WO2023157970A1 - 灌流培養方法 - Google Patents

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WO2023157970A1
WO2023157970A1 PCT/JP2023/006038 JP2023006038W WO2023157970A1 WO 2023157970 A1 WO2023157970 A1 WO 2023157970A1 JP 2023006038 W JP2023006038 W JP 2023006038W WO 2023157970 A1 WO2023157970 A1 WO 2023157970A1
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WO
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recombinant protein
cell
culture
cells
perfusion
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PCT/JP2023/006038
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French (fr)
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信方 ▲高▼尾
拓哉 樋口
俊平 風呂光
Original Assignee
中外製薬株式会社
味の素株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a perfusion culture method for animal cells.
  • the invention also relates to methods for producing recombinant proteins and methods for improving recombinant protein production, as well as agents for improving recombinant protein production. Additionally, the present invention relates to a method for reducing the cell proliferation rate of animal cells.
  • recombinant proteins such as therapeutic antibodies have become more and more important in the pharmaceutical field, and most of the recombinant proteins approved as pharmaceuticals are produced by culturing animal cells that produce the recombinant proteins. It is manufactured by However, the production of recombinant proteins requires higher costs than the production of low-molecular-weight compounds, and the products are also required to be of higher quality. Therefore, control and optimization of cell culture conditions for the purpose of improving the productivity and quality of recombinant proteins are extremely important matters for successful commercial production of recombinant proteins.
  • the culture medium is continuously filtered and discharged from the culture vessel to provide fresh medium containing nutrients.
  • a perfusion culture method is used in which the culture tank is continuously supplied. According to this method, the cell density can be increased while the nutrient concentration and the waste concentration are kept constant, so that the protein production rate per volume of the culture tank can be improved.
  • the produced recombinant protein can be recovered immediately from the culture vessel, so it is possible to recover high-quality recombinant protein, and even proteins that are unstable in the culture medium can be efficiently recovered. can do.
  • WO2018/178069 describes a method of improving productivity in perfusion culture by controlling the molar ratio of potassium ions and sodium ions in the cell culture medium.
  • An object of the present invention is to improve productivity in the production of recombinant proteins.
  • a method for improving recombinant protein production in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein comprising: A method comprising adding cystine to a cell culture medium.
  • a method for improving recombinant protein production per cell in perfusion culture of animal cells having recombinant protein-producing ability comprising: A method comprising adding cystine to a cell culture medium.
  • [4] The method of [3], wherein recombinant protein production is improved by 10% or more.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], including adding cystine after 1 hour from the start of culture.
  • [6] The method according to any one of [1] to [4], including adding cystine after 6 hours from the start of culture.
  • [7] The method according to any one of [1] to [4], including adding cystine after 24 hours from the start of culture.
  • [8] The method according to any one of [1] to [4], including adding cystine after 72 hours from the start of culture.
  • [9] The method according to any one of [1] to [8], wherein the cysteine source concentration of the starting medium in the perfusion culture is 0.1 mM to 2.1 mM.
  • a method for perfusion culture of animal cells capable of producing a recombinant protein comprising: Perfusion culture of animal cells with recombinant protein-producing ability in a cell culture starting medium containing a cysteine source concentration of 0.1 mM to 2.1 mM; and addition of cystine to the cell culture medium after 72 hours of culture initiation.
  • a method comprising: [11] The method of [10], wherein the recombinant protein-producing ability is improved compared to the case of adding cysteine at an equimolar concentration of cysteine in terms of cysteine.
  • the method of [11] wherein the recombinant protein productivity is improved by 10% or more.
  • a method for producing a recombinant protein comprising: perfusion culturing animal cells with recombinant protein-producing ability in a cell culture starting medium containing a cysteine source concentration of 0.1 mM to 2.1 mM; adding cystine to the cell culture medium after 72 hours of culture; and A method comprising recovering a recombinant protein.
  • the method of [13] wherein the recombinant protein production is improved compared to the case of adding cysteine at a concentration equimolar to cysteine in terms of cysteine.
  • a method for improving recombinant protein production per cell in perfusion culture of animal cells having recombinant protein-producing ability comprising: A method comprising perfusion culturing an animal cell capable of producing a recombinant protein with a cell culture medium containing ammonium ferric citrate. [30] The method of [28] or [29], wherein the recombinant protein production is improved compared to when the cell culture medium contains other iron sources instead of ammonium ferric citrate. [31] The method of [30], wherein the other iron source is sodium ferrous citrate. [32] The method of [30] or [31], wherein recombinant protein production is improved by 10% or more.
  • a method for perfusion culture of animal cells capable of producing a recombinant protein comprising: A method comprising perfusion culturing an animal cell capable of producing a recombinant protein with a cell culture medium containing ammonium ferric citrate.
  • a method for reducing cell growth rate in perfusion culture of animal cells capable of producing a recombinant protein comprising: A method comprising culturing an animal cell capable of producing a recombinant protein in a cell culture medium containing ammonium ferric citrate.
  • a method for reducing the amount of culture medium discharged in perfusion culture of animal cells having recombinant protein-producing ability comprising: perfusion culturing an animal cell capable of producing a recombinant protein with a cell culture medium containing ammonium ferric citrate; The amount of the culture medium to be discharged is the amount of the culture medium to be discharged in the bleeding step, and in the bleeding step, the culture medium is discharged from the culture vessel, and the same amount of fresh medium as the discharged culture medium is added to the culture vessel.
  • a method for producing a recombinant protein comprising: perfusion culturing an animal cell capable of producing a recombinant protein with a cell culture medium containing ammonium ferric citrate; and recovering the recombinant protein.
  • the method of any one of [28]-[50] comprising adding cystine to the cell culture medium.
  • An agent for improving recombinant protein production in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein comprising ferric ammonium citrate as an active ingredient.
  • the present invention can improve productivity in recombinant protein production.
  • FIG. 1 is a graph showing differences in recombinant protein productivity due to differences in cysteine sources.
  • FIG. 2 is a graph showing differences in antibody production rate (SPR) and cell proliferation rate due to different iron sources.
  • Recombinant protein in the present disclosure refers to a polymer of amino acids of any length produced using any genetic recombination technology.
  • the polymer may be linear or branched, may contain modified amino acids, and may contain non-amino acids.
  • Recombinant proteins may also be subjected to disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization with protecting groups and the like, cleavage, or labeling moieties (e.g. radioisotopes) or drugs (e.g. , toxins, cytotoxic drugs, radioactive isotopes).
  • any molecule that includes a recombinant protein portion as part of its structure is included in the recombinant protein of the present invention.
  • the gene recombination technique to be used is not particularly limited as long as it is a technique for artificially manipulating genes, but a typical example is introduction of a nucleic acid encoding a recombinant protein into a host cell.
  • recombinant proteins include, but are not limited to, enzymes, hormones, cytokines, clotting factors (or blood clotting-related proteins), extracellular proteins, Notch ligands, produced using recombinant technology. , antibodies, antibody mimetics and immunoadhesins. These recombinant proteins are mainly used in the fields of medicine, agricultural chemicals, food and other chemical industries, but are not limited to specific uses.
  • Examples of enzymes include alkaline phosphatase, beta-lactamase, galactosidase, glucosidase, glucocerebrosidase, superoxide dismutase, and DNase.
  • hormones include renin, growth hormone (such as human or bovine growth hormone), parathyroid hormone, thyrotropic hormone, calcitonin, gonadotropins (e.g., follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone), glucagon, insulin ( insulin A chain and insulin B chain), and proinsulin.
  • cytokines include tumor necrosis factor (eg, TNF- ⁇ and - ⁇ ), vascular endothelial growth factor (VEGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophic factors (eg, NT-3 to NT-6 ), nerve growth factor (NGF), platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factors (e.g. aFGF, bFGF), epidermal growth factor (EGF), transforming growth factors (e.g.
  • tumor necrosis factor eg, TNF- ⁇ and - ⁇
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • neurotrophic factors eg, NT-3 to NT-6
  • nerve growth factor e.g. NT-3 to NT-6
  • NGF nerve growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • fibroblast growth factors e.g. aFGF, bFGF
  • epidermal growth factor transforming growth factors
  • TGF- ⁇ , TGF- ⁇ 1 to TGF- ⁇ 5) activin (eg, activin A, activin C, activin E), insulin-like growth factor (eg, IGF-I, IGF-II), hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor, stem cells factor (SCF), bone morphogenetic protein (BMP), RANTES, erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), interferon- ⁇ , - ⁇ and - ⁇ , colony-stimulating factors (e.g. M-CSF, GM-CSF, G- CSF), and interleukins (eg, IL-1 through IL-13).
  • activin eg, activin A, activin C, activin E
  • insulin-like growth factor eg, IGF-I, IGF-II
  • HGF hepatocyte growth factor
  • SCF stem cells factor
  • BMP bone morphogenetic protein
  • RANTES erythro
  • clotting factors and blood clotting-related proteins include Factor VII, Factor VIII, Factor VIIIC, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor XII, tissue factor, von Willebrand factor, protein C, protein S, plasminogen activator (eg urokinase, human urinary or human tissue plasminogen activator (t-PA)), thrombin, prothrombin, thrombopoietin, thrombomodulin, antithrombin III, fibrinogen, serum albumin is mentioned.
  • plasminogen activator eg urokinase, human urinary or human tissue plasminogen activator (t-PA)
  • thrombin prothrombin
  • thrombopoietin thrombomodulin
  • fibrinogen serum albumin
  • Examples of extracellular proteins include fibronectin, vitronectin, collagen, osteopontin, laminin, and subsequences thereof.
  • Examples of Notch ligands include DLL1, DLL3, DLL4, Jagged-1, Jagged-2.
  • Notch ligands may be configured as fusion proteins with, for example, an Fc region.
  • Antibody in the present disclosure refers to an immunoglobulin molecule that has the ability to bind an antigen and includes, but is not limited to, full-length antibodies having polypeptide chains that include light and heavy chains and Portions (fragments such as Fv, Fab, Fab′, F(ab′) 2 , VHH fragments) are included.
  • Each heavy or light chain may comprise a variable region (involved in antigen recognition and binding) and a constant region (involved in localization and cell-cell interaction).
  • the most common full length antibodies are composed of two heavy chain constant regions (CH), two heavy chain variable regions (VH), two light chain constant regions (CL) and two light chain variable regions ( VL).
  • the variable region comprises complementarity determining regions (CDRs), which are the sequences that confer antigen specificity to the antibody, and framework regions (FRs).
  • Antibodies include monoclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) formed from two or more types of antibodies or antigen-binding sites, antibody fragments having the desired biological activity, and antigen-binding sites of antibodies. Including fusion proteins. Antibodies also include chimeric antibodies (eg humanized antibodies), (fully) human antibodies, multivalent antibodies and modified antibodies.
  • An antibody can be of any class (eg, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE), any subclass (isotype).
  • Antibodies have undergone chemical or biological modifications, such as conjugation with other molecules, including but not limited to small or large toxins (cytotoxic drugs) and radioisotopes. and antibodies with these modifications are also included in the antibodies of the present invention.
  • Antibody mimetic in the present disclosure refers to a protein that can specifically bind to an antigen but is not structurally related to an antibody. Specifically, antibody mimetics include protein A Z domains (affibodies). More specifically, antibody mimetics include ZHER2 affibody.
  • Recombinant proteins are not limited to the above examples. viral antigens (eg, viral envelope proteins) and the like. Recombinant proteins also include fusion proteins comprising any of the proteins described above.
  • Having the ability to produce a recombinant protein in the present disclosure means having the ability to produce a protein by genetic recombination technology.
  • the recombinant protein produced may be secreted extracellularly, ie, into the medium, or accumulated intracellularly, but is preferably secreted extracellularly.
  • a host cell can be endowed with the ability to produce (express) a recombinant protein by introducing a nucleic acid encoding the recombinant protein into the host cell.
  • typical recombinant protein-producing cells are cells that contain a nucleic acid encoding a recombinant protein.
  • Various methods are known in the art for introducing nucleic acids into host cells, and any method known at the time of implementation can be used.
  • An example of such techniques includes transforming a host cell with a vector containing a nucleic acid encoding the recombinant protein.
  • the vector is preferably an expression vector comprising a nucleic acid encoding a recombinant protein in an expressible form (e.g. in operable linkage with regulatory sequences such as promoters, enhancers, ribosome binding sequences and/or transcription termination sequences), It may be a plasmid.
  • Examples of methods for introducing vectors into host cells include methods of physically or chemically introducing vectors into host cells by electroporation, particle gun method, calcium phosphate method, or lipofection; Included are methods of infecting host cells.
  • the nucleic acid in the vector introduced into the host cell may be integrated into the genome in the host cell by genome editing technology such as CRISPR/Cas9.
  • the gene sequence on the genomic DNA is directly modified by genome editing technology such as CRISPR / Cas9 to encode the recombinant protein of interest.
  • the production of the endogenous protein of interest may be controlled (eg, enhanced) by altering the control sequence or the like. All proteins produced in such a manner are also included in the recombinant proteins of the present invention.
  • animal cell can be used as the "animal cell” in the present disclosure, but a cell line that is suitably used for recombinant protein production is preferred.
  • Animals include mammals (mammals), birds, amphibians, and insects.
  • Preferred animals include insects and mammals, with mammals being particularly preferred.
  • An example of an insect cell is the cell of Spodoptera frugiperda.
  • Cells of the armyworm include Sf9 cells, Sf21 cells, and SF+ cells derived from the ovary of the armyworm.
  • Mammalian cells cells of primates such as humans and monkeys, and cells of rodents such as mice, rats and hamsters are preferably used.
  • Mammalian cells include, but are not limited to, HL-60 (ATCC No. CCL-240), HT-1080 (ATCC No. CCL-121), HeLa (ATCC No. CCL-2), 293 (ECACC No. 85120602), Hep G2 (ATCC No. HB8065); VERO (ATCC No. CCL-1651), CV1 (ATCC No. CCL70) and COS-7 (ATCC No. CRL-1651); No. CRL-1658), NS0 (ATCC No.
  • CHO cells Chinese hamster ovary cells
  • BHK21 also referred to simply as BHK cells; ATCC No. CRL-10
  • MDCK ATCC No. CCL -34
  • substrains derived from these cell lines e.g., BHK TK-cells as substrains of BHK cells, CHO-K1 cells as substrains of CHO cells, CHO-S cells, CHO-DXB11 cells (also called CHO-DUKX cells or DuxB11 cells) and CHO-DG44 cells).
  • Cell culture medium refers to a solution containing nutrients used to grow or maintain cells, but when referring to sales / provision forms also includes liquid concentrates and powders (granules) from which solutions are made.
  • Nutrient sources include essential and useful components for cell growth and survival, examples of such components include carbohydrates such as sugars, lipids, nucleic acids, vitamins, essential and non-essential amino acids, essential elements, pH Conditioning agents and solvents (water) are included.
  • the medium may be a serum-free medium or an animal protein-free medium.
  • the cell culture medium can be appropriately selected from commercially available media and known media described in literature according to the cells to be cultured and the purpose.
  • the composition can be changed, and animal serum, animal peptones, other animal-derived components, nutrients/growth factors or hormones can be added.
  • Cell culture media are adjusted to a pH and salt concentration suitable for cell survival and growth.
  • the pH of the cell culture medium is, for example, 5.0 to 9.0, preferably 6.0 to 8.0, and more preferably 6.5 to 7.5.
  • Examples of commercially available media include RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) medium, L-15 medium, MEM (Eagle's Minimum Essential Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), Iscove's Modification.
  • DMEM Ham's F10 and F12 media.
  • a “chemically defined cell culture medium” (CDM) in the present disclosure refers to a medium in which all components are chemically defined without animal-derived products such as animal serum or peptones.
  • Chemically defined cell culture media can be appropriately selected from commercially available media and known media described in the literature according to the cell line to be cultured and the purpose, as with ordinary cell culture media. A mixture of two or more media can be used, and animal serum or other animal components, nutrients/growth factors or hormones can be added. Solutions are adjusted to optimal pH and salt concentration for cell survival and growth.
  • Examples of commercially available chemically defined cell culture media include AmpliCHO CD Medium, Dynamis® Medium, EX-CELL® Advanced® CHO Feed Medium, CD FortiCHO ® Medium, CP OptiCHO®, BalanCD® CHO Growth A Medium, ActiPro®, MEM (Eagle's Minimum Essential Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) media and CELLiST® Basal Media (BASAL3, BASAL10), Feed Media (FEED2).
  • perfusion culture in the present disclosure means that the cell culture medium is continuously or intermittently discharged from the culture vessel while the cells are retained in the culture vessel (also referred to as a reactor or incubator) during culture, and nutrients are added. It is a culture method in which cells are cultured while maintaining a constant amount of solvent by continuously or intermittently introducing a medium (fresh medium) containing the medium into the culture vessel (perfusion of the medium). In order to keep the cells in the culture vessel during culture, it is necessary to separate the cells from the culture medium and keep the cells in the culture vessel.
  • Methods for separating the cells and the medium include filtration using a semipermeable membrane or filter (alternating tangential flow perfusion filtration system, etc.), gravitational sedimentation, centrifugation, acoustic separation, or the like.
  • a semipermeable membrane or filter alternating tangential flow perfusion filtration system, etc.
  • gravitational sedimentation centrifugation
  • acoustic separation or the like.
  • many culture tanks, culture apparatuses, or culture systems having separation functions suitable for perfusion culture are known and commercially available.
  • the cell culture medium used in perfusion culture can be the same as the cell culture medium used in other types of cell culture.
  • the medium at the start of culture (initial medium) and the medium used for subsequent perfusion (perfusion medium) may have the same composition or a different composition (some components may be increased or decreased, or other components may be added). good.
  • Cystine as used in the present disclosure includes cystine (L-cystine), cystine salts that function as cystine after medium addition, and hydrates thereof. However, when referring to the cystine concentration, it means the concentration of cystine (L-cystine). Cystine salts include cystine dihydrochloride, cystine disodium salt, cystine disodium salt monohydrate and the like. Hydrates include cystine disodium salt monohydrate. It is also possible to use a combination of multiple cystines or cystine salts.
  • cyste source used in the present disclosure means a compound that can be used as cysteine in cells after undergoing a process such as decomposition as necessary.
  • Specific examples of cysteine sources include cysteine, cystine and glutathione.
  • cyste source concentration refers to the cysteine-equivalent concentration of a cysteine source. For example, for cystine, the cysteine source concentration is double the cystine concentration, and for glutathione, the cysteine source concentration is equal to the glutathione concentration.
  • “Ferric ammonium citrate” used in the present disclosure is not particularly limited as long as it is ammonium iron (III) citrate consisting of citrate ions, ferric ions and ammonium ions or its hydrate. .
  • ferric ammonium citrate green and reddish-brown ones are known depending on the content ratio of each ion, but both can be suitably used in the embodiments of the present disclosure.
  • iron sources used in the present disclosure refer to iron ion-containing molecules other than ferric ammonium citrate that can be used as iron sources for cell culture media.
  • other iron sources include ferric phosphate, ferric pyrophosphate, ferric nitrate, ferrous sulfate, ferric chloride, ferrous lactate, ferric citrate, ferric citrate Included are sodium monoferric, sodium ferric ethylenediaminetetraacetate, ferric dextran and hydrates thereof, and any combination thereof.
  • iron concentration iron ion concentration
  • the value of the iron content in the iron source or information that can lead to the iron content such as the molecular formula of the iron source
  • the source marketing source, etc.
  • Examples of methods for quantifying the iron concentration in a solution include phenanthroline absorption spectrophotometry, flame atomic absorption spectrometry, electrical heating atomic absorption spectrometry, and ICP emission spectrometry after appropriate treatment such as reduction. can be done.
  • phenanthroline absorption spectrophotometry flame atomic absorption spectrometry
  • electrical heating atomic absorption spectrometry electrical heating atomic absorption spectrometry
  • ICP emission spectrometry after appropriate treatment such as reduction.
  • a “medium additive” in the present disclosure refers to any substance or composition containing a substance added to a medium.
  • the medium additive may supplement components already present in the medium to be added, or may newly add components not present in the medium to be added.
  • Media additives are typically provided in liquid or powder form (including granular form). Moreover, the purpose of addition is not particularly limited.
  • the upper limit and lower limit indicated by “ ⁇ ” and “from” shall be included, respectively.
  • the description “A to B” or “A to B” using numerical values A and B means that A or more and B or less.
  • the description of "A to B”, “A to B” or “A or more and B or less” in the numerical ranges described in stages in the present disclosure independently means that "A or more is preferable”.
  • , and "preferably B or less” and these lower or upper limits may be replaced with upper or lower limits of other numerical ranges.
  • the lower and upper limits of the numerical ranges described in the present disclosure may be replaced with numerical values within the numerical ranges shown in the examples.
  • a method for enhancing recombinant protein production in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein, comprising adding cystine to the cell culture medium comprising adding cystine to the cell culture medium. This method improves the productivity of recombinant protein production by improving recombinant protein production during perfusion culture.
  • recombinant protein production rate per culture tank production amount per unit time
  • recombinant protein per unit culture volume medium volume
  • Production rate production amount per unit time
  • recombinant protein production rate per unit cell production amount per unit time
  • protein production is improved in at least one of the above indicators.
  • the amount of protein can be quantified by a known quantification method according to each protein.
  • chromatography such as HPLC and absorption of protein (e.g., absorption at 280 nm) are combined to obtain an absorption coefficient (calculated value from amino acid sequence, value of reference protein such as BSA, etc.). and the absorption peak area, and a method of quantifying from the absorbance of a protein purified/roughly purified by chromatography (eg, HPLC) or the like.
  • the purified/roughly purified protein can also be quantified using the BCA method, the Bradford method, the Lowry method, or the like.
  • a method for increasing recombinant protein production per cell in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein comprising adding cystine to the cell culture medium.
  • a recombinant protein production rate per cell for example, protein production amount per cell per day
  • Antibody production rate (SPR) is preferably used when the recombinant protein is an antibody. This method improves the production of recombinant protein per cell during perfusion culture, thereby reducing the cost of producing recombinant protein and improving productivity.
  • the recombinant protein production per cell can be calculated by quantifying the protein by a quantification method according to each protein and counting the number of cells. Any protein quantification method may be used, and the number of cells may be measured manually, or measured using a machine, or a reagent capable of quantifying the number of cells may be used. It may be quantified by the biological/chemical method used, or may be measured by combining these methods.
  • the ratio (purity) of recombinant protein to cell-derived impurities and contaminants increases, making subsequent purification steps easier and reducing costs. be able to.
  • improving the quality of the protein at the time of production can lead to improving the quality of the final product, and improving the quality of the final product is also preferable from the viewpoint of safety when it becomes a pharmaceutical product.
  • perfusion culture has the advantage of circulating the cell culture medium, which consumes more medium compared to other culture methods, which can lead to increased costs.
  • Increased recombinant protein production per cell means that more recombinant protein can be obtained using the same volume of cell culture medium (less medium), which can lead to further cost reduction and productivity improvement.
  • a method for perfusion culturing animal cells capable of producing a recombinant protein comprising perfusing the animal cells capable of producing a recombinant protein with a cell culture starting medium;
  • a method comprising adding cystine to.
  • cells with high productivity of recombinant proteins can be cultured.
  • a perfusion medium for perfusion culture different from the starting medium can be used, and cystine can be added together with or separately from the perfusion medium.
  • a method for producing a recombinant protein comprising perfusion culturing an animal cell capable of producing a recombinant protein in a cell culture starting medium; adding cystine to the cell culture medium; and , recovering the recombinant protein.
  • recombinant proteins can be produced with excellent productivity.
  • a perfusion medium for perfusion culture different from the starting medium can be used, and cystine can be added together with or separately from the perfusion medium.
  • Perfusion culture in the embodiment of the present disclosure is not limited to a specific perfusion culture method, and any perfusion culture method known at the time of implementation can be used.
  • Cell separation means, medium supply means, culture conditions (CO 2 concentration, DO, culture temperature, culture time, etc.), culture scale and culture tank are not particularly limited, and the properties of the cells to be cultured and the recombinant protein produced It can be carried out by appropriately selecting from known conditions, etc., taking into consideration the properties of the method.
  • Exemplary culture conditions include culture temperature of 30-40° C., CO 2 concentration of 0-40%, DO of 20-70%, culture time of 1-90 days, culture volume of 10 mL-2000 L, and/or perfusion volume of 0 per day. .1 to 30 culture volumes.
  • Animal cells are preferably cultured under conditions in which the recombinant protein is expressed or conditions suitable for expression of the recombinant protein.
  • the cell culture medium used for perfusion culture is not limited to a specific one, and can be selected as appropriate in consideration of the cells to be cultured and the recombinant protein to be produced.
  • the cell culture medium is preferably a chemically defined cell culture medium (CDM).
  • the starting medium and the perfusion medium may have the same or similar compositions, or different compositions.
  • this when referring to "medium”, “culture medium” or “cell culture medium” without special mention, this is the “starting medium” which is the medium at the start of perfusion culture, and the “starting medium” which is newly added for perfusion. It refers to both the medium, "perfusion medium”.
  • typical examples of animal cells capable of producing recombinant proteins include animal cells containing nucleic acids encoding recombinant proteins.
  • a nucleic acid encoding a recombinant protein may be integrated into the genome.
  • cell lines are preferred, particularly animal cell lines useful for the production of recombinant proteins.
  • Animal cells are preferably, but not limited to, insect cells and mammalian cells, more preferably mammalian cells.
  • suitable insect cell lines include Sf9 cells, Sf21 cells, SF+ cells.
  • suitable mammalian cell lines include BHK21 cells and CHO cells, particularly preferred are Chinese Hamster Ovary cells (CHO cells).
  • CHO cells include various sublines derived from CHO cells, such as CHO-K1 cells, CHO-S cells, CHO-DXB11 cells (also called CHO-DUKX cells or DuxB11 cells), or CHO-DG44 cells. is also included.
  • the target recombinant protein is not limited to a specific one, and any recombinant protein can be targeted.
  • a preferred example of a recombinant protein is an antibody.
  • Cystine in the embodiment of the present disclosure may be anything as long as it functions as cystine (L-cystine) in the medium after addition. It is preferably added to the culture medium.
  • the timing and target medium for adding cystine are not particularly limited, and may be added to the initial medium before the start of culture, or may be added to the perfusion medium and/or the initial medium after the start of culture.
  • cystine may be added to the medium at once, or may be added in multiple portions.
  • Cystine is preferably added to the medium after initiation of culture, and even more preferably added to the perfusion medium. Especially when the cystine concentration is high, adding cystine after the start of culture can lead to better cell growth.
  • cystine When cystine is added after the start of culture, for example, it may be added after 1 hour after the start of culture, preferably after 6 hours after the start of culture, more preferably after 24 hours, and even more preferably after 72 hours. added.
  • cystine may be added directly to the medium, or a solution or suspension in which cystine is dissolved or suspended, or the medium may be added.
  • a cystine-containing medium may be prepared in advance and used as the perfusion medium.
  • the amount of cystine to be added is not particularly limited within the range in which the effects of the invention are exhibited, but examples include an amount such that the cystine concentration in the medium after addition (immediately after addition) is 0.5 mM to 10 mM. .
  • Cystine concentration in the medium after addition (immediately after addition) is preferably 0.7 mM to 10 mM or 0.8 mM to 10 mM, more preferably 1 mM to 10 mM, even more preferably 1.5 mM to 10 mM, particularly preferably 2 mM to 10 mM, more preferably 2.1 mM to 10 mM, or 2.5 mM to 10 mM.
  • cystine is within these ranges, particularly excellent effects can be exhibited.
  • additional addition of cystine so that the concentration falls within the above range is also included in the above embodiment.
  • cysteine source concentration in the medium can be limited.
  • the cysteine source concentration in the starting medium and/or perfusion medium is, for example, 0.1 mM to 3 mM, preferably 0.1 mM to 2.1 mM, more preferably 0.1 mM to 1.5 mM.
  • the cysteine source concentration of the starting medium is within the above range. More preferably, the cysteine source concentrations in the starting medium and the perfusion medium are within the above range.
  • Cystine may be added in any of the forms described above in addition to the cysteine source at these cysteine source concentrations.
  • the cysteine source is a cysteine source other than cystine, and the cysteine source other than cystine is within the above concentration range. At this time, cystine may be added separately from cysteine sources other than cystine within the concentration range described above.
  • a cysteine source other than cystine is preferably cysteine.
  • the starting medium and/or the perfusion medium may contain no cysteine sources other than cystine, and may contain only cystine as the cysteine source.
  • a low cysteine source concentration in the starting medium is advantageous for medium stability, as cysteine can adversely affect medium stability.
  • perfusion culture uses an extremely large amount of medium compared to other culture methods (e.g., fed-batch culture), so it is necessary to prepare a large amount of medium in advance.
  • high medium stability is a very advantageous property. That is, this effect can be said to be a particularly desirable effect in perfusion culture.
  • “Improve recombinant protein production” or “recombinant protein production is improved” in embodiments of the present disclosure means that recombinant protein production is improved compared to when performed under conditions outside the present disclosure. However, preferably, recombinant protein production is improved compared to the case where cysteine is added at a concentration equimolar to cystine in terms of cysteine. That is, in a further embodiment of the present disclosure, recombinant protein production or recombinant protein-producing ability is improved compared to the case where cysteine is added at a concentration equimolar to cysteine in terms of cysteine.
  • cysteine is two cysteines linked by an S—S bond, and an equimolar concentration in terms of cysteine means that the cystine concentration is half the molar concentration of cysteine.
  • recombinant protein production or recombinant protein productivity is improved by 10% or more.
  • Recombinant protein production or recombinant protein productivity is preferably improved by 20% or more, more preferably 30% or more, and even more preferably 40% or more.
  • the recombinant protein productivity that can be achieved by further embodiments of the present disclosure is, for example, 5 to 20 g/L/day, preferably 5.5 to 20 g/L/day, more preferably 6 to 20 g /L/day, still more preferably 7 to 20 g/L/day.
  • Another indicator of recombinant protein productivity is, for example, 20 to 200 pg/cell/day, preferably 24 to 150 pg/cell/day, still more preferably 25 to 120 pg/cell/day. Other ranges may also include 20-40 pg/cell/day, 23 or 24-40 pg/cell/day, or 25-40 pg/cell/day.
  • Additional steps include purifying the recombinant protein and chemically or biologically modifying the recombinant protein.
  • a plurality of techniques are usually used in combination for the purification of recombinant proteins, and chromatography is preferably used.
  • the recombinant protein is an antibody, affinity chromatography, protein A chromatography and the like are preferably used.
  • Chemical or biological modifications of recombinant proteins include, but are not limited to, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization with protecting groups, etc. , cleavage, or conjugation with labeling moieties or drugs (such as toxins) and the like.
  • a method for producing an antibody conjugated to a drug such as a toxin is also included in the method for producing a recombinant protein of the present disclosure, in which case the additional step further comprises conjugating the antibody and the drug. You can In this case, the drug-conjugated antibody is included in the recombinant protein of the present disclosure.
  • the ammonium ferric citrate embodiments described below are combined with the above embodiments.
  • the cell culture medium comprises ferric ammonium citrate. Details of embodiments using ferric ammonium citrate can be referred to the description below, and various embodiments described below can be combined.
  • Another embodiment of the present disclosure is an agent for improving recombinant protein production in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein, comprising cystine as an active ingredient.
  • This agent can improve the productivity of recombinant protein production by improving recombinant protein production during perfusion culture.
  • Embodiments of the above agents are not limited to specific forms as long as they contain cystine as an active ingredient. It doesn't matter if there is.
  • the agent may be in the form of a liquid, or in the form of a solid, such as a powder (including the form of granules).
  • An embodiment of the above agent is intended for use in improving recombinant protein production in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein. Uses are preferably described in the agent's marketing brochures, instruction manuals, product websites, and the like. In this case, the use can also be described as the effect of the agent.
  • specific usage of the agent includes use as a medium additive before culture (at the time of medium preparation) or during culture.
  • cystine as an agent for improving recombinant protein production in perfusion culture of animal cells having recombinant protein-producing ability, or These embodiments include the use of cystine to enhance recombinant protein production in perfusion cultures of animal cells, and can be practiced similarly to the agent embodiments described above.
  • ferric ammonium citrate as an iron source also contributes to the improvement of recombinant protein productivity.
  • certain embodiments of the present disclosure provide a method for enhancing recombinant protein production in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein, comprising treating the animal cell capable of producing recombinant protein with citric acid.
  • a method comprising perfusion culturing with a cell culture medium containing iron ammonium. This method improves recombinant protein production during perfusion culture and improves the productivity of recombinant protein production.
  • An embodiment of the present disclosure provides a method for improving recombinant protein production per cell in a perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein, comprising: A method comprising perfusion culturing with a cell culture medium containing ammonium ferric citrate. This method improves the production of recombinant protein per cell during perfusion culture, thereby reducing the cost of producing recombinant protein and improving productivity.
  • Improve recombinant protein production or “enhance recombinant protein production” in embodiments of the present disclosure means that recombinant protein production is improved compared to when performed under conditions outside the present disclosure. Meaning, preferably the recombinant protein production is improved compared to when the cell culture medium contains other iron sources instead of ammonium ferric citrate.
  • recombinant protein production or recombinant protein productivity is improved compared to when the cell culture medium contains other iron sources instead of ammonium ferric citrate.
  • the methods of the embodiments of the present disclosure compared to when the cell culture medium contains other iron sources instead of ammonium ferric citrate, reduce recombinant protein production. Or the ability to produce a recombinant protein is improved.
  • the other iron source is sodium ferrous citrate.
  • the present embodiment exhibits superior effects as compared with the case of using common sodium ferrous citrate as an iron source.
  • recombinant protein production or recombinant protein productivity is improved by 10% or more.
  • Recombinant protein production or recombinant protein productivity is preferably improved by 20% or more, more preferably 30% or more, and even more preferably 40% or more.
  • the recombinant protein productivity that can be achieved by further embodiments of the present disclosure is, for example, 5 to 20 g/L/day, preferably 5.5 to 20 g/L/day, more preferably 6 to 20 g /L/day, still more preferably 7 to 20 g/L/day.
  • Another indicator of recombinant protein productivity is, for example, 20 to 200 pg/cell/day, preferably 24 to 150 pg/cell/day, still more preferably 25 to 120 pg/cell/day.
  • Other ranges may also include 20-40 pg/cell/day, 23 or 24-40 pg/cell/day, or 25-40 pg/cell/day.
  • a method for perfusion culturing an animal cell capable of producing a recombinant protein comprising perfusion culturing the animal cell capable of producing a recombinant protein with a cell culture medium comprising ammonium ferric citrate.
  • a method comprising: In this method, cells with high productivity of recombinant proteins can be cultured.
  • An embodiment of the present disclosure is a method for reducing cell growth rate in perfusion culture of animal cells capable of producing a recombinant protein, comprising treating the animal cells capable of producing a recombinant protein with ferric ammonium citrate. culturing in a cell culture medium comprising: This method improves the productivity of recombinant protein production by reducing the cell growth rate in perfusion culture.
  • Certain embodiments of the present disclosure can suppress cell growth while improving the production of recombinant proteins. can be suppressed.
  • cell-derived impurities can be reduced in the same amount of recombinant protein, contributing to reduction in purification cost and improvement in quality.
  • Reduce the cell growth rate or “reduce the cell growth rate” in the embodiments of the present disclosure means that the cell growth rate is reduced compared to when performed under conditions outside the present disclosure. However, preferably the cell growth rate is reduced compared to when the cell culture medium contains other iron sources instead of ammonium ferric citrate.
  • the other iron source is sodium ferrous citrate.
  • the present embodiment exhibits superior effects as compared with sodium ferrous citrate, which is commonly used as an iron source.
  • cell proliferation rate is reduced by 10% or more.
  • Cell proliferation rate is preferably reduced by 20% or more, more preferably by 30% or more, even more preferably by 40% or more.
  • An embodiment of the present disclosure is a method for reducing the amount of culture medium discharged in perfusion culture of recombinant protein-producing animal cells, wherein the recombinant protein-producing animal cells are treated with citric acid.
  • perfusion culture with a cell culture medium containing iron ammonium wherein the amount of the culture medium discharged is the amount of culture medium discharged in the bleeding step, and the bleeding step discharges the culture medium from the culture tank, adding the same amount of fresh medium to the culture tank as the culture solution obtained from the fermentation.
  • Reducing the amount of culture medium to be discharged” or “reducing the amount of culture medium to be discharged” in the embodiments of the present disclosure means that recombinant protein production It means that the amount of culture medium discharged in the perfusion culture of competent animal cells is reduced.
  • the indicator of the amount of the culture medium discharged is not limited to this, but the total amount of the culture medium discharged in the entire bleeding process or within a certain period of time, or the amount of the culture medium discharged in a unit time. (discharge rate of culture solution) is used.
  • Certain embodiments of the present disclosure can reduce the amount of culture medium drained while improving recombinant protein production, in which case the desired recombinant protein production is maintained while the required It is possible to suppress the amount of culture medium and the like.
  • the extracellularly secreted recombinant protein it is possible to produce it at a higher concentration by reducing the volume of the discharged culture medium, which is advantageous in terms of subsequent quality and purification cost.
  • a further embodiment of the present disclosure provides a method for improving the draining culture medium in the perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein compared to when the cell culture medium contains other iron sources instead of ammonium ferric citrate. reduce the amount.
  • the amount of the discharged culture medium is reduced compared to the case where the cell culture medium contains other iron sources instead of ammonium ferric citrate. Decrease.
  • the other iron source is sodium ferrous citrate.
  • the present embodiment exhibits superior effects as compared with sodium ferrous citrate, which is commonly used as an iron source.
  • the volume of media to be discharged is reduced by 10% or more.
  • the amount of culture medium discharged is preferably reduced by 20% or more, more preferably by 30% or more, even more preferably by 40% or more.
  • Ammonium iron citrate in the embodiments of the present disclosure may also be referred to as iron (III) ammonium citrate or ferric ammonium citrate.
  • Ammonium ferric citrate is added to the starting medium and/or the perfusion medium. At the time of addition, ammonium ferric citrate may be added directly to the medium, or a solution or suspension in which ammonium ferric citrate is dissolved or suspended, or a medium may be added.
  • the amount of ammonium ferric citrate to be added is not particularly limited as long as the effects of the invention are achieved.
  • An amount of 10 mg/L to 300 mg/L can be mentioned.
  • iron concentrations are sometimes expressed using, for example, the phrase "an amount that provides an iron concentration of 10 mg/L to 300 mg/L.”
  • the iron concentration is preferably 20 mg/L to 200 mg/L or 30 mg/L to 200 mg/L, more preferably 40 mg/L to 200 mg/L or 40 mg/L to 150 mg/L, even more preferably 50 mg/L to 200 mg /L or 50 mg/L to 150 mg/L.
  • the ammonium ferric citrate is within these ranges, particularly excellent effects can be exhibited.
  • the amount of ammonium ferric citrate to be added is not particularly limited within the scope of the effects of the invention.
  • the concentration of ferric ammonium citrate is preferably 100 mg/L to 1000 mg/L or 150 mg/L to 1000 mg/L, more preferably 200 mg/L to 1000 mg/L or 200 mg/L to 750 mg/L, even more preferably 250 mg/L /L to 1000 mg/L or 250 mg/L to 750 mg/L. When the ammonium ferric citrate is within these ranges, particularly excellent effects can be exhibited.
  • the cell culture medium may contain other iron sources in addition to the ammonium ferric citrate described above.
  • the amount thereof is not particularly limited, but an exemplary amount of the iron source is an iron concentration of 1 mg/L to 400 mg/L in the medium including ferrammonium citrate. , 10 mg/L to 300 mg/L, 20 mg/L to 200 mg/L, 30 mg/L to 200 mg/L, 40 mg/L to 200 mg/L, 40 mg/L to 150 mg/L, 50 mg/L to 200 mg/L or 50 mg /L to 150 mg/L.
  • ferric ammonium citrate embodiments For the details and further embodiments of the above-mentioned ferric ammonium citrate embodiments, reference can be made to the details and specific embodiments of the above-mentioned cystine embodiments, and the configuration and details thereof are Embodiments relating to iron ammonium are also incorporated.
  • recombinant protein in the ammonium ferric citrate embodiment animal cells capable of producing recombinant protein, perfusion culture, or increasing recombinant protein production
  • the recombinant protein in the aforementioned cystine embodiment animal cells capable of producing recombinant protein, perfusion culture, or increase in recombinant protein production can be referred to.
  • Another embodiment of the present disclosure is an agent for improving recombinant protein production in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein, comprising ferric ammonium citrate as an active ingredient.
  • This agent can improve the productivity of recombinant protein production by improving recombinant protein production during perfusion culture.
  • another embodiment of the present disclosure is an agent for reducing the cell growth rate in perfusion culture of animal cells having recombinant protein-producing ability, which contains ferric ammonium citrate as an active ingredient, or recombinant protein production It is an agent for reducing the amount of culture medium discharged in the perfusion culture of animal cells having the ability.
  • Embodiments of the above agent are not limited to a specific form as long as it contains ferric ammonium citrate as an active ingredient. It may be in the form of a composition containing. Also, the agent may be in the form of a liquid, or in the form of a solid, such as a powder (including the form of granules). Embodiments of the above agents respectively improve recombinant protein production in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein and reduce cell growth rate in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein. Alternatively, it is used to reduce the amount of culture medium discharged in perfusion culture of animal cells having recombinant protein-producing ability.
  • Uses are preferably described in the agent's marketing brochures, instruction manuals, product websites, and the like. In this case, the use can also be described as the effect of the agent.
  • specific usage of the agent includes use as a medium additive before culture (at the time of medium preparation) or during culture.
  • Embodiments related to the above agent embodiments include the use of ferric ammonium citrate as an agent for improving recombinant protein production in perfusion culture of animal cells having recombinant protein-producing ability, Use of ammonium ferric citrate to enhance recombinant protein production in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein, Iron citrate as an agent for reducing cell growth rate in perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein use of ammonium, use of ferric ammonium citrate to reduce cell growth rate in perfusion culture of animal cells having recombinant protein-producing ability, use of culture solution discharged in perfusion culture of animal cells having recombinant protein-producing ability use of ammonium ferric citrate as a volume-reducing agent, or use of ammonium ferric citrate to reduce the volume of culture fluid discharged in perfusion cultures of animal cells capable of producing recombinant proteins. and these embodiments can be implemented in the same manner as the above agent embodiments.
  • Another embodiment of the present disclosure is a cell culture medium for perfusion culture of animal cells capable of producing recombinant protein comprising cystine and ammonium ferric citrate.
  • This medium can improve the productivity of recombinant protein production by exhibiting both the actions and effects of the embodiment relating to cystine and the embodiment relating to ferric ammonium citrate described above.
  • the medium may be used as starting medium and may be used as perfusion medium.
  • the medium includes both liquid medium and powder medium.
  • recombinant proteins produced by embodiments of the present disclosure are provided.
  • a pharmaceutical composition or medicament comprising the recombinant protein, the use of the recombinant protein in the manufacture of a medicament, or a method of treating a disease comprising administering the recombinant protein.
  • Yet another embodiment comprises any step according to embodiments of the present disclosure or any method according to embodiments of the present disclosure, thereby obtaining a recombinant protein, further comprising It also relates to a method of making a pharmaceutical composition or formulation comprising admixing the protein and the carrier.
  • a CHO cell line producing humanized IgG antibodies (DXB-11 strain; G. Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) was used.
  • Vi-CELL (Beckman Coulter, Calif., US) was used to measure viable cell density and viability, and the titer was measured by Protein A-HPLC method (absorbance coefficient calculated from amino acid sequence and A280 peak). calculated based on the area).
  • Example 1 Evaluation of Cysteine Source Enhancement with Cysteine and Cystine This example demonstrated that enhancement of cystine as a cysteine source resulted in better productivity than enhancement of cysteine.
  • Condition (1) perfusion medium containing 3.379 mM cysteine
  • condition (2) perfusion medium containing 5.333 mM cysteine
  • condition (3) perfusion medium containing 1.942 mM cysteine and 1.696 mM cystine was used to perform evaluation by perfusion culture (addition of cystine from 72 hours after the start of culture).
  • Example 2 Evaluation of iron source enhancement using sodium ferrous citrate and ammonium ferric citrate Proven.
  • Cell culture starting medium and perfusion medium were prepared without iron source, and the final iron concentration was adjusted by adding corresponding amounts of sodium ferrous citrate and ammonium ferric citrate concentrates.
  • CELLiST registered trademark
  • Basal media Ajinomoto Co., Inc.: BASAL10
  • BASAL Basal media

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Abstract

組換えタンパク質の製造における生産性を改善することのできる灌流培養方法等を提供する。具体的には、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、細胞培養培地にシスチンおよび／またはクエン酸鉄アンモニウムを添加することを含む、方法等が提供される。

Description

灌流培養方法
　本発明は、動物細胞の灌流培養方法に関する。また、本発明は、組換えタンパク質を製造するための方法および組換えタンパク質産生を向上させるための方法、並びに組換えタンパク質産生を向上させるための剤にも関する。更に、本発明は、動物細胞の細胞増殖速度を低下させるための方法にも関する。
　近年、治療用抗体などの組換えタンパク質の医薬分野での重要性はますます高くなってきており、医薬として承認された組換えタンパク質の大部分は、組換えタンパク質を産生する動物細胞を培養することにより製造されている。しかしながら、組換えタンパク質の製造には、低分子化合物の製造と比べ、高いコストが必要であり、また、生産物にも、より高い品質が要求されている。
　そのため、組換えタンパク質の生産性や品質の向上を目的とした細胞培養条件の制御および最適化は、組換えタンパク質の商業的生産を成功させるために極めて重要な事項である。
　動物細胞の培養による組換えタンパク質製造の生産性を向上させるための培養工程の連続化方法の一つとして、培養液を培養槽から連続的に濾過および排出し、栄養成分を含む新鮮な培地を連続的に培養槽に供給する灌流培養方法が用いられている。この方法によれば、栄養成分濃度および老廃物濃度を一定に維持しながら細胞密度を高くすることができるため、培養槽容量当たりのタンパク質生産速度を向上させることができる。また、灌流培養方法では、産生された組換えタンパク質を培養槽からすぐに回収できるため、高い品質の組換えタンパク質を回収することが可能であり、培養液中で不安定なタンパク質でも効率よく回収することができる。
　灌流培養における生産性の改善を目的として、培養細胞の改良、細胞培養培地の改良、灌流培養方法の改良など、様々な面から、様々な改良が試みられてきた。
　例えば、国際公開２０１８／１７８０６９号には、細胞培養培地中のカリウムイオンとナトリウムイオンのモル比を制御することにより、灌流培養における生産性を改善する方法が記載されている。
〔特許文献〕
国際公開第２０１８／１７８０６９号
　灌流培養では、老廃物とともに培地成分や生産物も連続的に抜き出されるため、培地ロスによるコストの増加や生産物濃度の低下による精製コストの増加が生じ得る。
　本発明は、組換えタンパク質の製造における生産性を改善することを目的とする。
　すなわち、本発明によれば、以下に示す態様が提供される。
［１］
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、
　細胞培養培地にシスチンを添加することを含む、方法。
［２］
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における一細胞あたりの組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、
　細胞培養培地にシスチンを添加することを含む、方法。
［３］
　システイン換算でシスチンと等モル濃度のシステインを添加した場合と比較して、組み換えタンパク質産生が向上する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
　組み換えタンパク質産生が１０％以上向上する、［３］に記載の方法。
［５］
　培養開始１時間後以降にシスチンを添加することを含む、［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
　培養開始６時間後以降にシスチンを添加することを含む、［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
　培養開始２４時間後以降にシスチンを添加することを含む、［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
　培養開始７２時間後以降にシスチンを添加することを含む、［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
　灌流培養における初発培地のシステイン源濃度が０．１ｍＭ～２．１ｍＭである、［１］から［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を灌流培養するための方法であって、
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、０．１ｍＭ～２．１ｍＭのシステイン源濃度を含む細胞培養初発培地で灌流培養すること；および
　培養開始７２時間後以降に、細胞培養培地にシスチンを添加すること
を含む、方法。
［１１］
　システイン換算でシスチンと等モル濃度のシステインを添加した場合と比較して、組み換えタンパク質産生能が向上する、［１０］に記載の方法。
［１２］
　組み換えタンパク質産生能が１０％以上向上する、［１１］に記載の方法。
［１３］
　組換えタンパク質を製造するための方法であって、
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、０．１ｍＭ～２．１ｍＭのシステイン源濃度を含む細胞培養初発培地で灌流培養すること；
　培養開始７２時間後以降に、細胞培養培地にシスチンを添加すること；および、
　組換えタンパク質を回収すること
を含む、方法。
［１４］
　システイン換算でシスチンと等モル濃度のシステインを添加した場合と比較して、組み換えタンパク質産生が向上する、［１３］に記載の方法。
［１５］
　組み換えタンパク質産生が１０％以上向上する、［１４］に記載の方法。
［１６］
　添加後のシスチン濃度が０．５ｍＭ～１０ｍＭである、［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
　添加後のシスチン濃度が１ｍＭ～１０ｍＭである、［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
　添加後のシスチン濃度が１．５ｍＭ～１０ｍＭである、［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
　添加後のシスチン濃度が２ｍＭ～１０ｍＭである、［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
　ｐＨ１０以上に調整されたシスチン含有液を添加することを含む、［１］から［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
　組換えタンパク質が抗体である、［１］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞が組換えタンパク質をコードする核酸を含む、［１］から［２１］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］
　動物細胞が哺乳動物細胞である、［１］から［２２］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］
　哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、［２３］に記載の方法。
［２５］
　ＣＨＯ細胞がＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞またはＣＨＯ－ＤＧ４４細胞である、［２４］に記載の方法。
［２６］
　灌流培養における細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムを含む、［１］から［２５］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］
　シスチンを有効成分として含む、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための剤。
［２８］
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含む、方法。
［２９］
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における一細胞あたりの組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含む、方法。
［３０］
　細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、組み換えタンパク質産生が向上する、［２８］または［２９］に記載の方法。
［３１］
　他の鉄源がクエン酸第一鉄ナトリウムである、［３０］に記載の方法。
［３２］
　組み換えタンパク質産生が１０％以上向上する、［３０］または［３１］に記載の方法。
［３３］
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を灌流培養するための方法であって、
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含む、方法。
［３４］
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における細胞増殖速度を低下させるための方法であって、
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で培養することを含む、方法。
［３５］
　細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、細胞増殖速度が低下する、［３３］または［３４］に記載の方法。
［３６］
　他の鉄源がクエン酸第一鉄ナトリウムである、［３５］に記載の方法。
［３７］
　細胞増殖速度が１０％以上低下する、［３５］または［３６］に記載の方法。
［３８］
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養において排出する培養液の量を減少させるための方法であって、
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含み、
　前記排出する培養液の量はブリーディング工程において排出する培養液の量であり、ブリーディング工程は、培養槽から培養液を排出し、当該排出した培養液と同量の新鮮培地を前記培養槽に加える工程である、方法。
［３９］
　細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、排出する培養液の量が減少する、［３８］に記載の方法。
［４０］
　他の鉄源がクエン酸第一鉄ナトリウムである、［３９］に記載の方法。
［４１］
　排出する培養液の量が１０％以上減少する、［３９］または［４０］に記載の方法。
［４２］
　組換えタンパク質を製造するための方法であって、
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養すること；および、
　組換えタンパク質を回収すること、を含む、方法。
［４３］
　細胞培養培地が、３０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌの鉄濃度を与える量のクエン酸鉄アンモニウムを含む、［２８］から［４２］のいずれか一項に記載の方法。
［４４］
　細胞培養培地が、４０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌの鉄濃度を与える量のクエン酸鉄アンモニウムを含む、［２８］から［４２］のいずれか一項に記載の方法。
［４５］
　細胞培養培地が、５０ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌの鉄濃度を与える量のクエン酸鉄アンモニウムを含む、［２８］から［４２］のいずれか一項に記載の方法。
［４６］
　組換えタンパク質が抗体である、［２８］から［４５］のいずれか一項に記載の方法。
［４７］
　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞が組換えタンパク質をコードする核酸を含む、［２８］から［４６］のいずれか一項に記載の方法。
［４８］
　動物細胞が哺乳動物細胞である、［２８］から［４７］のいずれか一項に記載の方法。
［４９］
　哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、［４８］に記載の方法。
［５０］
　ＣＨＯ細胞がＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞またはＣＨＯ－ＤＧ４４細胞である、［４９］に記載の方法。
［５１］
　細胞培養培地にシスチンを添加することを含む、［２８］から［５０］のいずれか一項に記載の方法。
［５２］
　クエン酸鉄アンモニウムを有効成分として含む、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための剤。
［５３］
　シスチンおよびクエン酸鉄アンモニウムを含む、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養のための細胞培養培地。
　本発明は、組換えタンパク質の製造における生産性を改善することができる。
システイン源の違いによる組換えタンパク質の生産性の違いを示すグラフである。 鉄源の違いによる抗体生産速度（ＳＰＲ）および細胞増殖速度の違いを示すグラフである。
〔用語の説明〕
　本開示中においては、特記のない限り、各用語は以下に示す意味を有する。
　本開示における「組換えタンパク質」は、任意の遺伝子組換え技術を用いて製造された任意の長さのアミノ酸のポリマーのことをいう。ポリマーは、直鎖状でも分岐状でもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸を含んでいてもよい。また、組換えタンパク質は、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、アミド化、保護基等による誘導体化、切断、または、標識成分（例えば、放射性同位体）もしくは薬物（例えば、毒素、細胞傷害牲薬物、放射性同位体）との結合等の、化学的または生物学的修飾を受けていてもよい。組換えタンパク質部分をその構造の一部に含む分子は全て、本発明の組換えタンパク質に含まれる。用いられる遺伝子組換え技術は、遺伝子を人工的に操作する技術であれば特に限定されるものではないが、典型的な例は、組換えタンパク質をコードする核酸の宿主細胞への導入である。
　組換えタンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、遺伝子組換え技術を用いて製造される酵素、ホルモン、サイトカイン、凝固因子（または血液凝固関連タンパク質）、細胞外タンパク質、Ｎｏｔｃｈリガンド、抗体、抗体ミメティックおよびイムノアドヘシンが挙げられる。これらの組換えタンパク質は、主に、医薬、農薬、食品、その他化学工業分野で用いられるが、特定の用途に限定されるものではない。
　酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、β－ラクタマーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、およびＤＮａｓｅが挙げられる。
　ホルモンの例としては、レニン、成長ホルモン（ヒト成長ホルモンまたはウシ成長ホルモンなど）、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、カルシトニン、性腺刺激ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン）、グルカゴン、インスリン（インスリンＡ鎖およびインスリンＢ鎖）、およびプロインスリンが挙げられる。
　サイトカインの例としては、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ－αおよび－β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子（例えば、ＮＴ－３～ＮＴ－６）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β１～ＴＧＦ－β５）、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＡＮＴＥＳ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターフェロン－α、－βおよび－γ、コロニー刺激因子（例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ）、およびインターロイキン（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１３）が挙げられる。
　凝固因子および血液凝固関連タンパク質の例としては、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プラスミノーゲン活性化因子（例えば、ウロキナーゼ、ヒト尿またはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ））、トロンビン、プロトロンビン、トロンボポエチン、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、フィブリノゲン、血清アルブミンが挙げられる。
　細胞外タンパク質の例としては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、オステオポンチン、ラミニン、それらの部分配列が挙げられる。
　Ｎｏｔｃｈリガンドの例としては、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、Ｊａｇｇｅｄ－１、Ｊａｇｇｅｄ－２が挙げられる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、例えば、Ｆｃ領域との融合タンパク質として構成されていてもよい。
　本開示における「抗体」は、抗原との結合性を有する免疫グロブリン分子のことをいい、これに限定されるものではないが、軽鎖と重鎖とを含むポリペプチド鎖を有する全長抗体およびその一部分（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨＨフラグメントなどの断片）が含まれる。それぞれの重鎖または軽鎖は、可変領域（抗原に対する認識および結合に関係する）と定常領域（局在化および細胞間相互作用に関係する）を含み得る。最も一般的な全長抗体は、２箇所の重鎖定常領域（ＣＨ）、２箇所の重鎖可変領域（ＶＨ）、２箇所の軽鎖定常領域（ＣＬ）、および２箇所の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。可変領域は、抗原特異性を抗体に付与する配列である相補性決定領域（ＣＤＲ）と、フレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。
　抗体は、モノクローナル抗体、２種類以上の抗体または抗原結合部位から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、所望の生物学的活性を有する抗体断片および抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質を含む。また、抗体は、キメラ抗体（例えばヒト化抗体）、（完全）ヒト抗体、多価抗体、および改変抗体を含む。
　抗体は、何れのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、何れのサブクラス（アイソタイプ）であってもよい。
　抗体は、他の分子（限定されるものではないが、低分子または高分子の毒素（細胞傷害牲薬物）や放射性同位体等）と結合するなどの、化学的または生物学的修飾を受けていてもよく、これらの修飾を受けた抗体も、本発明の抗体に含まれる。
　本開示における「抗体ミメティック」は、抗原と特異的に結合することができるが、抗体とは構造的に関連しないタンパク質のことをいう。具体的には、抗体ミメティックとして、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ；Ａｆｆｉｂｏｄｙ）が挙げられる。より具体的には、抗体ミメティックとして、ＺＨＥＲ２　ａｆｆｉｂｏｄｙが挙げられる。
　組換えタンパク質は上記の例に限定されるものではなく、例えば、上記サイトカイン等の受容体、トランスフェリン、各種ＣＤタンパク質、腫瘍関連抗原（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体、ＣＡ１２５）、ワクチン用などのウィルス抗原（例えば、ウィルスのエンベロープタンパク質）なども含まれる。また、上述のいずれかのタンパク質を含む融合タンパク質も、組換えタンパク質に含まれる。
　本開示における「組換えタンパク質産生能を有する」とは、遺伝子組換え技術によりタンパク質を産生する能力を有することを意味する。産生された組換えタンパク質は、細胞外、すなわち培地中、に分泌されても、細胞内に蓄積されてもよいが、好ましくは細胞外に分泌される。
　典型的には、組換えタンパク質をコードする核酸を宿主細胞内に導入することにより、組換えタンパク質を産生する（発現する）能力を宿主細胞に与えることができる。すなわち、典型的な組換えタンパク質産生能を有する細胞は、組換えタンパク質をコードする核酸を含む細胞である。核酸を宿主細胞内に導入する方法は、当該技術分野では様々な手法が知られており、実施時点で公知の任意の方法を用いることができる。そのような手法の例としては、組換えタンパク質をコードする核酸を含むベクターで、宿主細胞を形質転換する方法が挙げられる。ベクターは、発現可能な形（例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列および／または転写終結配列等の調節配列と作動可能に連結した形で）で組換えタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターが好ましく、プラスミドであってもよい。
　ベクターを宿主細胞に導入する方法の例には、エレクトロポレーション法、パーティクル・ガン法、リン酸カルシウム法またはリポフェクション法により、物理的または化学的に宿主細胞内にベクターを導入する方法や、ウィルスベクターを宿主細胞に感染させる方法が含まれる。宿主細胞内に導入されたベクター内の核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集技術により、宿主細胞中のゲノムに組み込まれてもよい。あるいは、組換えタンパク質をコードする核酸を宿主細胞内に導入する代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集技術等により、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子配列を直接改変することで、目的の組換えタンパク質をコードするようにしたり、制御配列等を改変して目的の内在性タンパク質の産生を制御しても（例えば、向上させても）よい。このような態様で産生されるタンパク質も全て、本発明の組換えタンパク質に含まれる。
　本開示における「動物細胞」としては、任意の動物細胞を用いることができるが、組換えタンパク質の産生に好適に用いられる株化細胞が好ましい。動物（動物種）としては、哺乳動物（哺乳類）、鳥類、両生類、昆虫が挙げられる。好ましい動物としては、昆虫および哺乳動物が挙げられ、特に好ましくは哺乳動物である。
　昆虫細胞の例としては、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）の細胞が挙げられる。ツマジロクサヨトウの細胞としては、ツマジロクサヨトウ卵巣由来のＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、ＳＦ＋細胞が挙げられる。
　哺乳動物細胞としては、ヒトまたはサル等の霊長類の細胞や、マウス、ラットまたはハムスター等のげっ歯類の細胞が好適に用いられる。
　哺乳動物細胞には、これに限定されるものではないが、ＨＬ－６０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－２４０）、ＨＴ－１０８０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－１２１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－２）、２９３（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ．８５１２０６０２）、Ｈｅｐ　Ｇ２（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ８０６５）；ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－１６５１）、ＣＶ１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ７０）およびＣＯＳ－７（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５１）；ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）、ＮＳ０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１８２７）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＢＨＫ２１（単にＢＨＫ細胞とも称される；ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１０）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－３４）等の細胞株や、これらの細胞株から誘導された亜株（例えば、ＢＨＫ細胞の亜株としてのＢＨＫ　ＴＫ－細胞や、ＣＨＯ細胞の亜株としてのＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞（ＣＨＯ－ＤＵＫＸ細胞またはＤｕｘＢ１１細胞とも称される）およびＣＨＯ－ＤＧ４４細胞）が含まれる。
　本開示における「細胞培養培地」、「培養培地」および「培地」は、細胞を増殖または維持するために使用される栄養源を含む溶液のことをいうが、販売・提供形態について言及する場合には、その溶液を作るための原液や粉末（顆粒）も含む。栄養源は、細胞の増殖や生存に必須な成分や有用な成分を含み、そのような成分の例としては、糖類などの炭水化物、脂質、核酸、ビタミン、必須および非必須アミノ酸、必須元素、ｐＨ調整剤および溶媒（水）が挙げられる。培地は、無血清培地であってもよく、動物性タンパク質不含培地であってもよい。
　細胞培養培地は、培養する細胞や目的に応じて、商業的に入手可能な培地や文献に記載された公知の培地から適宜選択することができ、２種類以上の培地を混合して用いたり、培養の目的や細胞に応じて組成を変更したり、動物血清、動物ペプトン、その他の動物由来成分や栄養／増殖因子またはホルモンを添加することもできる。細胞培養培地は、細胞の生存および増殖に適するｐＨおよび塩濃度に調整される。細胞培養培地のｐＨは、例えば５．０～９．０であり、好ましくは６．０～８．０、より好ましくは６．５～７．５の範囲で用いられることが多い。
　商業的に利用可能な培地の例としては、ＲＰＭＩ－１６４０（Roswell Park Memorial Institute 1640）培地、Ｌ－１５培地、ＭＥＭ（イーグルの最小必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコの修正イーグル培地）、Ｉｓｃｏｖｅｓの修正ＤＭＥＭ、ハムのＦ１０培地およびＦ１２培地が含まれる。
　本開示における「化学的に定義された細胞培養培地」（ＣＤＭ）は、動物血清やペプトンなどの動物由来産物を含まず、全ての成分が化学的に定義された培地のことをいう。化学的に定義された細胞培養培地も、通常の細胞培養培地と同じく、培養する細胞株や目的に応じて、商業的に入手可能な培地や文献に記載された公知の培地から適宜選択することができ、２種類以上の培地を混合して用いたり、動物血清その他の動物成分や栄養／増殖因子またはホルモンを添加することもできる。溶液は、細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に調整される。
　商業的に利用可能な化学的に定義された細胞培養培地の例としては、ＡｍｐｌｉＣＨＯ　ＣＤ培地、Ｄｙｎａｍｉｓ（登録商標）培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）ＣＨＯ流加培地、ＣＤ　ＦｏｒｔｉＣＨＯ（登録商標）培地、ＣＰ　ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）、ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）ＣＨＯ増殖Ａ培地、ＡｃｔｉＰｒｏ（登録商標）、ＭＥＭ（イーグルの最小必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコの修正イーグル培地）、ＲＰＭＩ－１６４０（Roswell Park Memorial Institute 1640）培地およびＣＥＬＬｉＳＴ（登録商標）Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉａ（ＢＡＳＡＬ３、ＢＡＳＡＬ１０）、Ｆｅｅｄ　Ｍｅｄｉａ（ＦＥＥＤ２）を挙げることができる。
　本開示における「灌流培養」とは、培養中に細胞を培養槽（リアクター、培養器ともいう）内に保持しながら、細胞培養培地を連続的または断続的に培養槽から排出し、栄養成分を含む培地（新鮮な培地）を連続的または断続的に培養槽に導入すること（培地の灌流）により、溶媒量をおよそ一定に維持しながら細胞を培養する培養方法である。
　培養中に細胞を培養槽内に保持するには、細胞を培地と分離し、細胞を培養槽内に留める作業が必要である。この細胞と培地の分離の方式としては、半透膜やフィルターを用いたろ過（交互接線流灌流濾過システムなど）、重力沈降、遠心分離または音響分離などが用いられる。また、灌流培養に適する分離機能等を有した培養槽・培養装置または培養システムも多く知られており、商業的に利用可能である。
　灌流培養において用いられる細胞培養培地は、他の方式の細胞培養で用いられる細胞培養培地と同一のものを用いることができる。また、培養開始時の培地（初発培地）と、その後の灌流に用いる培地（灌流培地）とは同じ組成でも異なる組成（一部の成分が増減したり、別の成分が添加されている）でもよい。
　本開示にて用いられる「シスチン」は、シスチン（Ｌ－シスチン）と、培地添加後にシスチンとして機能するシスチン塩と、それらの水和物とを含む。ただし、シスチン濃度について言及する場合は、シスチン（Ｌ－シスチン）の濃度を意味する。
　シスチン塩としては、シスチン二塩酸塩、シスチン二ナトリウム塩、シスチン二ナトリウム塩一水和物などが挙げられる。水和物としては、シスチン二ナトリウム塩一水和物が挙げられる。複数のシスチンまたはシスチン塩を組み合わせて用いることも可能である。
　本開示にて用いられる「システイン源」とは、必要に応じて分解などの過程を経たのちに、細胞内でシステインとして利用され得る化合物を意味する。システイン源の具体例としては、システイン、シスチン、グルタチオンが挙げられる。
　本開示にて用いられる「システイン源濃度」とは、システイン源のシステイン換算の濃度をいう。例えば、シスチンの場合、システイン源濃度はシスチン濃度の二倍となり、グルタチオンの場合にはシステイン源濃度はグルタチオン濃度と等しくなる。
　本開示にて用いられる「クエン酸鉄アンモニウム」は、クエン酸イオンと第二鉄イオンとアンモニウムイオンからなるクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムまたはその水和物であれば、特に限定されるものではない。クエン酸鉄アンモニウムについては、各イオンの含有割合によって緑色と赤褐色のものとが知られているが、いずれも本開示の実施形態に好適に用いることができる。
　本開示にて用いられる「他の鉄源」とは、細胞培養培地の鉄源として利用可能な、クエン酸鉄アンモニウム以外の鉄イオン含有分子のことをいう。他の鉄源の例としては、リン酸第二鉄、ピロリン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第一鉄、塩化第二鉄、乳酸第一鉄、クエン酸第二鉄、クエン酸第一鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸第二鉄ナトリウム、デキストラン鉄およびこれらの水和物、ならびにこれらの任意の組み合わせが含まれる。
　本開示における「鉄濃度」（鉄イオン濃度）については、入手元（市販元等）から鉄源中の鉄含有量の値（あるいは、鉄源の分子式等の鉄含有量につながり得る情報）を入手できる場合、その値を用いて鉄濃度の理論値を計算するのが最も好ましいが、それができない場合は、公知の方法を用いて、溶液中の鉄濃度（鉄イオン濃度）を定量してもよい。
　溶液中の鉄濃度を定量する方法としては、還元等の必要な処理を適宜行った上での、フェナントロリン吸光光度法、フレーム原子吸光法、電気加熱原子吸光法およびＩＣＰ発光分光分析法を挙げることができる。
　クエン酸鉄アンモニウムを添加する場合において、計算により鉄濃度の理論値を求める際に、入手元から鉄含有量の値等を入手できず、クエン酸鉄アンモニウムの分子式も不明または未確定の場合には、簡便のため、クエン酸鉄アンモニウムの鉄含有量として１７．５質量％（赤褐色の場合）または１５質量％（緑色の場合）を用いることができる。
　本開示における「培地添加物」は、培地に添加される任意の物質又は物質を含む組成物を指す。培地添加物は、添加する培地に既に存在する成分を補充するものでも、添加する培地に存在しない成分を新規に追加するものでもよい。培地添加物は、典型的には、液体形態又は粉末形態（顆粒形態を含む）で提供される。また、添加の目的は、特に限定されない。
　本開示で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途明確に指示されない限り、複数の対象を含み得る。
　本開示で使用される「および／または」は、「および」で表される関係性と、「または」で表される関係性の双方を含む。
　本開示における「を含む」には、「から主としてなる」、「から実質的になる」および「からなる」が含まれ、「から主としてなる」には「から実質的になる」および「からなる」が含まれ、「から実質的になる」には「からなる」が含まれる。
　本開示におけるそれぞれの数値範囲については、「～」、「から」で示された上限値および下限値をそれぞれ含むものとする。例えば、数値ＡおよびＢを用いた「Ａ～Ｂ」または「ＡからＢ」なる記載は、Ａ以上Ｂ以下であることを意味する。また、本開示に段階的に記載されている数値範囲における「Ａ～Ｂ」、「ＡからＢ」または「Ａ以上Ｂ以下」との記載は、独立して、「Ａ以上が好ましい」ことと、「Ｂ以下が好ましい」ことの双方を含み、これらの下限値または上限値を他の数値範囲の上限値または下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲の下限値または上限値は、その数値範囲内の数値であって、実施例で示されている数値に置き換えてもよい。
〔実施形態〕
　以下、発明を実施するための形態を用いて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　これらの実施形態は、単独でも、複数を組み合わせてもよい。また、各実施形態の定義や詳細については、前述の「用語の説明」も参照できる。
　本開示で用いられる公知の技術および手順は、当業者には十分に理解されるものであり、常法に従い実施することができる。
　ある実施形態では、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、細胞培養培地にシスチンを添加することを含む、方法が提供される。この方法では、灌流培養時の組換えタンパク質産生が向上することで、組換えタンパク質製造の生産性が向上する。
　組換えタンパク質産生の指標として、これに限定されるものではないが、例えば、培養槽あたりの組換えタンパク質産生速度（単位時間当たりの産生量）、単位培養容積（培地容積）あたりの組換えタンパク質産生速度（単位時間当たりの産生量）、単位細胞あたりの組換えタンパク質産生速度（単位時間当たりの産生量）を用いることができる。これらの例としては、それぞれ、１日当たりの組換えタンパク質産生量、１日、１Ｌ当たりの組換えタンパク質産生量、および１日、１細胞当たりの組換えタンパク質産生量が挙げられる。ある実施形態では、上記指標のうちの少なくとも一つにおいて、タンパク質産生が向上する。
　タンパク質の量は、それぞれのタンパク質に応じた公知の定量方法により、定量することができる。タンパク質の定量方法としては、例えば、ＨＰＬＣ等のクロマトグラフィーとタンパク質の吸光（例えば、２８０ｎｍでの吸光）を組み合わせて、吸光係数（アミノ酸配列からの計算値やＢＳＡ等の参照タンパク質の値等を基にしたもの）と吸光ピーク面積から定量する方法や、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）等で精製／粗精製したタンパク質の吸光から定量する方法が挙げられる。精製／粗精製したタンパク質については、ＢＣＡ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法またはＬｏｗｒｙ法などを用いて定量することもできる。
　ある実施形態では、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における一細胞あたりの組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、細胞培養培地にシスチンを添加することを含む、方法が提供される。一細胞あたりの組換えタンパク質産生の指標としては、一細胞あたりの組換えタンパク質産生速度（例えば、１日、１細胞あたりのタンパク質産生量）を用いることができる。組換えタンパク質が抗体の場合、抗体生産速度（ＳＰＲ）が好適に用いられる。この方法では、灌流培養時の一細胞あたりの組換えタンパク質産生が向上することで、組換えタンパク質製造のコストが抑えられ、生産性が向上する。
　一細胞あたりの組換えタンパク質産生は、それぞれのタンパク質に応じた定量方法によりタンパク質を定量するともに、細胞数を計測することにより、算出することができる。タンパク質の定量方法は、いずれの手法を用いてもよく、細胞数の計測も、手動で計測しても、機械を用いて計測しても、あるいは、細胞数を定量化することのできる試薬を用いた生物・化学的手法により定量化しても、これらを組み合わせて計測してもよい。
　一細胞あたりの組換えタンパク質産生が向上することで、細胞由来の不純物・夾雑物に対する組換えタンパク質の比率（純度）が増加するため、その後の精製工程がより簡便なものになり、コストを抑えることができる。また、産生時点でのタンパク質の品質の改善は、最終製品の品質の改善にもつながり得、最終製品の品質の改善は、医薬製品となった際の安全性などの観点からも好ましい。
　特に、灌流培養は、細胞培養培地を還流させるために、他の培養方法と比べ、より多くの培地を消費することになり、コスト増につながり得るという改善点を有していた。一細胞あたりの組換えタンパク質産生が向上することで、同じ量の細胞培養培地を使用した際に、より多量の組換えタンパク質を得ることができ（同じ量の組換えタンパク質を産生するのにより少量の培地で済み）、更なるコスト減・生産性の向上につながり得る。
　ある実施形態では、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を灌流培養するための方法であって、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、細胞培養初発培地で灌流培養すること；および細胞培養培地にシスチンを添加することを含む、方法が提供される。この方法では、組換えタンパク質の高い産生能を有する細胞を培養することができる。
　この方法では、初発培地とは異なる灌流培養用の灌流培地を用い、その灌流培地と共にもしくは別々にシスチンを添加することもできる。
　ある実施形態では、組換えタンパク質を製造するための方法であって、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、細胞培養初発培地で灌流培養すること；細胞培養培地にシスチンを添加すること；および、組換えタンパク質を回収することを含む、方法が提供される。この方法では、優れた生産性で、組換えタンパク質を製造することができる。
　この方法では、初発培地とは異なる灌流培養用の灌流培地を用い、その灌流培地と共にもしくは別々にシスチンを添加することもできる。
　本開示の実施形態における灌流培養（Perfusion培養）は特定の灌流培養方法に限定されるものではなく、実施時点で公知の任意の灌流培養法を用いることができる。細胞分離手段や培地の供給手段、培養条件（ＣＯ２濃度、ＤＯ、培養温度、培養時間等）・培養規模や培養槽についても、特に限定されず、培養する細胞の性質や産生する組換えタンパク質の性質などを考慮の上、公知の条件等から適宜選択して実施することができる。例示的な培養条件としては、培養温度３０～４０℃、ＣＯ２濃度０～４０％、ＤＯ２０～７０％、培養時間１～９０日、培養液量１０ｍＬ～２０００Ｌ、および／または灌流量１日当たり０．１～３０培養量が挙げられる。動物細胞は、好ましくは、組換えタンパク質が発現される条件下または組換えタンパク質の発現に好適な条件下で培養される。
　灌流培養に用いる細胞培養培地については、特定のものに限定されるものではなく、培養する細胞や産生する組換えタンパク質を考慮して適宜選択することができる。細胞培養培地は、好ましくは、化学的に定義された細胞培養培地（ＣＤＭ）である。また、初発培地と灌流培地は、同一または類似の組成であっても、異なる組成であってもよい。本開示の実施形態において、特別な言及なく「培地」、「培養培地」または「細胞培養培地」というとき、これは灌流培養開始時の培地である「初発培地」と、灌流のため新たに加える培地である「灌流培地」の双方を意味する。
　本開示の実施形態において、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の典型例としては、組換えタンパク質をコードする核酸を含む動物細胞が挙げられる。組換えタンパク質をコードする核酸はゲノムに組み込まれていてもよい。
　本開示の実施形態における動物細胞としては任意の動物細胞を用いることができるが、株化細胞、特に組換えタンパク質の製造に有用な動物細胞株が好ましい。
　動物細胞は、これに限定されるものではないが、好ましくは昆虫細胞および哺乳動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞である。
　好適な昆虫細胞株の例としては、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、ＳＦ＋細胞を挙げることができる。
　好適な哺乳動物細胞株の例としては、ＢＨＫ２１細胞およびＣＨＯ細胞を挙げることができ、特に好ましいのはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）である。ＣＨＯ細胞には、ＣＨＯ細胞から派生した様々な亜株（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞（ＣＨＯ－ＤＵＫＸ細胞またはＤｕｘＢ１１細胞とも称される）またはＣＨＯ－ＤＧ４４細胞）も含まれる。
　本開示の実施形態において、対象となる組換えタンパク質は特定のものに限定されず、任意の組換えタンパク質を対象とすることができる。組換えタンパク質の好適な例は、抗体である。
　本開示の実施形態におけるシスチンについては、添加後に培地中でシスチン（Ｌ－シスチン）として機能するものであれば何でもよいが、シスチンの可溶性を高める観点からｐＨを１０以上に調整したシスチン含有液を培地に加えることが好ましい。
　シスチンを添加する時期及び対象培地については特に限定されるものではなく、培養開始前の初発培地に添加してもよく、灌流培地および／または培養開始後の初発培地に添加してもよい。また、シスチンは、培地に対して一度に添加してもよく、複数回に分けて添加してもよい。シスチンは、好ましくは、培養開始後に培地に添加され、さらにより好ましくは灌流培地に添加される。特にシスチン濃度が高い場合、培養開始後にシスチンを添加することで、より良好な細胞の生育につながり得る。培養開始後にシスチンを添加する場合、例えば、培養開始１時間後以降に添加されてよいが、好ましくは培養開始６時間後以降、より好ましくは２４時間後以降、更により好ましくは７２時間後以降に添加される。添加の際には、シスチンを直接培地に添加しても、シスチンを溶解・懸濁させた溶液・懸濁液または培地を添加してもよい。灌流培地にシスチンを添加する際には、シスチン含有培地をあらかじめ調製し、それを灌流培地として使用してもよい。
　添加するシスチンの量は、発明の効果を奏する範囲内で特に限定されるものではないが、例えば、添加後（添加直後）の培地中のシスチン濃度が０．５ｍＭ～１０ｍＭとなる量が挙げられる。添加後（添加直後）の培地中のシスチン濃度は、好ましくは０．７ｍＭ～１０ｍＭまたは０．８ｍＭ～１０ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ～１０ｍＭ、さらにより好ましくは１．５ｍＭ～１０ｍＭ、特に好ましくは２ｍＭ～１０ｍＭ、特により好ましくは２．１ｍＭ～１０ｍＭ、あるいは、２．５ｍＭ～１０ｍＭである。シスチン添加量がこれらの範囲にあるとき、特に優れた効果を発揮することができる。上記範囲より低濃度のシスチンを添加したのちに、上記範囲内となるようにシスチンを追加添加することも上記実施形態に含まれる。
　本開示の実施形態におけるシスチンは、動物細胞でシステイン源として用いられる。そのため、本開示のある実施形態によれば、培地中のシステイン源濃度を制限することができる。
　すなわち、本開示の更なる実施形態では、初発培地および／または灌流培地のシステイン源濃度は、例えば、０．１ｍＭ～３ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ～２．１ｍＭ、より好ましくは、０．１ｍＭ～１．５ｍＭである。好ましくは初発培地のシステイン源濃度が上記の範囲内である。より好ましくは、初発培地および灌流培地のシステイン源濃度が上記の範囲である。これらのシステイン源濃度のシステイン源に上乗せする形で、更に、前述したいずれかの形態でシスチンを添加してもよい。
　別の実施形態では、システイン源がシスチン以外のシステイン源であり、シスチン以外のシステイン源が上記濃度範囲内である。このとき、上記濃度範囲のシスチン以外のシステイン源とは別に、シスチンが添加されていてもよい。シスチン以外のシステイン源は、好ましくはシステインである。
　別の実施形態では、初発培地および／または灌流培地はシスチン以外のシステイン源を含まず、シスチンのみをシステイン源として含有していてもよい。
　システインは培地安定性に悪影響を与え得るため、初発培地でのシステイン源濃度が低いことは、培地安定性の上で有利となる。
　特に灌流培養は、他の培養方法（例えば、流加培養（Fed-batch培養））に比べ、培地使用量が極めて多くなるため、大量の培地を前もって調製する必要があり、この大量調整の際に培地安定性の高さは非常に有利な特性となる。すなわち、この効果は、灌流培養において特に望ましい効果といえる。
　本開示の実施形態における「組み換えタンパク質産生を向上させる」または「組み換えタンパク質産生が向上する」とは、本開示外の条件で実施した際と比較して、組換えタンパク質産生が向上することを意味するが、好ましくは、システイン換算でシスチンと等モル濃度のシステインを添加した場合と比較して、組換えタンパク質産生が向上する。
　すなわち、本開示の更なる実施形態では、システイン換算でシスチンと等モル濃度のシステインを添加した場合と比較して、組み換えタンパク質産生または組み換えタンパク質産生能が向上する。実施例にて示されたように、驚くべきことに、システイン換算でシスチンと等モル濃度のシステインを添加した場合と比較して、本開示の実施形態の方法では、組み換えタンパク質産生または組み換えタンパク質産生能が向上する。
　シスチンは二つのシステインがＳ－Ｓ結合でつながれているものであり、システイン換算で等モル濃度とは、シスチン濃度がシステインの半分のモル濃度であることを意味する。
　本開示の更なる実施形態では、組み換えタンパク質産生または組み換えタンパク質産生能が１０％以上向上する。組み換えタンパク質産生または組み換えタンパク質産生能は、好ましくは、２０％以上、より好ましくは３０％以上、更により好ましくは４０％以上向上する。
　また、本開示の更なる実施形態が達成し得る組み換えタンパク質の産生能としては、例えば、５～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは、５．５～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは６～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙ、さらにより好ましくは７～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙが挙げられる。組換えタンパク質の産生能の別の指標としては、例えば、２０～２００ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ、好ましくは２４～１５０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ、さらにより好ましくは２５～１２０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙが挙げられる。また、他の範囲として、２０～４０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ、２３もしくは２４～４０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ、または２５～４０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙを挙げることもできる。
　本開示の実施形態により組換えタンパク質を製造する際には、前述した工程に加えて、更に様々な追加工程を含んでもよく、それらも本開示の実施形態に含まれる。追加的な工程としては、組換えタンパク質を精製することや、組換えタンパク質を化学的または生物学的に修飾することが挙げられる。
　組換えタンパク質の精製には通常、複数の手法が組み合わせて用いられるが、クロマトグラフィーが好適に用いられる。特に、組換えタンパク質が抗体である場合は、アフィニティークロマトグラフィーやプロテインＡクロマトグラフィーなどが好適に用いられる。
　組換えタンパク質の化学的または生物学的な修飾としては、これに限定されるものではないが、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、アミド化、保護基等による誘導体化、切断、または、標識成分もしくは薬物（毒素等）などとの結合が挙げられる。一例として、毒素等の薬物と結合した抗体の製造方法も、本開示の組換えタンパク質の製造方法に含まれ、その場合、追加的な工程として、抗体と薬物とを結合させることを更に含んでいてもよい。この場合は、薬物と結合した抗体は、本開示の組換えタンパク質に含まれる。
　本開示の更なる実施形態では、後述するクエン酸鉄アンモニウムに係る実施形態が、上記実施形態と組み合わされる。
　すなわち、本開示の更なる実施形態では、細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムを含む。クエン酸鉄アンモニウムを用いる実施態様の詳細については、後述する説明を参照することができ、後述する様々な実施形態を組み合わせることができる。
　本開示の別の実施形態は、シスチンを有効成分として含む、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための剤である。この剤は、灌流培養時の組換えタンパク質産生を向上させることにより、組換えタンパク質製造の生産性を向上させることができる。
　上記剤の実施形態は、シスチンを有効成分として含む限り、特定の形態に限定されるものではなく、シスチンのみからなっても、あるいは、担体やｐＨ調整剤、培地等を含む組成物の形であっても構わない。また、剤は、液体の形態であってよく、固体、例えば粉末の形態（顆粒の形態を含む）であってもよい。
　上記剤の実施形態は、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させることを用途とするものである。用途は、好ましくは、剤の販売用パンフレット、取扱説明書、製品に関するウェブサイト等において記載される。この場合、用途は、剤の効果として記載されることもあり得る。また、剤の具体的な使用法としては、培養前（培地調製時）または培養中における培地添加物としての使用が挙げられる。
　上記剤の実施形態の詳細やその更なる実施形態については、前述した方法の実施形態の詳細や各実施形態を参照にすることができ、その構成や詳細が本実施形態にも援用される。
　上記剤の実施形態に関連する実施形態として、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための剤としてのシスチンの使用、または、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるためのシスチンの使用が挙げられ、これらの実施形態も上記剤の実施形態と同様に実施することができる。
　これまでシスチンを用いた実施形態について説明してきたが、本発明者らは、鉄源としてのクエン酸鉄アンモニウムも、組換えタンパク質の生産性向上に寄与することを見出した。
　すなわち、本開示のある実施形態は、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含む、方法である。この方法では、灌流培養時の組換えタンパク質産生が向上し、組換えタンパク質製造の生産性が向上する。
　本開示のある実施形態は、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における一細胞あたりの組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含む、方法である。この方法では、灌流培養時の一細胞あたりの組換えタンパク質産生が向上することで、組換えタンパク質製造のコストが抑えられ、生産性が向上する。
　本開示の実施形態における「組換えタンパク質産生を向上させる」または「組み換えタンパク質産生が向上する」とは、本開示外の条件で実施した際と比較して、組換えタンパク質産生が向上することを意味するが、好ましくは、細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、組換えタンパク質産生が向上する。
　すなわち、本開示の更なる実施形態では、細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、組み換えタンパク質産生または組み換えタンパク質産生能が向上する。実施例にて示されたように、驚くべきことに、細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、本開示の実施形態の方法では、組み換えタンパク質産生または組み換えタンパク質産生能が向上する。
　本開示の更なる実施形態では、他の鉄源は、クエン酸第一鉄ナトリウムである。本実施形態は、鉄源として一般的なクエン酸第一鉄ナトリウムを用いた場合と比較して、優れた効果を奏する。
　本開示の更なる実施形態では、組み換えタンパク質産生または組み換えタンパク質産生能が１０％以上向上する。組み換えタンパク質産生または組み換えタンパク質産生能は、好ましくは、２０％以上、より好ましくは３０％以上、更により好ましくは４０％以上向上する。
　また、本開示の更なる実施形態が達成し得る組み換えタンパク質の産生能としては、例えば、５～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは、５．５～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは６～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙ、さらにより好ましくは７～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙが挙げられる。組換えタンパク質の産生能の別の指標としては、例えば、２０～２００ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ、好ましくは２４～１５０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ、さらにより好ましくは２５～１２０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙが挙げられる。また、他の範囲として、２０～４０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ、２３もしくは２４～４０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ、または２５～４０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａyを挙げることもできる。
　ある実施形態では、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を灌流培養するための方法であって、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含む、方法が提供される。この方法では、組換えタンパク質の高い産生能を有する細胞を培養することができる。
　本開示のある実施形態は、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における細胞増殖速度を低下させるための方法であって、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で培養することを含む、方法である。この方法では、灌流培養における細胞増殖速度が低下することにより、組換えタンパク質製造の生産性が向上する。
　本開示のある実施形態は、組換えタンパク質の産生を向上させつつ、細胞増殖を抑制することができ、その場合は、所望の組換えタンパク質の産生量は維持しつつ、必要な培地量等を抑えることができる。また、同じ量の組換えタンパク質における細胞由来の不純物も低減させることができ、精製コストの削減や品質の向上にも寄与する。
　本開示の実施形態における「細胞増殖速度を低下させる」または「細胞増殖速度が低下する」とは、本開示外の条件で実施した際と比較して、細胞増殖速度が低下することを意味するが、好ましくは、細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、細胞増殖速度が低下する。
　本開示の更なる実施形態では、他の鉄源は、クエン酸第一鉄ナトリウムである。本実施形態は、鉄源として一般的であるクエン酸第一鉄ナトリウムと比較して、優れた効果を奏する。
　本開示の更なる実施形態では、細胞増殖速度が１０％以上低下する。細胞増殖速度は、好ましくは、２０％以上、より好ましくは３０％以上、更により好ましくは４０％以上低下する。
　本開示のある実施形態は、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養において排出する培養液の量を減少させるための方法であって、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含み、前記排出する培養液の量はブリーディング工程において排出する培養液の量であり、ブリーディング工程は、培養槽から培養液を排出し、当該排出した培養液と同量の新鮮培地を前記培養槽に加える工程である、方法である。この方法では、排出する培養液の量が減少することにより、組換えタンパク質製造の生産性が向上する。排出する培養液の減少は、細胞増殖が抑えられることによりもたらされる。
　本開示の実施形態における「排出する培養液の量を減少させる」または「排出する培養液の量が減少する」とは、本開示外の条件で実施した際と比較して、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養において排出される培養液の量が減少することを意味する。排出する培養液の量の指標としては、これに限定されるものではないが、ブリーディング工程全体あるいはその中の一定時間で排出された培養液の総量や単位時間内に排出された培養液の量（培養液の排出速度）が用いられる。
　本開示のある実施形態は、組換えタンパク質の産生を向上させつつ、排出する培養液の量を減少させることができ、その場合は、所望の組換えタンパク質の産生量は維持しつつ、必要な培地量等を抑えることができる。また、細胞外に分泌される組換えタンパク質については、排出する培養液の量が減少することで、より高濃度での生産が可能となり、その後の品質や精製コストの点でも有利となる。
　本開示の更なる実施形態は、細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養において排出する培養液の量を減少させる。本実施形態では、実施例にて示されたように、驚くべきことに、細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、排出する培養液の量が減少する。
　本開示の更なる実施形態では、他の鉄源は、クエン酸第一鉄ナトリウムである。本実施形態は、鉄源として一般的であるクエン酸第一鉄ナトリウムと比較して、優れた効果を奏する。
　本開示の更なる実施形態では、排出する培養液の量が１０％以上減少する。排出する培養液の量は、好ましくは、２０％以上、より好ましくは３０％以上、更により好ましくは４０％以上減少する。
　本開示の実施形態におけるクエン酸鉄アンモニウムはクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムまたはクエン酸第二鉄アンモニウムとも表記され得る。クエン酸鉄アンモニウムは初発培地および／または灌流培地に添加される。添加の際には、クエン酸鉄アンモニウムを直接培地に添加しても、クエン酸鉄アンモニウムを溶解・懸濁させた溶液・懸濁液または培地を添加してもよい。
　添加するクエン酸鉄アンモニウムの量は、発明の効果を奏する範囲内で特に限定されるものではないが、例えば、添加後の培地中においてクエン酸鉄アンモニウムに由来する鉄濃度（鉄イオン濃度）が１０ｍｇ／Ｌ～３００ｍｇ／Ｌとなる量が挙げられる。本開示では、このような鉄濃度を、例えば、「１０ｍｇ／Ｌ～３００ｍｇ／Ｌの鉄濃度を与える量」という表現を用いて表すことがある。鉄濃度は、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌまたは３０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌまたは４０ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌまたは５０ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌである。クエン酸鉄アンモニウムがこれらの範囲にあるとき、特に優れた効果を発揮することができる。
　別の実施形態では、添加するクエン酸鉄アンモニウムの量については、発明の効果を奏する範囲内で特に限定されるものではないが、例えば、細胞培養培地は５０ｍｇ／Ｌ～１５００ｍｇ／Ｌのクエン酸鉄アンモニウムを含む。クエン酸鉄アンモニウムの濃度は、好ましくは１００ｍｇ／Ｌ～１０００ｍｇ／Ｌまたは１５０ｍｇ／Ｌ～１０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｍｇ／Ｌ～１０００ｍｇ／Ｌまたは２００ｍｇ／Ｌ～７５０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは２５０ｍｇ／Ｌ～１０００ｍｇ／Ｌまたは２５０ｍｇ／Ｌ～７５０ｍｇ／Ｌである。クエン酸鉄アンモニウムがこれらの範囲にあるとき、特に優れた効果を発揮することができる。
　ある実施形態では、細胞培養培地は、上述のクエン酸鉄アンモニウムに加えて、他の鉄源を含んでいてもよい。
　他の鉄源を含むとき、その量は特に限定されるものではないが、例示的な鉄源の量としては、クエン酸鉄アンモニウムも含めた培地中の鉄濃度が１ｍｇ／Ｌ～４００ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ～３００ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌまたは５０ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌとなる量が挙げられる。
　上記のクエン酸鉄アンモニウムに係る実施形態の詳細や更なる実施形態については、前述したシスチンに係る実施形態の詳細や具体的な実施形態を参照にすることができ、その構成や詳細がクエン酸鉄アンモニウムに係る実施形態にも援用される。
　例えば、クエン酸鉄アンモニウムに係る実施形態における組換えタンパク質、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞、灌流培養、または組換えタンパク質産生量の増加については、前述のシスチンに係る実施形態における組換えタンパク質、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞、灌流培養、または組換えタンパク質産生量の増加の説明を参酌することができる。
　本開示の別の実施形態は、クエン酸鉄アンモニウムを有効成分として含む、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための剤である。この剤は、灌流培養時の組換えタンパク質産生を向上させることにより、組換えタンパク質製造の生産性を向上させることができる。
　また、本開示の別の実施形態は、クエン酸鉄アンモニウムを有効成分として含む、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における細胞増殖速度を低下させるための剤、または、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養において排出する培養液の量を低下させるための剤である。
　上記剤の実施形態は、クエン酸鉄アンモニウムを有効成分として含む限り、特定の形態に限定されるものではなく、クエン酸鉄アンモニウムのみからなっても、あるいは、担体やｐＨ調整剤、培地等を含む組成物の形であっても構わない。また、剤は、液体の形態であってよく、固体、例えば粉末の形態（顆粒の形態を含む）であってもよい。
　上記剤の実施形態はそれぞれ、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させること、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における細胞増殖速度を低下させること、または、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養において排出する培養液の量を減少させることを用途とするものである。用途は、好ましくは、剤の販売用パンフレット、取扱説明書、製品に関するウェブサイト等において記載される。この場合、用途は、剤の効果として記載されることもあり得る。また、剤の具体的な使用法としては、培養前（培地調製時）または培養中における培地添加物としての使用が挙げられる。
　上記実施形態の詳細や更なる具体的な実施形態については、前述した方法の実施形態の詳細や各実施形態（シスチンに係る実施形態を援用した部分を含む）を参照にすることができ、その構成や詳細が本実施形態にも援用される。
　上記剤の実施形態に関連する実施形態として、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための剤としてのクエン酸鉄アンモニウムの使用、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるためのクエン酸鉄アンモニウムの使用、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における細胞増殖速度を低下させるための剤としてのクエン酸鉄アンモニウムの使用、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における細胞増殖速度を低下させるためのクエン酸鉄アンモニウムの使用、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養において排出する培養液の量を低下させるための剤としてのクエン酸鉄アンモニウムの使用、または、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養において排出する培養液の量を低下させるためのクエン酸鉄アンモニウムの使用が挙げられ、これらの実施形態も上記剤の実施形態と同様に実施することができる。
　本開示の別の実施形態は、シスチンおよびクエン酸鉄アンモニウムを含む、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養のための細胞培養培地である。この培地は、上述したシスチンに係る実施形態とクエン酸鉄アンモニウムに係る実施形態の作用および効果を双方発揮することで、組換えタンパク質製造の生産性を向上させることができる。培地は、初発培地として用いられてよく、灌流培地として用いられてもよい。また、培地には、液体培地および粉末培地の双方を含む。
　上記実施形態の詳細や更なる具体的な実施形態については、前述した方法の実施形態の詳細や各実施形態（シスチンに係る実施形態を援用した部分を含む）を参照にすることができ、その構成や詳細が上記実施形態にも援用される。
　なお、上記実施形態等により説明される各方法等は、本発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
　例えば、ある実施形態では、本開示の実施形態で製造された組換えタンパク質が提供される。また、別の実施形態は、その組換えタンパク質を含む薬学的組成物または医薬、その組換えタンパク質の医薬の製造における使用、あるいはその組換えタンパク質を投与することを含む疾患の治療方法に関する。また、別の実施形態は、本開示の実施形態に係るいずれかの工程、または本開示の実施形態に係るいずれかの方法を含み、それにより組換えタンパク質を得ることを含み、更にその組換えタンパク質と担体とを混合することを含む、医薬組成物または医薬製剤の製造方法にも関する。
　以下、実施例により、本発明を説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬・機器等は、特に示さない限りは製造者の使用説明もしくは定法に従い使用した。
〔材料および方法〕
（細胞）
　全ての実験に関して、ヒト化ＩｇＧ抗体を産生するＣＨＯ細胞株（DXB-11株；G. Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980）を使用した。
（細胞培養条件）
灌流培養
　全容２Ｌのバイオリアクターに化学的に定義された細胞培養培地を加え、これに上記ＣＨＯ細胞株を播種し、培養液量１Ｌ、３７℃で培養を開始した。ＤＯは５０％、ｐＨは７．１５±０．０５で制御した。培養１日目より、化学的に定義された灌流培地にて、２．０μｍの中空糸フィルタ（Repligen, MA, US）を有する交互接線流灌流濾過システム（Refine Technologies, Hanover, NJ）を用いて、１日当たり１．０～５．０培養量で灌流を実施した。
リピート培養
　十分量の上記ＣＨＯ細胞株培養液を遠心して上清を除去した後、１００ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように化学的に定義された灌流培地に懸濁し、１２５ｍＬ三角フラスコ（Corning, NY, US）にて、培養液量２０ｍＬ、３７℃で培養を開始した。培養４日目まで１日毎に、培養液を遠心して上清を除去した後、１００ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように化学的に定義された新鮮な灌流培地に再懸濁し、培養液量２０ｍＬ、３７℃で培養を継続した。
（分析方法）
生細胞密度・生存率測定はＶｉ－ＣＥＬＬ（Beckman Coulter, CA, US）を用いて、力価は培養液の遠心上清をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ－ＨＰＬＣ法（アミノ酸配列から計算した吸光係数とＡ２８０のピーク面積を基に算出）を用いて測定した。
〔実施例１〕
システインおよびシスチンによるシステイン源増強評価
　本例は、システイン源としてシステインを増強するよりも、シスチンを増強した方が生産性が向上することを実証した。条件（１）（システインを３．３７９ｍＭ含む灌流培地）、条件（２）（システインを５．３３３ｍＭ含む灌流培地）、条件（３）（システインを１．９４２ｍＭ、シスチンを１．６９６ｍＭ含む灌流培地）を用いて、灌流培養（培養開始７２時間後からシスチン添加）による評価を実施した。なお、１．２５倍濃縮したCELLiST（登録商標）Basal media（味の素株式会社：BASAL10）と、CELLiST（登録商標）Feed media（味の素株式会社：FEED2）を９４：６で混合したものを細胞培養初発培地および灌流培地として使用した。図１に結果を示す。条件（１）と比して、システイン源を増強した条件（２）、条件（３）はともに生産性が向上したが、驚くべきことに、システイン換算で同等のｍｏｌ濃度で増強した条件（２）、条件（３）では、シスチンとして増強した条件（３）の方がさらに生産性が向上していた。
〔実施例２〕
クエン酸第一鉄ナトリウムおよびクエン酸鉄アンモニウムによる鉄源増強評価
　本例は、鉄源としてクエン酸鉄アンモニウムを増強することで、生産性が大幅に向上する一方、増殖性が抑制されることを実証した。細胞培養初発培地および灌流培地は鉄源を含まない形で調製され、対応する量のクエン酸第一鉄ナトリウムおよびクエン酸鉄アンモニウム各濃縮液を添加することで鉄終濃度を調整した。なお、細胞培養初発培地および灌流培地としてCELLiST（登録商標）Basal media（味の素株式会社：BASAL10）を使用した。評価はリピート培養にて実施した。結果を図２に示す。鉄源を増強することで生産性が向上したが、驚いたことに、クエン酸鉄アンモニウムとして増強した方が、生産性がより向上した一方で増殖性が鈍化していた。
　なお、本開示に引用された特許、特許出願、および出版物の開示内容は、その全体が、参照により本開示に援用される。

Claims (53)

  1. 　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、
    　細胞培養培地にシスチンを添加することを含む、方法。
  2. 　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における一細胞あたりの組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、
    　細胞培養培地にシスチンを添加することを含む、方法。
  3. 　システイン換算でシスチンと等モル濃度のシステインを添加した場合と比較して、組み換えタンパク質産生が向上する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　組み換えタンパク質産生が１０％以上向上する、請求項３に記載の方法。
  5. 　培養開始１時間後以降にシスチンを添加することを含む、請求項１または２に記載の方法。
  6. 　培養開始６時間後以降にシスチンを添加することを含む、請求項１または２に記載の方法。
  7. 　培養開始２４時間後以降にシスチンを添加することを含む、請求項１または２に記載の方法。
  8. 　培養開始７２時間後以降にシスチンを添加することを含む、請求項１または２に記載の方法。
  9. 　灌流培養における初発培地のシステイン源濃度が０．１ｍＭ～２．１ｍＭである、請求項１または２に記載の方法。
  10. 　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を灌流培養するための方法であって、
    　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、０．１ｍＭ～２．１ｍＭのシステイン源濃度を含む細胞培養初発培地で灌流培養すること；および
    　培養開始７２時間後以降に、細胞培養培地にシスチンを添加すること
    を含む、方法。
  11. 　システイン換算でシスチンと等モル濃度のシステインを添加した場合と比較して、組み換えタンパク質産生能が向上する、請求項１０に記載の方法。
  12. 　組み換えタンパク質産生能が１０％以上向上する、請求項１１に記載の方法。
  13. 　組換えタンパク質を製造するための方法であって、
    　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、０．１ｍＭ～２．１ｍＭのシステイン源濃度を含む細胞培養初発培地で灌流培養すること；
    　培養開始７２時間後以降に、細胞培養培地にシスチンを添加すること；および、
    　組換えタンパク質を回収すること
    を含む、方法。
  14. 　システイン換算でシスチンと等モル濃度のシステインを添加した場合と比較して、組み換えタンパク質産生が向上する、請求項１３に記載の方法。
  15. 　組み換えタンパク質産生が１０％以上向上する、請求項１４に記載の方法。
  16. 　添加後のシスチン濃度が０．５ｍＭ～１０ｍＭである、請求項１、２および１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　添加後のシスチン濃度が１ｍＭ～１０ｍＭである、請求項１、２および１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　添加後のシスチン濃度が１．５ｍＭ～１０ｍＭである、請求項１、２および１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　添加後のシスチン濃度が２ｍＭ～１０ｍＭである、請求項１、２および１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　ｐＨ１０以上に調整されたシスチン含有液を添加することを含む、請求項１、２および１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
  21. 　組換えタンパク質が抗体である、請求項１、２および１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
  22. 　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞が組換えタンパク質をコードする核酸を含む、請求項１、２および１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
  23. 　動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項１、２および１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
  24. 　哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２３に記載の方法。
  25. 　ＣＨＯ細胞がＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞またはＣＨＯ－ＤＧ４４細胞である、請求項２４に記載の方法。
  26. 　灌流培養における細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムを含む、請求項１、２および１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 　シスチンを有効成分として含む、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための剤。
  28. 　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、
    　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含む、方法。
  29. 　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における一細胞あたりの組換えタンパク質産生を向上させるための方法であって、
    　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含む、方法。
  30. 　細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、組み換えタンパク質産生が向上する、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 　他の鉄源がクエン酸第一鉄ナトリウムである、請求項３０に記載の方法。
  32. 　組み換えタンパク質産生が１０％以上向上する、請求項３０に記載の方法。
  33. 　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を灌流培養するための方法であって、
    　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含む、方法。
  34. 　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における細胞増殖速度を低下させるための方法であって、
    　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で培養することを含む、方法。
  35. 　細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、細胞増殖速度が低下する、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 　他の鉄源がクエン酸第一鉄ナトリウムである、請求項３５に記載の方法。
  37. 　細胞増殖速度が１０％以上低下する、請求項３５に記載の方法。
  38. 　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養において排出する培養液の量を減少させるための方法であって、
    　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養することを含み、
    　前記排出する培養液の量はブリーディング工程において排出する培養液の量であり、ブリーディング工程は、培養槽から培養液を排出し、当該排出した培養液と同量の新鮮培地を前記培養槽に加える工程である、方法。
  39. 　細胞培養培地がクエン酸鉄アンモニウムの代わりに他の鉄源を含む場合と比較して、排出する培養液の量が減少する、請求項３８に記載の方法。
  40. 　他の鉄源がクエン酸第一鉄ナトリウムである、請求項３９に記載の方法。
  41. 　排出する培養液の量が１０％以上減少する、請求項３９に記載の方法。
  42. 　組換えタンパク質を製造するための方法であって、
    　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞を、クエン酸鉄アンモニウムを含む細胞培養培地で灌流培養すること；および、
    　組換えタンパク質を回収すること、を含む、方法。
  43. 　細胞培養培地が、３０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌの鉄濃度を与える量のクエン酸鉄アンモニウムを含む、請求項２８、２９、３３、３４および３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 　細胞培養培地が、４０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌの鉄濃度を与える量のクエン酸鉄アンモニウムを含む、請求項２８、２９、３３、３４および３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. 　細胞培養培地が、５０ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌの鉄濃度を与える量のクエン酸鉄アンモニウムを含む、請求項２８、２９、３３、３４および３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
  46. 　組換えタンパク質が抗体である、請求項２８、２９、３３、３４および３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
  47. 　組換えタンパク質産生能を有する動物細胞が組換えタンパク質をコードする核酸を含む、請求項２８、２９、３３、３４および３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
  48. 　動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８、２９、３３、３４および３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
  49. 　哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４８に記載の方法。
  50. 　ＣＨＯ細胞がＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞またはＣＨＯ－ＤＧ４４細胞である、請求項４９に記載の方法。
  51. 　細胞培養培地にシスチンを添加することを含む、請求項２８、２９、３３、３４および３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
  52. 　クエン酸鉄アンモニウムを有効成分として含む、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養における組換えタンパク質産生を向上させるための剤。
  53. 　シスチンおよびクエン酸鉄アンモニウムを含む、組換えタンパク質産生能を有する動物細胞の灌流培養のための細胞培養培地。
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