CN112771153A - 动物细胞培养用添加物、培养用培养基和培养方法 - Google Patents

动物细胞培养用添加物、培养用培养基和培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及含有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖的动物细胞培养用添加物、在培养基成分的基础上进一步含有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖的动物细胞培养用培养基、以及包括使用前述培养基对动物细胞进行培养或者在培养物中添加前述添加物的动物细胞培养方法。根据本发明，尤其在使用无血清培养基、低白蛋白培养基进行动物细胞的培养时，能够提高动物细胞的增殖性。

Description

动物细胞培养用添加物、培养用培养基和培养方法
技术领域
本发明涉及可提高动物细胞的增殖性的动物细胞培养用添加物、培养用培养基和培养方法。
发明背景
以胚胎干细胞、人工多能性干细胞等干细胞为代表，很多动物细胞是通过使用基质胶、玻连蛋白、层粘连蛋白等人型重组基质等作为基础材料的粘附培养来增殖维持的。
但为了将动物细胞用于研究、物质生产、医疗等，作为高效增殖、大量培养的方法，使用的不是上述粘附培养，而是以细胞团块状态进行悬浮培养的方法。
动物细胞的培养中，为了补充生长因子等成分，一般有必要在培养液中添加5(w/v)％～20(w/v)％左右的血清。
但血清价格高，血清中含有包括未知成分的500种以上蛋白质，因而很多情况下，难以进行作用于细胞的因子的分子水平的研究、由细胞产生的物质的分离/纯化。此外，血清中还有可能含有朊病毒、病毒等。所以，动物细胞的培养中，很多时候也会使用不含血清的无血清培养基、减少了白蛋白含量的低白蛋白培养基。使用无血清培养基、低白蛋白培养基对动物细胞进行培养时，为了提高细胞的增殖性，添加转铁蛋白等蛋白质、各种生长因子、胰岛素等激素等。
然而，根据培养的动物细胞的种类，增殖所需的生长因子、激素等的种类和组合是不同的，难以用低成本获得可促进各种动物细胞的增殖的添加物。
所以，正在寻找可高效促进各种动物细胞的增殖的动物细胞培养用添加物。
发明内容
发明所要解决的课题
因此，本发明的目的在于，提供尤其在使用无血清培养基、低白蛋白培养基进行动物细胞的培养时可提高动物细胞的增殖性的培养用添加物、以及培养用培养基和培养方法。
用于解决课题的方法
为了解决上述课题，本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过添加色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸等氨基酸或葡萄糖、或者通过添加前述氨基酸和葡萄糖，动物细胞的增殖性提高，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下方案。
[1]一种动物细胞培养用添加物，含有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖。
[2]根据[1]所述的添加物，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸组成的组的1种或2种以上。
[3]根据[1]所述的添加物，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸组成的组的1种或2种以上。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的添加物，动物细胞为干细胞。
[5]根据[4]所述的添加物，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞组成的组的1种或2种以上。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的添加物，其为动物细胞悬浮培养用添加物。
[7]根据[6]所述的添加物，动物细胞悬浮培养为细胞团块状态的悬浮培养。
[8]根据[1]～[5]中任一项所述的添加物，其为动物细胞粘附培养用添加物。
[9]一种动物细胞培养用培养基，在培养基成分的基础上进一步含有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖。
[10]根据[9]所述的培养基，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸组成的组的1种或2种以上。
[11]根据[9]所述的培养基，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸组成的组的1种或2种以上。
[12]根据[9]～[11]中任一项所述的培养基，pH为7以上。
[13]根据[9]～[12]中任一项所述的培养基，动物细胞为干细胞。
[14]根据[13]所述的培养基，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞组成的组的1种或2种以上。
[15]根据[9]～[14]中任一项所述的培养基，其为动物细胞悬浮培养用培养基。
[16]根据[15]所述的培养基，动物细胞悬浮培养为细胞团块状态的悬浮培养。
[17]根据[9]～[14]中任一项所述的培养基，其为动物细胞粘附培养用培养基。
[18]一种动物细胞的培养方法，包括：用添加有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖的动物细胞培养用培养基对动物细胞进行培养，或者在动物细胞培养物中添加氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖。
[19]根据[18]所述的培养方法，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸组成的组的1种或2种以上。
[20]根据[18]所述的培养方法，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸组成的组的1种或2种以上。
[21]根据[18]～[20]中任一项所述的培养方法，动物细胞为干细胞。
[22]根据[21]所述的培养方法，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞组成的组的1种或2种以上。
[23]根据[18]～[22]中任一项所述的培养方法，其为动物细胞的悬浮培养方法。
[24]根据[23]所述的培养方法，使动物细胞形成细胞团块来进行悬浮培养。
[25]根据[18]～[22]中任一项所述的培养方法，其为动物细胞的粘附培养方法。
发明效果
根据本发明，能够提供可适当提高动物细胞、尤其是干细胞的增殖性的动物细胞培养用添加物，能够提供可适当提高动物细胞的增殖性的动物细胞培养用培养基和动物细胞的培养方法。
附图说明
图1为显示试验例1中，本发明的培养用添加物在人源人工多能性干细胞1210B2株的悬浮培养中对增殖性的影响的图。
图2为显示试验例2中，本发明的培养基在人源人工多能性干细胞1210B2株的粘附培养中对增殖性的影响的图。
图3为显示试验例2中，本发明的培养基在人源人工多能性干细胞201B7株的粘附培养中对增殖性的影响的图。
图4为显示试验例3中，本发明的培养方法在人源人工多能性干细胞1210B2株的悬浮培养中对增殖性的影响的图。
图5为显示试验例3中，本发明的培养方法在人源人工多能性干细胞1231A3株的悬浮培养中对增殖性的影响的图。
具体实施方式
本发明提供动物细胞培养用添加物(以下在本说明书中也称为“本发明的添加物”)。
这里，“动物细胞培养用添加物”是指适合于动物细胞的培养的添加物，是指在培养动物细胞时添加在培养基或培养物中的添加物。
本发明中，作为动物细胞，可列举哺乳动物来源的正常细胞、干细胞和前体细胞。
作为哺乳动物来源的正常细胞，可列举精子、卵子等生殖细胞、构成生物体的体细胞。
作为构成生物体的体细胞的例子，可列举但不限于以下的细胞：成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、周细胞、树突状细胞、脂肪细胞、间质细胞、上皮细胞、表皮细胞(例如角化细胞(keratinocyte)、角质细胞等)、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经细胞、胶质细胞、Oligodendrocyte(少突胶质细胞)、Microglia(小胶质细胞)、Astrocyte(星形胶质细胞)、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如平滑肌细胞、骨骼肌细胞)、胰腺β细胞、黑素细胞和单核细胞等。
该体细胞中，包括例如从皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰腺、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液(包括脐带血)、骨髓、心脏、眼、脑或者神经组织等任意组织采集的细胞。
干细胞是指具有自我复制能力和分化为他种细胞的能力、能够无限增殖的细胞。
可列举例如：造血干细胞、卫星细胞、神经干细胞、间质系干细胞、乳腺干细胞、嗅粘膜干细胞、神经冠干细胞、肝干细胞、胰干细胞、肌肉干细胞、生殖干细胞、肠道干细胞、毛囊干细胞等成体干细胞，胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工多能性干细胞(iPS细胞)等多能性干细胞，癌干细胞等。
前体细胞是处于从前述干细胞向特定的体细胞、生殖细胞分化的过程阶段的细胞，可列举卫星细胞、胰前体细胞、血管前体细胞、血管内皮前体细胞、造血前体细胞(脐带血来源的CD34阳性细胞等)等。
本发明的添加物优选作为干细胞的培养用添加物提供，更优选作为成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞的培养用添加物来提供，进一步优选作为胚胎干细胞和人工多能性干细胞的培养用添加物来提供。
本发明的添加物含有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖。
本发明的添加物中含有的氨基酸是具有氨基和羧基的两性有机化合物，优选为作为生物体蛋白质的构成单元的α－氨基酸，可列举具有烷基的中性氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、具有羟基的氨基酸(丝氨酸、苏氨酸)、含有硫的氨基酸(甲硫氨酸、半胱氨酸)、具有酰胺基的氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有亚氨基的氨基酸(脯氨酸)、具有芳香族基的氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)等。
此外，半胱氨酸的二聚物即胱氨酸如果添加于培养基、培养物则被还原为半胱氨酸，所以能够与半胱氨酸同样地使用。
本发明的添加物中，就氨基酸而言，可以单独含有1种，也可以组合含有2种以上。
从动物细胞的增殖性提高效果的观点出发，作为氨基酸，更优选含有选自由色氨酸(2－氨基－3－(吲哚啉)丙酸)、丝氨酸(2－氨基－3－羟基丙酸)、半胱氨酸(2－氨基－3－磺胺丙酸)、胱氨酸(3,3’－二硫代双(2－氨基丙酸))、甲硫氨酸((S)－4－(甲基硫代)－2－氨基酪酸)和精氨酸(2－氨基－5－胍基戊酸)组成的组的1种或2种以上，进一步优选含有色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸这5种氨基酸。
此外，从动物细胞的增殖性提高效果的观点出发，除了上述色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸以外，还可以列举组氨酸(2－氨基－3－(1H－咪唑－4－基)丙酸)、异亮氨酸(2－氨基－3－甲基戊酸)、亮氨酸(2－氨基－4－甲基戊酸)、赖氨酸(2,6－二氨基己酸)、苯丙氨酸(2－氨基－3－苯基丙酸)、缬氨酸(2－氨基－3－甲基丁酸)作为优选氨基酸。
因此，本发明的另一方式中，更优选含有选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸组成的组的1种或2种以上，进一步优选含有色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸这11种氨基酸。
作为本发明的添加物中含有的氨基酸，L－型、D－型、DL－型中的任一种均可使用，优选为L－型和DL－型，进一步优选为L－型。
此外，上述氨基酸不仅可以使用游离体，也可以使用盐的形态。本说明书中的术语“氨基酸”、“色氨酸”、“丝氨酸”、“半胱氨酸”、“胱氨酸”、“甲硫氨酸”、“精氨酸”、“组氨酸”、“异亮氨酸”、“亮氨酸”、“赖氨酸”、“苯丙氨酸”和“缬氨酸”的概念也包括它们各自的盐。作为盐的形态，可以列举酸加成盐、与碱的盐等，优选选择药理学上允许的盐。
作为上述氨基酸的盐，具体可列举与无机碱、有机碱、无机酸、有机酸的盐和与氨基酸的盐等。作为与无机碱的盐，可列举例如与锂、钠、钾等碱金属的盐、与镁、钙等碱土金属的盐、铵盐等。作为与有机碱的盐，可列举例如与单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等链烷醇胺的盐、与吗啉、哌啶等杂环式胺的盐等。作为与无机酸的盐，可列举例如与卤化氢(盐酸、溴化氢、碘化氢等)、硫酸、硝酸、磷酸等的盐等。作为与有机酸的盐，可列举例如：与甲酸、乙酸、丙酸等一元羧酸的盐，与草酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸等饱和二羧酸的盐，与马来酸、富马酸等不饱和二羧酸的盐，与柠檬酸等三羧酸的盐，与α－酮戊二酸等酮酸的盐等。作为与氨基酸的盐，可列举：与甘氨酸、丙氨酸等脂肪族氨基酸的盐，与苯丙氨酸等芳香族氨基酸的盐，与精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的盐，与天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸的盐，与焦谷氨酸等形成内酰胺的氨基酸的盐等。
为了本发明的目的，作为上述氨基酸，优选为游离体。此外，也优选使用盐酸盐。
本发明中，游离体和盐形态的上述氨基酸可以使用从天然存在的动植物等提取纯化的氨基酸、或者通过化学合成法、发酵法、酶法或基因重组法等得到的氨基酸中的任一种，也可以利用由各个公司提供的市售制品。
本发明的添加物中氨基酸的含量相对于氨基酸的全部量通常为0.01重量％～100重量％，优选为0.1重量％～100重量％。
需说明的是，本发明的添加物中含有的氨基酸中，存在以盐的形态含有的氨基酸时，对于该氨基酸，通过换算成游离体的含量而算出上述氨基酸的含量。
本发明的添加物含有色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸这5种氨基酸时，优选以它们分别换算成游离体的含量的重量比(色氨酸:丝氨酸:半胱氨酸(使用胱氨酸时，用换算成还原生成的半胱氨酸的量表示):甲硫氨酸:精氨酸)为1:0.01～100:0.01～100:0.01～100:0.01～100的方式含有，更优选以成为1:0.1～10:0.1～10:0.1～10:0.1～10的方式含有。
此外，本发明的添加物含有色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸这11种氨基酸时，优选以它们分别换算成游离体的含量的重量比(色氨酸:丝氨酸:半胱氨酸(使用胱氨酸时，用换算成还原生成的半胱氨酸的量表示):甲硫氨酸:精氨酸:组氨酸:异亮氨酸:亮氨酸:赖氨酸:苯丙氨酸:缬氨酸)为1:0.01～100:0.01～100:0.01～100:0.01～100:0.01～100:0.01～100:0.01～100:0.01～100:0.01～100:0.01～100的方式含有，更优选以成为1:0.1～10:0.1～10:0.1～10:0.1～10:0.1～10:0.1～10:0.1～10:0.1～10:0.1～10:0.1～10的方式含有。
本发明的添加物中含有的葡萄糖是果实、蜂蜜中游离存在的己醛醣，在动物细胞的培养中作为碳源使用。
本发明中，作为葡萄糖，可以通过从果实、蜂蜜等分离纯化、以及淀粉的水解等制造而使用，也可以使用由各个公司提供的市售制品。
本发明的添加物中葡萄糖的含量通常为1重量％～100重量％，优选为10重量％～100重量％。
本发明的添加物中，可以含有氨基酸和葡萄糖中的任一种，也可以同时含有两者。
从动物细胞的增殖性提高效果的观点出发，优选含有氨基酸和葡萄糖双方，更优选含有选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸组成的组的1种或2种以上与葡萄糖，进一步优选含有色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸与葡萄糖。
此外，本发明的另一方式中，更优选含有选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸组成的组的1种或2种以上与葡萄糖，进一步优选含有色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸与葡萄糖。
需说明的是，本发明的添加物中，氨基酸和葡萄糖优选以氨基酸的全部量(换算成游离体的量)与葡萄糖的重量比[氨基酸的全部量(换算成游离体的量)：葡萄糖]为1:1～1:500的方式含有，更优选以为1:5～1:50的方式含有。
本发明中，可以将氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖直接作为本发明的添加物，此外也可以溶解或分散在水、多元醇等溶剂中，制成水溶液、分散液等液体形态，或者与赋形剂、粘合剂等一般在制剂化中使用的添加剂混合而制成粉末状、颗粒状、锭剂状等固体形态的添加物。
此外，还可以将上述氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖与碳水化合物、无机盐等以下所述培养基成分的一部分混合，制备成本发明的添加物。
从容易在动物细胞培养用培养基中添加、且容易与培养基混和的观点出发，本发明的添加物优选以液态、粉末状、颗粒状、锭剂状等形态来提供。
本发明的添加物优选进行灭菌处理而制备。灭菌处理的方法没有特别限制，可列举例如121℃20分钟的高压灭菌器灭菌、放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、过滤器过滤灭菌等，可以根据本发明的添加物的形态等适当选择。
本发明的添加物可以添加在后述动物细胞培养用培养基的成分中而用于动物细胞培养用培养基的制备，此外，也可以添加在后述动物细胞培养用培养基中而使用。或者，本发明的添加物还可以添加在动物细胞的培养物中而使用。
相对于动物细胞培养用培养基或者动物细胞的培养物，本发明的添加物以按氨基酸的浓度(换算成游离氨基酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～900000mg/L/天、优选为1mg/L/天～10000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～600mg/L/天、按葡萄糖的浓度计通常为0.1g/L/天～900g/L/天、优选为1g/L/天～200g/L/天、更优选为1g/L/天～20g/L/天的方式添加。
需说明的是，本发明的添加物含有选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸组成的组的1种或2种以上作为氨基酸的情况下，相对于动物细胞培养用培养基或者动物细胞的培养物，本发明的添加物以按色氨酸的浓度(换算成游离色氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～11000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按丝氨酸的浓度(换算成游离丝氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～425000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按半胱氨酸或胱氨酸的浓度(换算成游离半胱氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～280000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按甲硫氨酸的浓度(换算成游离甲硫氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～55000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、以按精氨酸的浓度(换算成游离精氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～150000mg/L/天、优选为1mg/L/天～2000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～200mg/L/天的方式添加。
此外，本发明的添加物含有选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸组成的组的1种或2种以上作为氨基酸的情况下，相对于动物细胞培养用培养基或者动物细胞的培养物，本发明的添加物以按色氨酸的浓度(换算成游离色氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～11000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按丝氨酸的浓度(换算成游离丝氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～425000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按半胱氨酸或胱氨酸的浓度(换算成游离半胱氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～280000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按甲硫氨酸的浓度(换算成游离甲硫氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～55000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按精氨酸的浓度(换算成游离精氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～150000mg/L/天、优选为1mg/L/天～2000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～200mg/L/天、按组氨酸的浓度(换算成游离组氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～41900mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按异亮氨酸的浓度(换算成游离异亮氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～41200mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按亮氨酸的浓度(换算成游离亮氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～22400mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按赖氨酸的浓度(换算成游离赖氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～900000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按苯丙氨酸的浓度(换算成游离苯丙氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～29600mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、按缬氨酸的浓度(换算成游离缬氨酸的浓度)计通常为0.1mg/L/天～85000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天的方式添加。
添加有本发明的添加物的动物细胞培养用培养基通常含有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等糖、淀粉等碳水化合物作为碳源，此外还含有氨基酸、肽、蛋白质作为氮源。
因此，添加有本发明的添加物的动物细胞培养用培养基可以原本就含有氨基酸、葡萄糖，该培养基中氨基酸最初的含有浓度(换算成游离氨基酸的浓度)通常为0.1mg/L～5g/L左右，该培养基中葡萄糖最初的含有浓度通常为0.1g/L～10g/L左右。
通过使用添加本发明的添加物而制备的动物细胞培养用培养基、以及将本发明的添加物添加在动物细胞培养用培养基中对动物细胞进行培养、或者在动物细胞的培养物中添加本发明的添加物，能够提高动物细胞的增殖性。尤其在用无血清培养基或低白蛋白培养基对动物细胞进行培养时，本发明的添加物对于提高动物细胞的增殖性而言是合适的。
本发明的添加物也可以用于使动物细胞悬浮在培养基中而增殖的悬浮培养和使动物细胞附着于培养容器而增殖的粘附培养中的任一培养。
使用本发明的添加物进行动物细胞的悬浮培养时，能够形成大小受到控制的细胞团块，能够以细胞团块状态进行悬浮培养。
本发明还提供一种动物细胞培养用培养基(以下在本说明书中也称为“本发明的培养基”)。
对于“动物细胞”，本发明的添加物如上所述。
需说明的是，本发明的培养基优选作为干细胞培养用培养基提供，更优选作为成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞培养用培养基提供，进一步优选作为胚胎干细胞和人工多能性干细胞培养用培养基提供。
本发明的培养基在动物细胞的培养中通常使用的培养基成分的基础上进一步含有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖。
关于本发明的培养基中进一步含有的氨基酸和葡萄糖，本发明的添加物如上所述。
本发明中，氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖可以是在作为上述本发明的添加物制备的状态下与前述培养基成分一起含有，或者也可以直接添加在培养基成分中。
本发明的培养基中，氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖相对于本发明的添加物以上述浓度添加在培养基成分中。
作为本发明的培养基中可含有的培养基成分，可以列举动物细胞的培养中通常使用的培养基成分，可列举例如：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖，天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸等氨基酸，白蛋白、转铁蛋白等蛋白质，甘胺酰甘胺酰甘氨酸、大豆肽等肽，血清，维生素A、B族维生素(硫胺素、核黄素、吡哆醇、氰钴胺、生物素、叶酸、泛酸、烟酰胺等)、维生素C、维生素E等维生素，油酸、花生四烯酸、亚油酸等脂肪酸，胆固醇等脂质，氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钠等无机盐，锌、铜、硒等微量元素，N,N－双(2－羟基乙基)－2－氨基乙烷磺酸(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES))、4－(2－羟基乙基)－1－哌嗪乙烷磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES))、N－[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine(Tricine))等缓冲剂，两性霉素B、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素等抗生素，I型胶原、II型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚－L－赖氨酸、聚－D－赖氨酸等细胞粘附因子和细胞外基质成分，白细胞介素、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)－α、转化生长因子(TGF)－β、血管内皮生长因子(VEGF)、激活素A等细胞因子和生长因子，地塞米松、氢化可的松、雌二醇、黄体酮、胰高血糖素、胰岛素等激素等；可以根据培养的动物细胞的种类，选择使用适当的成分。
需说明的是，血清中有可能含有未知因子、朊病毒、病毒等，因此，本发明的培养基优选不含血清作为培养基成分。此外，本发明的培养基作为人细胞培养用培养基制备的情况下，优选不含来源于人以外的动物的成分。
此外，本发明中，氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖也可以添加在作为用于上述哺乳动物来源的正常细胞、干细胞和前体细胞等动物细胞的培养的通用培养基中，制成本发明的培养基。
作为哺乳动物细胞来源的正常细胞的培养中使用的培养基，可列举杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)、Ham F12培养基(Ham’sNutrient Mixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy 5A培养基(McCoy’s 5A medium)、最低必需培养基(Minimum Essential Medium)(MEM)、伊格尔最低必需培养基(Eagle’s MinimumEssential Medium)(EMEM)、α改良型伊格尔最低必需培养基(alpha Modified Eagle’sMinimum Essential Medium)(αMEM)、罗斯威尔公园纪念研究所(Roswell Park MemorialInstitute)(RPMI)1640培养基、伊斯科夫改良杜尔贝科培养基(Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium)(IMDM)、MCDB131培养基、威廉姆斯培养基E(William’s Medium E)、费舍尔培养基(Fischer’s Medium)等。
作为干细胞的培养中使用的培养基，可列举STEMPRO(注册商标)hESC SFM培养基(生命技术(Life Technologies)公司)、mTeSR1培养基(干细胞技术(STEMCELLTechnologies)公司)、TeSR2培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、TeSR－E8培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、Essential 8培养基(生命技术(Life Technologies)公司)、HEScGRO(商标)Serum－Free Medium for hES cells(密理博(Millipore)公司)、PluriSTEM(商标)Human ES/iPS Medium(EMD密理博(EMD Millipore)公司)、NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(以色列生物工业Beit-Haemek(BiologicalIndustries Israel Beit-Haemek)株式会社)、NutriStem(商标)XF/FF Culture Medium(施泰金(Stemgent)公司)、AF NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(以色列生物工业Beit-Haemek(Biological Industries Israel Beit-Haemek)株式会社)、S－medium(DS医药生物医学株式会社)、StemFit(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)、hESF9培养基、hESF－FX培养基、CDM培养基、DEF－CS 500Xeno－Free 3D Spheroid Culture Medium(赛拉提斯(Cellartis)公司)、StemFlex培养基(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司)等。
作为前体细胞的培养中使用的培养基，可列举HPGM(商标)(凯姆布雷克斯公司)、QBSF－60(质量生物学公司)等。
本发明中，氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖优选添加在干细胞培养用培养基中，更优选添加在成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞培养用培养基中，进一步优选添加在胚胎干细胞和人工多能性干细胞培养用培养基中。
此外，为了本发明的目的，更优选使用无血清培养基或者低白蛋白培养基，此外，在用于人的细胞培养用培养基时，优选不含来源于人以外的动物成分的培养基(无异源培养基)。
需说明的是，本发明的培养基可以原本就含有葡萄糖、氨基酸作为培养基成分。这种情况下，培养基中氨基酸最初的含有浓度(换算成游离氨基酸的浓度)通常为0.1mg/L～5g/L左右，葡萄糖最初的含有浓度通常为0.1g/L～10g/L左右。
进一步，从也在动物细胞的悬浮培养中使用的观点出发，本发明的培养基优选制成溶液、分散液等液体形态。
此外，本发明的培养基中，优选将用于动物细胞培养时的pH控制在7以上。
本发明的培养基的pH可以通过在本发明的培养基含有的培养基成分中、或者在添加于本发明的培养基的本发明的添加物中添加pH调节剂、缓冲剂来调节。
作为该pH调节剂或缓冲剂，只要能够将本发明的培养基的pH控制在7以上即可，没有特别限定，可列举例如碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢钾、三羟基甲基氨基甲烷等，根据培养基中含有的成分适当选择使用。
需说明的是，本发明的培养基的pH是在培养温度下通过通用的方法测定的。例如，如果是液体培养基，可以通过玻璃电极法来测定；如果是固体培养基，可以使用扁平型电极来测定或者在进行形成半流动状态等的预处理后使用一般的玻璃电极来测定。
本发明的培养基可以将按照公知的组成从上述培养基成分适当选择的成分与氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖添加在水等溶剂中溶解或分散而制备。
此外，本发明的培养基也可以在由各公司、各机构提供的上述动物细胞培养用培养基中添加氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖并溶解或分散而制备。
进一步，本发明的培养基还可以制成下述形态：以与使用时的浓度相比浓缩的状态、冷冻干燥的粉末状的状态制备，使用时，用水等溶剂稀释或者在水等溶剂中溶解或分散而使用。
本发明的培养基优选实施上述那样的灭菌处理而制备。
本发明的培养基在动物细胞的悬浮培养和粘附培养中均可使用。将本发明的培养基用于动物细胞的悬浮培养时，能够形成大小受到控制的细胞团块，适合进行细胞团块状态的悬浮培养。
通过使用本发明的培养基，在悬浮培养、粘附培养中均能够提高动物细胞的增殖性。
本发明的培养基优选用于干细胞的培养，更优选用于成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞的培养，进一步优选用于胚胎干细胞和人工多能性干细胞的培养。
进一步，本发明提供一种动物细胞的培养方法(以下在本说明书中也称为“本发明的培养方法”)。
本发明的培养方法包括用添加有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖的动物细胞培养用培养基对动物细胞进行培养。或者，本发明的培养方法包括将氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖添加在动物细胞的培养物中。
需说明的是，本发明中，可以进行动物细胞的悬浮培养和粘附培养中的任一种。特别是，本发明的培养方法能够形成大小受到控制的细胞团块，适合于细胞团块状态的悬浮培养。
关于“添加有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖的动物细胞培养用培养基”，本发明的添加物和本发明的培养基的相关信息如上所述，本发明中，添加于动物细胞培养用培养基的氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖可以作为上述本发明的添加物制备添加，也可以是氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖直接添加在动物细胞培养用培养基中。
此外，本发明的培养方法中，氨基酸和葡萄糖分别在本发明的添加物中以上述浓度添加在动物细胞培养用培养基或培养物中。
需说明的是，进行动物细胞的粘附培养时，优选使用基础材料。作为该基础材料，可以使用动物细胞的粘附培养中通常使用的基础材料，例如可以使用基质胶等基底膜基质、玻连蛋白、层粘连蛋白等人型重组基质。
关于动物细胞，如上文中本发明的添加物中所述。
本发明的培养方法中，动物细胞的培养可以按照通常的悬浮培养或者粘附培养方法来进行。
即，根据培养方式(悬浮培养或粘附培养)和培养规模，适当使用细胞培养用平板、细胞培养瓶、生物反应器等培养容器或培养装置，在上述本发明的培养基或添加有本发明的添加物的动物细胞培养用培养基中接种动物细胞，通常在25℃～39℃、优选在33℃～39℃、通常在4体积％～10体积％、优选在4体积％～6体积％二氧化碳的存在下、此外通常在1体积％～25体积％、优选在4体积％～20体积％氧的存在下、通常进行1天～30天、优选进行2天～14天的培养。需说明的是，每2～3天、或者1天1次或多次进行培养基更换。
培养基更换通过下述方法来进行：在悬浮培养时，通过离心分离、过滤使动物细胞与培养基分离后，在动物细胞中添加新的培养基；或者，通过进行离心分离、过滤使动物细胞适当浓缩后，在浓缩细胞液中添加新的培养基。
上述离心分离时的重力加速度(G)通常为50G～1,000G、优选为100G～500G，过滤中使用的过滤器的细孔大小(直径)通常为10μm～200μm。
粘附培养时的培养基更换可以如下进行：通过吸取等将培养基除去，在动物细胞中添加新的培养基。
本发明中，动物细胞的悬浮培养可以进行搅拌、振荡、回流、气体通风等而实施。
搅拌可以使用生物反应器、带有搅拌叶片的培养槽等来进行，通常以10rpm～2,000rpm、优选以40rpm～1,000rpm的搅拌速度进行。
振荡可以使用振荡机、振荡培养机来进行，通常以10rpm～500rpm、优选以50rpm～250rpm的振荡速度进行。
回流可以使用蠕动泵、油管泵等来进行，通常以10μL/分钟～1,000mL/分钟、优选以1mL/分钟～100mL/分钟的流速进行。作为回流用的管，使用有机硅、潜水料(氯丁橡胶)、Marprene(聚丙烯/乙丙橡胶)等制的蠕动泵用管、油管泵用管等。
气体通风可以使用微型喷射器、过滤喷射器等各种喷射器来进行，通常可以以1mL/分钟～1,000mL/分钟、优选以50mL/分钟～200mL/分钟的通风量进行。
为了高效获得大小受到控制的细胞团块，动物细胞的悬浮培养优选进行搅拌或振荡而实施。
通过悬浮培养培养的动物细胞可以通过离心分离或者使用过滤器的过滤来回收。
离心分离在50G～1,000G、优选在100G～500G进行1分钟～10分钟左右。
此外，过滤可以使用具有直径10μm～200μm左右的细孔的过滤器来进行。
通过粘附培养培养的动物细胞可以将培养基吸去，通过例如使用胰蛋白酶溶液或者胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)溶液进行处理而从培养容器剥离后，通过离心分离或者使用过滤器的过滤来回收。
培养、回收的动物细胞优选使用ステム－セルバンカー(STEM－CELLBANKER)(日本全药工业株式会社)等含有冷冻保护剂的冷冻用培养基在液氮中保存。
通过本发明的培养方法，在悬浮培养、粘附培养中均能够提高动物细胞的增殖性。
需说明的是，本发明的培养方法优选用于干细胞的培养，可以更优选用于成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞的培养，可以进一步优选用于胚胎干细胞和人工多能性干细胞的培养。
[实施例]
以下，通过实施例进一步详细地对本发明进行说明。
[实施例1]动物细胞培养用添加物
将D－葡萄糖(Nacalai Tesque株式会社，16806-25)直接作为本发明的添加物(实施例1)。
[实施例2]动物细胞培养用添加物
将L－色氨酸(味之素株式会社)、L－丝氨酸(味之素株式会社)、L－半胱氨酸(日本蛋白质株式会社)、L－甲硫氨酸(味之素株式会社)和L－精氨酸(味之素株式会社)按1:1:1:1:2的重量比(L－色氨酸:L－丝氨酸:L－半胱氨酸:L－甲硫氨酸:L－精氨酸)混合，作为本发明的添加物(实施例2)。
[实施例3]动物细胞培养用添加物
将L－色氨酸(味之素株式会社)、L－丝氨酸(味之素株式会社)、L－半胱氨酸(日本蛋白质株式会社)、L－甲硫氨酸(味之素株式会社)、L－精氨酸(味之素株式会社)和D－葡萄糖(Nacalai Tesque株式会社，16806-25)按1:1:1:1:2:100的重量比(L－色氨酸:L－丝氨酸:L－半胱氨酸:L－甲硫氨酸:L－精氨酸：D－葡萄糖)混合，作为本发明的添加物(实施例3)。
[试验例1]人源人工多能性干细胞(iPS)的悬浮培养中本发明的添加物的效果的评价
使用微型生物反应器(ambr15(赛多利斯(sartorius)公司，001-0881)，在14mL含有10μM的Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)(富士胶片和光纯药株式会社，034-24024)的ステムフィット(StemFit)(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)中将iPS细胞1210B2株(iPSAcademiaJapan株式会社)按2×105cells/mL的细胞密度接种，在37℃、pH＝7.2、二氧化碳浓度＝5体积％、溶解氧浓度＝20体积％、搅拌速度＝300rpm的条件下搅拌培养。
接种第2天以后，每天将70％的培养基用ステムフィット(StemFit)(注册商标)AK03N培养基更换，按D－葡萄糖的浓度计以2g/L/天的浓度添加实施例1的本发明的添加物，按L－色氨酸、L－丝氨酸、L－半胱氨酸和L－甲硫氨酸计分别为20mg/L/天、按L－精氨酸计为40mg/L/天的浓度添加实施例2的本发明的添加物，按L－色氨酸、L－丝氨酸、L－半胱氨酸和L－甲硫氨酸计分别为20mg/L/天、按L－精氨酸计为40mg/L/天、按D－葡萄糖计为2g/L/天的浓度添加实施例3的本发明的添加物，继续培养。
需说明的是，作为对照，未添加任何添加物，同样地进行培养基更换，继续培养。
添加实施例1～3的各添加物而培养时、以及对于对照，在培养第6天，使用生死细胞自动分析仪(Vi－CELL(注册商标)XR(贝克曼库尔特公司))测定活细胞数。将测定结果示于图1。
如图1所示，在iPS细胞的培养物中分别添加了实施例1～3的添加物时，与对照相比，确认到活细胞数的增加。
因此，确认通过5种氨基酸(L－色氨酸、L－丝氨酸、L－半胱氨酸、L－甲硫氨酸和L－精氨酸)或葡萄糖的添加，iPS细胞的增殖性提高。
此外，通过添加5种氨基酸与葡萄糖双方，确认获得相加性的iPS细胞增殖性提高效果。
[实施例4]动物细胞培养用培养基
在ステムフィット(StemFit)(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)中以2g/L的浓度添加D－葡萄糖(和光纯药工业株式会社，045-31167)，作为实施例4的动物细胞培养用培养基。
[实施例5]动物细胞培养用培养基
在ステムフィット(StemFit)(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)中,按各20mg/L的浓度添加L－色氨酸(味之素株式会社)、L－丝氨酸(味之素株式会社)、L－半胱氨酸(日本蛋白质株式会社)和L－甲硫氨酸(味之素株式会社)、并按40mg/L的浓度添加L－精氨酸(味之素株式会社)，作为实施例5的动物细胞培养用培养基。
[实施例6]动物细胞培养用培养基
在ステムフィット(StemFit)(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)中，按各20mg/L的浓度添加L－色氨酸(味之素株式会社)、L－丝氨酸(味之素株式会社)、L－半胱氨酸(日本蛋白质株式会社)和L－甲硫氨酸(味之素株式会社)、按40mg/L的浓度添加L－精氨酸(味之素株式会社)、并按2g/L的浓度添加D－葡萄糖(和光纯药工业株式会社，045-31167)，作为实施例6的动物细胞培养用培养基。
[试验例2]iPS细胞的粘附培养中本发明的培养基的效果的评价
作为iPS细胞，使用1210B2株和201B7株(iPS Academia Japan株式会社)，用实施例5和6的各培养基对1210B2株进行粘附培养，用实施例4～6的各培养基对201B7株进行粘附培养。
准备包被有基底膜基质(iMatrix－511(株式会社Nippi，892012))的12孔板，每孔添加1mL实施例4～6的各培养基，以单细胞状态接种10,000个细胞，在37℃、二氧化碳浓度＝5体积％、氧浓度＝20体积％的条件下培养7天。在各培养基中加入终浓度＝10μM的Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)(富士胶片和光纯药株式会社，034-24024)。在培养第1、2、5天和第6天，进行全部量的培养基更换。
需说明的是，作为对照，使用ステムフィット(StemFit)(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)，同样地进行iPS细胞1210B2株和201B7株的粘附培养。
培养第7天用インキュサイト(IncuCyte)(埃森生物科学公司)测定细胞被覆率。使用各培养基的粘附培养和细胞被覆率的测定分别进行3次，测定结果用平均值示于图2、3。
如图2所示，1210B2株的粘附培养中，使用本发明的实施例5和6的各培养基时，与对照相比，确认到细胞增殖性的提高。
此外，如图3所示，201B7株的粘附培养中，通过使用本发明的实施例4～6的各培养基，确认到细胞增殖性的提高。
根据试验例2的上述结果，提示在iPS细胞的粘附培养中，通过5种氨基酸(L－色氨酸、L－丝氨酸、L－半胱氨酸、L－甲硫氨酸和L－精氨酸)或葡萄糖、或者前述5种氨基酸和葡萄糖的添加，细胞增殖性也会提高。
[实施例7、8]iPS细胞的悬浮培养
使用iPS细胞用30mL一次性生物反应器(艾博尔(ABLE)公司:BWV-S03A)，在加入有10μM的Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)(富士胶片和光纯药株式会社，034-24024)的ステムフィット(StemFit)(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)中，以6×105cells/mL的细胞密度接种iPS细胞1210B2株和1231A3株(iPS Academia Japan株式会社)，在CO2恒温箱内搅拌培养(37℃、氧浓度＝20体积％、二氧化碳浓度＝5体积％)。接种后第2天，将70％的培养基更换为ステムフィット(StemFit)(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)。接种后第3天，将10mL细胞悬浮液再悬浮在10mL新鲜的ステムフィット(StemFit)(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)中(关于1210B2株，细胞密度＝0.806×106cells/mL；关于1231A3株，细胞密度＝0.481×106cells/mL)，移至微型生物反应器(ambr15(赛多利斯(sartorius)公司:001-0881)，在37℃、pH＝7.2、溶解氧浓度＝20体积％、二氧化碳浓度＝5体积％、搅拌速度＝300rpm的条件下继续搅拌培养，1天1次更换70％的培养基。
此时，在一个组中添加L－色氨酸(味之素株式会社)(40mg/L/天)、L－丝氨酸(味之素株式会社)(40mg/L/天)、L－半胱氨酸盐酸盐(日本蛋白质株式会社)(40mg/L/天)、L－甲硫氨酸(味之素株式会社)(40mg/L/天)、L－精氨酸(味之素株式会社)(160mg/L/天)、D－葡萄糖(Nacalai Tesque株式会社，16806-25)(4g/L/天)而进行培养(实施例7)，在另一组中在前述5种氨基酸和葡萄糖的基础上还添加L－组氨酸(味之素株式会社)(18.6mg/L/天)、L－异亮氨酸(味之素株式会社)(43.7mg/L/天)、L－亮氨酸(味之素株式会社)(43.7mg/L/天)、L－赖氨酸盐酸盐(味之素株式会社)(73.1mg/L/天)、L－苯丙氨酸(味之素株式会社)(28.4mg/L/天)和L－缬氨酸(味之素株式会社)(42.3mg/L/天)而进行培养(实施例8)。
[试验例3]iPS细胞的悬浮培养中本发明的培养方法的效果的评价
对于1210B2株，在培养第8天使用生死细胞自动分析仪(Vi－CELL(注册商标)XR(贝克曼库尔特公司)测定活细胞数；对于1231A3株，在培养第7天使用生死细胞自动分析仪(Vi－CELL(注册商标)XR(贝克曼库尔特公司)测定活细胞数。
将对于1210B2株和1231A3株的活细胞数测定结果分别示于图4和5。
如图4和5所示，添加5种氨基酸(L－色氨酸、L－丝氨酸、L－半胱氨酸盐酸盐、L－甲硫氨酸和L－精氨酸)和葡萄糖而培养时(实施例7)以及添加11种氨基酸(L－色氨酸、L－丝氨酸、L－半胱氨酸盐酸盐、L－甲硫氨酸、L－精氨酸、L－组氨酸、L－异亮氨酸、L－亮氨酸、L－赖氨酸盐酸盐、L－苯丙氨酸和L－缬氨酸)和葡萄糖而培养时(实施例8)，与再悬浮时相比，在1210B2株和1231A3株双方中均确认到活细胞数的增加，细胞增殖被促进，但在添加11种氨基酸和葡萄糖时(实施例8)确认到更大的细胞增殖促进效果。
产业可利用性
如以上的详述那样，根据本发明，能够提供可适当提高动物细胞、尤其是干细胞的增殖性的动物细胞培养用添加物，能够提供可适当提高动物细胞的增殖性的动物细胞培养用培养基和动物细胞的培养方法。
本申请以在日本提出的特愿2018－184352为基础，其内容全部包括在本说明书中。

Claims (25)

1.一种动物细胞培养用添加物，其中，含有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的添加物，其中，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸组成的组中的1种或2种以上。
3.根据权利要求1所述的添加物，其中，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸组成的组中的1种或2种以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的添加物，其中，动物细胞为干细胞。
5.根据权利要求4所述的添加物，其中，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞组成的组中的1种或2种以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的添加物，其为动物细胞的悬浮培养用添加物。
7.根据权利要求6所述的添加物，其中，动物细胞的悬浮培养为细胞团块状态下的悬浮培养。
8.根据权利要求1～5中任一项所述的添加物，其为动物细胞的粘附培养用添加物。
9.一种动物细胞培养用培养基，其中，在培养基成分的基础上进一步含有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖。
10.根据权利要求9所述的培养基，其中，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸组成的组中的1种或2种以上。
11.根据权利要求9所述的培养基，其中，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸组成的组中的1种或2种以上。
12.根据权利要求9～11中任一项所述的培养基，其中，pH为7以上。
13.根据权利要求9～12中任一项所述的培养基，其中，动物细胞为干细胞。
14.根据权利要求13所述的培养基，其中，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞组成的组中的1种或2种以上。
15.根据权利要求9～14中任一项所述的培养基，其为动物细胞的悬浮培养用培养基。
16.根据权利要求15所述的培养基，其中，动物细胞的悬浮培养为细胞团块状态下的悬浮培养。
17.根据权利要求9～14中任一项所述的培养基，其为动物细胞的粘附培养用培养基。
18.一种动物细胞的培养方法，包括：用添加有氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖的动物细胞的培养用培养基对动物细胞进行培养，或者在动物细胞的培养物中添加氨基酸或葡萄糖、或者氨基酸和葡萄糖。
19.根据权利要求18所述的培养方法，其中，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸和精氨酸组成的组中的1种或2种以上。
20.根据权利要求18所述的培养方法，其中，氨基酸为选自由色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸组成的组中的1种或2种以上。
21.根据权利要求18～20中任一项所述的培养方法，其中，动物细胞为干细胞。
22.根据权利要求21所述的培养方法，其中，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能性干细胞组成的组中的1种或2种以上。
23.根据权利要求18～22中任一项所述的培养方法，其为动物细胞的悬浮培养方法。
24.根据权利要求23所述的培养方法，其中，使动物细胞形成细胞团块来进行悬浮培养。
25.根据权利要求18～22中任一项所述的培养方法，其为动物细胞的粘附培养方法。
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