CN114746441A - 阳离子交换色谱期间的高盐加载调节以去除产物相关杂质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在阳离子交换色谱期间的高盐加载调节，用于去除在制造重组多特异性蛋白期间的低等电点产物相关杂质。

Description

阳离子交换色谱期间的高盐加载调节以去除产物相关杂质

本申请要求2019年11月7日提交的美国临时申请号62/931,863的权益，将其通过引用特此并入。

技术领域

本发明涉及生物药剂制造领域。特别地，本发明涉及用于在阳离子交换纯化操作期间去除低等电点产物相关杂质的方法。

背景技术

抗体产品是生物药剂市场上最大的领域，在未来十年内很可能达到数千亿美元的销售额。治疗性单克隆抗体的商业开发开始于20世纪80年代，而且第一批治疗性单克隆抗体获得批准，此后一直处于持续发展和扩大。尽管单克隆抗体以高亲和力和特异性与靶标结合，并且对于一些适应症已经是非常成功的治疗性治疗，但单克隆抗体也有局限性。单克隆抗体与单一靶标结合；然而许多疾病是多因性的。在癌症免疫疗法中，单一靶标治疗可能不足以破坏或固定癌细胞。另外，一些接受单克隆抗体治疗的患者可能对治疗无响应，或出现耐药性。

已开发出新的抗体样结构，例如抗体Fab片段、Fc融合蛋白、抗体-药物偶联物、乙二醇工程化的抗体，尤其是双特异性和其他多特异性抗体样结构，以应对这些挑战。这些抗体样结构，特别是双特异性抗体，相对于传统的单克隆抗体治疗提供了改进，并经证明是有效的具有多种形式的新一代生物治疗剂，可以将其开发用于应对甚至更多具有挑战性的治疗适应症。

双特异性抗体是这些抗体样结构中最多样化的一组，其框架的种类也在不断增加，以满足治疗适应症的需求。这些结构将抗体的结合特性与另外的分子特性(经工程化以适应所需的疾病适应症)组合。正在开发双特异性抗体，用于多种适应症和用途，如将免疫效应细胞重新定向至肿瘤细胞以针对癌症进行免疫应答、阻断信号传导途径、靶向肿瘤血管生成、阻断细胞因子、穿越血脑屏障、诊断测定、治疗病原体、以及作为递送剂。(Sedykh等人,Drug Design,Development and Therapy[药物设计、开发和疗法]18(12),195-208,2018；Walsh,Nature Biotechnology[自然生物技术],32(10),992-1000,2014；Ecker等人,mAbs 7(1),9-14,2015；Spiess等人,Mol Immunol[分子免疫学]67,95-106,2015；Fan等人,J Hematol&Oncology[血液与肿瘤学杂志]8:130-143,2015；Williams等人,ProcessDesign for Bispecific Antibodies[双特异性抗体的过程设计],BiopharmaceuticalProcessing,Development,Design and Implementation of Processes[生物药剂加工、开发、设计与过程实现],Jagschies等人编辑,爱思唯尔有限公司(Elsevier Ltd),第837-855页,2018)。

这些多特异性蛋白的开发带来了新的生物制造挑战，特别是关于产品不稳定性和低表达产量。特别地，多特异性蛋白的纯化由于形成产品相关变体(例如同二聚体、半抗体、聚集体、高分子量物质和低分子量物质等)而变得复杂。这些变体与目的多特异性蛋白共同具有相似的结构和物理特性(例如电荷)，这使得在纯化期间难以将其分离。这些产物相关杂质降低了多特异性药物产品的产量和活性，并且影响了制造过程的稳健性。

在阳离子交换色谱单元操作期间，与目的多特异性蛋白具有相似电荷(等电点)的产物相关杂质可与多特异性蛋白共洗脱，从而使纯化复杂化并且产量降低。在洗脱之前分离低pI产物相关杂质将是有益的。本文所述的发明通过在阳离子交换色谱期间提供高盐加载调节以去除这些低pI杂质来满足此需求。

发明内容

本发明提供了从组合物中纯化多特异性蛋白的方法，该组合物包含该多特异性蛋白和至少一种产物相关杂质，该方法包括用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该组合物在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；用至少一种包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液洗涤柱；并且从阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白。在一个实施例中，上样缓冲液包含94-96mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含96-105mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含94mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含96mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含105mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和94mM-105mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含94-96mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含96-105mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含94mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含96mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含105mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐和94mM-105mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含0-26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐和94-96mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐和25mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐和105mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐。在一个实施例中，至少一种平衡缓冲液包含94-96mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种平衡缓冲液包含96-105mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种平衡缓冲液包含94mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种平衡缓冲液包含96mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种平衡缓冲液包含105mM氯化钠。在一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐。在一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐和94mM-105mM氯化钠。在一个实施例中，以10-27g/L加载组合物。在一个实施例中，以15-27g/L加载组合物。在一个实施例中，通过梯度将多特异性蛋白从阳离子交换树脂洗脱。在相关的实施例中，梯度是线性的。在一个实施例中，梯度是盐梯度。在一个实施例中，多特异性蛋白是双特异性蛋白。在一个实施例中，多特异性蛋白是双特异性抗体。在一个实施例中，提供了通过上述方法制备的纯化的多特异性蛋白。在一个实施例中，阳离子交换色谱介质是树脂。

本发明提供了从阳离子交换色谱的洗脱液中减少低pI杂质的方法，该方法包括用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该组合物在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；用至少一种包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液洗涤柱；并且从阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；其中与从在平衡、加载以及洗涤步骤中不使用氯化钠的相应方法中回收的阳离子交换色谱洗脱液相比，该阳离子交换色谱洗脱液具有减少的低pI杂质。在一个实施例中，低pI杂质是产物相关杂质。在一个实施例中，至少一种产物相关杂质是半抗体或2X、3X或4X轻链错配。

本发明提供了在高盐加载条件下进行阳离子交换色谱以减少产物相关杂质的方法，该方法包括用平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该组合物在上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；用第一和第二洗涤缓冲液洗涤柱；并且从阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；其中该平衡、加载和第一洗涤缓冲液包含94-105mM氯化钠。在一个实施例中，第二洗涤缓冲液包含0-26mM。

本发明提供了生产分离的、纯化的重组多特异性蛋白的方法，该方法包括用表达该多特异性蛋白的宿主细胞在生物反应器中建立细胞培养；培养该宿主细胞以表达该多特异性蛋白；收获该重组多特异性蛋白；亲和纯化该收获的重组多特异性蛋白；在来自亲和纯化的洗脱液池中、在低pH下灭活病毒并且中和该池；用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该中和的、亲和纯化的重组多特异性蛋白在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到平衡的阳离子交换介质；用包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液，随后用包含0-26mM氯化钠的第二洗涤缓冲液，洗涤该阳离子交换介质；从该阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；以流过模式将包含该重组多特异性蛋白的阳离子交换色谱洗脱液加载到第二色谱树脂上；并且将该纯化的重组多特异性蛋白在配制品缓冲液中浓缩。在一个实施例中，第二色谱树脂选自阴离子交换色谱树脂、阳离子交换色谱树脂、多模式色谱树脂、疏水相互作用色谱树脂以及羟基磷灰石色谱树脂。在相关的实施例中，提供了通过上述方法制备的分离的、纯化的重组多特异性蛋白。在相关的实施例中，提供了通过上述方法制备的药物组合物，该药物组合物包含分离的、纯化的重组多特异性蛋白。

附图说明

图1显示出用主产物(双特异性#1)洗脱的杂质(半抗体和2X LC)。

图2显示出高盐加载调节后，低pI杂质在加载和第一洗涤步骤之间流经柱。第二洗涤使UV基线在洗脱前归零。在双特异性#1洗脱期间，洗脱峰从四个峰减少到一个峰。

图3显示出在双特异性#2的陡峭的洗脱梯度下，高加载密度、无盐加载调节导致的一个洗脱峰。在高加载密度下，低pI产物相关杂质不能从主产物分离，并且主要存在于级分1-3中。

图4显示出较低的加载密度(10相比于25g/L)和较缓的梯度(8相比于16mM/CV)，允许主要的低pI产物杂质分离成由级分1-4(fir双特异性#2)形成的明显峰。

图5显示出在高盐加载条件下，双特异性#2洗脱曲线中杂质峰的数量从两个峰减少至具有小肩峰(级分1-3)的单峰，该单峰仍含有一些错配的物质(LC1/LC2＝2至3)。

具体实施方式

因为文献中涉及多特异性蛋白的下游处理的信息不是很多，因此经常应用为单克隆抗体开发的平台(Shulka和Norman,第26章Downstream Processing of Fc FusionProteins,Bispecific Antibodies,and Antibody-Drug Conjugates[Fc融合蛋白、双特异性抗体和抗体药物缀合物的下游处理],在第二版Process Scale Purification ofAntibodies[抗体的生产规模纯化]中,Uwe Gottswchalk编辑,第559-594页,John Wiley&Sons[约翰威立父子公司],2017)。在对抗体和抗体样蛋白质典型的条件下，以结合和洗脱模式对多特异性蛋白质进行阳离子交换色谱(CEX)，导致在洗脱曲线中出现多个杂质峰。这些杂质具有的等电点均低于和高于主产物。具有较低pI的杂质在主产物之前洗脱，作为前峰。该洗脱曲线不支持稳健的、可持续、商业规模的制造过程的发展。

多特异性蛋白的性质可能使其易于形成与产物相关杂质，并且细胞培养条件可能会影响此类杂质的量。这些杂质使纯化复杂化，并且可以降低所需多特异性蛋白的产量和活性。发现高盐加载策略通过在洗脱步骤之前去除较低的pI杂质，改善了CEX洗脱液池中主产物的产量。通过将平衡缓冲液、最终经调节的上样缓冲液以及第一洗涤缓冲液的最终氯化钠浓度设定为94-105mM，较低的pI杂质流经柱，减少了洗脱曲线中的峰数，并且减少了CEX洗脱液中与产物相关杂质量。还增加了第二洗涤步骤以确保所需多特异性蛋白的完全结合条件，并且在洗脱开始前将UV基线重新设置为零，从而收紧了洗脱曲线，导致主产物的更有效的收集和更好的质量。例如，高盐加载调节出乎意料地将双特异性蛋白的洗脱长度从44个柱体积(CV)减少至20.3个CV，节约了时间和资源，以及减少了CEX洗脱液池体积，这对中间下游单元操作中的工艺效率和稳健性而言是高度期望的。对于这两种双特异性，高盐加载条件允许在洗脱前有效去除杂质，减少了CEX洗脱液中与产物相关杂质的量，以及简化了洗脱收集标准，从而提供了更稳健的制造过程。

本发明提供了从组合物中纯化多特异性蛋白的方法，该组合物包含该多特异性蛋白和至少一种产物相关杂质，该方法包括用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该组合物在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；用至少一种包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液洗涤柱；并且从阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白。

本发明还提供了从阳离子交换色谱的洗脱液中减少低pI杂质的方法，该方法包括用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该组合物在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；用至少一种包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液洗涤柱；并且从阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；其中与从在平衡、加载以及洗涤步骤中不使用氯化钠的相应方法中回收的阳离子交换色谱洗脱液相比，该阳离子交换色谱洗脱液具有减少的低pI杂质。

本发明还提供了在高盐加载条件下进行阳离子交换色谱以减少产物相关杂质的方法，该方法包括用平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该组合物在上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；用第一和第二洗涤缓冲液洗涤柱；并且从阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；其中该平衡、加载和第一洗涤缓冲液包含94-105mM氯化钠。

本发明还提供了生产分离的、纯化的重组目的多特异性蛋白的方法，该方法包括用表达该目的多特异性蛋白的宿主细胞在生物反应器中建立细胞培养；培养该宿主细胞以表达该多特异性蛋白；收获该重组多特异性蛋白；亲和纯化该收获的重组多特异性蛋白；在来自亲和纯化的洗脱液池中、在低pH下灭活病毒并且中和该池；用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该中和的、亲和纯化的重组多特异性蛋白在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到平衡的阳离子交换介质；用包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液，随后用包含0-26mM氯化钠的第二洗涤缓冲液，洗涤该阳离子交换介质；从该阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；并且以流过模式将包含该重组多特异性蛋白的阳离子交换色谱洗脱液加载到第二色谱树脂上；并且将该纯化的重组多特异性蛋白在配制品缓冲液中浓缩。

在一个实施例中，上样缓冲液包含94-105mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104或105mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含94mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含96mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含98mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含105mM氯化钠。

在本发明的一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐，pH为5.0±0.05至5.0±0.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐，pH 5.0。在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐。在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 5.0±0.05％至pH 5.0±0.1％。

在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和94mM-105mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和94mM-96mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和96mM-105mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和94mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和96mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和98mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和105mM氯化钠。在相关实施例中，乙酸盐浓度为100mM。

在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为4.9、5.0或5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠，pH为4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为5.0。在相关实施例中，乙酸盐浓度为100mM。

在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH4.9-5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9、5.0或5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 5.0。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含94-96mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含96-105mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104或105mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含94mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含96mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含98mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含105mM氯化钠。

在本发明的一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9、5.0、或5.1。在一个实施例中，洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH为5.0±0.05至5.0±0.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 5.0±0.05％至pH 5.0±0.1％。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-96mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、96mM-105mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、96mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、98mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、105mM氯化钠。在相关实施例中，乙酸盐浓度为100mM。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为4.9、5.0或5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为5.0。在相关实施例中，乙酸盐浓度为100mM。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH5.0±0.05至5.0±0.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9、5.0或5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 5.0。

在一个实施例中，有至少一种具有不同的洗涤缓冲液的另外的洗涤步骤。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤是第二洗涤。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含0-26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含0、23、24、25或26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含0mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含23mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含24mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含25mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含26mM氯化钠。

在本发明的一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH为5.0±0.05至5.0±0.1。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH4.9-5.1。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 5.0±0.05％至pH 5.0±0.1％。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐和氯化钠，随后至少一种另外的洗涤。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含0-26mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含23-26mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含0mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含23mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含24mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含25mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含26mM氯化钠。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐和氯化钠，随后至少一种另外的洗涤。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤包含乙酸盐。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、0-26mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、23-26mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、0mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、23mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、24mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、25mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM氯化钠，随后另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、23-24mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、96mM氯化钠，随后另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、25mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、98mM氯化钠，随后另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、105mM氯化钠，随后另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、0mM氯化钠。在一个实施例中，乙酸盐浓度为100mM。

在一个实施例中，另外的洗涤是第二洗涤。在相关的实施例中，第二洗涤缓冲液包含0-26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠，随后第二洗涤缓冲液包含乙酸盐、0-26mM氯化钠。在一个实施例中，乙酸盐浓度为100mM。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、0-26mM氯化钠，其中这些缓冲液的pH相同或不同。在一个实施例中，一种或多种洗涤缓冲液的pH为pH 4.9-5.1。在一个实施例中，一种或多种洗涤缓冲液的pH为pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在一个实施例中，一种或多种洗涤缓冲液的pH为pH 4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，一种或多种洗涤缓冲液的pH为pH 5.0。在一个实施例中，一种或多种洗涤缓冲液的pH为pH5.0±0.05％至pH 5.0±0.1％。在一个实施例中，一种或多种洗涤缓冲液的乙酸盐浓度为100mM。

在一个实施例中，平衡缓冲液包含94-96mM氯化钠。在一个实施例中，平衡缓冲液包含96-105mM氯化钠。在一个实施例中，平衡缓冲液包含94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104或105mM氯化钠。在一个实施例中，平衡缓冲液包含94mM氯化钠。在一个实施例中，平衡缓冲液包含96mM氯化钠。在一个实施例中，平衡缓冲液包含105mM氯化钠。

在本发明的一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐。在一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐，pH 5.0。在一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐，pH为5.0±0.05至5.0±0.1。在一个实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐。在一个实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在一个实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐，pH4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 5.0±0.05％至pH 5.0±0.1％。

在一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠。在一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、94mM-96mM氯化钠。在一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、96mM-105mM氯化钠。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、94mM氯化钠。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、96mM氯化钠。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、105mM氯化钠。在一个实施例中，乙酸盐浓度为100mM。

在一个实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为4.9、4.95、5.0、5.05或5.1。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为4.9、5.0或5.1。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为5.0。在一个实施例中，乙酸盐浓度为100mM。

在一个实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH4.9-5.1。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为4.9、4.95、5.0、5.01或5.1。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为4.9、5.0或5.1。在相关的实施例中，平衡缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为5.0。

在一个实施例中，以10-27g/L加载组合物。在相关的实施例中，以10-25g/L加载组合物。在相关的实施例中，以10-23g/L加载组合物。在相关的实施例中，以10-15g/L加载组合物。在相关的实施例中，以15-27g/L加载组合物。在相关的实施例中，以15-25g/L加载组合物。在相关的实施例中，以15-23g/L加载组合物。在相关的实施例中，以23-27g/L加载组合物。在相关的实施例中，以23-25g/L加载组合物。在相关的实施例中，以25-27g/L加载组合物。在一个实施例中，以10、15、23、25或27g/L加载组合物。在一个实施例中，以10g/L加载组合物。在一个实施例中，以15g/L加载组合物。在一个实施例中，以23g/L加载组合物。在一个实施例中，以25g/L加载组合物。在一个实施例中，以27g/L加载组合物。

在一个实施例中，通过梯度将多特异性蛋白从阳离子交换树脂洗脱。在相关的实施例中，梯度是线性的。在一个相关实施例中，梯度是盐梯度。

在相关的实施例中，低pI杂质是产物相关杂质。在相关的实施例中，至少一种产物相关杂质是半抗体或2X、3X或4X轻链错配。

在一个实施例中，多特异性蛋白是双特异性蛋白。在一个实施例中，多特异性蛋白是双特异性抗体。

在一个实施例中，阳离子交换色谱介质是树脂。在一个实施例中，第二色谱介质是树脂。在相关的实施例中，第二色谱树脂选自阴离子交换色谱树脂、阳离子交换色谱树脂、多模式色谱树脂、疏水相互作用色谱树脂以及羟基磷灰石色谱树脂。

本发明提供了根据本文所述的方法生产的纯化的、多特异性蛋白。本发明提供了根据本文所述的方法制备的、分离的、纯化的重组多特异性蛋白。

本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含根据本文所述的方法的分离的、纯化的重组目的多特异性蛋白。

“多特异性”、“多特异性蛋白”和“多特异性抗体”在本文可互换使用，指重组工程化以同时结合和中和同一抗原上的至少两个不同抗原或至少两个不同表位的蛋白。例如，多特异性蛋白质可以被工程化以靶向免疫效应子和针对肿瘤的细胞毒性剂或感染剂。已发现这些多特异性蛋白可通过将免疫效应子细胞重定向至肿瘤细胞、通过阻断信号传导途径修饰细胞信号传导、靶向肿瘤血管生成、阻断细胞因子、以及作为药物的预靶向递送媒介物(如递送化疗剂、放射性标记(以改善检测灵敏度)和纳米颗粒(定向到特定的细胞/组织，如癌细胞))而用于多种应用，如在癌症免疫疗法中。

最常见和最多样化的多特异性蛋白是结合两种抗原的那些蛋白，在本文中可互换称为“双特异性”、“双特异性蛋白”和“双特异性抗体”。双特异性蛋白可分为两大类：免疫球蛋白G(IgG)样分子和非IgG样分子。IgG样分子保留Fc介导的效应子功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，Fc区有助于改善溶解性和稳定性并且促进一些纯化操作。非IgG样分子是更小的、增加组织渗透性的。(Sedykh等人,Drug Design,Development and Therapy[药物设计、开发和疗法]18(12),195-208,2018；Fan等人,J Hematol&Oncology[血液与肿瘤学杂志]8:130-143,2015；Spiess等人,Mol Immunol[分子免疫学]67,95-106,2015)；Williams等人,第41章Process Design for Bispecific Antibodies in Biopharmaceutical ProcessingDevelopment[生物制药处理开发中双特异性抗体的过程设计],Design andImplementation of Manufacturing Processes[制造过程的设计与实现],Jagschies等人编辑,2018,第837-855页。双特异性蛋白有时被用作具有对不同抗原或表位数目的结合特异性的另外组分的框架，增加了分子的结合特异性。

包括双特异性抗体的双特异性蛋白的形式正在不断发展，并且包括但不限于四源杂交瘤(quadromas)、杵臼结构(knobs-in-holes)、交叉单克隆抗体(cross-Mabs)、双可变结构域IgG(DVD-IgG)、IgG-单链Fv(scFv)、scFv-CH3 KIH、双功能Fab(DAF)、半-分子交换、κλ-体、串联scFv、scFv-Fc、双抗体、单链双抗体(sc双抗体)、sc双抗体-CH3、三抗体、微型抗体、微型体、TriBi微型体、串联双抗体、sc双抗体-HAS、串联scFv-毒素、双亲和重定向分子(dual-affinity retargeting molecule，DART)、纳米抗体、纳米抗体-HSA、对接和锁定(DNL)、链交换工程化结构域SEED体(SEEDbody)、三功能抗体(Triomab)、亮氨酸拉链(LUZ-Y)、

Fab-臂交换、DutaMab、DT-IgG、电荷对(charged pair)、Fcab、正交Fab、IgG(H)-scFv、scFV-(H)IgG、IgG(L)-scFV、IgG(L1H1)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFV-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zy体、DVI-Ig4(四位一体)、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFV、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、sc双抗体-Fc、双抗体-Fc、胞内抗体、ImmTAC、HSA体(HSABody)、IgG-IgG、Cov-X-体、scFv1-PEG-scFv2、单链双特异性抗体构建体、单链双特异性T细胞衔接子(BITE)、双特异性T细胞衔接子以及半衰期延长的双特异性T细胞衔接子(HLE BITE)(Fan同上；Spiess,同上；Sedykh,同上；Seimetz等人,Cancer Treat Rev[癌症治疗评论]36(6)458-67,2010；Shulka和Norman,第26章Downstream Processing of Fc Fusion Proteins,Bispecific Antibodies,andAntibody-Drug Conjugates[Fc融合蛋白、双特异性抗体和抗体药物缀合物的下游处理],在第二版Process Scale Purification of Antibodies[抗体的生产规模纯化]中,UweGottswchalk编辑,p559-594,John Wiley&Sons[约翰威立父子公司],2017；Moore等人,MAbs[单克隆抗体]3:6,546-557,2011)。

在一些实施例中，双特异性蛋白可以包括博纳吐单抗、卡妥索单抗、厄妥索单抗、索利托单抗、targomiRs、鲁吉珠单抗(ABT981)、伐努赛珠单抗(RG7221)、壬托鲁单抗(ABT122)、ozoralixumab(ATN103)、floteuzmab(MGD006)、帕妥昔珠单抗(AMG112、MT112)、lymphomun(FBTA05)、(ATN-103)、AMG211(MT111、Medi-1565)、AMG330、AMG420(B1836909)、AMG-110(MT110)、MDX-447、TF2、rM28、HER2Bi-aATC、GD2Bi-aATC、MGD006、MGD007、MGD009、MGD010、MGD011(JNJ64052781)、IMCgp100、铟标记的IMP-205、xm734、LY3164530、OMP-305BB3、REGN1979、COV322、ABT112、ABT165、RG-6013(ACE910)、RG7597(MEDH7945A)、RG7802、RG7813(RO6895882)、RG7386、BITS7201A(RG7990)、RG7716、BFKF8488A(RG7992)、MCLA-128、MM-111、MM141、MOR209/ES414、MSB0010841、ALX-0061、ALX0761、ALX0141；BII034020、AFM13、AFM11、SAR156597、FBTA05、PF06671008、GSK2434735、MEDI3902、MEDI0700、MEDI7352、以及其分子或变体或类似物，和上述任何一种的生物类似物。

双特异性蛋白还包括三特异性抗体、四价双特异性抗体、不含抗体组分多特异性蛋白(如双抗体、三抗体或四抗体、微型体)、以及能够结合多个靶标的单链蛋白。Coloma,M.J.等人,Nature Biotech[自然生物技术].15(1997)159-163。

在一些实施例中，目的多特异性蛋白与以下特异性结合、中和、和/或相互作用：一种或多种CD蛋白、HER受体家族蛋白、细胞粘附分子、生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子、骨诱导因子、胰岛素和胰岛素相关蛋白、凝血和凝血相关蛋白、集落刺激因子(CSF)、其他血液和血清蛋白血型抗原；受体、受体相关蛋白、生长激素、生长激素受体、T细胞受体；神经营养因子、神经营养蛋白、松弛素(relaxin)、干扰素、白介素、病毒抗原、脂蛋白、整联蛋白、类风湿因子、免疫毒素、表面膜蛋白、转运蛋白、归巢受体、地址素、调节蛋白和免疫粘附素。

在一些实施例中，目的多特异性蛋白单独或以任何组合与以下一种或多种蛋白质结合、中和、和/或相互作用：CD蛋白(包括但不限于CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD70、CD123、CD133、CD138、CD171和CD174)、HER受体家族蛋白(包括例如HER2、HER3、HER4和EGF受体)、EGFRvIII、细胞粘附分子(例如LFA-1、Mol、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白)、生长因子(包括但不限于例如血管内皮生长因子(“VEGF”))；VEGFR2、生长激素、促甲状腺激素、卵泡刺激素、黄体生成素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、米勒管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、促红细胞生成素(EPO)、神经生长因子(如NGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(包括例如aFGF和bFGF)、表皮生长因子(EGF)、Cripto、转化生长因子(TGF)(尤其包括TGF-α和TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5))、胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)和骨诱导因子、胰岛素和胰岛素相关蛋白(包括但不限于胰岛素、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素原和胰岛素样生长因子结合蛋白)；(凝血蛋白和凝血相关蛋白，尤其如，VIII因子、组织因子、范威尔邦德(von Willebrand)因子、蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、纤溶酶原激活剂(如尿激酶和组织纤溶酶原激活剂(“t-PA”))、邦巴辛(bombazine)、凝血酶、血小板生成素和血小板生成素受体、集落刺激因子(CSF)(尤其包括以下物质：M-CSF、GM-CSF和G-CSF)、其他血液和血清蛋白(包括但不限于白蛋白、IgE和血型抗原)、受体和受体相关蛋白(包括例如flk2/flt3受体、肥胖(OB)受体、生长激素受体和T细胞受体)；神经营养因子，包括但不限于骨源性神经营养因子(BDNF)和神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)；松弛素A链、松弛素B链和松弛素原、干扰素(包括例如干扰素α、干扰素β和干扰素γ)、白介素(IL)(例如IL-1至IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-23、IL-12/IL-23、IL-2Ra、IL1-R1、IL-6受体、IL-4受体和/或IL-13受体、IL-13RA2或IL-17受体、IL-1RAP；病毒抗原，包括但不限于AIDS包膜病毒抗原、脂蛋白、降钙素、胰高血糖素、心钠素、肺表面活性剂、肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β、脑啡肽酶、BCMA、IgKappa、ROR-1、ERBB2、间皮素、RANTES(受激活调节的正常T细胞表达与分泌因子)、小鼠促性腺激素相关肽、DNA酶、FR-α、抑制素和激活素、整联蛋白、蛋白A或D、类风湿因子、免疫毒素、骨形态发生蛋白(BMP)、超氧化物歧化酶、表面膜蛋白、衰变加速因子(DAF)、AIDS包膜、转运蛋白、归巢受体、MIC(MIC-a、MIC-B)、ULBP 1-6、EPCAM、地址素、调节蛋白、免疫粘附素、抗原结合蛋白、生长激素、CTGF、CTLA4、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)-1、MUC1、CEA、c-MET、密蛋白(Claudin)-18、GPC-3、EPHA2、FPA、LMP1、MG7、NY-ESO-1、PSCA、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GM2、BAFF、OPGL(RANKL)、肌生成抑制素、Dickkopf-1(DKK-1)、Ang2、NGF、IGF-1受体、肝细胞生长因子(HGF)、TRAIL-R2、c-Kit、B7RP-1、PSMA、NKG2D-1、程序性细胞死亡蛋白1和配体、PD1和PDL1、甘露糖受体/hCGβ、丙型肝炎病毒、间皮素dsFv[PE38]缀合物、嗜肺军团菌(lly)、IFNγ、γ干扰素诱导蛋白10(IP10)、IFNAR、TALL-1、TNFα、TL1A、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)、干细胞因子、Flt-3、降钙素基因相关肽(CGRP)、OX40L、α4β7、血小板特异性(血小板糖蛋白Iib/IIIb(PAC-1)、转化生长因子β(TFGβ)、STEAP1、透明带精子结合蛋白3(ZP-3)、TWEAK、血小板来源的生长因子受体α(PDGFRα)、硬化蛋白(sclerostin)以及任何前述物质的生物活性片段或变体。

在一些实施例中，目的多特异性蛋白可以包括这样的双特异性抗体，该双特异性抗体与包括CD3和CD19、EpCAM、CEA、PSA、CD33、BCMA、Her2、CD20、P-钙粘素、CD123、gpA33、或B7H3的组合特异性结合。在一些实施例中，目的双特异性抗体可以包括这样的双特异性抗体，该双特异性抗体与包括IL1α+IL1β的组合特异性结合。

多特异性蛋白可能具有科学意义或商业意义，特别是基于双特异性的治疗法。可以以多种方式生产多特异性蛋白，最常见的通过使用细胞培养方法重组动物细胞系的方式。多特异性蛋白可以在细胞内产生或分泌到可以从中回收和/或收集的培养基中，并且可互换称为“重组多特异性蛋白”、“重组多特异性抗体”。术语“分离的多特异性蛋白”、“分离的重组多特异性抗体”是指多特异性蛋白，该多特异性蛋白已经从会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其它用途的蛋白质、多肽、DNA和/或其它污染物或杂质中纯化出来。还包括“重组双特异性蛋白”、“重组双特异性抗体”、“分离的重组双特异性蛋白”以及“分离的重组双特异性抗体”。目的多特异性蛋白包括通过结合两个或更多个靶、特别是下面列出的那些中的靶而发挥治疗作用的多特异性抗体，包括从其衍生的靶标、与其相关的靶标及其修饰。

本发明提供了从组合物中纯化多特异性蛋白的方法，该组合物包含该多特异性蛋白和至少一种产物相关杂质，该方法包括用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该组合物在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；用至少一种包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液洗涤柱；并且从阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白。

“纯化”意味着通过从组合物中去除(部分或完全)至少一种产物相关杂质来提高组合物中多特异性蛋白的纯度。通过下游单元操作(特别是那些涉及离子交换色谱的操作)来完成多特异性蛋白的回收和纯化，导致产生更“均质的”多特异性蛋白组合物，该多特异性蛋白组合物满足产量和产品质量目标(如减少产物相关杂质、提供产品质量等)。

“产物相关杂质”是指产物相关目的多特异性蛋白的变体。在某些情况下，洗脱峰中这些杂质的pI低于主产物。产物相关杂质包括，例如，同二聚体、半抗体、聚集体、抗体片段和抗体片段的各种组合、以及轻链错配(如2XLC、3XLC或4XLC)、高分子量(HMW)物质、低分子量(LMW)物质。“半抗体”是指可以(例如)由于两个重链多肽之间的不完全组装或相互作用的破坏而形成的产物相关杂质。半抗体包含单个轻链多肽和单个重链多肽。“同二聚体”是指可能(例如)当对同一靶标具有特异性的重链和轻链彼此重组而不是与对不同靶标具有特异性的重链和轻链配对以形成所需的双特异性异二聚体时，而形成的产物相关杂质。这典型地在宿主细胞中表达期间发生。对于需要多条链(如轻链，LC)通过工程化的残基(如带电荷的成对突变，杵臼结构等)以正确配对的多特异性构建体，在LC和HC之间错配时，仍然可能具有杂质，其中LC1不是与HC1配对，而是错误地与HC2(2x LC1)配对，反之亦然(2xLC2)。如果多特异性蛋白是二价的，具有两个与每个目标抗原结合的位点，则可能具有3XLC1、4X LC1和错配物质的其他组合。

本发明提供了从阳离子交换色谱的洗脱液中减少低pI杂质的方法，该方法包括用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该组合物在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；用至少一种包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液洗涤柱；并且从阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；其中与从在平衡、加载以及洗涤步骤中不使用氯化钠的相应方法中回收的阳离子交换色谱洗脱液相比，该阳离子交换色谱洗脱液具有减少的低pI杂质。

如本文所披露，产物相关杂质的pI可以类似于所需的多特异性蛋白的pI。在主产物的洗脱液峰中发现这些产物相关杂质。它们具有稍低的pI，所以它们刚好在主产物之前洗脱，作为前峰。蛋白质的“等电点”或“pI”是指正电荷平衡蛋白质负电荷的pH。可以使用已知方法(例如根据蛋白质氨基酸残基的净电荷或通过等电聚焦)来计算/确定pI。具有比主产物低的pI的产物相关杂质的酸性高于主产物。

本发明提供了生产分离的、纯化的重组目的多特异性蛋白的方法，该方法包括用表达该多特异性蛋白的宿主细胞在生物反应器中建立细胞培养；培养该宿主细胞以表达该多特异性蛋白；收获该重组多特异性蛋白；亲和纯化该收获的重组多特异性蛋白；在来自亲和纯化的洗脱液池中、在低pH下灭活病毒并且中和该池；用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；将该中和的、亲和纯化的重组多特异性蛋白在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到平衡的阳离子交换介质；用包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液，随后用包含0-26mM氯化钠的第二洗涤缓冲液，洗涤该阳离子交换介质；从该阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；并且以流过模式将包含该重组多特异性蛋白的阳离子交换色谱洗脱液加载到第二色谱树脂上；并且将该纯化的重组多特异性蛋白在配制品缓冲液中浓缩。

本文中提供了包含至少一种编码多特异性蛋白的核酸分子的呈质粒、表达载体、转录盒或表达盒形式的表达系统和构建体，以及包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。如本文所用，“载体”意指适合用于将编码信息的多特异性蛋白转移和/或转运至宿主细胞和/或特定位置和/或宿主细胞内的区室的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒衣壳、病毒体、裸DNA、复合DNA等)。载体可以包括病毒和非病毒载体、非附加型哺乳动物载体。载体通常被称为表达载体，例如，重组表达载体和克隆载体。可以将载体引入宿主细胞以允许载体自身的复制，并从而扩增其中包含的多核苷酸的拷贝。克隆载体可含有序列组分，这些序列组分通常包括但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和选择性标志物。这些元件可以由本领域普通技术人员适当选择。

一种或多种“细胞”包括任何原核或真核细胞。细胞可以是离体细胞、体外细胞或体内细胞，可以是单独的或作为高级结构(如组织或器官)的一部分。细胞包括“宿主细胞”，也称为“细胞系”，它们经基因工程化以表达具有商业或科学意义的多特异性蛋白。宿主细胞典型地源自来自原代培养物的谱系，该原代培养物可在培养中维持无限时间。基因工程化宿主细胞涉及用重组多核苷酸分子转染、转化或转导细胞，和/或以其他方式改变(例如，通过同源重组和基因激活或重组细胞与非重组细胞的融合)以引起宿主细胞表达所需的重组多特异性蛋白。用于遗传工程化细胞和/或细胞系以表达目的多特异性蛋白的方法和载体是本领域技术人员熟知的。

宿主细胞可以为任何原核细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如酵母、昆虫、或动物细胞，特别是哺乳动物细胞(例如，CHO细胞))。可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。

在一个实施例中，细胞是宿主细胞。当在适当条件下培养时，宿主细胞表达目的多特异性蛋白，该目的多特异性蛋白随后可以从培养基收集(如果该宿主细胞将其分泌至培养基中)或直接由产生它的宿主细胞收集(如果其并非分泌的)。适当的宿主细胞的选择将取决于各种因素，如所需的表达水平、活性所需或必需的蛋白质修饰(如糖基化或磷酸化)以及易于折叠成生物活性分子。

“培养”(“culture”或“culturing”)是指细胞在多细胞生物体或组织外部的生长和繁殖。哺乳动物细胞的适合的培养条件是本领域已知的。细胞培养基和组织培养基可互换用于指在体外细胞培养期间适合宿主细胞生长的培养基。典型地，细胞培养基含有缓冲液、盐、能源、氨基酸、维生素和痕量必需元素。可以使用能够支持适当宿主细胞在培养中生长的任何培养基。可以将细胞培养基进一步补充其他组分以最大化特定培养的宿主细胞中的细胞生长、细胞活力和/或重组蛋白生产，该细胞培养基是可商购的，并且包括RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、伊格尔最低必需培养基、F-12K培养基、哈姆F12培养基、伊思考夫改良的杜尔贝科培养基、麦考伊5A培养基、LeibovitzL-15培养基和无血清培养基如EX-CELL^TM300系列等，该培养基可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)或SAFC生物科学公司(SAFC Biosciences)和其他供应商处获得。细胞培养基可以是无血清、无蛋白、无生长因子和/或无蛋白胨的培养基。还可以通过添加营养来富集细胞培养物，并以高于其通常的、推荐的浓度使用。

在培养过程中可以使用各种培养基配制品，例如，以促进从一个阶段(例如，生长阶段或生长期)过渡到另一阶段(例如，生产阶段或生产期)和/或优化细胞培养期间的条件(例如在灌注培养过程中提供的浓缩培养基)。生长培养基配制品可用于促进细胞生长并使蛋白表达最小化。生产培养基配制品可用于促进目的蛋白的产生和细胞的维持，同时使新细胞的生长减至最少。饲料培养基，典型地是包含在细胞培养物生长期过程中消耗的更加浓缩的组分(如营养素和氨基酸)的培养基，该培养基可用于补充和维持活性培养物，特别是分批加料、半灌注或灌注模式的培养物。这种浓缩的饲料培养基可以包含大多数细胞培养基组分，例如，其正常量的约5×、6×、7×、8×、9×、10×、12×、14×、16×、20×、30×、50×、100×、200×、400×、600×、800×或甚至约1000×。

生长期可以在比生产期更高的温度下进行。例如，生长期可以在约35℃至约38℃的第一温度下进行，并且生产期可以在约29℃至约37℃，任选地约30℃至约36℃或约30℃至约34℃的第二温度下进行。此外，可以在温度变化之前和/或之后的同时添加蛋白质产生的化学诱导剂，如，例如咖啡因、丁酸酯和六亚甲基双乙酰胺(HMBA)。如果在温度变化后添加诱导剂，则可以在温度变化后一小时至五天，任选地在温度变化后一天至两天添加诱导剂。pH也可能在培养期间变化，可以单独进行，也可以与其他方法组合进行。

宿主细胞可以悬浮或粘附形式培养，附着在固体基质上。可以在带有或不带有微载体的流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、摇瓶或搅拌式生物反应器中建立细胞培养。

细胞培养能以分批、分批加料、连续、半连续或灌注模式进行。哺乳动物细胞(如CHO细胞)可以在生物反应器中以小于100ml至小于1000ml的较小规模培养。可替代地，可以使用含有1000ml至20,000升以上培养基的较大规模生物反应器。大规模细胞培养，如用于蛋白治疗剂的临床和/或商业规模生物制造的细胞培养，可维持数周甚至数月，在此期间细胞生产所需的一种或多种蛋白。

因为产物相关杂质(如同二聚体、半抗体、2X LC-错误比对等)可能类似于所需的多特异性蛋白，因此已开发了策略和技术(如杵臼结构，CrossMab，DVD IgG等)来增加细胞培养对所需的多特异性蛋白的选择性。然而，仍然会产生一部分产物相关杂质，这些杂质必须在下游处理期间被去除。

然后可以从细胞培养基中收获所产生的表达的重组多特异性蛋白。从悬浮细胞中收获蛋白质的方法是本领域已知的，并且包括但不限于酸沉淀、加速沉降(如絮凝)、使用重力分离、离心、声波分离、过滤(包括使用超滤器、微滤器、切向流过滤器、替代切向流过滤器、深度过滤器和冲积过滤器的膜过滤)。通过本领域已知的氧化还原折叠过程的方法，从细胞质中的包涵体中回收由原核生物表达的重组蛋白。

然后，可以通过一个或多个下游纯化操作从任何杂质，如剩余的细胞培养基、细胞提取物、不需要的组分、宿主细胞蛋白、表达不正确的蛋白、产物相关杂质等中纯化或部分纯化收获的多特异性蛋白。

从收获的细胞培养液中纯化多特异性蛋白可以从捕获色谱开始，该捕获色谱利用树脂和/或含有与重组目的蛋白结合的试剂的膜进行，例如亲和色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱(HIC)、固相金属亲和色谱(IMAC)等。此类材料是本领域已知的并且可以是商购的。亲和色谱选择可以包含例如底物结合捕获机制、适配体结合捕获机制以及辅因子结合捕获机制。对于含有Fc组分的多特异性蛋白，可以使用抗体或抗体片段结合捕获机制，如蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G、蛋白质L。

在下游处理的任何点都可以进行病毒灭活和/或病毒过滤，以从纯化的多特异性蛋白溶液中去除病毒物质。一种用于实现病毒灭活的方法是在低pH或其他溶液条件下孵育，该方法用于实现病毒灭活。在低pH病毒灭活之后，可以进行中和单元操作，该中和单元操作将重新调节经过病毒灭活的溶液至更符合后续单元操作要求的pH值。典型地，在pH 5-7进行中和。病毒灭活或中和的病毒灭活池后也可以进行过滤，例如深层过滤，以去除任何产生的浑浊或沉淀。无菌过滤典型地与深度过滤一起进行。可以使用微滤器或纳滤器进行病毒过滤，如可以从旭化成株式会社

和EDM Millipore

获得的那些。

术语“精制”在本文用于指进行一个或多个色谱步骤以从包括接近最终所需纯度的重组多特异性蛋白的流体中去除残留的污染物和杂质，如DNA、宿主细胞蛋白、产物特异性杂质、变体产物和聚集体和病毒吸附。模式精制色谱利用树脂和/或含有试剂的膜，该试剂可以在以下模式中使用：流过模式(其中目的蛋白流过树脂/膜并且污染物和杂质与色谱介质结合，并且目的蛋白包含在洗脱液中)、正面色谱或超载色谱模式(将含有目的蛋白的溶液加载到柱上，直到其上的吸附位被占据，并且对固定相(目的蛋白)具有最低亲和力的物质开始洗脱)、或结合并洗脱模式(其中目的蛋白与色谱介质结合，并在污染物和杂质流过色谱介质或从色谱介质中洗涤出后被洗脱)。此类色谱方法的实例包括离子交换色谱(IEX)(包括阴离子交换色谱(AEX)和/或阳离子交换色谱(CEX))；疏水相互作用色谱(HIC)；混合模式或多模式色谱(MM)、羟基磷灰石色谱(HA)；反相色谱和凝胶过滤。在一个实施例中，色谱方法是阳离子交换色谱。在一个实施例中，阳离子交换介质是树脂。

本发明提供了在高盐加载条件下进行阳离子交换色谱以减少产物相关杂质的方法，该方法包括用平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质，将该组合物在上样缓冲液中加载到阳离子交换介质，用第一和第二洗涤缓冲液洗涤柱，以及从该阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白，其中该平衡、加载和第一洗涤缓冲液包含94-105mM氯化钠。

“阳离子交换色谱”是指在带负电荷且具有游离阳离子的固相材料上进行的色谱用于与通过或穿过固相的水溶液中的阳离子交换。电荷可能是通过将一个或多个带电配体附接至固相(例如通过共价连接)上来提供。可替代地或此外，电荷可以是固相的固有特性(例如，对于硅胶而言，它带有总体负电荷)。可商购的阳离子交换材料是可获得的，并且包括但不限于树脂和膜吸收介质、弱阳离子交换剂、强阳离子交换剂、固定在琼脂糖上的磺基丙基(SP)(例如SP-SEPHAROSE FAST FLOW^TM、SP-SEPHAROSE FAST FLOW XL^TM或SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE^TM，来自通用电气医疗集团(GE Healthcare))、CAPTO S^TM、CAPTO SP ImpRes^TM、CAPTO S ImpAct^TM(GE Healthcare)、FRACTOGEL-SO3^TM、FRACTOGEL-SEHICAP^TM、FRACTOPREP^TM(EMD Merck)、

EMD SO3-(M)、

EMD SE Hicap(M)、

CPX、

S树脂、

EMD COO-(M)、含有Mustang S的MustangS Acrodisc、含有Mustang S的AcroPrep、含有CM Ceramic

F的CM Ceramic

FAcroSep等。

对于本发明的方法，以结合和洗脱模式进行阳离子交换色谱。将含有目的多特异性蛋白的洗脱液或存储池加载到平衡的阳离子交换介质上，使得目的多特异性蛋白与阳离子交换介质结合。通过将多特异性蛋白与阳离子交换材料“结合”是指在适当条件下(pH/电导率)，将多特异性蛋白暴露于阳离子交换材料，使得该多特异性蛋白凭借目的多特异性蛋白与阳离子交换材料的一个或多个带电基团之间的离子相互作用来可逆地固定在阳离子交换材料中或之上。多特异性蛋白可能存在于洗脱液或池中，该洗脱液或池源自先前的单元操作，如亲和色谱、中和的低pH病毒灭活、深层过滤或收获和/或精制色谱操作。

对于本发明的方法，阳离子交换色谱在结合和洗脱模式下的性能由几个步骤组成。在制备将多特异性蛋白加载到阳离子交换介质中，在加载前用与多特异性蛋白组合物相同的缓冲液组合物平衡介质。“平衡缓冲液”是在加载组合物前用于平衡色谱材料的缓冲液，该组合物包含目的多特异性蛋白。

平衡之后，将含有来自先前单元操作的目的多特异性蛋白的洗脱液或储存池用高盐缓冲液配制品滴定，使得组合物的最终经调节的上样缓冲液含有在所需浓度下的氯化钠。“上样缓冲液”和“最终经调节的上样缓冲液”在本文中可互换使用。上样缓冲液具有适合的配制品，使得目的多特异性蛋白与阳离子交换材料结合。

然后，将加载的和结合的阳离子交换色谱材料进行多洗涤。洗涤阳离子交换材料意指使适当的洗涤缓冲液通过或穿过阳离子交换材料。洗涤缓冲液从阳离子交换材料中去除一种或多种污染物，这些污染物包括产物相关杂质，基本上不洗脱目的多特异性蛋白。根据本发明的一个实施例，有两个洗涤步骤。在一个实施例中，有“第一洗涤缓冲液”和“第二洗涤缓冲液”。在洗脱目的多特异性蛋白之前，洗涤缓冲液用于洗涤或重新平衡阳离子交换材料。一种或多种洗涤缓冲液配制品可以与平衡和/或最终经调节的上样缓冲液配制品相同。术语“第一洗涤”和“第二洗涤”不应解释为在加载和第一次和/或第二洗涤步骤之间排除使用一种或多种另外的洗涤或其他缓冲液。优选地，在第二洗涤步骤结束时，在开始洗脱之前，UV基线已经恢复到或非常接近于零。

本发明提供了平衡缓冲液、最终经调节的上样缓冲液以及至少一种洗涤缓冲液具有高盐缓冲液配制品，在一个实施例中，它们都具有相同的高盐配制品缓冲液。在一个实施例中，平衡缓冲液、最终经调节的上样缓冲液以及至少一种洗涤缓冲液包含94-105mM氯化钠。

“缓冲液”是通过其酸-碱偶联组分的作用抵抗pH变化的溶液。在一个实施例中，缓冲液是乙酸盐缓冲液。在一个实施例中，缓冲液是100mM乙酸盐缓冲液。在一个实施例中，缓冲液的pH在5±0.05至5.0±0.1的范围内。在一个实施例中，范围是pH 4.9至5.1。在一个实施例中，范围是pH 4.95至5.05。

平衡缓冲液、最终经调节的上样缓冲液以及至少一种洗涤缓冲液也都包含盐。在一个实施例中，盐是氯化钠。在一个实施例中，盐是约94mM至约105mM的量的氯化钠。

在一个实施例中，上样缓冲液包含96-105mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104或105mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含94mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含96mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含105mM氯化钠。

在本发明的一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐，pH为5.0±0.05至5.0±0.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐。在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 5.0±0.05％至pH 5.0±0.1％。

在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和94mM-105mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和94mM-96mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和96mM-105mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和94mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和96mM氯化钠。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐和105mM氯化钠。在一个实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、94-96mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、96-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、96mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、105mM氯化钠，pH 5.0±0.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为4.9、5.0或5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为5.0。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、94-96mM氯化钠，pH为4.9-5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、96mM氯化钠，pH为5.0±0.05。在相关的实施例中，上样缓冲液包含乙酸盐、105mM氯化钠，pH为5.0±0.1。

在一个实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94-96mM氯化钠，pH5.0±0.05。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、96-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、96mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、105mM氯化钠，pH 5.0±0.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为4.9、5.0或5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为5.0。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、94-96mM氯化钠，pH为4.9-5.1。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、96mM氯化钠，pH为5.0±0.05。在相关的实施例中，上样缓冲液包含100mM乙酸盐、105mM氯化钠，pH为5.0±0.1。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含94-96mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含96-105mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104或105mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含94mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含96mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含105mM氯化钠。

在本发明的一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9、5.0、或5.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH为5.0±0.05至5.0±0.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9-5.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 4.9、5.0或5.1。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH 5.0±0.05％至pH 5.0±0.1％。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-96mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、96mM-105mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、96mM氯化钠。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、105mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-96mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、96-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、96mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、105mM氯化钠，pH 5.0±0.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为4.9、5.0或5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为5.0。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-96mM氯化钠，pH为4.9-5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、96mM氯化钠，pH为5.0±0.05。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、105mM氯化钠，pH为5.0±0.1。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH5.0±0.05至5.0±0.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94-96mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、96-105mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、96mM氯化钠，pH 5.0±0.05。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、105mM氯化钠，pH 5.0±0.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH 4.9-5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为4.9、5.0或5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94mM-105mM氯化钠，pH为5.0。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94-96mM氯化钠，pH为4.9-5.1。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、96mM氯化钠，pH为5.0±0.05。在相关的实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、105mM氯化钠，pH为5.0±0.1。

在一个实施例中，有至少一种具有不同的洗涤缓冲液的另外的洗涤步骤。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤是第二洗涤。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含0-26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含23-26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含23、24、25或26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含23mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含24mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含25mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种另外的洗涤缓冲液包含25mM氯化钠，pH为5.0±0.05。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐和氯化钠，随后至少一种另外的洗涤。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含0-26mM氯化钠。在一个实施例中，另外的洗涤是第二洗涤。在相关的实施例中，第二洗涤缓冲液包含0-26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-96mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、25mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、105mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐。

在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94-105mM氯化钠，pH为5.0±0.05，随后至少一种另外的洗涤。在相关的实施例中，另外的洗涤是第二洗涤。在相关的实施例中，第二洗涤缓冲液包含0-26mM氯化钠。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、94-96mM氯化钠，pH为5.0±0.05，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、25mM氯化钠，pH为5.0±0.05。在一个实施例中，至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐、105mM氯化钠，pH为5.0±0.1，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐，pH为5.0±0.1。

然后从阳离子交换色谱材料中洗脱结合的多特异性蛋白。可以通过梯度洗脱多特异性蛋白。可以通过线性或步长梯度，从阳离子交换材料中洗脱多特异性蛋白。优选地，梯度是盐梯度。使用至少两种洗脱缓冲液生产梯度，其中这些缓冲液的组合具有显著增加的电导率，使得目的多特异性蛋白从阳离子交换材料中洗脱。优选地，梯度的电导率大于平衡缓冲液和每一种前述缓冲液的电导率。

可以使阳离子交换色谱洗脱液经受进一步的精制色谱纯化操作。优选地，至少一种另外的精制色谱操作。优选地，将目的多特异性蛋白应用至流过模式中的色谱材料。

可以通过超滤和渗滤操作完成纯化的多特异性蛋白的浓缩和缓冲液交换成所需的配制品缓冲液用于原料药的大量储存。还可以在下游处理的任何时间进行病毒过滤。

可以测量纯化的多特异性蛋白的关键属性和性能参数，以更好地指导有关制造期间每个步骤性能的决策。这些关键属性和参数可以实时监测、近实时监测和/或事后监测。在细胞培养期间可以测量主要的关键参数，如消耗的培养基组分(如葡萄糖)、累积的代谢副产物(如乳酸和氨)的水平、以及与细胞维持和存活相关的参数(如溶解氧含量)。关键属性，如比生产率、活细胞密度、pH、摩尔渗透压浓度、外观、颜色、聚集、产率百分比、滴定、浓度、活力、活性等，可在制造过程的适当储存期间进行监测。可以使用已知技术和可商购的设备进行监测和测量。

这些药物组合物(溶液、悬浮液等)可包括以下一种或多种：缓冲液，如中性缓冲盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂；无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠，固定油，如可用作溶剂或悬浮介质的合成的单甘油酯或二甘油酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇，或其他溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

尽管在本申请中使用的术语是本领域中的标准术语，但本文提供了某些术语的定义以确保权利要求的含义的清楚性和确定性。单位、前缀和符号可能会用它们的国际单位制(SI)接受形式表示。本文列举的数值范围包括限定该范围的数值并且包括并支持所限定范围内的每个整数。除非另外指示，否则本文所描述的方法及技术通常根据本领域中熟知的常规方法且如贯穿本说明书所援引及论述的各种通用及更特定参考文献中所描述来进行。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约(2001)和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法],Greene Publishing Associates[格林出版联合公司](1992)；以及Harlow和LaneAntibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约(1990)。在本申请中所引用的所有文件或文件的部分(包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍和专著)均特此通过引用清楚地并入。在本发明的一个实施例中描述的内容可以与本发明的其他实施例组合。

本发明在范围上不受本文所描述的特定实施例的限制，这些特定实施例旨在作为本发明各个方面的单个说明，并且功能上等效的方法和组分在本发明的范围内。实际上，根据前述说明和附图，除了本文中所显示和描述的那些情形之外的本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改旨在包含在所附权利要求的范围内。

实例

实例1无盐加载双特异性#1

在表1中概括的条件下，将在乙酸盐缓冲液中含有完全人双特异性工程化的免疫球蛋白(双特异性#1)的中和蛋白A池加载到Eshmuno

阳离子交换色谱树脂(通用电气医疗集团生物科学部(GE Healthcare Bio-Science)，马尔堡(Marlborough)，马萨诸塞州(MA))。

表1在低盐加载条件下进行阳离子交换色谱的条件

图1显示出柱上残留了多种杂质，并随主产物一起洗脱。这些杂质的电荷(等电点)与主产物相似，并且包括半抗体、2X轻链错误组装和高分子量(HMW)。

实例2高盐加载调节双特异性#1

将含有双特异性#1的中和病毒灭活池(100mM乙酸盐，pH 5.0)与上样缓冲液(100mM乙酸盐、350mM氯化钠，pH 5.00)以1:0.378的比率组合，产生了最终经调节的加载：100mM乙酸盐、96mM氯化钠，pH 5.00。在表2中所述的条件下，将经调节的加载加载到Capto-SP

阳离子交换色谱树脂。

表2在高盐加载条件下进行阳离子交换色谱的条件

发现当使用高盐加载条件时，在洗脱之前从树脂中去除较低pI的杂质。图2显示出高盐加载条件导致洗脱曲线中杂质峰的数量从三个峰减少到一个峰(显示中心点结果)。在加载步骤和第二洗涤步骤期间去除大部分杂质。半mAb在加载过程中流经树脂，或与柱最低限度地结合。在第一洗涤步骤后，从柱中去除2X LC，或与柱最低限度地结合。第二洗涤步骤提供了对剩余蛋白质物质的完全结合条件，并且在洗脱开始前将UV基线重新设置为零，收紧了洗脱曲线，导致主产物的更有效的收集和更好的质量。

平衡缓冲液、最终经调节的加载以及第一洗涤缓冲液在94-98mM氯化钠下测试，具有相似结果。在各种浓度下测试平衡缓冲液、最终经调节的加载以及两种洗涤缓冲液配制品的pH为4.95至5.05，具有相似结果。在5-27mg/ml下测试加载浓度，具有相似结果。

总的来说，与无盐加载条件相比，高盐加载具有较低产率(约60％)。原因是在无盐加载运行时，洗脱可能会分级，从而允许在控制最终产物质量时具有更高的准确度和精密度。然而，无盐加载具有8mM[氯化钠]/CV的陡峭梯度，对稳健的制造过程并非最佳，而高盐加载具有16mM[氯化钠]/CV的盐梯度。高盐加载调节允许洗脱的长度从44个柱体积减少至20个柱体积。柱体积的减少节省了时间和资源，因为洗脱梯度更短，这也导致了更稳健的制造过程。

实例3高加载密度，无盐加载调节，双特异性#2

在表3中概括的条件下，将含有完全人工程化的IgG/Fab融合蛋白(双特异性#2)的中和蛋白A洗脱液池加载到Capto-SP

阳离子交换色谱树脂(通用电气医疗集团生物科学部，马尔堡，马萨诸塞州)。

表3无盐加载条件下高加载密度阳离子交换色谱的条件

图3显示出在陡峭的洗脱梯度下，高加载密度、无盐加载调节导致的一个洗脱峰。在高加载密度下，低pI产物相关杂质不能从主产物中分离，并且主要存在于级分1、2和3中，如LC1与LC2的比率为4比7(错配的LC1物质)和LMW物质为2％比4％的降低的CE-SDS所示。

实例4较低加载密度，无盐加载调节，双特异性#2

在表4中概括的条件下，将含有完全人工程化的IgG/Fab融合蛋白(双特异性#2)的中和蛋白A洗脱液池加载到Capto-SP

阳离子交换色谱树脂(通用电气医疗集团生物科学部，马尔堡，马萨诸塞州)。

表4无盐加载条件下较低加载密度阳离子交换色谱的条件

由于实例3的高加载密度、陡峭的洗脱梯度条件不能提供足够的来自低pI产物相关杂质的主产物的分辨率，因此减少了加载密度和梯度条件。图4显示出较低的加载密度(10相比于25g/L)和较缓的梯度(8相比于16mM/CV)，允许主要的低pI产物杂质分离成由级分1-4形成的明显峰。此级分显示LC1与LC2的比率为3比10，这表明LC1物质错配。相反，主峰显出累积的LC1与LC2比率为1.2。尽管分辨率更好，并且将产率从44％增加到73％，因为它仍然需要基于OD的自动合并，因此仍然有必要通过超过前峰的最高OD开始收集洗脱液，从而降低了产率，使得该过程不足以用于制造操作。

实例5高盐加载调节、双特异性#2

将含有双特异性#2的中和病毒灭活池与高盐上样缓冲液(100mM乙酸盐500mM氯化钠pH 5.00)组合，产生了浓度为100mM乙酸盐、105mM氯化钠，pH 5.00的最终经调节的上样缓冲液。在表4中概括的条件下，将经调节的加载加载到Capto-SP

阳离子交换色谱树脂(通用电气医疗集团生物科学部，马尔堡，马萨诸塞州)。

表5在高盐加载下进行阳离子交换色谱的条件。

发现当使用高盐加载条件时，在洗脱之前从CEX柱中去除低pI产物相关杂质。鉴于收集的洗涤1和洗涤2上的LC1与LC2的比率为5.0(与LC1和LC2正确组装和配对时的预期比例为1相比)，这些杂质可能对应于错配的LC1物质。图5显示出在高盐加载条件下，洗脱曲线中杂质峰的数量从两个峰减少至具有小肩峰(级分1-3)的单峰，该单峰仍含有错配的物质(LC1/LC2＝2至3)。第二洗涤步骤在洗脱开始之前也将UV基线重新设置为零，收紧了洗脱曲线，导致主产物的更有效的收集和更好的质量。采用较低加载水平和较缓梯度的优化程序，与高盐条件加载结合，从而允许CEX纯化产率从44％增加至58％，同时获得用于收集具有低水平错配LC1物质(如LC1与LC2之比接近1证明)、HMW和LMW的纯化池的洗脱曲线，以及基于吸光度的池标准。

Claims (57)

1.一种从组合物中纯化多特异性蛋白的方法，该组合物包含该多特异性蛋白和至少一种产物相关杂质，该方法包括

用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；

将该组合物在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；

用至少一种包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液洗涤柱；以及

从该阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该上样缓冲液包含94-96mM氯化钠。

3.根据权利要求2所述的方法，其中该上样缓冲液包含96-105mM氯化钠。

4.根据权利要求2所述的方法，其中该上样缓冲液包含94mM氯化钠。

5.根据权利要求2所述的方法，其中该上样缓冲液包含96mM氯化钠。

6.根据权利要求2所述的方法，其中该上样缓冲液包含98mM氯化钠。

7.根据权利要求2所述的方法，其中该上样缓冲液包含105mM氯化钠。

8.根据权利要求1所述的方法，其中该上样缓冲液包含乙酸盐。

9.根据权利要求8所述的方法，其中该上样缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。

10.根据权利要求8所述的方法，其中该上样缓冲液包含乙酸盐，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。

11.根据权利要求8所述的方法，其中该上样缓冲液包含100mM乙酸盐。

12.根据权利要求1所述的方法，其中该上样缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠。

13.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含94-105mM氯化钠。

14.根据权利要求13所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含94-96mM氯化钠。

15.根据权利要求13所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含96-105mM氯化钠。

16.根据权利要求13所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含94mM氯化钠。

17.根据权利要求13所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含96mM氯化钠。

18.根据权利要求13所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含98mM氯化钠。

19.根据权利要求13所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含105mM氯化钠。

20.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐。

21.根据权利要求20所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。

22.根据权利要求20所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。

23.根据权利要求20所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含100mM乙酸盐。

24.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94mM-105mM氯化钠。

25.根据权利要求1所述的方法，其中该方法包括至少一种另外的洗涤缓冲液。

26.根据权利要求25所述的方法，其中至少一种另外的洗涤缓冲液是第二洗涤缓冲液。

27.根据权利要求25所述的方法，其中至少一种另外的洗涤缓冲液包含0-26mM氯化钠。

28.根据权利要求25所述的方法，其中至少一种洗涤缓冲液包含乙酸盐、94-105mM氯化钠，随后至少一种另外的洗涤缓冲液包含乙酸盐、0-25mM氯化钠。

29.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种平衡缓冲液包含94-105mM氯化钠。

30.根据权利要求29所述的方法，其中至少一种平衡缓冲液包含94-96mM氯化钠。

31.根据权利要求29所述的方法，其中至少一种平衡缓冲液包含96-105mM氯化钠。

32.根据权利要求29所述的方法，其中至少一种平衡缓冲液包含94mM氯化钠。

33.根据权利要求29所述的方法，其中至少一种平衡缓冲液包含96mM氯化钠。

34.根据权利要求29所述的方法，其中至少一种平衡缓冲液包含98mM氯化钠。

35.根据权利要求29所述的方法，其中至少一种平衡缓冲液包含105mM氯化钠。

36.根据权利要求1所述的方法，其中该平衡缓冲液包含乙酸盐。

37.根据权利要求36所述的方法，其中该平衡缓冲液包含乙酸盐，pH 4.9-5.1。

38.根据权利要求36所述的方法，其中该平衡缓冲液包含乙酸盐，pH 5.0±0.05至5.0±0.1。

39.根据权利要求36所述的方法，其中该平衡缓冲液包含100mM乙酸盐。

40.根据权利要求1所述的方法，其中以10-27g/L加载该组合物。

41.根据权利要求40所述的方法，其中以15-27g/L加载该组合物。

42.根据权利要求1所述的方法，其中通过梯度将该多特异性蛋白从阳离子交换树脂洗脱。

43.根据权利要求42所述的方法，其中该梯度是线性的。

44.根据权利要求42所述的方法，其中该梯度是盐梯度。

45.根据权利要求1所述的方法，其中该多特异性蛋白是双特异性蛋白。

46.根据权利要求1所述的方法，其中该多特异性蛋白是双特异性抗体。

47.一种纯化的、多特异性蛋白，其通过根据权利要求1所述的方法制备。

48.根据权利要求1所述的方法，其中该阳离子交换色谱介质是树脂。

49.一种从阳离子交换色谱的洗脱液中减少低pI杂质的方法，该方法包括

用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；

将该组合物在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；

用至少一种包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液洗涤柱；以及

从该阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；

其中与从在平衡、加载以及洗涤步骤中不使用氯化钠的相应方法中回收的阳离子交换色谱洗脱液相比，该阳离子交换色谱洗脱液具有减少的低pI杂质。

50.根据权利要求49所述的方法，其中该低pI杂质是产物相关杂质。

51.根据权利要求50所述的方法，其中至少一种产物相关杂质是半抗体或2X、3X或4X轻链错配。

52.一种在高盐加载条件下进行阳离子交换色谱以减少产物相关杂质的方法，该方法包括

用平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；

将该组合物在上样缓冲液中加载到阳离子交换介质；

用第一和第二洗涤缓冲液洗涤柱；以及

从该阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；

其中该平衡、加载和第一洗涤缓冲液包含94-105mM氯化钠。

53.根据权利要求52所述的方法，其中该第二洗涤缓冲液包含0-26mM氯化钠。

54.一种生产分离的、纯化的重组多特异性蛋白的方法，该方法包括

用表达该多特异性蛋白的宿主细胞在生物反应器中建立细胞培养；

培养该宿主细胞以表达该多特异性蛋白；

收获该重组多特异性蛋白；

亲和纯化该收获的重组多特异性蛋白；

在来自亲和纯化的洗脱液池中、在低pH下灭活病毒并且中和该池；

用包含94-105mM氯化钠的平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱介质；

将该中和的、亲和纯化的重组多特异性蛋白在包含94-105mM氯化钠的上样缓冲液中加载到平衡的阳离子交换介质；

用包含94-105mM氯化钠的洗涤缓冲液，随后用包含0-26mM氯化钠的第二洗涤缓冲液，洗涤该阳离子交换介质；

从该阳离子交换色谱介质中洗脱该多特异性蛋白；

以流过模式将包含该重组多特异性蛋白的阳离子交换色谱洗脱液加载到第二色谱树脂上；以及

将该纯化的重组多特异性蛋白在配制品缓冲液中浓缩。

55.根据权利要求47所述的方法，其中该第二色谱树脂选自阴离子交换色谱树脂、阳离子交换色谱树脂、多模式色谱树脂、疏水相互作用色谱树脂以及羟基磷灰石色谱树脂。

56.一种分离的、纯化的重组多特异性蛋白，其通过根据权利要求55所述的方法制备。

57.一种药物组合物，其包含通过根据权利要求55所述的方法制备的分离的、纯化的重组多特异性蛋白。

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