KR20210086655A - 지속적으로 수확하고 세포 출혈없는 강화된 관류에 의한 세포 배양 과정 - Google Patents
지속적으로 수확하고 세포 출혈없는 강화된 관류에 의한 세포 배양 과정 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포를 배양하고 생체적 제제를 수확하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것으로, 구체적으로는, 지속적으로 수확하고 세포 출혈없이 강화된 관류에 의한 세포 배양 과정에 관한 것이다.
Description
본 출원은 2018년 11월 2일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2018/113776 및 2019년 6월 4일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2019/089993에 우선권을 주장한다. 두 출원의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
본 발명은 세포를 배양하고 생체적 제제를 수확하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것으로, 구체적으로는, 지속적으로 수확하고 세포 출혈없이 강화된 관류에 의한 세포 배양 과정에 관한 것이다.
1980년대에 바이오 의약품 제조가 시작된 이래로, 더 많은 양의 치료용 재조합 단백질에 대한 수요가 계속 증가하고 있다. 재조합 단백질 또는 기타 생체 생성물의 생산을 위한 제조 공정을 개발하는 것은 많은 변수가 균형을 이루어야 하는 복잡한 시도이다.
통상적인 관류 공정에서는, 세포에 신선한 배지를 지속적으로 공급하고 세포를 출혈시켜 높은 세포 생존력을 유지함으로써 세포를 장기간에 걸쳐 배양한다. 연속 제조과정에서 생물 반응기에 세포를 정기적으로 출혈하는 것은 일반적으로 필요하나, 이는 관심있는 세포와 생체적 생성물의 손실을 유발하기 때문에 비효율적이다.
전형적인 세포 배양 공정에서, 세포에 의해 분비되는 생체적 생성물은 사용된 보유 시스템에 따라 세포 배양 동안 보유되거나 수확된다. 특정 상황에서 세포와 생체적 생성물은 배양 과정 동안 생물 반응기에 남아 있다. 예를 들어, 미국 특허 제9,469,865호는 생체 물질 및 세포 배양물을 포함하는 세포 배양물이 분리 시스템을 통해 순환되는 관류 공정을 개시하고, 여기서 생체 물질은 반응기에 유지되거나 반응기로 다시 공급되고 배양이 종료되면 생성물이 수확된다. 수확시, 채워진 세포 부피가 크면 세포와 생체적 생성물의 혼합물을 명확히 하기가 어려워 전체 수율이 낮아진다. 다른 특정 상황에서, 세포와 생체적 생성물은 배양 과정 중에 생물 반응기에서 분리된다.
더 큰 생성물 수율, 개선된 생성물 품질 및 감소된 비용으로 이어질 수 있는 세포 배양 공정에 대한개선이 여전히 필요하다. 본 발명은 지속적으로 수확하고 세포 출혈없는 강화된 관류에 의한 세포 배양을 위한 방법 및 시스템을 제공함으로써 이러한 요구 중 적어도 하나를 충족시킨다.
본 발명은 세포를 배양하고 생체적 제제를 수확하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것으로, 구체적으로는, 지속적으로 수확하고 세포 출혈없이 강화된 관류에 의한 세포 배양 과정에 관한 것이다.
본 발명은 생물 반응기에서 세포 배양물의 관류 배양에 의해 생체 물질을 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기서 기초 배지 및 피드 배지는 상이한 속도로 세포 배양물에 공급되고, 세포 배양물은 생체 물질을 연속적으로 수확하기 위해 분리 시스템을 통과한다. 배양 과정에서 세포는 출혈없이 생물 반응기에 유지된다. 본 발명의 공정은 PVCD (최고 생존 세포 밀도) 및 Qp (세포 특이적 생산성) 측면에서 상당한 이점을 제공한다. 그 결과, 본 공정은 원하는 생체 물질의 생산성을 향상시킬 수 있다.
기초 배지와 피드 배지를 서로 다른 속도로 세포 배양에 공급하고 배양중에 온도를 변화시키고 세포 배양을 출혈시키지 않음으로써, 초기 단계에서 많은 양의 바이오 매스가 발생하고 이후 단계에서 높은 생산성을 달성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 생체 물질을 지속적으로 수확하는 조정된 분리 시스템은 높은 Qp, 더 나은 품질의 생체 물질 및/또는 높은 정제 수율을 달성하는 데 도움이 된다. 본 발명의 방법은 강화된 관류 배양 (IPC) 공정으로 지칭되며, 여기서 관류 공정은 연속 수확 공정과 조율되고 여기서 출혈 공정은 생략된다.
구체적으로, 본 발명은 (a) 세포 배양 배지 및 세포를 포함하는 세포 배양물을 배양하는 단계, (b) 생물 반응기에서 기초 배지 및 피드 배지로 세포 배양물을 관류하는 단계, 및 (c) 생체 물질을 수확하는 단계를 포함하는 생체 물질의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 기초 배지 및 피드 배지는 상이한 속도로 세포 배양물에 공급되고, 세포 배양물은 분리 시스템을 통해 연속적으로 통과되고, 세포는 출혈없이 생물 반응기에서 전체 배양 과정 동안 유지된다.
본 발명의 일 예에서, 세포 배양은 생물 반응기에서 관심 생체 물질을 발현하는 세포를 접종함으로써 확립된다. 본 발명의 다른 일 예에서, 세포 배양은 생물 반응기에서 적어도 0.1x106 생존가능한세포/mL를 접종함으로써 확립된다. 본 발명의 다른 일 예에서, 세포 배양은 약 0.7-0.8x106 생존가능한세포/mL, 약 0.8-1.0x106 생존가능한세포/mL, 약 1.0-4.0x106 생존가능한세포/mL를 접종함으로써 확립된다. 본 발명의 다른 일 예에서, 세포 배양은 약 0.1-4.0x106 생존가능한세포/mL, 0.1-0.5x106 생존가능한세포/mL, 약 0.5-1.0x106 생존가능한세포/mL, 약 1.0-1.5x106 생존가능한세포/mL, 약 1.5-2.0x106 생존가능한세포/mL, 약 2.0-2.5x106 생존가능한세포/mL, 약 2.5-3.0x106 생존가능한세포/mL, 약 3.0-3.5x106 생존가능한세포/mL, 약 3.5 -4.0x106 생존가능한세포/mL, 약 0.2-0.4x106 생존가능한세포/mL, 약 0.4-0.6x106 생존가능한세포/mL, 약 0.6-0.8x106 생존가능한세포/mL, 약 0.8-1.0x106 생존가능한세포/mL, 약 1.0-1.2x106 생존가능한세포/mL, 약 1.2-1.4x106 생존가능한세포/mL, 약 1.4-1.6x106 생존가능한세포/mL, 약 1.6-1.8x106 생존가능한세포/mL, 또는 약 1.8-2.0x106 생존가능한세포/mL 를 접종함으로써 확립된다.
세포 배양은 기초 배지와 피드 배지를 다른 속도로 관류함으로써 유지된다. 본 발명의 일 예에서, 피드 배지의 관류는 기초 배지의 관류 속도의 약 0.1-20%, 예를 들어 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 또는 약 20% 기초 배지 관류 속도이다. 피드 배지의 관류 속도는 세포 밀도, 생존력 및 삼투압에 따라 조정된다. 본 발명의 일 예에서, 기초 배지는 2.0VVD 이하, 예를 들어 약 0.1 내지 2.0VVD, 약 0.1 내지 1.5VVD, 약 0.3 내지 1.2VVD, 또는 약 0.5 내지 1.0VVD로 공급된다. 본 발명의 일 예에서, 기초 배지는 2.0VVD 이하의 관류 속도, 예를 들어 약 0.1 내지 2.0VVD, 약 0.1 내지 0.3VVD, 약 0.3 내지 0.6VVD, 약 0.6 내지 0.9VVD, 약 0.9 내지 1.2VVD, 약 1.2 내지 1.5VVD, 약 1.5 내지 1.8VVD, 약 1.8 내지 2.0VVD, 약 0.5 내지 1.0VVD, 약 0.7 내지 1.2VVD, 또는 약 1.0 내지 1.5VVD 로 공급된다. 본 발명의 일 예에서, 피드 배지의 관류는 기초 배지의 관류 속도의 약 1-15%, 바람직하게는 약 1-10%, 더욱 바람직하게는 약 1-9%의 속도이다. 본 발명의 일 예에서, 피드 배지의 관류는 기초 배지의 관류 속도의 약 1-15%, 약 1-14%, 약 1-13%, 약 1-12%, 약 1-11%, 약 1-10%, 약 1-9%, 약 1-8%, 약 1-7%, 약 1-6%, 약 1-5%, 약 1-4%, 약 1-3%, 약 1-2%, 약 2-9%, 약 3-9%, 약 4-9%, 약 5-9%, 약 6-9% 또는 약 7-9%의 속도이다. 기초 배지의 피드 속도는 세포 밀도가 증가함에 따라 증가할 수 있고 세포 밀도가 최고점에 도달하기 전에 목표 피드 속도 (예를 들어, 3내지6일)에 도달할 수 있으며, 그런 다음 배양이 종료될 때까지 목표 피드 속도를 고정할 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 기초 배지의 공급 속도는 배양 과정의 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일에 증가된다. 충분한 영양을 공급하기 위해 세포 밀도가 증가함에 따라 피드 배지의 피드 속도가 증가할 수 있으며, 일반적으로 2일에서 4일까지 시작하여 6일에서 10일에 최고점에 도달할 수 있으며, 때로는 세포 밀도 또는 생존력이 감소함에 따라 세포 배양 중에 감소될 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 피드 배지의 피드 속도는 배양 공정의 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일에 증가한다. 본 발명의 다른 일 예에서, 피드 배지의 피드 속도는 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일에 최고치에 도달한다.
본 발명의 일 예에서, 세포 배양물을 온도 변화로 처리하는 것을 추가로 포함한다. 온도 변화의 목적은 VCD가 최고점에 도달하기 전에 세포의 과성장을 억제하는 것이다. 본 발명의 일 예에서, 온도 변화는 VCD 피크와 같이 미리 결정된 파라미터에 대응한다. 본 발명의 다른 일 예에서, 온도 변화는 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일에 발생한다. 본 발명의 일 예에서, 온도 변화는 예를 들어 약 35-37°C에서 약 28-33°C로, 또는 약 34-36°C에서 약 27-34°C로, 또는 약 36-38°C에서 약 29-34°C, 또는 약 36-39°C에서 약 30-35°C로, 또는 약 33-35°C에서 약 26-31°C이다.
본 발명의 일 예에서, 생성된 생체 물질은 중공 섬유 필터가 있는 분리 시스템에 의해 연속적으로 수확된다. 본 발명의 일 예에서, 중공 섬유 필터의 기공 크기 또는 분자량 컷오프는 중공 섬유 필터가 관심있는 생체 물질을 보유하지 않고 세포를 보유하도록 선택된다. 따라서 세포에서 생성된 생체 물질이 수확되고 세포가 배양에 유지된다. 본 발명의 일 예에서, 중공 섬유 필터의 기공 크기는 약 0.08μm 내지 약 0.5μm, 바람직하게는 약 0.1μm 내지 약 0.5μm, 더 바람직하게는 약 0.2μm 또는 약 0.45μm이다. 본 발명의 일 예에서, 중공 섬유 필터의 기공 크기는 약 0.08μm 내지 약 1.0μm, 예를 들어 약 0.1μm 내지 약 0.8μm, 약 0.1μm 내지 약 0.6μm, 약 0.1μm 내지 약 0.5μm, 약 0.1μm 내지 약 0.4μm, 약 0.1μm 내지 약 0.3μm, 약 0.2μm 내지 약 0.8μm, 약 0.2μm 내지 약 0.8μm, 약 0.3μm 내지 약 0.8μm, 약 0.4μm 내지 약 0.8μm, 약 0.2μm 내지 약 0.6μm, 약 0.2μm 내지 약 0.5μm이다. 본 발명의 일 예에서, 중공 섬유 필터는 약 0.2μm 또는 약 0.45μm이다.
본 발명의 일 예에서, 중공 섬유 필터를 갖는 분리 시스템은 교류 접선 흐름 (ATF) 또는 접선 흐름 여과 (TFF) 장치이다.
본 발명의 일 예에서, 세포는 출혈없이 전체 배양 과정 동안 생물 반응기에 유지된다. 출혈 시스템을 생략하여 높은 수준의 세포 밀도를 얻을 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 일 예에서, 수확된 물질은 크로마토그래피 단계에 의해 연속적인 생성물 포획에 적용되었다. 연속적인 생성물 포획 공정을 채택함으로써 매우 생산적인 (예를 들어, 매우 생산적인) 세포 배양이 달성될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다.
또한, 생체 물질을 생산하기 위한 시스템이 본 발명에 제공되며, 이 시스템은 (a) 생물 반응기에서 기초 배지 및 피드 배지로 세포 배양물을 관류하기 위한 모듈; 및 (b) 생체 물질의 분자량보다 큰 기공 크기 또는 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는 중공 섬유 필터를 포함하는 생체 물질을 연속적으로 수확하기 위한 모듈이고, 그 결과 관심있는 생체 물질을 보유하지 않고 세포를 보유하며, 바람직하게는, 생체 물질을 지속적으로 수확하기 위한 모듈은 교류 접선 흐름 (ATF) 장치이고; 및 c) 수확된 물질로부터 생체 물질의 연속 포획을 위한 모듈임. 본 발명의 일 예에서, 시스템은 세포 배양용 생물 반응기 및/또는 마이크로스파저를 추가로 포함한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물은 그 전체가 참고로 포함된다. 이 섹션에 설명된 정의가 여기에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물에 설명된 정의와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 이 섹션에 설명된 정의가 여기에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
본 발명에 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 표시되지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 예를 들어, "a" 생체 물질은 하나 이상의 생체 물질을 포함한다.
본 명세서상 용어 "생물 반응기"는 세포 배양이 차례로 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물을 포함할 수 있는 시스템이다. 본 발명의 일 예에서, 이는 다른 세포가 원하는 세포를 오염시키는 것을 방지하기 위해 공기 필터와 같은 멸균 장벽을 제공한다. 본 발명의 일 예에서, 혼합, 온도, pH, 산소 농도 등과 같은 적합한 배양 조건을 제공함으로써 세포에 유리한 환경을 유지한다.
본 명세서상 용어 "세포 배양" 또는 "배양"은 다세포 유기체 또는 조직 외부의 세포의 성장 및 증식을 의미한다. "세포 배양"은 세포 배양 배지, 세포 및 생체 물질을 포함하는 액체를 포함하며, 이 액체는 세포 배양 배지의 반응기에서 세포를 배양하는 과정의 결과이며, 세포는 생체 물질을 생산한다. 포유 동물 세포에 적합한 배양 조건은 당업계에 공지되어 있다. 동물 세포 배양의 예를 참조하라: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). 포유류 세포는 현탁액 또는 고체 기질에 부착된 상태에서 배양될 수 있다.
본 명세서상 용어 "세포"는 관심 생체 물질을 생산하는 세포, 예를 들어 생성물을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 생성물을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 세포는 예를 들어 세포 생성물을 코딩하는 유전자 및 적합한 선택 마커를 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드로 세포를 형질감염시킴으로써 제조될 수 있다. 생성물을 생산하는데 사용될 수 있는 세포는 원칙적으로 생체적 생성물을 생산할 수 있는 능력을 가진 당업자에게 공지된 모든 세포이다. 세포는 동물 세포, 특히 포유류 세포일 수 있다. 포유 동물 세포의 예는 CHO (중국 햄스터 난소) 세포, 하이브리도마 (hybridomas), BHK (아기 햄스터 신장) 세포, 골수종 (myeloma) 세포, 인간 세포, 예를 들어 HEK-293 세포, 인간 림프모세포 (humanLymphoblastoid) 세포, E1 불멸화 HER (E1 immortalized HER) 세포, 마우스 세포, 예를 들어 NS0 세포를 포함한다.
본 명세서상 용어 "세포 배양 배지"("배양 배지" , "세포 배양 배지" 라고도 함)는 세포, 예를 들어 동물 또는 포유류 세포를 성장시키는데 사용되는 임의의 영양 용액을 지칭하고,일반적으로 다음으로부터 적어도 하나 이상의 성분을 제공한다: 에너지원 (보통 포도당과 같은 탄수화물의 형태); 모든 필수 아미노산 중 하나 이상, 일반적으로 20개의 염기성 아미노산 및 시스테인; 일반적으로 저농도로 필요한 비타민 및/또는 기타 유기 화합물; 지질 또는 유리 지방산; 및 미량 원소, 예를 들어 무기 화합물 또는 일반적으로 매우 낮은 농도,일반적으로 마이크로 몰 범위에서 요구되는 자연 발생 원소.
본 명세서상 용어 "기초 세포 배양 배지"는 전형적으로 세포 배양을 개시하는데 사용되며 세포 배양을 지지하기에 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다. 상업적으로 이용 가능한 기초 배지는 CD OptiCHO AGT (인비트로겐), CD CHO AGT (인비트로겐), Dynamis AGT 배지 (인비트로겐), SFM4CHO ADCF (하이클론), HyCell CHO 배지 (하이클론), CDM4MAB (하이클론), DPM 하이클론 ActiPro (하이클론), Advanced CHO Fed-batch Medium (시그마)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서상 용어 "피드" 세포 배양 배지 또는 피드 배지는 지수 성장 기간인 "성장기" 동안 세포 배양에 전형적으로 사용되며, 이 단계 동안 세포 배양을 지원하기에 충분히 완전한 세포 배양 배지를 의미한다. 성장 세포 배양 배지는 또한 숙주 세포주에 통합된 선택 가능한 마커에 대한 내성 또는 생존을 부여하는 하나 이상의 선택 제제를 포함할 수 있다. 이러한 선택 제제에는 제네네신 (G4118, geneticin), 네오마이신 (neomycin), 하이그로마이신 B (hygromycin B), 퓨로마이신 (puromycin), 제오신 (zeocin), 메티오닌 설폭시민 (methionine sulfoximine), 메토트렉세이트 (methotrexate), 글루타민-없는 세포 배양 배지, 글리신-없는 세포 배양 배지, 하이포크산틴 (hypoxanthine) 및 티미딘 (thymidine), 또는 티미딘 단독을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상업적으로 이용 가능한 피드 배지는 CHO CD Efficient FeedA (인비트로겐), CHO CD Efficient FeedB (인비트로겐), CHO CD Efficient FeedC (인비트로겐), Sheff-CHO PLUS PF ACF (FM012) (케리), CHO CD Efficient Feed A+ (인비트로겐), CHO CD Efficient Feed B+ (인비트로겐), CHO CD Efficient Feed C+ (인비트로겐), DPM- Cell Boost 7a (하이클론), DPM- Cell Boost 7b (하이클론) 또는 FAA01A (하이클론)를 포함하지만, 이에 국한되지 않고 활용될 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 세포 배양 배지는 무혈청 (serum-free) 및/또는 동물 기원의 생성물 또는 성분이 없음 (free of products or ingredients)이다. 본 발명의 일 예에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 정의되며, 여기에 모든 화학적 성분은 알려져 있다. 선택적 구성 요소를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 배지와 보조 성분 또는 성분을 활용할 수 있고, 통상적인 기술을 사용하는 당업자에 의해 공지되고 실시되는 바와 같이, 필요하거나 원하는 대로 적절한 농도 또는 양으로 첨가될 수 있다.
본 명세서상 용어 "생성물", "생체적" 및 "생체 물질"은 상호 교환 가능하다. 예를 들어 (재조합) 유전자 코딩을 발현함으로써 세포에 의해 생산될 수 있는 생성물은 예를 들어 (재조합) 단백질, 특히 수용체, 효소, 융합 단백질, 혈액 응고 캐스케이드 (cascade)로부터의 단백질과 같은 혈액 단백질, 예를 들어 백신에 사용하기 위한 에리트로포이에틴 (erythropoietin), 바이러스 또는 박테리아 단백질과 같은 다기능 단백질; 항체, 예를 들어 IgG 또는 IgM과 같은 면역글로불린 (immunoglobulins), 이중 특이적 항체와 같은 다중 특이적 항체 (multi-specific antibodies) 등이다. 바람직하게는 단백질, 보다 바람직하게는 항체가 세포에 의해 생산되는 것이다.
본 명세서상 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 서브클래스의 글리코실화 및 비-글리코실화 면역글로불린 (glycosylated and non-glycosylated immunoglobulins) 또는 특이적 결합에 대해 온전한 항체와 경쟁하는 그의 항원-결합 영역에 대한 것을 포함하고, 달리 명시되지 않는 한, 인간, 인간화, 키메라 (chimeric), 다중 특이적, 단일클론, 다클론, 및 올리고머 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디, Fd, dAb, 맥시바디, 단일 사슬 항체 분자, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 표적 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도일부를 함유하는 폴리펩티드와 같은 항원 결합 단편 또는 영역을 갖는 단백질이 포함된다. 본 명세서상 용어 "항체"는 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 분리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항체의 예는 상기 언급된 단백질 및/또는 하기 항원을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 단백질의 임의의 하나 또는 조합을 인식하는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-13 수용체, IL-18 수용체 서브유닛, FGL2, PDGF-β 및 이의 유사체 (미국 특허 번호 5,272,064 및 5,149,792 참조), VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, EGF 수용체 (미국 특허 번호 6,235,883 참조), VEGF 수용체, 간세포 성장 인자, 오스테게린 (osteoprotegerin) 리간드, 인터페론 감마, B 림프구 자극기 (BlyS, BAFF, THANK, TALL-1 및 zTNF4로도 알려짐; Do and Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25 참조), C5 보체 (complement), IgE, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원,LCG (폐암과 관련하여 발현되는 유전자 산물), HER-2, HER-3 , 종양 관련 당단백질 TAG-72, SK-1 항원, 콜론 및/또는 췌장암 환자의 혈청에서 상승된 수준으로 존재하는 종양 관련 에피토프 (epitopes), 유방암에서 발현되는 암 관련 에피토프 (epitopes) 또는 단백질, 콜론, 편평 세포 (squamous cell), 전립선, 췌장, 폐, 및/또는 신장 암 세포 및/또는 흑생종에서, 신경아 교종, 또는 신경 모세포종 세포, 종양의 괴사 코어 (necrotic core of a tumor), 인테그린 알파 4 베타 7, 인테그린 VLA-4, B2 인테그린, TRAIL 수용체 1, 2, 3, 4, RANK, RANK 리간드, TNF-α, 접착 분자 VAP-1, 상피 세포 접착 분자 (EpCAM), 세포간 접착 분자-3 (ICAM-3), 류코인테그린 아데신 (leukointegrin adhesin), 혈소판 당단백질 gp IIb/IIIa, 심장 미오신 중쇄, 부갑상선 호르몬, rNAPc2 (VIIa-조직 인자의 억제제), MHC I, 암배아 항원 (CEA), 알파 태아단백질 (AFP), 종양 괴사 인자 (TNF), CTLA-4 (세포독성 T 림프구 관련 항원), Fc-γ-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, 스클레로스틴 (sclerostin),L-셀렉틴, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), B형 간염 바이러스 (HBV), 스트렙토코쿠스 무탄스 (Streptococcus mutans) 및 황색포도상 구균 (Staphlycoccus aureus). 본 발명의 방법을 사용하여 생산될 수 있는 공지된 항체의 특정 예는 아달리 무맙 (adalimumab), 베바시주맙 (bevacizumab), 인플릭시맙 (infliximab), 아비시시맙 (abciximab), 알렘투주맙 (alemtuzumab), 바피네우주맙 (bapineuzumab), 바실릭시맙 (basiliximab), 벨리무맙 (belimumab), 브리아키누맙 (briakinumab), 카나키누맙 (canakinumab), 세르톨리주맙 페골 (certolizumab pegol), 세툭시맙 (cetuximab), 코나투무맙 (conatumumab), 데노수맙 (denosumab), 에쿨리주맙 (eculizumab), 젬투주맙 (gemtuzumab), 오조가미신 (ozogamicin), 골리무맙 (golimumab), 이브리투모맙 티우세탄 (ibritumomab tiuxetan), 라베투주맙 (labetuzumab), 마파투무맙 (mapatumumab), 마투주맙 (matuzumab), 메폴리주맙 (mepolizumab), 모타비주맙 (motavizumab), 무로모나브-CD3 (muromonab-CD3), 나탈리주맙 (natalizumab), 니모투주맙 (nimotuzumab), 오파투무맙 (ofatumumab), 오말리주맙 (omalizumab), 오레고고보맙 (oregovomab), 팔리비주맙 (palivizumab), 파니투무맙 (panitumumab), 펨투모맙 (pemtumomab), 페르투주맙 (pertuzumab), 라니비주맙 (ranibizumab), 리툭시맙 (rituximab), 로벨리주맙 (rovelizumab), 토실리주맙 (tocilizumab), 토시투모맙 (tositumomab), 트라스투주맙 (trastuzumab), 우스테키누맙 (ustekinumab), 베돌리조맙 (vedolizomab), 잘루투무맙 (zalutumumab) 및 자놀리무맙 (zanolimumab)을 포함 하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 예에서, 세포에 의해 생산된 단백질 또는 백신과 같은 생성물은 약제학적 제제에서 활성 성분으로 사용될 수 있다. 생성물의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 항-hTNFα (아달리무맙, Adalimumab (Humira TM)), VEGF (애플리버셉트, Aflibercept (EYLEA TM)를 표적으로하는 융합 단백질, 에리트로포이에틴 알파 (erythropoietin alpha, Epogen®), 림프모세포 인터페론 α-n1 (lymphoblastoid Interferon α-n1, Wellferon TM), (재조합) 응고 인자 (NovoSeven TM), 에타너셉트 (Etanercept, Enbrel TM), 트라스투주맙 (Trastuzumab, Herceptin TM), 인플릭시맵 (Infliximab, Remicade TM), 바실릭시맙 (Basiliximab, Simulect ??), 다클리주맙 (Daclizumab, Zenapaz TM), (재조합) 응고 인자 IX (Benefix TM), 글루코세레브로시다아제 (Glucocerebrosidase, Cerezyme TM), 인터페론 베타 1b (Betaseron®), G-CSF (Neupogen®Filgrastim), 인터페론 알파 -2b (Infergen®), 재조합 인슐린 (Humulin®), 인터페론 베타 1 a (Avonex®), 인자 VIII (Factor VIII, KoGENate®), 테넥테플라제 (Tenecteplase, TNKase TM), (재조합) 항혈우병 인자 (antihemophilic factor, ReFacto TM), TNF 알파 수용체 (Enbrel®), 난포 자극 호르몬 (Gonal-F®), 맵 아빅시마브 (Mab abciximab, Synagis®, ReoPro®), 맵 리툭시마브 (Mab rituximab, Rituxan®), 조직 플라스미노겐 활성화제 (tissue plasminogen activator, Activase ®, Actilyase®), 인간 성장 호르몬 (Protropin®, Norditropin ®, GenoTropin TM). 또한, 본 명세서상 용어 "항체 구조물"의 정의는 1가, 2가 및 다가/멀티 구조물, 즉, 2개 이상의 항원 구조, 예를 들어 2개 이상의 항원 구조에 특이적으로 결합하는 다중특이적/멀티특이적 구조물뿐만 아니라 2개의 항원 구조에만 특이적으로 결합하는 이중특이적 구조물, 예를 들어 별개의 결합 도메인을 통해 3개, 4개 또는 그 이상의 구조를 포함한다. 더욱이, "항체 구조물"이라는 용어의 정의는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 구성된 분자뿐만 아니라 단 하나의 폴리펩티드 사슬로 구성된 분자를 포함하며, 사슬은 동일 (동종이량체, 동종삼량체 또는 동종올리고머)하거나 또는 상이 (이종이량체, 이종삼량체 또는 이종올리고머)할 수 있다. 상기 확인된 항체 및 이의 변이체 또는 유도체에 대한 예는 특히 Harlow andLane, Antibodies aLaboratory manual, CSHL Press (1988) 및 Using Antibodies: aLaboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010 andLittle, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009에 설명되어 있다.
본 명세서상 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합 (펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 의미한다. 본 명세서상 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산 사슬을 지칭하며, 특정 길이의 생성물을 지칭하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 둘 이상의 아미노산 사슬을 지칭하는데 사용되는 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의에 포함되며, "폴리펩티드"는 이들 용어 대신에 또는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서상 용어 "폴리펩티드"는 또한 제한없는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 또는 비천연에 의한 변형을 포함하는 아미노산을 발생시키는 폴리펩티드의 발현 후 변형 생성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원에서 유래하거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만 반드시 지정된 핵산 서열에서 번역되는 것은 아니다. 이는 화학적 합성을 포함하여 어떤 방식으로든 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 크기가 약 3이상, 5이상, 10이상, 20이상, 25이상, 50이상, 75이상, 100이상, 200이상, 500이상, 1,000이상, 또는 2,000이상의 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원 구조를 가질 수 있지만 반드시 그러한 구조를 가지고 있는 것은 아니다. 정의된 3 차원 구조를 가진 폴리펩티드는 접힌 것으로 나타나고, 정의된 3차원 구조를 가지지 않고 오히려 많은 수의 다른 형태를 채택할 수 있는 폴리펩티드는 펼쳐진 것으로 나타난다.
본 명세서상 용어 "응집"은 일반적으로, 예를 들어, 반데르발스힘 또는 화학적 결합을 통한 분자 간의 직접적인 상호 인력을 지칭한다. 특히, 응집은 단백질이 함께 축적되고 응집되는 것으로 되며, 즉, "응집물" 및 "단편"을 의미한다. 응집물은 무정형 응집체, 올리고머 및 아밀로이드 피브릴 (amyloid fibrils)을 포함할 수 있으며, 일반적으로 고분자량 (HMW)종, 즉, 일반적으로 본 명세서에서 저분자량 (LMW)종 또는 단량체로 지칭되는 응집되지 않은 분자인 순수 생성물 분자보다 더 높은 분자량을 갖는 분자로 지칭된다.
본 명세서상 용어 "마이크로스파저"는일반적으로 생물 반응기 탱크 내의 세포 배양물에 산소 및/또는 기타 가스를 제공하도록 구성된 스파저를 의미한다. 통풍기 또는 마이크로스파저는 산소 또는 기타 가스의 공급원에 연결될 수 있으며, 가스를 세포 배양으로 유도하여 세포 배양에서 가스가 거품을 일으키게 하여 세포 배양을 통기할 수 있다. 일부 예에서, 마이크로스파저는 드릴튜브스파저와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 기재된 바와 같이 제조된 생체적 제제는 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 등과 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하는데 사용되는 실제 조건은 부분적으로 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자에게는 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제를 위해 생체적 제제가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생체적 제제 (예를 들어, 면역 접합체)의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 사용될 수 있다. 순차 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피는, 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 생체적 제제, 예를 들어 면역 접합체를 분리하는데 사용될 수 있다. 생체적 제제 (예를 들어, 면역 접합체)의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 및 유사한 방법을 포함하여 잘 알려진 다양한 분석 방법에 의해 결정될 수 있다.
관류 배양 공정
"관류" 배양 공정은 세포 배양에 신선한 배지를 추가하고 사용된 배지를 생물 반응기에서 제거하는 공정이다. 관류는 연속적, 단계적, 간헐적, 또는 이들의 일부 또는 전부의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 관심 생체 물질을 발현하는 세포, 예를 들어, 적어도 0.1x106 생존가능한세포/mL, 예를 들어 약 0.7-0.8x106 생존가능한세포/mL, 약 0.8-1.0x106 생존가능한세포/mL, 약 1.0-4.0x106 생존가능한세포/mL를 생물 반응기에서 접종함으로써 세포 배양을 확립한다. 본 발명의 일 예에서, 세포 배양은 생물 반응기에서 관심 생체 물질을 발현하는 세포, 예를 들어, 적어도 0.1x106 생존가능한세포/mL,, 예를 들어 약 0.1-4.0x106 생존가능한세포/mL, 0.1-0.5x106 생존가능한세포/mL, 약 0.5-1.0x106 생존가능한세포/mL, 약 1.0-1.5x106 생존가능한세포/mL, 약 1.5-2.0x106 생존가능한세포/mL, 약 2.0-2.5x106 생존가능한세포/mL, 약 2.5-3.0x106 생존가능한세포/mL, 약 3.0-3.5x106 생존가능한세포/mL, 약 3.5-4.0x106 생존가능한세포/mL, 약 0.2-0.4x106 생존가능한세포/mL, 약 0.4-0.6x106 생존가능한세포/mL, 약 0.6-0.8x106 생존가능한세포/mL, 약 0.8- 1.0x106 생존가능한세포/mL, 약 1.0-1.2x106 생존가능한세포/mL, 약 1.2-1.4x106 생존가능한세포/mL, 약 1.4-1.6x106 생존가능한세포/mL, 약 1.6-1.8x106 생존가능한세포/mL, 또는 약 1.8-2.0x106 생존가능한세포/mL를 접종함으로써 확립된다.
세포 배양은 기초 배지 및 피드 배지를 공급함으로써 유지된다. 세포는 배지를 공급하기 전에 하루 동안 기초 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 기초 배지의 관류는 2일부터 시작될 수 있고, 피드 배지의 관류는 3일부터 시작될 수 있다. 그렇지 않으면, 기초 배지의 관류는 1일부터 시작될 수 있다. 또 다른 예로서, 기초 배지의 관류는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일부터 시작될 수 있으며, 피드 배지의 관류는 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일부터 시작될 수 있다.
본 명세서상 용어 "관류 속도"는 일반적으로 주어진 시간에 작업 용적의 일부 또는 배수로 표현되는 생물 반응기로부터 통과 (추가 및 제거)되는 매체의 양이다. "작업 용적"은 세포 배양에 사용되는 생물 반응기 용적의 양을 의미한다. 본 발명의 일 예에서, 기초 배지의 관류 속도는 작업 용적/1일 (VVD) 2.0 이하, 예를 들어 약 0.1 내지 1.5VVD, 약 0.3 내지 1.2VVD, 또는 약 0.5 내지 1.0VVD일 수 있다.
세포 배양 배지를 배양물에 첨가하는 속도는 세포의 생존력 및 밀도에 영향을 미칠 수 있다. 놀랍게도 기초 배지와 피드 배지의 공급 속도를 조정하고 이들을 다른 단계에서 공급함으로써 높은 생존 세포 밀도 (VCD) 및 생존력을 달성할 수 있다는 것이 발견되었다. 본 명세서상 용어 "생존 세포 밀도"는 표준 생존력 분석 (예를 들어, 트리판 블루 염료 배제 방법)에 의해 결정된 바와 같이 주어진 부피의 배양 배지에서 살아있는 세포의 수를 의미한다.
본 발명의 일 예에서, 기초 배지 및 피드 배지는 상이한 관류 속도로 세포 배양물에 공급되며, 피드 배지의 관류 속도는 기초 배지의 관류 속도의 약 0-20%, 예를 들어, 약 0.1-20%, 예를 들어 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19% 또는 약 20% 이다. 본 발명의 일 예에서, 기초 배지의 관류 속도는 약 2.0VVD 이하, 예를 들어, 약 0.1 내지 1.5VVD, 약 0.3 내지 1.2VVD, 또는 약 0.5 내지 1.0VVD이다. 예를 들어, 기초 배지의 관류는 1일부터 약 0.4VVD의 속도로 시작될 수 있으며 속도는 3일에 약 1.5VVD로 증가될 수 있고 배양이 끝날 때까지 약 1.5VVD로 유지될 수 있다. 피드 배지의 관류는 4일에 기초 배지의 약 2.0%의 비율로 시작될 수 있고 7일에 기초 배지의 약 4.0%로 증가될 수 있으며, 8일부터 점진적으로 감소되어 17일에 약 1%가 될 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 기초 배지의 관류는 약 0.4VVD의 속도로 1일부터 시작될 수 있고 속도는 4일에 약 1.5VVD로 증가될 수 있고 배양이 끝날 때까지 약 1.5VVD로 유지될 수 있다. 피드 배지의 관류는 5일부터 기초 배지의 약 2.0%의 비율로 시작될 수 있고, 12일에 기초 배지의 약 9%로 증가되고, 18일에 약 7%로 감소되고, 19일부터 종료시까지 약 6%로 유지될 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 기초 배지의 관류는 약 0.6VVD의 속도로 2일부터 시작될 수 있고, 6일에 속도는 약 0.88VVD로 증가될 수 있고, 배양이 끝날 때까지 약 0.88VVD로 유지될 수 있다. 피드 배지의 관류는 2일부터 기초 배지의 약 6.7%의 비율로 시작될 수 있고, 12일에 기초 배지의 약 16%로 증가되고, 종결까지 약 16%로 유지될 수 있다.
세포 배양 조절
본 발명 방법에 적합한 세포 배양 조건은 pH, 용존 산소 (O2), 이산화탄소 (CO2), 교반 및 폭기, 및 온도를 주의하는 세포의 관류 배양 또는 이들 방법의 임의 조합에 대해 전형적으로 사용되고 공지된 것들이다.
재조합 단백질 또는 생체적 생산 동안, 원하는 시간 동안 또는 원하는 시간 동안 세포를 성장시킨 다음 세포의 생리적 상태를 성장 제한 또는 정지, 세포 밀도를 높이기 위한 재조합 단백질을 생산하기 위해 세포가 에너지와 기질을 사용하는 높은 생산성 상태로 전환하는 제어 시스템을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 상업적 규모의 세포 배양 및 생체 치료제의 제조를 위해, 세포 성장을 제한 또는 정지하고 생산 단계 동안 세포를 성장 제한 또는 정지 상태로 유지할 수 있는 능력이 매우 바람직하다. 이러한 방법에는, 예를 들어 온도 변화가 포함된다.
성장을 제한하거나 저지하기 위한 이러한 메커니즘 중 하나는 세포 배양 동안 온도를 변화시키는 것이다. 예를 들어, 성장 단계는 더 높은 온도에서 발생할 수 있고, 더 낮은 온도로 이동하면 생산 단계를 시작 및/또는 유지할 수 있다. 예를 들어, 성장 단계는 약 35°C 내지 약 37°C의 제1 온도 설정점에서 발생할 수 있고, 생산 단계는 약 28°C 내지 약 33°C의 제2 온도 설정 점에서 발생할 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 온도 변화는 피크 VCD와 같은 미리 결정된 파라미터에 대응한다. 본 발명의 일 예에서, 온도 변화는 예를 들어 약 35-37°C에서 약 28-33°C 로의 온도 변화일 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 성장 단계는 약 30°C 내지 약 38°C, 예를 들어 약 31°C 내지 약 37°C, 약 32°C 내지 약 36°C, 약 33°C 내지 약 35°C, 약 33°C 내지 약 34°C, 약 32°C 내지 약 35°C, 또는 약 31°C 내지 약 34°C의 제1 온도 설정점에서 발생할 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 생산 단계는 약 25°C 내지 약 35°C, 예를 들어 25°C 내지 약 30°C, 30°C 내지 약 35°C, 26°C 내지 약 31°C, 27°C 내지 약 32°C, 28°C 내지 약 33°C, 또는 29°C 내지 약 34°C의 제2 온도 설정점에서 발생할 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 온도 변화는 피크 VCD와 같은 미리 결정된 파라미터에 대응한다. 본 발명의 일 예에서, 온도 변화는 예를 들어 약 35-37°C에서 약 28-33°C로, 예를 들어 약 34-36°C에서 약 27-34°C로, 약 36-38°C에서 29-34°C로, 약 36-39°C에서 약 30-35°C로, 또는 약 33-35°C에서 약 26-31°C로일 수 있다.
온도 설정점 전환은 수동으로 수행하거나 생물 반응기 제어 시스템을 사용하여 자동으로 수행할 수 있다. 온도 설정점은 미리 결정된 시간에 또는 세포 밀도, 예를 들어 적정 농도 또는 하나 이상의 배지 성분의 농도와 같은 하나 이상의 세포 배양 매개변수에 대응하여 전환될 수 있다.
본 발명 방법의 한 가지 장점은 출혈 단계가 필요하지 않다는 것이다. 기초 배지와 피드 배지를 서로 다른 속도로 세포 배양에 공급하고 온도 변화 전략을 채택하고 세포의 출혈을 생략함으로써, 초기 단계에서 많은 양의 바이오 매스와 높은 생산성을 얻을 수 있고 나중 단계에서 높은 생산성을 달성할 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 출혈 단계를 생략하면 세포가 비정상 상태로 유지되고 세포 밀도가 매우 높은 수준으로 밀려난다. 높은 VCD 및 생존력을 유지하기 위해, 본 발명의 공정은 온도 이동 및 기초 및 피드 배지의 상이한 공급 속도를 이용한다.
본 발명의 일 예에서, 세포 접종 전에 소포제가 생물 반응기에 첨가된다. 본 발명의 일 예에서, 세포 접종 전에 약 5 내지 20ppm, 약 8 내지 15ppm, 약 9 내지 12ppm, 또는 약 10ppm의 소포제가 생물 반응기에 첨가된다. 본 발명의 일 예에서, 약 5 내지 200 ppm, 약 8 내지 150 ppm, 약 9 내지 120 ppm, 약 10 내지 100 ppm의 소포제가 배양 동안 배양 배지에 첨가된다. 소포제는 매일, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 또는 한번 추가될 수 있다.
본 명세서상 용어 "소포제"는 본 발명 내용의 맥락에서 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 일 예에서, 소포제는 배양물에서 거품의 형성을 감소시키고 방해하는 임의의 제제일 수 있다. 본 발명에서, 접종 전 소포제를 첨가하면 배양 중 거품이 터져 발생하는 세포 손상이 완화된다. 본 발명의 일 예에서, 본 발명의 기술적 효과를 얻을 수 있는 임의의 소포제가 사용될 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 소포제는 유성 소포제, 분말 소포제, 수성 소포제, 실리콘 기반 소포제, EO/PO 기반 소포제, 또는 알킬 폴리아크릴레이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 일 예에서, 유성 소포제에서 오일은 미네랄 오일, 식물성 오일, 화이트 오일 또는 발포 배지에 불용성인 임의의 다른 오일 (실리콘 오일은 제외)일 수 있다. 본 발명의 다른 일 예에서, 유성 소포제는 또한 성능을 향상시키기 위해 왁스 및/또는 소수성 실리카를 포함한다. 전형적인 왁스는 에틸렌 비스 스테아르아미드 (EBS), 파라핀 왁스, 에스테르 왁스 및 지방 알코올 왁스이다. 본 발명의 일 예에서, 분말 소포제는 원칙적으로 실리카와 같은 미립자 담체상의 오일 기반 소포제이다. 이들은 시멘트, 석고 및 세제와 같은 분말 생성물에 추가된다. 본 발명의 일 예에서, 수성 소포제는 오일이 종종 미네랄 오일 또는 식물성 오일이고 왁스가 장쇄 지방 알코올, 지방산 비누 또는 에스테르인 수성베이스에 분산된 상이한 유형의 오일 및 왁스이다. 본 발명의 일 예에서, 실리콘 기반 소포제는 실리콘 화합물이 실리콘 오일에 분산된 소수성 실리카로 구성되고 실리콘 글리콜 및 기타개질된 실리콘 유체를 포함할 수 있는 실리콘 백본을 갖는 중합체이다. 본 발명의 일 예에서, EO/PO 기반 소포제는 우수한 분산 특성을 갖고 침전이 문제될 때 종종 매우 적합한 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜 공중합체 (copolymers)를 포함한다. 본 발명의 일 예에서, 알킬 폴리아크릴레이트는 공기 방출이 표면 발포체의 분해보다 더 중요한 소수성 시스템에서 소포제로 사용하기에 적합하다.
본 발명의 일 예에서, 마이크로스파저가 본 발명의 방법에 사용된다. 본 발명의 다른 일 예에서, 마이크로스파저는 요구되는 산소 유속이 약 0.2VVM에 도달될 때 사용된다. 본 발명에서, 마이크로스파저의 구현은 배양 중에 터지는 기포로 인한 세포 손상을 완화시킨다.
지속적인 수확
본 발명의 일 예에서, 세포에 의해 생성된 관심 생체 물질이 세포 배양물로부터 연속적으로 수확되는 동안 세포는 배양물에 유지된다. 이와 관련하여 중공 섬유 필터가 있는 분리 시스템이 관류 시스템에 연결된다. 중공 섬유 필터의 기공 크기 또는 분자량 컷오프는 중공 섬유 필터가 관심 생체 물질을 보유하지 않고 세포를 보유하도록 선택된다.
세포 배양 배지, 세포 (예를 들어, 전체 및 용해), 가용성 발현 재조합 단백질, 숙주 세포 단백질, 폐기물 등을 포함한 세포 배양이 필터에 도입되면 중공 섬유 물질은 루멘 (lumen) 측에 특정 세포 배양 성분을 보유하고 관심 생체 물질이 필터를 통과하도록 허용할 수 있다. 남아있는 세포는 생물 반응기로 반환된다. 세포 배양물은 중공 섬유의 내강 측을 통해 세포 배양물을 통과시키는 펌핑 시스템에 의해 생물 반응기에서 필터로 인출될 수 있다.
본 발명의 다양한 예에서, 관심 생체 물질이 아닌 세포가 유지되도록 기공 크기 또는 분자량 컷오프 (MWCO)가 선택되는 한, 임의의 필터가 분리 시스템으로 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 필터의 비제한적인 예는 멤브레인 (membrane)필터, 세라믹 필터 및 금속 필터를 포함한다. 필터는 어떤 형태로든 사용할 수 있다; 파일러 (filer)는 예를 들어 나선형으로 감거나 관형일 수 있거나 시트 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 다양한 예에서, 사용된 필터는 멤브레인 필터이다. 본 발명의 일 예에서, 필터는 중공 섬유 필터이다. 본 발명의 일 예에서, 중공 섬유 필터의 기공 크기는 약 0.08μm 내지 0.5μm, 약 0.1μm 내지 0.5μm, 약 0.2μm 또는 약 0.45μm이다. 본 발명의 일 예에서, 중공 섬유 필터의 기공 크기는 약 0.08μm 내지 약 1.0μm, 예를 들어 약 0.1μm 내지 약 0.8μm, 약 0.1μm 내지 약 0.6μm, 약 0.1μm 내지 약 0.5μm, 약 0.1μm 내지 약 0.4μm, 약 0.1μm 내지 약 0.3μm, 약 0.2μm 내지 약 0.8μm, 약 0.2μm 내지 약 0.8μm, 약 0.3μm 내지 약 0.8μm, 약 0.4μm 내지 약 0.8μm, 약 0.2μm 내지 약 0.6μm, 또는 약 0.2μm 내지 약 0.5μm이다. 본 발명의 일 예에서, 중공 섬유 필터는 약 0.2μm 또는 약 0.45μm이다. 중공 섬유를 포함하는 필터 모듈은, 예를 들어 Refine Technology에서 상업적으로 이용 가능하다.
생체 물질, 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물을 분리 시스템을 통해 순환시킴으로써, 세포는 반응기에 유지되고 관심 생체 물질이 수확된다. 예를 들어 2일 또는 3일과 같이, 관류 과정이 시작될 때 세포 배양의 순환이 시작될 수 있다.
필터를 통한 세포 배양물의 순환은 막다른 흐름으로도 알려진, 예를 들어 단방향 접선 흐름 (TFF) 또는 교차 흐름과 같은 접선 흐름으로도 알려진, 필터 표면에 대해 실질적으로 수직인 흐름 또는 필터 표면에 실질적으로 평행한 흐름일 수 있다. 교차 흐름의 바람직한 예는 매우 높은 셀 밀도에서도 필터 막힘이 (빠르게) 발생하지 않는 것으로 밝혀진 교류 접선 흐름 (ATF)이다.
"교류 접선 흐름"이란 흐름이 앞뒤로 이동하는 필터 표면 (들)과 동일한 방향 (즉, 접선 방향)으로 하나의 흐름이 있고 상기 필터 표면에 실질적으로 수직인 방향으로 다른 흐름이 있음을 의미한다. 교류 접선 흐름은 당업자에게 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (예를 들어, 그 전체가 본 발명에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,544,424호에 설명됨).
본 발명의 일 예에서, 세포에 의해 생성된 생체 물질은 약 0.08μm 내지 0.5μm, 약 0.1μm 내지 0.5μm, 약 0.2μm 또는 약 0.45μm의 기공 크기를 갖는 중공 섬유 필터가 있는 분리 시스템에 의해 연속적으로 수확된다.
본 발명의 일 예에서, 세포에 의해 생성된 생체 물질은 약 0.08μm 내지 약 1.0μm, 예를 들어, 약 0.1μm 내지 약 0.8μm, 약 0.1μm 내지 약 0.6μm, 약 0.1μm 내지 약 0.5μm, 약 0.1μm 내지 약 0.4μm, 약 0.1μm 내지 약 0.3μm, 약 0.2μm 내지 약 0.8μm, 약 0.2μm 내지 약 0.8μm, 약 0.3μm 내지 약 0.8μm, 약 0.4μm 내지 약 0.8μm, 약 0.2μm 내지 약 0.6μm, 또는 약 0.2μm 내지 약 0.5μm 의 기공 크기를 갖는 중공 섬유 필터가 있는 분리 시스템에 의해 연속적으로 수확된다. 본 발명의 일 예에서, 중공 섬유 필터는 약 0.2μm 또는 약 0.45μm이다.
다운스트림 정제
본 발명의 공정에서 생성된 생체 물질은 소위 다운스트림 공정에서 수확된 물질로부터 추가로 포획될 수 있다. 다운스트림 처리에는일반적으로 다양한 조합 및 순서로 여러 정제 단계가 포함된다.
다운 스트림 공정에서 정제 단계의 비제한적인 예는 분리 단계 (예를 들어, 친 화성 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 수성 2-상 시스템에 의한 추출 및/또는 예를 들어 황산 암모늄과 같은 것에 의한 침전), 생물학적 물질의 농축 단계 (예를 들어, 한외여과 (ultrafiltration) 또는 정용여과 (diafiltration)에 의한 것), 완충액 교환 단계 및/또는 바이러스 제거 또는 비활성화 단계 (예를 들어, 바이러스 여과, pH 이동 또는 용매 세제 처리)이다.
본 발명의 일 예에서, ATF 장치로부터 수확된 물질은 크로마토그래피 단계에 의해 연속 생성물 포획에 적용된다. 예를 들어, 모의 이동상 (SMB), 주기적 역류 크로마토그래피 (PCC) 및 2-컬럼 크로마토그래피 (TCC)와 같은 다중 컬럼 크로마토그래피 시스템을 연속 생성물 포획에 사용할 수 있다.
본 발명의 일 예에서, ATF 장치에서 수확된 물질은 크로마토그래피 단계를 통해,
예를 들어 2 내지 16 컬럼, 바람직하게는 3 내지 8 컬럼, 더 바람직하게는 포획할 생성물의 특성에 따라 적절한 수지 (단백질 A, IEX, HIC, 혼합모드, IMAC 등과 같은 다른 기능성 리간드 포함하여)로 포장된 3개의 컬럼을 사용하여, 연속 생성물 포획을 거치게 된다. 로드 단계 및 로드 후 세척 단계에서는 두개 이상의 (2 내지 15) 컬럼이 직렬로 연결되고 다른 단계에서는 나머지 컬럼이 서로 다른 단계에서 서로 다른 버퍼로 처리된다. 특히, 2-칼럼 공정의 경우, 처음에 수확물을 수집하기 위해 하나의 칼럼을 사용하고, 비로딩 단계를 위해 두 번째 칼럼을 사용한다. 비로딩 단계가 완료되면 두 번째 컬럼이 첫 번째 컬럼의 출구에 연결되어 로드의일부와 로드 후 세척 단계를 통한 흐름을 포착한다. 이러한 모든 라인은 BioSMB (Pall), AKTA pcc (GE Healthcare), BioSC (Novasep), Contichrom (ChromaCon) 등과 같은 연속 크로마토그래피 시스템에서 병렬로 처리된다. 본 발명의 일 예에서, ATF 장치로부터 수확된 물질은 MabSelect PrismA 수지로 포장된, 예를 들어 1.1/5cm (내부 직경/층 높이)의 3개의 컬럼을 사용하여 연속 생성물 포획 공정을 거친다. 로드 단계 및 로드 후 세척 단계에서는 두개의 컬럼이 직렬로 연결되고 다른 단계에서는 하나의 단일 컬럼만 처리된다. 이 두개의 유동 경로는 BioSMB PD 시스템에서 병렬로 처리되고 자동으로 세개의 컬럼간에 전환된다. 연속 생성물 포획 공정은 전통적인 배치 공정보다 훨씬 효율적이다.
본 발명은 세포를 배양하고 생체적 제제를 수확하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것으로, 구체적으로는, 지속적으로 수확하고 세포 출혈없이 강화된 관류에 의한 세포 배양 과정에 관한 것이다.
도 1a는 본 발명의일 예에 따른 배양 시스템의 개략도이다.
도 1b는 본 발명의일 예에 따른 연속적인 생성물 포획 시스템의 개략도이다.
도 2는 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존 세포 밀도를 (106/mL) 보여준다.
도 3은 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존력 (%)을 보여준다.
도 4는 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 누적 부피 생산성 (Pv) (g/L)을 보여준다.
도 5는 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 포도당 농도를 보여준다.
도 6은 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 유산염 (lactate) 생산 또는 축적을 보여준다.
도 7은 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 cIEF (모세관 등전 전기영동) 결과를 보여준다.
도 8은 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 SEC 및 SDS_캘리퍼_NR 결과를 보여준다.
도 9는 실시예 2에서의 IPC-1 내지 IPC-8 실험에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존 세포 밀도 (106/mL)를 보여준다.
도 10은 실시예 2에서의 IPC-1 내지 IPC-8 실험에 대한 세포의 생존력을 보여준다.
도 11은 실시예 2에서의 IPC-1 내지 IPC-8 실험에 대한 누적 부피 생산성 (Pv)을 보여준다.
도 12는 실시예 2에서의 IPC-1 내지 IPC-8 실험의 포도당 농도를 보여준다.
도 13은 실시예 2에서의 IPC-1 내지 IPC-8 실험에 대한 유산염 농도를 보여준다.
도 14는 실시예 3에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (관류 세포 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존 세포 밀도 (106/mL)를 보여준다.
도 15는 실시예 3에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (관류 세포 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존력 (%)을 보여준다.
도 16은 실시예 3에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (관류 세포 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 누적 Pv (g/L)를 보여준다.
도 17은 실시예 3에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (관류 세포 배양)에 대한 포도당 농도를 보여준다.
도 18 실시예 3에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (관류 세포 배양)에 대한 유산염 생산 또는 축적을 보여준다.
도 19는 실시예 4에서의 공정 A 및 B에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존 세포 밀도 (106/mL)를 보여준다.
도 20은 실시예 4에서의 공정 A 및 B에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존력 (%)을 보여준다.
도 21은 실시예 4에서의 공정 A 및 B에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 누적 Pv (g/L)를 보여준다.
도 22는 실시예 4에서의 공정 A 및 B에 대한 포도당 농도를 보여준다.
도 23은 실시예 4에서의 공정 A 및 B에 대한 유산염 농도를 보여준다.
도 24는 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존 세포 밀도 (106/mL)를 보여준다.
도 25는 상이한 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존력 (%)을 보여준다.
도 26은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 세포 평균 직경을 보여준다.
도 27은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 포도당 농도를 보여준다.
도 28은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 유산염 농도를 보여준다.
도 29 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 암모늄 농도를 보여준다.
도 30은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 온라인 pH를 보여준다.
도 31은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 오프라인 pH를 보여준다.
도 32는 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 pCO2 수준을 보여준다.
도 33은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 삼투압을 보여준다.
도 34는 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 누적 Pv (g/L)를 보여준다.
도 35는 실험 4에서 15L 및 250L 규모의 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 포획 단계의 SEC 결과 및 수율을 보여준다.
도 36은 실험 4에서 15L 및 250L 규모의 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 cIEF (모세관 등전 전기영동) 결과를 보여준다.
도 1b는 본 발명의일 예에 따른 연속적인 생성물 포획 시스템의 개략도이다.
도 2는 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존 세포 밀도를 (106/mL) 보여준다.
도 3은 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존력 (%)을 보여준다.
도 4는 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 누적 부피 생산성 (Pv) (g/L)을 보여준다.
도 5는 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 포도당 농도를 보여준다.
도 6은 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 유산염 (lactate) 생산 또는 축적을 보여준다.
도 7은 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 cIEF (모세관 등전 전기영동) 결과를 보여준다.
도 8은 실시예 1에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (농축된 유가식)에 대한 SEC 및 SDS_캘리퍼_NR 결과를 보여준다.
도 9는 실시예 2에서의 IPC-1 내지 IPC-8 실험에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존 세포 밀도 (106/mL)를 보여준다.
도 10은 실시예 2에서의 IPC-1 내지 IPC-8 실험에 대한 세포의 생존력을 보여준다.
도 11은 실시예 2에서의 IPC-1 내지 IPC-8 실험에 대한 누적 부피 생산성 (Pv)을 보여준다.
도 12는 실시예 2에서의 IPC-1 내지 IPC-8 실험의 포도당 농도를 보여준다.
도 13은 실시예 2에서의 IPC-1 내지 IPC-8 실험에 대한 유산염 농도를 보여준다.
도 14는 실시예 3에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (관류 세포 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존 세포 밀도 (106/mL)를 보여준다.
도 15는 실시예 3에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (관류 세포 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존력 (%)을 보여준다.
도 16은 실시예 3에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (관류 세포 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 누적 Pv (g/L)를 보여준다.
도 17은 실시예 3에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (관류 세포 배양)에 대한 포도당 농도를 보여준다.
도 18 실시예 3에서의 공정 A (전통적인 유가식), 공정 B (강화된 관류 배양) 및 공정 C (관류 세포 배양)에 대한 유산염 생산 또는 축적을 보여준다.
도 19는 실시예 4에서의 공정 A 및 B에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존 세포 밀도 (106/mL)를 보여준다.
도 20은 실시예 4에서의 공정 A 및 B에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존력 (%)을 보여준다.
도 21은 실시예 4에서의 공정 A 및 B에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 누적 Pv (g/L)를 보여준다.
도 22는 실시예 4에서의 공정 A 및 B에 대한 포도당 농도를 보여준다.
도 23은 실시예 4에서의 공정 A 및 B에 대한 유산염 농도를 보여준다.
도 24는 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존 세포 밀도 (106/mL)를 보여준다.
도 25는 상이한 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 생존력 (%)을 보여준다.
도 26은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 세포 평균 직경을 보여준다.
도 27은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 포도당 농도를 보여준다.
도 28은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 유산염 농도를 보여준다.
도 29 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 암모늄 농도를 보여준다.
도 30은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 온라인 pH를 보여준다.
도 31은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 오프라인 pH를 보여준다.
도 32는 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 pCO2 수준을 보여준다.
도 33은 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 배양의 삼투압을 보여준다.
도 34는 상이한 규모에서 공정 A (전통적인 유가식) 및 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 공정 시간 (일) 대비 플롯된 누적 Pv (g/L)를 보여준다.
도 35는 실험 4에서 15L 및 250L 규모의 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 포획 단계의 SEC 결과 및 수율을 보여준다.
도 36은 실험 4에서 15L 및 250L 규모의 공정 B (강화 관류 배양)에 대한 cIEF (모세관 등전 전기영동) 결과를 보여준다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
세포주 및 배양 조건
클론 X: CHO-K1 숙주 세포를 ATCC (ATCC 번호: CCL 61)에서 구입하고 바이알을 해동하고 마스터 세포 은행 (MCB)의 100개 바이알을 생성한 다음, 워킹 세포 은행 (WCB)의 136개 바이알을 생성했다. 그런 다음 WCB 바이알을 해동하고, 무혈청 배지와 함께 현탁액 배양에 조정했다. 60개 PCB 바이알, 170개 MCB 바이알 및 230개 WCB 바이알을 적합한 클론 CHO-K1-A4로 현탁액에 생성하였다. 안정적인 형질감염을 위하여 CHO-K1 숙주 세포 CHO-K1-A4) 하나의 WCB 바이알을 해동시켰다.
미국 특허 제6,090,382호에개시된 항-hTNFα를 발현하기 위한 cDNA 서열을 각각 블라스티시딘 (Blasticidin) 및 제오신 (Zeocin) 내성 마커를 포함하는 2개의 벡터로 클로닝 하였다. 리포솜을 사용하여 안정적인 형질감염을 수행했다. 형질감염 후, 풀 선택 (pool selection)을 위해 세포를 선택 배지 (9㎍/mL 블라스티시딘 및 400㎍/m 제오신을 포함하는 CD CHO 배지)에 계대시켰다. 약 2주간의 풀 선택 후 풀은 FACS 분류에 의해 복제되었다. 클론은 스핀 튜브에서 유가 배양에 의해 스크리닝 되었다. 클론 X라는 고성능 클론 하나가 선택되었다.
클론 Y: CHO-K1 숙주 세포를 ATCC (ATCC 번호: CCL 61)에서 구입하고, 바이알을 해동하고 100개 MCB 바이알을 생성한 후 136개 WCB 바이알을 생성했다. 그런 다음 WCB 바이알을 해동하고 무혈청 배지와 함께 현탁액 배양에 조정했다. 60개 PCB 바이알, 170개 MCB 바이알 및 230개 WCB 바이알을 적합한 클론 CHO-K1-A4로 현탁액에 생성하였다. 안정한 형질감염을 위해 CHO-K1 숙주 세포 CHO-K1-A4) 하나의 WCB 바이알을 해동시켰다.
미국 특허 제7,070,959B1호에개시된 바와 같이 VEGF를 표적으로 하는 융합 단백질을 발현하기 위한 cDNA 서열을 각각 블라스티시딘 및 제오신 내성 마커를 포함하는 2개의 벡터로 클로닝 하였다. 리포솜을 사용하여 안정적인 형질 감염을 수행했다. 형질 감염 후, 미니풀 선택을 위해 세포를 선택 배지 (9㎍/mL 블라스티시딘 및 400 ㎍/mL 제오신을 포함하는 CD CHO 배지)의 96-웰 플레이트에 플레이팅 하였다. 약 2주간 미니풀 선택 후, 고생산성 미니풀을 확장하고 혼합했다. 혼합된 미니풀은 2라운드의 ClonePix에 의해 클로닝 되었고, 클론은 스핀 튜브에서 유가 배양으로 스크리닝되었다. 클론 Y라는 고성능 클론 하나가 선택되었다.
클론 Z: CHO-K1 숙주 세포를 ATCC (ATCC 번호: CCL 61)에서 구입하고, 바이알을 해동하고 100개 MCB 바이알을 생성한 후136개 WCB 바이알을 생성했다. 그런 다음 WCB 바이알을 해동하고 무혈청 배지와 함께 현탁액 배양에 조정했다. 60개 PCB 바이알, 170개 MCB 바이알 및 230개 WCB 바이알을 적합한 클론 CHO-K1-A4로 현탁액에 생성하였다. 안정한 형질 감염을 위해 CHO-K1 숙주 세포 CHO-K1-A4) 하나의 WCB 바이알을 해동시켰다.
WO 2019/057124A에개시된 바와 같이 이중 특이적 항-CD3xCD19 항체를 발현하기 위한 cDNA 서열을 각각 블라스티시딘 및 제오신 내성 마커를 포함하는 2개의 벡터로 클로닝 하였다. 리포솜을 사용하여 안정적인 형질 감염을 수행했다. 형질 감염 후, 미니풀 선택을 위해 세포를 선택적 배지 (9㎍/mL 블라스티시딘 및 400㎍/mL 제오신을 포함하는 CD CHO 배지)의 96- 웰 플레이트에 플레이팅 하였다. 약 2 주간 미니풀 선택 후, 고생산성 미니풀은개별적으로 확장되었다. 미니풀은 한 라운드의 FACS로 클로닝 되었고, 클론은 스핀 튜브에서 유가 배양으로 스크리닝 되었다. 클론 Z라는 고성능 클론 하나가 선택되었다.
실시예 1
이 실시예에서, 클론 X를 사용하여, 강화된 관류 배양 공정 (B)의 성능을 전통적인 유가식 공정 (A) 및 농축된 유가식 공정 (C)의 성능과 직접 비교하였다.
전통적인 유가식 공정 A:
공정 A는 셰이크 플라스크에서 실행되었다. 전통적인 유가식 공정 A는 250mL 용기 부피에서 50 mL 초기 작업 부피에서 실행되었다. 세포를 4.0mML-글루타민이 보충된 CDM4 배지 (하이클론)에 0.40x106 세포/mL로 접종한 후 14일 동안 배양하였다. 배양 동안, 3.00% 기초 배지 CB7a 및 0.30% 피드 배지 CB7를 3일, 6일, 8일 및 10일에개별적으로 공급하였다. 5일차에 온도가 36.5°C에서 31.0°C로 변경되었다. 전체 배양 과정에서 포도당 스톡 용액 400g/kg을 공급하여 포도당 농도를 4.0g/L 이상으로 유지했다.
강화된 관류 배양 공정 B:
공정 B는 36.5°C, 약 7.2 내지 6.8의 pH 범위 및 40% 공기 포화도 DO에서 온도를 제어하기 위해 델타 V 컨트롤러를 사용하는 3L Applikon 용기에서 수행되었다. ATF-2H 시스템 (Refine Technology)과 함께 ATF 흐름 모드에서 작동되는 0.2μm 컷오프 중공 섬유 필터 (SpectrumLabs)를 사용하여 세포를 유지했다.
배양은 4.0mML-글루타민이 보충된 CDM4 배지 (하이클론)에 0.80-1.00x106 세포/mL로 시작되었다. 3일부터 매일 약 10-100ppm의 소포제를 첨가했다. 기초 배지 (CDM4, 하이클론)의 관류는 1일부터 시작되었으며, 0.4VVD였던 속도는 3일에 1.5VVD로 증가했다. 피드 배지 (CB7a/CB7b)의 관류는 4일부터 기초 배지의 2.0% 비율로 시작되었고 7일에 기초 배지의 4.0%로 증가했다. 8일째부터 피드 배지의 관류율은 세포 밀도 및 생존력의 저하로 인해 17일에 점차적으로 1%로 감소했다.
3일부터 배양이 끝날 때까지 CDM4 배지의 관류 속도는 1.5VVD로 유지되었다. 0.5VVM의 유속으로 산소를 전달하기 위해 마이크로스파저가 사용되었다. 5일째에 온도를 36.5°C에서 31.0°C로 낮추고 배양이 종료될 때까지 31.0°C를 유지했다. 세포 배양은 ATF를 통해 지속적으로 수확되었다. 전체 배양 과정에서 세포는 출혈없이 생물 반응기에 유지되었다.
농축된 유가식 공정 (C):
공정 C는 36.5℃, 약 7.2 내지 6.8의 pH 범위 및 40% 공기 포화도 DO에서 온도를 제어하기 위해 델타 V 제어기를 사용하여 수행되었다. 농축된 유가식 공정의 작업은 컷오프 중공 섬유 필터 (SpectrumLabs)를 제외하고는 배양액에서 세포와 생체적 생성물을 모두 유지하기 위해 구멍이 50 KD 인 공정 B와일치했다.
공정들 간 비교:
도 2는 공정 B 및 C에서 높은 피크 생존 세포 밀도 (전통적인 유가식 공정 A 대비 거의 3 배 정도)가 달성됨을 보여준다.
도 3은 공정 B와 C가 19일 동안 운영을 유지했음을 근거로 공정 B 및 C로 세포의 생존력이 더 오래 유지될 수 있음을 보여준다.
도 4는 공정 A 및 C와 비교할 때, 공정 B로부터의 누적 Pv가 가장 높다는 것을 보여준다. 공정 B의 누적 Pv는 전통적인 유가식 공정 A 및 농축된 유가식 공정 C의 최종 농도보다 약 9.41 배 및 1.29 배 더 높다. 여기서 농축된 유가식 공정 C의 최종 농도는 채워진 세포 부피에 의해 조정된다.
도 5는 전통적인 유가식 공정 A에 비해, 공정 B 및 농축된 유가식 공정 C에서보다 원활한 포도당 농도 조절이 달성되었음을 보여준다.
도 6은 공정 B 및 C에서 명백한 유산염 생산 또는 축적 문제가 관찰되지 않는 반면, 공정 A의 유산염 농도는 10일째부터 상승 추세를 나타냄을 보여준다.
도 7은 공정 A 및 C에 비해, 공정 B에서 산성 피크의 감소와 함께 증가된 cIEF 주요 피크가 달성됨을 보여준다.
도 8은 공정 B 및 다른 두 공정 A, C에 의해 생성된 응집체 및 단편의 비교를 보여준다. 공정 B의 SEC 주요 피크는 농축된 유가식 공정 C와 비슷하며 두 가지 모두 전통적인 유가식 공정 A 보다 높다. 공정 B의 SDS_캘리퍼스_NR 순도는 공정 A 및 C와 비교할 때 뚜렷한 차이가 없다.
공정 B에서 수확된 물질을 9일부터 21일까지 수집하고, 각각 9일 내지 13일, 13일 내지 17일, 및 17일 내지 21일 동안 3개의 백에 보관했다. 각 수확된 풀에 대해, 작은 컬럼에서 배치 모드 평가를 위해 약 100mL 샘플을 취하고 나머지는 연속 모드에서 BioSMB 시스템으로 처리했다. 전통적인 배치 및 연속 공정의 수율과 생산성을 비교하고, 생성물 품질 속성, SEC 순도 및 HCP 함량도 평가했다.
전통적인 배치 직접 생성물 포획 공정:
배치 모드 크로마토그래피는 MabSelect PrismA 수지로 채워진 0.5/5.6 cm (내경/베드 높이) 컬럼이 있는 AKTA 순수 시스템에서 수행되었다. 표 1은 크로마토그래피의 각 단계의 공정 매개 변수를 보여준다.
적재 용량은 수지65g/L이고, 적재 체류 시간은 5 분이었다. 크로마토그래피 단계는 실온 (18°C 내지 26°C)에서 수행되었다. 로딩 부피는 크로마토그래피 시스템의 부피 적산기에 의해 결정되는 반면, 용출풀 부피는 수집된 샘플의 순중량으로 결정되었다. 수율은 용출풀의 생성물양을 로딩풀의 생성물양으로 나눈 값을 기준으로 계산되었다. 용출풀의 농도는 280nm 파장에서 UV 흡광도로 측정한 반면, 로딩풀의 농도는 Protein A HPLC로 측정했다. 생산성은 가공품의 양을 가공 시간과 수지의 부피로 나눈 값으로 산출되었다.
용출풀을 pH5.5로 중화시킨 후, 용출 후 0.2㎛ PES 시린지 필터로 여과하였다. 중화된 풀의 SEC 순도 및 HCP 함량은 각각 CHO 세포용 SEC HPLC 및 상용 ELISA 키트에 의해 결정되었다.
연속 생성물 포획 공정:
연속 모드 크로마토그래피는 MabSelect PrismA 수지로 채워진 3개의 1.1/5cm (내경/베드 높이) 컬럼이 있는 BioSMB PD 시스템에서 수행되었다. 표 3은 크로마토그래피의 각 단계에 대한 자세한 공정 매개 변수를 보여준다. 로드 단계 및 로드 후 세척 단계에서는 두개의 컬럼이 직렬로 연결되고 다른 단계에서는 하나의 단일 컬럼만 처리되었다. 이 두개의 유동 경로는 BioSMB PD 시스템에서 병렬로 처리되었으며 세개의 컬럼 사이에서 자동으로 전환되었다.
연속 공정의 적재 용량 및 체류 시간은 상이한 체류 시간 및 로드 농도에서의 파단 곡선 (break through curve)을 기초로 계산되었으며, 표 4에 나타난 바와 같이 상이한 적정 농도를 갖는 재료에 대해 상이하였다. 언급되지 않은 다른 작업 조건은 위에서 설명한 배지 공정과 유사하다.
배치 및 연속 공정의 수율, 생산성, SEC 순도 및 HCP 함량을 각각 표 2 및 표 4에 나타낸 바와 같이 요약하였다.
배양 시간에 걸쳐일관된 수율 및 생성물 품질 속성 데이터는 강화된 관류 배양 공정 B에서 출발 물질의 변화가 다운스트림 공정에 약간의 영향을 미치고 연속 생성물 포획 공정이 배치 공정과 비슷하다는 것을 보여준다. 77% 더 높은 생산성은 연속 생성물 포획 공정이 전통적인 배치 공정에 비해 포획 단계의 생산성을 크게 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 강화된 관류 배양 공정 B는 안정적인 것으로 간주되며 연속 생성물 포획 공정은 전통적인 배치 공정보다 훨씬 효율적이다.
단계 | 버퍼 | pH |
전도도
(mS/cm) |
유량
(mL/min) |
부피
(CV) |
린스 1 | 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4 | 7.53 | 17.00 | 1.10 | 2 |
사용 전 살균 | 0.1 M NaOH | NA | NA | 1.10 | 5 |
평형 | 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4 | 7.53 | 17.00 | 1.10 | 5 |
로드 | NA | NA | NA | 0.22 | NA |
워시 1 | 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4 | 7.53 | 16.998 | 1.10 | 6 |
워시 2 | 50 mM NaAc-HAc,1 M NaCl, pH5.5 | 5.52 | 89.264 | 1.10 | 3 |
워시 3 | 50 mM NaAc-HAc,pH5.5 | 5.6 | 3.474 | 1.10 | 5 |
용출 | 50 mM NaAc-Hac, pH3.8 | 3.81 | 0.528 | 0.49 | 6 |
스트립 | 1 M HAc | NA | NA | 1.099 | 3 |
린스 2 | 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4 | 7.53 | 16.998 | 1.099 | 2 |
사용 후 살균 | 0.1 M NaOH | NA | NA | 1.099 | 5 |
린스 3 | 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4 | 7.53 | 16.998 | 1.099 | 2 |
수확 시간
(Day) |
로드 용량
(수지mg/mL) |
로드 농도
(mg/mL) |
로드 체류시간
(min) |
SEC 순도 (%) |
HCP 함량
(ppm) |
수율
(%) |
생산성
(g/L/h) |
전체 생산성
(g/L/h) |
||
모노머 | HMW | LMW | ||||||||
9 - 13 | 65 | 1.17 | 5 | 91.5 | 8.5 | < 0.1 | 497 | 88.12 | 12.14 | 13.74 |
13 - 17 | 1.57 | 92.0 | 7.9 | 0.1 | 674 | 90.75 | 15.26 | |||
17 - 21 | 1.39 | 93.1 | 6.9 | 0.1 | 659 | 87.87 | 14.19 |
단계 | 버퍼 | pH |
전도도
(mS/cm) |
유량
(mL/min) |
부피
(CV) |
평형 | 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4 | 7.50 | 16.888 | 4.8 | 5 |
로드 | NA | NA | NA | NA | NA |
로드 후 세척 | 50 mM NaAc-HAc,1 M NaCl, pH5.5 | 5.52 | 89.264 | NA | 3 |
워시 1 | 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4 | 7.50 | 16.888 | 4.8 | 3 |
워시 2 | 50 mM NaAc-HAc,1 M NaCl, pH5.5 | 5.52 | 89.264 | 4.8 | 3 |
워시 3 | 50 mM NaAc-HAc,pH5.5 | 5.60 | 3.474 | 4.8 | 5 |
용출 | 50 mM NaAc-Hac, pH3.8 | 3.81 | 0.528 | 4.8 | 7.5 |
스트립 | 1 M HAc | NA | NA | 4.8 | 3 |
린스 2 | 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4 | 7.50 | 16.888 | 4.8 | 2 |
사용 후 살균 | 0.1 M NaOH | NA | NA | 4.8 | 3 |
수확 시간
(Day) |
로드 용량(mg/mL resin) |
로드 농도
(mg/mL) |
로드 및 로드 후 원시 체류 시간 (min) | 수지 사이클 번호 | SEC 순도 (%) |
HCP 함량
(ppm) |
수율
(%) |
생산성
(g/L/h) |
전체 생산성
(g/L/h) |
생산성 증가 (배치 공정의%) | ||
모노머 | HMW | LMW | ||||||||||
9 - 13 | 76 | 1.17 | 1 | 1 - 15 | 91.7 | 8.3 | < 0.1 | 925 | 92.70 | 20.47 | 24.36 | 77 |
13 - 17 | 79 | 1.57 | 1 | 16 - 35 | 91.0 | 8.9 | 0.1 | 1211 | 89.64 | 28.49 | ||
17 - 21 | 78 | 1.39 | 1 | 36 - 52 | 92.8 | 7.1 | 0.1 | 643 | 89.53 | 24.26 |
실시예 2
본 발명의 실시예에서는 클론 X를 사용하여 강화된 관류 배양 공정 (B)의 성능을 평가하였다.
강화된 관류 배양 공정
실험 IPC-1 내지 IPC-8은 델타 V 제어기를 사용하여 약 36.5℃, 약 7.2 내지 6.8의 pH범위 및 약 40% 공기 포화도 DO에서 온도를 제어하기 위해 수행되었다. ATF-2H 시스템 (Refine Technology)과 함께 ATF 흐름 모드에서 작동되는 모든 공정 (중공 섬유 필터 기공 크기가 0.45μm인 공정 5 제외)에 대해 0.2μm 컷오프 중공 섬유 필터 (SpectrumLabs)를 세포를 유지하기 위해 사용했다.
실험 IPC-1, IPC-2 및 IPC-3은 7L Applikon 용기에서 수행되었으며 실험 IPC-4, IPC-5, IPC-6, IPC-7 및 IPC-8은 3L Applikon 용기에서 수행되었다.
IPC-1 내지 IPC-8 실험을 위한 배양은 4.0mML-글루타민이 보충된 CDM4배지 (하이클론)에서 약 0.90-1.10x106 세포/mL로 시작되었고, 0일부터 약 10-100 ppm 소포제가 매일 첨가되었다.
실험 IPC-1, IPC-4 및 IPC-5에서, 기초 배지 (CDM4, 하이클론)의 관류는 2일째에 0.4VV의 속도로 시작되었고, 속도는 4일에 1.0VVD로 증가되었다. 실험 IPC-2 및 IPC-3에서 기초 배지 (CDM4, 하이클론)의 관류는 1일부터 0.4VVD의 속도로 시작되었고, 속도는 2일에 1.0VVD로 증가했다. 실험 IPC-6에서 기초 배지 (CDM4, 하이클론)의 관류는 2일째부터 0.4VVD의 속도로 시작되었고, 속도는 4일째에 1.5VVD로 증가했다. 실험 IPC-7 및 IPC-8에서 기초 배지 (CDM4, 하이클론)의 관류는 1일부터 0.4VVD의 속도로 시작되었고 속도는 3일에 1.5VVD로 증가했다. IPC-1 내지 IPC-5 실험에서 CDM4 배지의 관류 속도는 5일부터 배양이 끝날 때까지 1.0VVD로 유지되었다. IPC-6 내지 IPC-8 실험에서 CDM4 배지의 관류 속도는 5일부터 배양이 끝날 때까지 1.5VVD로 유지되었다.
실험 IPC-1, IPC-2, IPC-3, IPC-4, IPC-5, IPC-6 및 IPC-8에서, 온도는 낮에 약 36.5°C에서 약 31.0°C로 감소했고, 배양이 끝날 때까지 약 31.0°C로 유지되었다. 실험 IPC-7에서, 온도는 6일에 약 36.5°C에서 약 33.0°C로 감소되었고, 배양이 끝날 때까지 약 33.0°C로 유지되었다.
IPC-1부터 IPC-8까지의 실험에서 피드 배지 (CB7a/CB7b)의 관류는 3일째부터 시작하여 전날의 포도당 이용률에 따라 매일 조절되어 최저 피드 속도로 포도당 농도를 2.0g/L 이상으로 유지하였다. 0.5VVM의 유속으로 산소를 전달하기 위해 마이크로스파저가 사용되었다. 세포 배양은 ATF를 통해 지속적으로 수확되었다. 전체 배양 과정에서 세포는 출혈없이 생물 반응기에 유지되었다.
도 9는 모든 공정이 높은 피크 생존 세포 밀도 (30Х106 세포/mL 이상)를 달성하고, 6일 후 온도가 33.0°C로 유지되는 공정 7을 제외하고는, 5-6일 동안 높은 수준으로 유지할 수 있음을 보여준다.
도 10은 종말점 생존율이 40% 인 공정 7을 제외하고, 거의 20일 동안 모든 공정에서 세포의 생존율이 배양 전반에 걸쳐 50% 이상으로 유지될 수 있음을 보여준다.
도 11은 모든 공정으로부터의 누적 부피 생산성 (Pv)이 12g/L 이상이고 최고치는 23g/L임을 보여준다.
도 12는 대부분의 공정의 포도당 농도가 전체 배양 기간 동안 2g/L 이상으로 제어됨을 보여준다.
도 13은 지수 성장기 동안의 전형적인 유산염 생산 기간에 이어 유산염 소비가 모든 공정에서 관찰됨을 보여준다.
실시예 3
이 실시예에서, 클론 Y를 사용하여, 강화된 관류 배양 공정 (B)의 성능을 전통적인 유가식 공정 (A) 및 관류 공정 (C)의 성능과 직접 비교하였다.
전통적인 유가식 공정 A:
공정 A는 250mL 용기 부피의 50mL 초기 작업 부피로 셰이크 플라스크에서 실행되었다. 세포를 6mML-글루타민이 보충된 Excell Advanced CHO 배지 (시그마)에 0.40x106개 세포/mL로 접종한 후 14일 동안 배양했다. 배양 동안, 3.00% 기초 배지 CB7a 및 0.30% 피드 배지 CB7b를 3일, 6일, 8일 및 10일에개별적으로 공급 하였다. 5일째에 온도는 36.5°C에서 33.0°C로 감소되었다. 포도당 농도는 400g/kg 포도당 스톡 용액을 공급하여 2.0g/L 이상으로 유지되었다.
강화된 관류 배양 공정 B:
공정 B는 약 36.5°C, 약 7.2 내지 6.8의 pH 범위 및 약 40% 공기 포화도 DO에서 온도를 제어하기 위해 델타 V 제어기를 사용하여 수행되었다. 공정 B는 ATF-2H 시스템 (Refine Technology)과 함께 ATF 흐름 모드에서 작동되는 0.2 μm 컷오프 중공 섬유 필터 (SpectrumLabs)가 있는 3L Applikon 용기에서 수행되어 세포를 유지했다. 배양은 6.0 mML-글루타민이 보충된 Excell Advanced CHO 배지 (시그마)에서 0.70-0.80 x106 세포/mL로 시작되었다. 5일째부터 배양 과정이 끝날 때까지 매일 약 10-100ppm의 소포제를 첨가했다. 기초 배지 (Excell Advanced CHO 배지, 시그마)의 관류는 1일부터 0.4VVD의 속도로 시작되었고, 속도는 4일에 1.5VVD로 증가되었다. 피드 배지 (CB7a/CB7b)의 관류는 5일부터 기초 배지의 2.0% 비율로 시작되었고 12일에 기초 배지의 9.0%로 증가했다. 18일째에는 피드 배지의 관류율이 7%로 감소하고, 19일부터 배양이 끝날 때까지 6%로 유지되었다. 4일째부터 배양이 끝날 때까지 기초 배지의 관류 속도는 1.5VVD로 유지되었다. 0.5VVM의 유속으로 산소를 전달하기 위해 마이크로스파저가 사용되었다. 온도는 5일째에 약 36.5°C에서 약 33.0°C로 감소되었고 배양이 종료될 때까지 33.0°C로 유지되었다. 세포 배양은 ATF를 통해 지속적으로 수확되었다. 전체 배양 과정에서 세포는 출혈없이 생물 반응기에 유지되었다.
관류 세포 배양 공정 C
관류 공정 C는 34.5 °C의 온도, 7.1과 6.7 사이의 pH 및 40% 공기 포화도의 DO를 제어하기 위해 델타 V 컨트롤러를 사용하여 탐색되었다. 공정 C는 ATF-2H 시스템 (Refine Technology)과 함께 ATF 흐름 모드에서 작동되는 0.2 μm 컷오프 중공 섬유 필터 (SpectrumLabs)가 있는 7L Applikon 용기에서 수행되어 세포를 유지했다. 배양은 6.0mML-글루타민 및 부가적인 2.5g/L 포도당이 보충된 Excell Advanced CHO 배지 (시그마)에서 약 0.50-0.60x106 세포/mL로 시작되었다. 4일째부터 매일 약 10-100ppm의 소포제를 첨가했다. 기초 배지 (Excell Advanced CHO 배지, 시그마)의 관류는 2일부터 0.5VVD의 속도로 시작되었고, 속도는 5일에 1.5VVD로 증가되었다. 피드 배지 (CB7a/CB7b)의 관류는 37일부터 기초 배지의 2.0% 비율로 시작되었고, 배양이 종료될 때까지 이 속도를 유지했다. 5일부터 배양이 끝날 때까지 기초 배지의 관류 속도는 1.5VVD로 유지되었다. 0.5VVM의 유속으로 산소를 전달하기 위해 마이크로스파저가 사용되었다. 전체 배양 과정에서 온도는 34.5°C로 설정되었다. 세포 배양은 ATF를 통해 지속적으로 수확되었다. 전체 배양 과정에서 VCD는 과도한 세포를 제거하기 위해 출혈을 통해 50.00x106 세포/mL로 표적화되었다.
도 14는 전통적인 유가식 공정 A에 비해 거의 7배인 공정 B에서 더 높은 피크 생존 세포 밀도가 달성됨을 보여준다. 공정 B는 동일한 배양 기간 동안 관류 공정 C에 비해 더 많은 바이오매스를 얻을 수 있다.
도 15는 14일의 기간을 갖는 전통적인 유가식 공정 A와 비교할 때 공정 B가 21일의 더 긴 기간 동안 더 높은 생존력을 유지할 수 있음을 보여준다.
도 16은 공정 B로부터의 누적 Pv가 공정 A 및 C에서개별적으로 최종 농도보다 대략 18.49배 및 1.39배 더 높다는 것을 보여준다.일일 작업량당 생산성으로 정의된 용량을 고려할 때 공정 B (2.48g/L/일)는 관류 공정 C (0.83g/L/일)보다 거의 3배 높다.
도 17은 상이한 포도당 제어 전략을 갖는 상이한 공정에서 상이한 포도당 프로파일이 제시됨을 보여준다.
도 18은 기하 급수적 성장기 동안의 전형적인 유산염 생산 기간에 이어지는 유산염 소비가 후속 배양 단계에서 유산염 농도가 상승하는 공정 A 및 C와 비교하여 공정 B에서 관찰됨을 보여준다.
실시예 4
이 실시예에서, 클론 Z를 사용하여, 강화된 관류 배양 공정 (B)의 성능을 전통적인 유가식 공정 (A)의 성능과 직접 비교하였다.
전통적인 유가식 공정 A:
전통적인 유가식 공정은 3L 규모로개발되었으며 최대 15L까지 확장되었다. 통적인 유가식 공정 A는 3L Applikon Vessel에서 2.0L 초기 작업 부피에서 실행되었다. 세포를 4mML-글루타민, 1% (v/v) 하이포크산틴 모노소듐 및 1% (v/v) 티미딘이 보충된 Actipro 배지 (하이클론)에 0.60x106개 세포/mL로 접종한 후 14일 동안 배양했다. 배양 동안, 0.30%, 0.50%, 0.50% 및 0.50% 사료 배지 CB7b와 결합된 3.00%, 5.00%, 5.00% 및 5.00% 사료 배지 CB7a를 3일, 5일, 7일 및 10일에개별적으로 공급 하였다. 5일차에 온도가 36.5°C에서 31.0°C로 감소되었다. 포도당 스톡 용액 400g/kg을 공급하여 포도당 농도를 1g/L 이상으로 유지했다.
강화된 관류 배양 공정 B:
공정 B는 3L 규모로개발되었으며, 15L 및 250L 규모로 확대되었다. 3L 규모 공정의 경우 1.5L 작업 부피를 3L Applikon 용기에서 배양했다. 15L 규모 공정을 위해 15L Applikon 용기에서 10L 작업 부피를 배양했다. 250L 규모의 경우 150L 작업 부피를 SUB 250L일회용 생물 반응기에서 배양했다. ATF 시스템 (Refine Technology)과 함께 ATF 흐름 모드에서 작동되는 0.2μm 중공 섬유 필터 (Spectrumlabs/Refine Technology)를 사용하여 세포를 유지했다. 공정 B는 약 36.5°C, 약 7.2 내지 6.8의 pH 범위 및 약 40% 공기 포화도 DO에서 온도를 제어하기 위해 델타 V 컨트롤러를 사용하여 수행되었다.
3L 규모 실험의 경우, 배양은 4mML-글루타민, 1% (v/v) 하이포크산틴 모노소듐 및 1% (v/v) 티미딘이 보충된 Actipro 배지 (하이클론)에서 1.10-1.30Х106 세포/mL로 시작되었다. 2일째부터 매일 약 10-100ppm의 소포제를 첨가했다. 기초 배지 (Actipro, 하이클론)의 관류는 2일부터 0.6VVD의 속도로 시작되었고 속도는 6일에 0.88VVD로 증가했다. 피드 배지 CB7a의 관류는 2일째부터 기초 배지의 6.7% 비율로 시작되었고 기초 배지의 15.9%로 증가했다. 피드 배지 CB7b의 관류는 2일부터 시작되었고 배양이 종료될 때까지 속도를 0.005VVD로 유지했다. 6일부터 배양이 끝날 때까지 기초 배지의 관류 속도는 0.88VVD로 유지되었다. 0.33 VVM의 유속으로 산소를 전달하기 위해 마이크로스파저가 사용되었다. 5일째에 온도를 36.5°C에서 31.0°C로 감소시켰고, 배양이 종료될 때까지 31.0°C를 유지했다. 세포 배양은 ATF를 통해 지속적으로 수확되었다. 전체 배양 과정에서 세포는 출혈없이 생물 반응기에 유지되었다.
250L 규모 실험의 경우, 배양은 4mML-글루타민, 1 % (v/v) 하이포크산틴 모노소듐 및 1 % (v/v) 티미딘이 보충된 Actipro 배지 (하이클론)에서 0.80 -1.40Х106 세포/mL로 시작되었다. 2일 후에 매일 약 10-100ppm의 소포제를 첨가했다. 기초 배지 (Actipro, 하이클론)의 관류는 2일부터 0.6VVD의 속도로 시작되었고, 속도는 6일에 0.88VVD로 증가했다. 피드 배지 CB7a의 관류는 2일째부터 기초 배지의 6.7% 비율로 시작되었고 기초 배지의 15.9%로 증가했다. 피드 배지 CB7b의 관류는 2일부터 시작되었고 배양이 종료될 때까지 속도를 0.005VVD로 유지했다. 6일부터 배양이 끝날 때까지 기초 배지의 관류 속도는 0.88VVD로 유지되었다. 마이크로 스파저를 사용하여 4일째부터 산소를 전달했다. 5일째에 온도를 36.5°C에서 31.0°C로 감소시켰고 배양이 끝날 때까지 31.0°C를 유지했다. 세포 배양은 ATF를 통해 지속적으로 수확되었다. 전체 배양 과정에서 세포는 출혈없이 생물 반응기에 유지되었다.
동일한 공정을 각각 15L 생물 반응기 및 250L 생물 반응기로 확장했다. 15L 생물 반응기에서의 배양을 위해, 세포를 유지하기 위한 2개의 ATF-2H 시스템 (Refine Technology)과 함께 ATF 흐름 모드에서 작동하는 0.2 μm 컷오프 중공 섬유 필터 (Spectrumlabs)를 사용했다. 250L 생물 반응기에서의 배양을 위해, 세포를 유지하기 위한 2개의 ATF-6 시스템 (Refine Technology)과 함께 ATF 흐름 모드에서 작동하는 0.2μm 컷오프 중공 섬유 필터 (Spectrumlabs)를 사용했다.
도 19는 동일한 3L 규모에서 전통적인 유가식 공정 A와 비교할 때, 공정 B에서 더 긴 지수 성장 단계와 거의 두 배 더 높은 최대 생존 세포 밀도가 입증되었음을 보여준다.
도 20은 동일한 3L 규모에서 공정 B가 14일 이전에는 공정 A와 유사한 세포 생존력을 유지할 수 있음을 보여준다.
도 21은 동일한 3L 규모에서 공정 B로부터의 누적 Pv가 전통적인 유가식 공정 A의 최종 농도보다 약 6.56 배 더 높다는 것을 보여준다.
도 22는 공정 A 및 B에 대한 포도당 농도 제어가 동일한 3L 규모에서 유사하다는 것을 보여준다.
도 23은 지수 성장기 동안의 전형적인 유산염 생산 기간에 이어 유산염 소비가 동일한 3L 규모로 공정 A 및 B 모두에서 관찰됨을 보여준다.
도 24는 전통적인 유가식 공정 A와 비교할 때 공정 B에서 더 긴 지수 성장 단계와 거의 두 배 더 높은 최대 생존 세포 밀도가 입증됨을 보여준다. 15L 및 250L 규모로 확장했을 때, 공정 B의 생존 세포 밀도 결과는 3L 규모와 비슷했다.
도 25는 공정 B가 공정 A와 유사한 세포 생존력을 유지할 수 있음을 보여준다. 15L 및 250L 규모까지 확장되었을 때 공정 B의 생존력 결과는 3L 규모와 비슷했다.
도 26은 공정 B의 세포 평균 직경이 전통적인 유가식 공정보다 더 컸음을 보여준다.
도 27은 포도당 제어 전략이 다르기 때문에 포도당 프로파일이 공정마다 다르다는 것을 보여준다.
도 28은 지수 성장기 동안의 전형적인 유산염 생산 기간에 이어 유산염 소비가 공정 A와 공정 B 모두에서 관찰된다는 것을 보여준다.
도 29는 공정 B의 암모늄 수준이 전통적인 유가식 공정보다 높았음을 보여준다.
도 30 및 31은 공정 A와 공정 B 모두에서 pH가 잘 조절되었고 공정이 확대됨에 따라 pH가 약간 낮았음을 보여준다.
도 32는 공정 B의 pCO2 프로파일이 동일한 규모에서 공정 A와 유사하다는 것을 보여준다. 그리고 공정이 확장됨에 따라 pCO2 수준이 증가한다.
도 33은 공정 B의 삼투압이 공정 A보다 약간 높았지만 400mOsm/Kg에서 잘 제어되었음을 보여준다.
도 34는 공정 B로부터의 누적 Pv가 전통적인 유가식 공정 A의 최종 농도보다 대략 4.5배 더 높다는 것을 보여준다. 다른 규모에서 공정 B의 누적 Pv는 모두 20g/L 이상에 도달했다.
도 35는 15L 규모 및 250L 규모에서 공정 B에 의해 생성된 응집체 및 단편의 비교를 보여준다. 두 규모에서 공정 B의 SEC 주요 피크는 비슷하다.
도 36은 공정 A 및 C와 비교하여 공정 B에서 달성된 산성 피크의 감소와 함께 cIEF 주요 피크를 보여준다.
다음으로, 강화된 관류 배양 공정 B로부터 물질의 직접 생성물 포획 공정에 대해 연속 공정을 평가하였다. 공정 B로부터의 수확된 재료는 7일부터 18일까지 수집되었고, 각각 7일 내지 10일, 10일 내지 13일, 13일 내지 16일, 및 16일 내지 18일 동안 4개의 백에 보관되었다. 연속 공정의 수율과 생산성을 계산하고 생성물 품질 속성, SEC 순도 및 HCP 함량도 평가했다.
연속 생성물 포획 공정:
연속 모드 크로마토그래피는 3개의 1.1/5.0cm (내경/베드 높이) 컬럼이 있는 BioSMB PD 시스템과 각각 15L 스케일 및 250L 스케일 3개의 10.0/5.2cm (내경/베드 높이) 컬럼이 있는 BioSMB 프로세스 공정에서 수행되었다. 두 컬럼 모두 MabSelect PrismA 수지로 포장되었다. 로드 단계 및 로드 후 세척 단계에서는 두개의 컬럼이 직렬로 연결되고 다른 단계에서는 하나의 단일 컬럼만 처리되었다. 이 두 흐름 경로는 BioSMB 시스템에서 병렬로 처리되었으며 자동으로 세개의 컬럼간에 전환되었다.
연속 공정의 로드 용량 및 체류 시간은 상이한 체류 시간 및 부하 농도에서 파단 곡선을 기반으로 계산되었다. 크로마토그래피 단계는 실온 (18-26°C)에서 수행되었다. 수율은 용출풀의 생성물양을 로딩풀의 생성물양으로 나눈 값을 기준으로 계산되었다. 용출풀의 농도는 280nm 파장에서 UV 흡광도로 측정한 반면, 로딩풀의 농도는 Protein A HPLC로 측정했다. 로딩 부피는 크로마토그래피 시스템의 부피 적산기에 의해 결정되는 반면, 용리풀 부피는 수집된 샘플의 순중량으로 결정되었다. 생산성은 가공품의 양을 가공 시간과 수지의 부피로 나눈 값으로 산출되었다.
용출풀을 pH5.5로 중화시킨 후, 용출 후 0.2㎛ PES 시린지 필터로 여과하였다. 중화된 풀의 SEC 순도 및 HCP 함량은 각각 CHO 세포용 SEC HPLC 및 상용 ELISA 키트에 의해 결정되었다. 이 두 실험의 수율 및 생성물 품질 속성 (SEC 순도, cIEF 순도 및 HCP 함량 포함)은 표 6에 요약되어 있다. 배양 시간 및 규모에 따른 일관된 수율 및 생성물 품질 속성 데이터는 강화된 관류 배양 공정 B가 강력하다는 것을 보여준다.
수확 시간 (Day) |
로드 용량
(mg/mL resin) |
SEC 순도 (%) |
HCP 함량
(ppm) |
cIEF(%) | 수율 (%) | |||||
모노머 | HMW | LMW | 타겟 | 기본 피크 | 메인 피크 | 산성 피크 | ||||
7 - 10 | 38 | 88.1 | 8.9 | 3.0 | 559 | 89.9 | 26.5 | 47.1 | 26.3 | 88.3 |
10 - 13 | 47 | 88.9 | 8.3 | 2.8 | 597 | 91.9 | 24.7 | 39.3 | 35.9 | |
92.0 | 4.2 | 3.8 | 209 | 90.5 | 19.3 | 32.6 | 48.0 | |||
13 - 16 | 48 | 90.2 | 7.8 | 2.0 | 722 | 94.7 | 28.1 | 43.3 | 28.6 | |
16 - 17 | 44 | 89.9 | 7.9 | 2.2 | 885 | 94.7 | 28.2 | 44.0 | 27.9 |
수확 시간 (Day) |
로드 용량
(mg/mL resin) |
SEC 순도 (%) |
HCP 함량
(ppm) |
cIEF(%) | 수율 (%) | |||||
모노머 | HMW | LMW | 타겟 | 기본 피크 | 메인 피크 | 산성 피크 | ||||
7 | 37 | 81.8 | 15.5 | 2.7 | 510 | 90.5 | 35.5 | 43.0 | 21.5 | 91.0 |
8 | 41 | 83.1 | 14.1 | 2.8 | 580 | 91.0 | 33.3 | 42.4 | 24.3 | |
9 | 37 | 86.0 | 11.6 | 2.4 | 753 | 91.8 | 32.2 | 40.0 | 27.8 | |
10 | 43 | 88.5 | 9.3 | 2.2 | 712 | 93.1 | 30.8 | 39.8 | 29.3 | |
11 | 46 | 89.3 | 8.7 | 2.1 | 756 | 94.8 | 31.2 | 40.3 | 28.5 | |
12 | 46 | 89.9 | 8.3 | 1.9 | 721 | 95.2 | 30.8 | 40.6 | 28.6 | |
13 | 44 | 90.3 | 7.7 | 2.0 | 698 | 96.1 | 29.4 | 39.3 | 31.3 | |
14 | 47 | 90.9 | 7.0 | 2.0 | 729 | 96.1 | 30.6 | 38.9 | 30.5 | |
15 | 47 | 90.5 | 7.4 | 2.1 | 710 | 96.3 | 30.5 | 39.2 | 30.3 | |
16 | 45 | 90.6 | 7.5 | 2.0 | 719 | 96.3 | 30.7 | 39.7 | 29.6 | |
17 | 44 | 89.7 | 8.3 | 2.0 | 841 | 96.6 | 32.1 | 40.3 | 27.7 |
Claims (50)
- 다음을 포함하는 생체 물질의 생산 방법:
(a) 세포 배양 배지 및 세포를 포함하는 세포 배양물을 배양하는 단계;
(b) 생물 반응기에서 기초 배지 및 피드 배지로 세포 배양물을 관류하는 단계; 및
(c) 생체 물질을 수확하는 단계,
상기 기초 배지 및 피드 배지는 상이한 속도로 세포 배양물에 공급되고, 세포 배양물은 분리 시스템을 통해 연속적으로 통과되고, 세포는 출혈없이 생물 반응기 내에 유지되는 것임. - 제1항에 있어서, 상기 분리 시스템은 교류 접선 흐름 (ATF) 장치 또는 접선 흐름 여과 (TFF) 장치인 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 분리 시스템은 중공 섬유 필터를 포함하는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 중공 섬유 필터의 분자량 컷오프 (MWCO)는 생체 물질의 분자량보다 큰 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 중공 섬유 필터의 기공 크기는 약 0.08μm 내지 약 0.5μm인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 중공 섬유 필터의 기공 크기는 약 0.1μm 내지 약 0.5μm인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 기공 크기는 약 0.2μm 또는 약 0.45μm인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기초 배지는 약 0.1 내지 약 2.0 작업 용적/1일 (VVD) 이하의 관류 속도로 공급되는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기초 배지는 약 0.1 내지 약 1.5 작업 용적/1일 (VVD)의 관류 속도로 공급되는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기초 배지는 약 0.3 내지 약 1.2 작업 용적/1일 (VVD)의 관류 속도로 공급되는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기초 배지는 약 0.5 내지 약 1.0 작업 용적/1일 (VVD)의 관류 속도로 공급되는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피드 배지의 관류는 기초 배지의 관류 속도의 약 0.1 내지 약 20% 범위의 속도인 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피드 배지의 관류는 기초 배지의 관류 속도의 약 1 내지 약 15% 범위의 속도인 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피드 배지의 관류는 기초 배지의 관류 속도의 약 1 내지 약 10% 범위의 속도인 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피드 배지의 관류는 기초 배지의 관류 속도의 약 1 내지 약 9% 범위의 속도인 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 약 35°C 내지 약 37°C의 범위에서 배양되는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 세포 배양물을 약 28°C 내지 약 33°C 범위의 온도로 온도 변화시키는 단계를 포함하는, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온도 변화는 미리 결정된 최대 생존 세포 밀도 (VCD)에 대한 응답인 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온도는 피크 VCD가 달성되기 전에 낮아지는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 소포제가 생물 반응기에 첨가되는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 소포제는 상기 소포제는 유성 소포제, 분말 소포제, 수성 소포제, 실리콘 기반 소포제, EO/PO 기반 소포제, 알킬 폴리아크릴레이트 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스파저 (microsparger)가 사용되는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 마이크로스파저는 약 0.2 내지 약 0.5VVM 범위의 유속으로 산소를 전달하는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포를 포함하는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 포유류 세포는 CHO (중국 햄스터 난소) 세포, 하이브리도마 (hybridomas), BHK (아기 햄스터 신장) 세포 또는 골수종 세포를 포함하는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 물질은 수용체, 효소, 융합 단백질, 혈액 단백질, 다기능 단백질, 바이러스 또는 박테리아 단백질 및 면역글로불린으로부터 선택되는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 혈액 단백질은 혈액 응고 캐스케이드에서 나오는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 다기능 단백질은 에리스로포이에틴 (erythropoietin)인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 바이러스 또는 박테리아 단백질은 백신에 사용되는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 면역글로불린은 항체 또는 다중 특이적 항체인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 항체는 IgG 또는 IgM인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 다중 특이적 항체는 이중 특이적 항체인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 약 10g/L 이상의 누적 부피 생산성 (Pv)을 달성하는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 약 15g/L 이상의 누적 부피 생산성 (Pv)을 달성하는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 약 20g/L 이상의 누적 부피 생산성 (Pv)을 달성하는 것인, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해 수확된 생체 물질을 연속 생성물 포획 공정에 적용하는 단계를 포함하는, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 적어도 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수확된 생체 물질을 연속 생성물 포획 공정에 적용하는 단계를 포함하는, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 2 내지 16개의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수확된 생체 물질을 연속 생성물 포획 공정에 적용하는 단계를 포함하는, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 3 내지 8개의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수확된 생체 물질을 연속 생성물 포획 공정에 적용하는 단계를 포함하는, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 적어도 3개 이상의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수확된 생체 물질을 연속 생성물 포획 공정에 적용하는 단계를 포함하는, 생체 물질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 의해 생성된 생체 물질.
- 다음을 포함하는 생체 물질을 생산하기 위한 시스템:
(a) 생물 반응기에서 기초 배지 및 피드 배지로 세포 배양물을 관류하기 위한 모듈; 및
(b) 생체 물질의 분자량보다 큰 기공 크기 또는 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는 중공 섬유 필터를 포함하는, 생체 물질을 연속적으로 수확하기 위한 모듈. - 제42항에 있어서, 추가적으로 수확된 물질로부터 생체 물질의 연속 포획을 위한 모듈을 포함하는, 생체 물질을 생산하기 위한 시스템.
- 제42항에 있어서, 상기 생체 물질을 연속적으로 수확하기 위한 모듈은 교류 접선 흐름 (ATF) 장치 또는 접선 흐름 여과 (TFF) 장치인, 생체 물질을 생산하기 위한 시스템.
- 제42항에 있어서, 상기 기초 배지 및 피드 배지는 서로 다른 속도로 공급되는 것인, 생체 물질을 생산하기 위한 시스템.
- 제42항에 있어서, 상기 중공 섬유 필터의 기공 크기는 약 0.08μm 내지 0.5μm인, 생체 물질을 생산하기 위한 시스템.
- 제42항에 있어서, 상기 중공 섬유 필터의 기공 크기는 약 0.1μm 내지 0.5μm인, 생체 물질을 생산하기 위한 시스템.
- 제42항에 있어서, 상기 중공 섬유 필터의 기공 크기는 약 0.2μm 인, 생체 물질을 생산하기 위한 시스템.
- 제42항에 있어서, 상기 중공 섬유 필터의 기공 크기는 약 0.45μm 인, 생체 물질을 생산하기 위한 시스템.
- 제42항에 있어서, 추가적으로 세포 배양용 생물 반응기 및/또는 마이크로스파저를 추가로 포함하는, 생체 물질을 생산하기 위한 시스템.
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