系是MCF-7。

本发明还涉及确立癌细胞培养的方法，包括如下步骤：

a)提供预先从患者获得的肿瘤样本，

b)在根据本发明的化学成分确定的培养基中培养肿瘤样本，其中培养引起肿瘤细胞增殖。

肿瘤样本的准备优选不包括对人体或动物体进行外科手术或治疗的任何步骤。肿瘤样本优选源自选自如下的任何组织：脑、乳房、结肠、结缔组织、肝、肺、胰腺、前列腺和皮肤。

此外，本发明涉及在3D悬浮培养中增殖癌细胞的方法，包括如下步骤：

a)提供3D肿瘤球形式的癌细胞，

b)将3D肿瘤球加入到根据本发明的化学成分确定的培养基中，

c)在化学成分确定的培养基中培养3D肿瘤球，其中培养引起肿瘤细胞增殖和/或肿瘤球生长。

根据该方法的一种实施方案，癌细胞是源自选自如下组织的癌细胞系：脑、乳房、结肠、结缔组织、肝、肺、胰腺、前列腺和皮肤。癌细胞系尤其选自U-87MG、MCF-7、HT-29、HT1080、HepG2、A-549、Panc-1、LNCaP和A-431。根据优选的实施方案，癌细胞系是MCF-7。

该方法还可包括肿瘤球的传代。

本发明进一步由如下非限制性实施例定义。

实施例

材料

癌症干细胞培养基

磷酸盐缓冲盐水w/o Ca⁺⁺/Mg⁺⁺(PBS,PromoCell#C-40232)

Detach-试剂盒(胰蛋白酶-EDTA和胰蛋白酶中和溶液；PromoCell#C-41210)

6-孔悬浮培养板(例如Greiner Bio One,#657 185)

实施例1-根据本发明的CSC培养基的制备

首先，将90％终体积细胞培养级水置于混合容器中。除了碳酸氢钠，随后在持续搅拌下按照如下限定的顺序加入成分的称重量或合适量的储备液。当成分都进入溶液之后，加入碳酸氢钠并最终调整体积，并且对培养基进行过滤灭菌。最终的培养基具有如下组成：四水合硝酸钙6.18 10¹mg/L、六水合二氯化镁4.18 10¹mg/L、无水硫酸镁2.09 10¹mg/L、氯化钾4.06 10²mg/L、氯化钠5.56 10³mg/L、无水磷酸二氢钠2.48 10²mg/L、无水磷酸氢二钠2.06 10¹mg/L、Zn 4.13 10²nM、Cu 1.56nM、Fe 7.31 10²nM、Se 1.95 10²nM、Mn 5.53 10^- ¹nM、Si 6.4 10²nM、Mo 3.48nM、V 1.08 10¹nM、Ni 9.64 10^-1nM、Sn 5.70 10^-1nM、Al7.46nM、Ag 1.40nM、Ba 7.99nM、Br 1.82nM、Cd 2.11 10¹nM、Co 5.50nM、Cr 2.83nM、F 6.0010¹nM、Ge 9.88nM、I 1.33nM、Rb 1.90 10¹nM、Zr 1.80 10¹nM、glycine 9.56mg/L、L-丙氨酸2.54mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1.14 10³mg/L、L-精氨酸盐酸盐6.31 10¹mg/L,L-精氨酸游离碱7.60 10¹mg/L,L-一水合天门冬酰胺6.06mg/L、L-无水天门冬酰胺2.85 10¹mg/L、L-天门冬氨酸1.65 10¹mg/L、L-一水合半胱氨酸单盐酸盐5.84mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐2.7510¹mg/L、L-谷氨酸1.04 10¹mg/L、L-一水合组氨酸盐酸盐1.32 10¹mg/L、L-羟基-L-脯氨酸1.85 10¹mg/L、L-异亮氨酸7.9410¹mg/L、L-亮氨酸3.36 10¹mg/L、L-赖氨酸单盐酸盐5.6110¹mg/L、L-蛋氨酸9.19mg/L、L-苯丙氨酸3.36 10¹mg/L,L-脯氨酸3.01 10¹mg/L,L-丝氨酸2.14 10¹mg/L,L-苏氨酸2.44 10¹mg/L、L-色氨酸9.32mg/L、L-二水合酪氨酸二钠盐5.2310¹mg/L、L-缬氨酸3.11 10¹mg/L、D-生物素1.88 10^-1mg/L、D-泛酸钙1.42mg/L、叶酸1.56mg/L、烟酰胺1.58mg/L、盐酸吡哆醛5.70 10^-1mg/L、盐酸吡哆醇4.41 10^-1mg/L、核黄素3.58 10^-1mg/L、盐酸硫胺素2.86mg/L、生育酚醋酸酯4.20 10^-2mg/L、维生素B12 5.21 10^- ¹mg/L、花生四烯酸3.80 10^-3mg/L、亚油酸1.62 10^-2mg/L、亚麻酸6.00 10^-3mg/L、肉豆蔻酸1.30 10^-2mg/L、油酸1.60 10^-2mg/L、棕榈酸1.20 10^-2mg/L、硬脂酸1.90 10^-2mg/L、腐胺二盐酸盐7.50 10^-2mg/L、丙酮酸钠1.57 10¹mg/L、硫辛酸7.48 10^-2mg/L、胸苷1.21 10^-1mg/L、白蛋白6.00 10³mg/L、胰岛素4.97 10^-1mg/L、转铁蛋白4.45 10¹mg/L、次黄嘌呤7.98 10^-1mg/L、对氨基苯甲酸2.61 10^-1mg/L、肌醇3.84 10¹mg/L、氯化胆碱3.41mg/L、表皮生长因子1.1010^-2mg/L、碱性成纤维细胞生长因子3.60 10^-2mg/L、HEPES 4.56 10³mg/L、L-还原型谷胱甘肽1.07 10¹mg/L、D-无水葡萄糖2.25 10³mg/L、胆固醇3.74 10^-1mg/L、

80 3.96mg/L、

F-68 1.90 10²mg/L、酚红钠盐5.93mg/L、碳酸氢钠2.3910³mg/L。

实施例2-乳腺癌细胞系由贴壁2D培养向3D肿瘤球培养的转移

乳腺癌细胞系MCF-7由成分不确定的标准培养基中的贴壁2D培养向根据实施例1的CSC-培养基(PromoCell CSC培养基)中的3D肿瘤球培养的转移使用下面的方案进行测试。作为参考，在相同的实验中同时测试用于癌细胞系肿瘤球培养的比较CSC培养基。比较CSC培养基是由Promab Biotechnologies Inc生产的Cancer Stem Premium^TM。该培养基的确切组成未公开。

在该方案中，两种培养基，CSC培养基1和比较CSC培养基，被称作CSC培养基。

2.1收获贴壁细胞

使用标准流程(即，使用Detach试剂盒采用胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶消化)分离含人CSC的贴壁生长的癌细胞系MCF-7的细胞。细胞80–90％汇合并且情况良好。以300×g对细胞悬液离心5分钟，并吸出上层清液。将细胞重悬于5ml的CSC培养基中。

2.2细胞计数

使用ViaCount^TM试剂和Muse^TM细胞分析仪(Millipore)对有活力的MCF-7细胞进行计数，用CSC培养基调整体积以获得1百万细胞/ml的浓度。

2.3设置肿瘤球培养

MCF-7细胞以10,000细胞/ml接种于合适的悬浮培养皿中，也就是，6-孔悬浮培养板的每个孔中4ml CSC培养基中接种40,000细胞。

2.4使肿瘤球生长

培养物孵育9(8至10)天。按照每3至4天加入体积是培养体积的50％的新鲜CSC培养基。不去除培养基。

实施例3-3D肿瘤球培养物的连续传代

根据下面的方案每9(8至10)天使肿瘤球在CSC培养基中进行3D肿瘤球培养的连续传代。采用将肿瘤球分离为单细胞并重新铺板的方法进行传代。

3.1收集肿瘤球

使用血清移液吸管将含有肿瘤球的培养基转移至15ml锥形管中。

3.2肿瘤球的重力沉降

室温下通过重力沉降10分钟使球下沉。吸出上层清液，但是大约200μl留在锥形管中。

3.3清洗肿瘤球

使用等体积的PBS重复沉降(步骤3.2)。轻轻吸出PBS，留大约200μl在锥形管中。3.4肿瘤球的酶消化

将1ml胰蛋白酶-EDTA加入至肿瘤球中，并在室温下孵育3分钟。

3.5剩余细胞团块的分解

使用1000μl移液器吸头上下吸取肿瘤球10至15次以产生单细胞悬浮液。正常吸出细胞悬浮液，但是当排出细胞时移液器吸头在管底部稍微倾斜。产生的剪切力有利于分散任何剩余的细胞团块。进行目视检查以确认没有大的细胞团块留存。分散之后立即加入两倍体积的胰蛋白酶中和溶液(TNS)。

3.6测定细胞数和活力

使用新鲜CSC培养基将体积加至5ml，并测定细胞数和活力。细胞以300×g旋转下降5分钟。丢弃上层清液，将细胞以1百万细胞/ml重悬于新鲜培养基中。

3.7细胞的铺板

按10,000细胞/ml将细胞重新接种于新鲜的悬浮培养皿中。为此，使用了6-孔平板，每个孔4ml培养基具有40,000细胞。为了继续进行连续传代，从步骤2.4开始重复完整的流程。

3.8结果

图1代表性地概括了进行的测试的结果。由2D标准培养向商购获得的比较CSC培养基转移的MCF-7细胞的确产生了缓慢地生长的肿瘤球。然而，这些肿瘤球停止增殖并甚至在1代之前就开始衰退。

相反，在本文提供的培养基中培养的肿瘤球稳定地增殖并作为肿瘤球培养物进行了10次连续传代。检测停止，但培养物没有显示出衰退的迹象。

当在本文描述的培养基和比较CSC培养基中培养时，用HT1080纤维肉瘤细胞系获得了可比较的结果。虽然4次连续传代之后比较培养基中肿瘤球培养物停止生长，但本文提供的培养基中的培养物能够连续传代10次而没有任何衰退迹象(未显示)。

实施例4-测定PromoCell CSC培养基中MCF-7细胞的肿瘤球形成效率(TFE)

对于按照实施例1和2培养的MCF-7细胞，在肿瘤球培养物连续传代过程中在不同传代次数对肿瘤球形成效率(TFE)进行重复测定。对使用化学成分确定的培养基的MCF-7肿瘤球培养物的连续传代1代、4代和9代(P1、P4和P9)测定TFE。

在肿瘤球培养物传代过程中，通过酶解离获得单细胞(参见实施例3，步骤3.4)。在P1、P4和P9，将肿瘤球解离得到的单细胞铺板于两个96孔u-底悬浮培养板中：每个孔(具有100μl化学成分确定的培养基)一个单细胞。5至6天之后，加入100μl新鲜培养基。10天之后，检查全部192个孔是否存在肿瘤球，并对所有铺板的细胞(其已形成肿瘤球)的百分比进行计算。能够形成肿瘤球的细胞的百分比是细胞的TFE。

在化学成分确定的培养基中培养为肿瘤球的MCF-7细胞的TFE在P1是2％，但在P4增加至14％且在P9增加至28％(参见图2)。由于只有CSC被认为是具有由单细胞形成肿瘤球的能力，因此这些结果表明MCF-7细胞作为肿瘤球培养物在化学成分确定的培养基中的连续传代以次数/代数依赖方式显著扩增了培养物中CSC的数目和百分比。

实施例5-PromoCell CSC培养基中癌细胞系的3D肿瘤球培养物

为了验证所提供的培养基对于维持不同来源的癌细胞系作为3D肿瘤球培养物的广泛适用性，对列于表1中的代表最常见类型人类恶性肿瘤的细胞系进行持续增殖和连续传代性检测。所有被测细胞系都可扩增为肿瘤球培养物并显示10次连续传代的持续增殖。所有培养物终止于第10代，没有任何生长率抑制的迹象。

表1：检测以PromoCell CSC培养基连续传代的细胞类型的列表

组织	检测的细胞系	细胞系来源
			脑	U-87MG	人脑的IV级恶性胶质瘤/星形细胞瘤
乳房	MCF-7	转移性人类乳腺癌的胸膜积液
			结肠	HT-29	人结肠癌
连接组织	HT 1080	人纤维肉瘤
			肝	HepG2	人肝脏的肝细胞
肺	A-549	人肺癌
			胰腺	Panc-1	人胰管的上皮瘤
前列腺	LNCaP	人类前列腺癌的淋巴结转移
			皮肤	A-431	人类皮肤的表皮样癌

实施例6-PromoCell CSC培养基2中癌细胞系的3D肿瘤球培养

下面的实施例显示根据本发明的化学成分确定的培养基甚至在缺少生长因子的情况下也支持细胞系的3D肿瘤球生长。

制备第二细胞培养基，即PromoCell CSC培养基2，其具有与实施例1的PromoCellCSC培养基相同的成分，区别仅在于不包括表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。省略前述两种生长因子，按照实施例1中PromoCell CSC培养基来制备PromoCell CSC培养基2。

检测PromoCell CSC培养基2支持两种不同癌细胞系的肿瘤球生长的能力。MCF-7是源自人类乳腺癌的细胞系，细胞系HT-29是源自结肠癌的细胞系。

按照实施例3的方案使用无生长因子的PromoCell CSC培养基2代替含有生长因子的PromoCell CSC培养基来培养两细胞系MCF-7和HT-29。

相应地，对细胞系进行三次连贯(连续)传代，MCF-7的恒定传代间隔为14至16天，HT-29的恒定传代间隔为10至12天。两细胞系显示了明显的增殖，每次传代大约三倍倍增(three population doublings)。

第三代之后，对细胞系进行分析。培养物没有显示生长抑制的迹象。MCF-7细胞培养物的图像显示于图3(100倍放大)中。由图3可以得出：即使没有添加生长因子，即EGF和bFGF，在MCF-7细胞培养中培养物也能够强健地形成肿瘤球并使肿瘤球生长。此外，形成球的细胞显示均一且健康的形态模式。

结合培养物持续不变的增殖率(尽管有些降低)，这些结果表明：即使是化学成分确定的培养基的无生长因子的变型，也能支持人癌细胞系持续的连续3D肿瘤球培养。

得益于前面的描述和相关附图提供的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本文所阐述的本发明的许多修改和其它实施方案。因此，应当理解的是，本发明并不限于已公开的特定实施方案，并且修改和其它实施方案旨在包括在所附权利要求的范围之内。虽然本文采用特定的术语，但是它们仅用于一般性和描述性意义，并非用于限制的目的。参考文献

1.Sanges,D.and M.P.Cosma,Reprogramming cell fate to pluripotency:thedecision-making signalling pathways.Int J Dev Biol,2010.54(11-12):p.1575-87.

2.Tu,S.M.,Cancer:a"stem-cell"disease？Cancer Cell Int,2013.13(1):p.40.

3.Bonnet,D.and J.E.Dick,Human acute myeloid leukemia is organized asa hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.Nat Med,1997.3(7):p.730-7.

4.Jordan,C.T.,Cancer stem cell biology:from leukemia to solidtumors.Curr Opin Cell Biol,2004.16(6):p.708-12.

5.Clarke,M.F.,et al.,Cancer stem cells--perspectives on currentstatus and future directions:AACR Workshop on cancer stem cells.Cancer Res,2006.66(19):p.9339-44.

6.Lamb,R.,et al.,Antibiotics that target mitochondria effectivelyeradicate cancer stem cells,across multiple tumor types:treating cancer likean infectious disease.Oncotarget,2015.6(7):p.4569-84.

7.Sheridan,S.D.,V.Surampudi,and R.R.Rao,Analysis of embryoid bodiesderived from human induced pluripotent stem cells as a means to assesspluripotency.Stem Cells Int,2012.2012:p.738910.

8.Zhao,W.,et al.,Embryonic stem cell markers.Molecules,2012.17(6):p.6196-236.

9.Adil,M.,et al.,Aldehyde Dehydrogenase:Cancer and Stem Cells.2012.

10.Pearce,D.J.,et al.,Characterization of cells with a high aldehydedehydrogenase activity from cord blood and acute myeloid leukemiasamples.Stem Cells,2005.23(6):p.752-60.

11.Greve,B.,et al.,Flow cytometry in cancer stem cell analysis andseparation.Cytometry A,2012.81(4):p.284-93.

12.Stuelten,C.H.,et al.,Complex display of putative tumor stem cellmarkers in the NCI60tumor cell line panel.Stem Cells,2010.28(4):p.649-60.

13.Liu,Y.,et al.,Lack of correlation of stem cell markers in breastcancer stem cells.Br J Cancer,2014.110(8):p.2063-71.

14.Kim,H.S.,Y.J.Sung,and S.Paik,Cancer Cell Line Panels EmpowerGenomics-Based Discovery of Precision Cancer Medicine.Yonsei Med J,2015.56(5):p.1186-98.

15.Kondo,T.,Stem cell-like cancer cells in cancer celllines.Inflammation and Regeneration,2007.27(5):p.506-511.

16.Masters,J.R.,Human cancer cell lines:fact and fantasy.Nat Rev MolCell Biol,2000.1(3):p.233-6.

17.Fillmore,C.M.and C.Kuperwasser,Human breast cancer cell linescontain stem-like cells that self-renew,give rise to phenotypically diverseprogeny and survive chemotherapy.Breast Cancer Res,2008.10(2):p.R25.

18.Min,S.O.,et al.,Ideal sphere-forming culture conditions tomaintain pluripotency in a hepatocellular carcinoma cell lines.Cancer CellInt,2015.15:p.95.

19.Qiu,X.,et al.,Characterization of sphere-forming cells with stem-like properties from the small cell lung cancer cell line H446.CancerLetters.323(2):p.161-170.

20.Grimshaw,M.J.,et al.,Mammosphere culture of metastatic breastcancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.Breast Cancer Res,2008.10(3):p.R52.

21.Hurt,E.M.,et al.,Identification of vitronectin as an extrinsicinducer of cancer stem cell differentiation and tumor formation.Stem Cells,2010.28(3):p.390-8.

22.Martin,M.J.,et al.,Human embryonic stem cells express animmunogenic nonhuman sialic acid.Nat Med,2005.11(2):p.228-32.

23.Guerrero-Cazares,H.,K.L.Chaichana,and A.Quinones-Hinojosa,Neurosphere culture and human organotypic model to evaluate brain tumor stemcells.Methods Mol Biol,2009.568:p.73-83.

24.Calvet,C.Y.,F.M.Andre,and L.M.Mir,The culture of cancer cell linesas tumorspheres does not systematically result in cancer stem cellenrichment.PLoS One,2014.9(2):p.e89644.

25.Moore,N.and S.Lyle,Quiescent,slow-cycling stem cell populations incancer:a review of the evidence and discussion of significance.J Oncol,2011.2011.

26.Pecqueur,C.,et al.,Targeting metabolism to induce cell death incancer cells and cancer stem cells.Int J Cell Biol,2013.2013:p.805975.

27.Akrap,N.,et al.Identification of Distinct Breast Cancer Stem CellPopulations Based on Single-Cell Analyses of Functionally Enriched Stem andProgenitor Pools.Stem Cell Reports,2016.6(1):p.121-36.

28.Kim,S.and C.M.Alexander.Tumorsphere assay provides more accurateprediction of in vivo responses to chemotherapeutics.Biotechnol Lett,2014.36(3):p.481-8.

Claims

1.一种用于3D肿瘤球培养的化学成分确定的培养基，包括水、至少一种碳源、一种或更多种维生素、一种或更多种盐、一种或更多种脂肪酸、一种或更多种缓冲成分、和微量元素:

铝(Al)，浓度范围为1.5nM至15nM；

钡(Ba)，浓度范围为1.5nM至15nM；

溴(Br)，浓度范围为0.4nM至4nM；

镉(Cd)，浓度范围为4nM至40nM；

钴(Co)，浓度范围为1nM至10nM；

铬(Cr)，浓度范围为0.5nM至5nM；

锗(Ge)，浓度范围为2nM至20nM；

碘(I)，浓度范围为0.25nM至2.5nM；

氟(F)，浓度范围为12nM至120nM；

镍(Ni)，浓度范围为0.2nM至2nM；

锰(Mn)，浓度范围为0.1nM至1nM；

钼(Mo)，浓度范围为0.7nM至7nM；

铷(Rb)，浓度范围为4nM至40nM；

硒(Se)，浓度范围为40nM至400nM；

银(Ag)，浓度范围为0.3nM至3nM；

硅(Si)，浓度范围为130nM至1.3μM；

锡(Sn)，浓度范围为0.1nM至1nM；

钒(V)，浓度范围为2nM至22nM；

锆(Zr)，浓度范围为3.5nM至35nM。

2.根据权利要求1所述的化学成分确定的细胞培养基，其中所述化学成分确定的细胞培养基不包括任何生长因子。

3.根据权利要求1所述的化学成分确定的细胞培养基，包括一种或更多种生长因子。

4.根据权利要求1所述的化学成分确定的培养基，其中所述一种或更多种脂肪酸选自花生四烯酸、亚麻酸、亚油酸、油酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸，各自以足以支持癌症干细胞增殖和/或维持的浓度存在。

5.根据权利要求1所述的化学成分确定的培养基，还包括至少一种表面活性剂。

6.根据权利要求5所述的化学成分确定的培养基，包括两种非离子型表面活性剂吐

80和普郎尼

F-68。

7.根据权利要求3所述的化学成分确定的培养基，其中所述一种或更多种生长因子选自表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、白血病抑制因子(LIF)。

8.根据权利要求1所述的化学成分确定的培养基，还包括胰岛素、转铁蛋白和/或白蛋白。

9.根据权利要求1所述的化学成分确定的培养基，其中所述缓冲成分选自HEPES、无机碳酸氢盐、无机磷酸盐、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)。

10.根据权利要求1所述的化学成分确定的培养基，包括至少三种缓冲成分。

11.根据权利要求1所述的化学成分确定的培养基，还包括胆固醇和/或生育酚醋酸酯。

12.根据权利要求4所述的化学成分确定的培养基，包括所述脂肪酸中的至少两种。

13.根据权利要求5所述的化学成分确定的培养基，其中所述表面活性剂是非离子型表面活性剂，其选自聚山梨醇酯、普郎尼

F-68、普郎尼

188、泊洛沙姆188。

14.根据权利要求3所述的化学成分确定的培养基，其中所述化学成分确定的细胞培养基包括EGF和bFGF。

15.根据权利要求4所述的化学成分确定的培养基，包括所述脂肪酸中的至少三种。

16.根据权利要求1所述的化学成分确定的培养基在癌症干细胞的培养中作为3D悬浮培养的用途。

17.一种细胞培养系统，包括癌症干细胞和根据权利要求1所述的化学成分确定的培养基。