TWI777364B - 連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的設備和方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露涉及連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的設備和方法。更具體地，本揭露涉及利用2套過濾孔徑不同的過濾器來連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的設備和方法。

Description

連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的設備和方法
本揭露涉及連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的設備和方法。更具體地，本揭露涉及利用2套過濾孔徑不同的過濾器來連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的設備和方法。
傳統灌流培養(TPC)及加強型灌流培養(IPC)需向培養體系中連續灌流新鮮培養基(補給培養基)來維持細胞的生長及生物物質的生產。但是，由於收穫速率與灌流速率通常相等，導致收穫液中目的產物濃度較低且收穫體積較大，這給下游純化帶去壓力，並且需要大尺寸的罐來儲存收穫細胞培養液，導致設備和土地成本增大。而且，長週期、高流量的收穫操作易造成中空纖維過濾器堵塞，這會導致目的產物也被截留在培養體系中，而中空纖維過濾器的更換會增加生產成本、操作複雜性以及汙染風險。
因此，為了解決上述以往培養方法中存在的問題，本發明人開發了既能應用於穩定的生物物質的生產，又能應用於不穩定的生物物質的生產的新的生物物質收穫設備和方法。
一方面，本揭露提供了連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的設備(下文中也稱為“本揭露的設備”)，其包括： (a)過濾器1，其為至少一個過濾器，其過濾孔徑不允許該細胞通過該過濾器，但允許該生物物質通過該過濾器，以及(b)過濾器2，其為至少一個過濾器，其過濾孔徑不允許該細胞和該生物物質通過該過濾器，但保持該過濾器流體流通，其中該過濾器1和該過濾器2以並聯方式與培養該細胞的設備流體連通。
在本揭露的設備的一個實施方式中，過濾器1和過濾器2藉由下列方式與該培養該細胞的設備流體連通：(a)各自直接，(b)經由分支管，或(c)(a)和(b)的組合。
在本揭露的設備的一些實施方式中，過濾器1的過濾孔徑為約0.08μm~0.5μm，較佳為約0.1μm~0.4μm，更佳為約0.2μm。在本揭露的設備的一些實施方式中，過濾器2的分子量截留值(MWCO)是50kD以下。
在本揭露的設備的一些實施方式中，本揭露的裝置還包括用於調節過濾器1的過濾速率的裝置和/或用於調節過濾器2的過濾速率的裝置。
在本揭露的設備的一些實施方式中，該過濾器1和該過濾器2之一或兩者是交替切向流(ATF)過濾器或切向流過濾(TTF)過濾器。在本揭露的設備的進一步實施方式中，該過濾器1和該過濾器2之一或兩者是中空纖維過濾器。
在本揭露的設備的一些實施方式中，該過濾器1的數量是1個、2個、3個或更多，和/或該過濾器2的數量是1個、2個、3個或更多。
在另一方面，本揭露提供了生產生物物質的系統(下文中也稱為“本揭露的系統”)，其包括：(a)培養細胞的設備，其用基礎培養基和補給培養基以灌流方式培養該細胞；和 (b)本揭露的設備。
在本揭露的系統的一些實施方式中，該系統還包括用於從由本揭露的設備收穫的物質中連續捕獲生物物質的設備。
在本揭露的系統的一些實施方式中，該系統還包括微噴霧器。
在另一方面，本揭露提供了連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的方法，其由本揭露的設備進行。在進一步方面，本揭露提供了生產生物物質的方法，其由本揭露的系統進行。上述兩種方法在下文中也稱為“本揭露的方法”。
在本揭露的方法的一些實施方式中，細胞包括哺乳動物細胞。在本揭露的方法的一個實施方式中，哺乳動物細胞包括CHO(中國倉鼠卵巢)細胞，雜交瘤，BHK(幼倉鼠腎)細胞或骨髓瘤細胞。
在本揭露的方法的一些實施方式中，生物物質選自受體，酶，融合蛋白，血液蛋白，多功能蛋白，病毒或細菌蛋白和免疫球蛋白。在本揭露的方法的一個實施方式中，該血液蛋白來自凝血級聯反應。在本揭露的方法的一個實施方式中，多功能蛋白質是促紅細胞生成素。在本揭露的方法的一個實施方式中，病毒或細菌蛋白被用於疫苗中。在本揭露的方法的一個實施方式中，免疫球蛋白是抗體或多特異性抗體。在本揭露的方法的一個實施方式中，抗體是IgG或IgM。在本揭露的方法的一個實施方式中，多特異性抗體是雙特異性抗體。
一．定義
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本揭露所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。本文引用的所有專利，申請，揭露的申請和其他出版物均藉由引用全文併入。如果本節中提出的定義與藉由引用併入本文的專利，申請，揭露的申請和其他出版物中 提出的定義相反或相反，則本節中提出的定義優先於以下部分：藉由引用併入本文。
如本文所用，除非另外指出，否則單數形式“一個”，“一種”和“該”包括複數形式。例如，“一種”生物物質包括一種或多種生物物質。
本文所用的“生物反應器”是可以包含細胞培養物的系統，該細胞培養物依次包括細胞和細胞培養基。在一些實施方式中，其提供無菌屏障，例如空氣過濾器，以防止其他細胞汙染所需細胞。在一些實施方式中，它藉由提供合適的培養條件如混合，溫度，pH，氧濃度等為細胞維持了有利的環境。
“細胞培養”或“培養”是指細胞在多細胞生物或組織外部的生長和繁殖。“細胞培養物”包括包含細胞培養基，細胞和生物物質的液體，該液體是用於在細胞培養基中的反應器中培養細胞的過程的結果，其中細胞產生生物物質。哺乳動物細胞的合適培養條件是本領域已知的。參見例如Animal cell culture：A Practical Approach,D.Rickwood,ed.,Oxford University Press,New York(1992)。哺乳動物細胞可以懸浮培養或附著在固體基質上培養。
“細胞”是指產生感興趣的生物物質的細胞，例如能夠表達編碼產物的基因的細胞。例如，可以藉由用含有編碼細胞產物的基因和編碼合適的選擇標記的基因的質粒轉染細胞來製備能夠表達編碼產物的基因的細胞。原則上，可用於產生產物的細胞是本領域技術人員已知的所有具有產生生物產物能力的細胞。該細胞可以是動物細胞，特別是哺乳動物細胞。哺乳動物細胞的例子包括CHO(中國倉鼠卵巢)細胞，雜交瘤，BHK(幼倉鼠腎)細胞，骨髓瘤細胞，人細胞，例如HEK-293細胞，人淋巴母細胞，E1永生化HER細胞，小鼠細胞，例如NS0細胞。
如本文所用，術語“細胞培養基(cell culturing medium)”(也稱為“培養基(culture medium)”或“細胞培養基(cell culture media)”)是指用於生長細胞(例如動物或哺乳動物細胞)的任何營養液，並且通常提供至少一種或多種下列成分：能源(通常為碳水化合物，如葡萄糖的形式)；所有必需氨基酸中的一種或多種，通常是二十種鹼性氨基酸，再加上半胱氨酸；通常需要低濃度的維生素和/或其他有機化合物；脂質或游離脂肪酸；痕量元素，例如無機化合物或天然存在的元素，通常以極低的濃度(通常在微摩爾範圍內)需要。
“基礎細胞培養基”是指通常用於起始細胞培養並且足夠完整以支持細胞培養的細胞培養基。可以利用市售的基礎培養基，包括但不限於CD OptiCHO AGT(Invitrogen)，CD CHO AGT(Invitrogen)，Dynamis AGT培養基(Invitrogen)，SFM4CHO ADCF(Hyclone)，HyCell CHO培養基(Hyclone)，CDM4MAB(Hyclone)，DPM Hyclone ActiPro(Hyclone)，高級CHO補給分批培養基(Sigma)。
“補給”細胞培養基或補給培養基是指通常在指數生長的時期(“生長階段”)中用於細胞培養的細胞培養基，並且在該階段中足夠完整以支持細胞培養。生長細胞培養基還可包含一種或多種選擇劑，這些選擇劑賦予摻入宿主細胞系的選擇標記抗性或存活性。這樣的選擇劑包括但不限於遺傳黴素(G4118)，新黴素，潮黴素B，嘌呤黴素，zeocin，蛋氨酸亞磺醯亞胺，甲氨蝶呤，無穀氨醯胺的細胞培養基，缺少甘氨酸的細胞培養基，次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，或單獨的胸苷。可以利用市售的補給培養基，包括但不限於CHO CD Efficient Feed A(Invitrogen)，CHO CD Efficient Feed B(Invitrogen)，CHO CD Efficient Feed C(Invitrogen)，Sheff-CHO PLUS PF ACF(FM012)(Kerry)，CHO CD Efficient Feed A+(Invitrogen)， CHO CD Efficient Feed B+(Invitrogen)，CHO CD Efficient Feed C+(Invitrogen)，DPM-Cell Boost 7a(Hyclone)，DPM-Cell Boost 7b(Hyclone)或FAA01A(Hyclone)。
在某些實施方式中，細胞培養基是無血清的和/或無動物來源的產品或成分。在某些實施方式中，化學定義細胞培養基，其中所有化學成分都是已知的。如本領域技術人員使用常規技術所公知和實踐的那樣，可以利用可商購的介質，並且可以根據需要或期望以適當的濃度或量添加補充組分或成分，包括任選的組分，包括任選的組分。
在本揭露的上下文中，術語“產品”，“生物物質(biologic)”和“生物物質(biological substance)”是可互換的。細胞可以產生的產物，例如藉由表達編碼(重組)基因的產物，因此是(重組)蛋白質，特別是受體，酶，融合蛋白，血液蛋白質，例如來自凝血級聯的蛋白質，多功能用於疫苗的蛋白質，例如促紅細胞生成素，病毒或細菌蛋白質；免疫球蛋白，例如抗體，例如IgG或IgM，多特異性抗體，例如雙特異性抗體等。細胞較佳產生蛋白質，更佳產生抗體。
術語“抗體”包括指任何同種型或亞類的糖基化和非糖基化的免疫球蛋白，或與完整抗體競爭特異性結合的其抗原結合區，除非另有說明，包括人，人源化，嵌合，多特異性，單植株，多植株和寡聚體或其抗原結合片段。還包括具有抗原結合片段或區域的蛋白質，例如Fab，Fab'，F(ab')2，Fv，雙抗體，Fd，dAb，最大抗體，單鏈抗體分子，互補決定區(CDR)片段，scFv，包含至少一部分免疫球蛋白的雙抗體，三抗體，四抗體和多肽，該免疫球蛋白足以賦予特異性抗原結合至靶多肽。術語“抗體”包括但不限於藉由重組方式製備，表達，產生或分離的那些，例如從轉染以表達該抗體的宿主細胞中分離的抗體。
抗體的實例包括但不限於識別任何一種蛋白質或蛋白質組合的抗體，包括但不限於上述蛋白質和/或以下抗原：CD2，CD3，CD4，CD8，CD11a，CD14，CD18，CD20，CD22，CD23，CD25，CD33，CD40，CD44，CD52，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD147，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-7，IL-4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-2受體，IL-4受體，IL-6受體，IL-13受體，IL-18受體亞基，FGL2，PDGF-β及其類似物(參見美國專利號5,272,064和5,149,792)，VEGF，TGF，TGF-β2，TGF-β1，EGF受體(參見美國專利號6,235,883)，VEGF受體，肝細胞生長因子，骨保護素配體，干擾素γ，B淋巴細胞刺激物(BlyS，也稱為BAFF，THANK，TALL-1和zTNF4；請參閱Do和Chen-Kiang(2002)，Cytokine Growth Factor Rev.13(1)：19-25)，C5補體，IgE，腫瘤抗原CA125，腫瘤抗原MUC1，PEM抗原，LCG(與lun結合表達的基因產物癌)，HER-2，HER-3，腫瘤相關糖蛋白TAG-72，SK-1抗原，腫瘤相關表位在結腸癌和/或胰腺癌患者血清中的含量較高，在乳腺癌，結腸癌，鱗狀細胞，前列腺癌，胰腺癌，肺癌和/或腎癌細胞和/或黑色素瘤，神經膠質瘤或神經母細胞瘤細胞(腫瘤的壞死核心)上表達的與癌症相關的抗原決定簇或蛋白，整聯蛋白α4 beta 7，整合素VLA-4，B2整合素，TRAIL受體1、2、3和4，RANK，RANK配體，TNF-α，黏附分子VAP-1，上皮細胞黏附分子(EpCAM)，細胞間黏附分子-3(ICAM-3)，白細胞整合素粘附素，血小板糖蛋白gp IIb/IIIa，心肌肌球蛋白重鏈，甲狀旁腺激素，rNAPc2(是VIIa因子組織因子的抑制劑)，MHC I，癌胚抗原(CEA)，α-甲胎蛋白(AFP)，腫瘤壞死因子(TNF)，CTLA-4(一種細胞毒性T淋巴細胞相關抗原)，Fc-γ-1受體tor，HLA-DR 10 beta，HLA-DR抗原，硬化蛋白，L-選擇素，呼吸道神經炎病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，乙型肝炎病毒(HBV)，變形鏈球菌和金黃色葡萄球菌。可以使用本揭露內容 的方法產生的已知抗體的具體實例包括但不限於阿達木單抗，貝伐單抗，英夫利昔單抗，阿昔單抗，阿來珠單抗，巴比單抗，巴利西單抗，貝利單抗，briakinumab，canakinumab，certolizumab pegol，西妥昔單抗，conatum依庫珠單抗，吉妥珠單抗奧佐米星，戈利木單抗，替伊莫單抗，labetuzumab，馬帕木單抗，馬妥珠單抗，美泊利單抗，莫維珠單抗，莫羅單抗-CD3，那他珠單抗，尼妥珠單抗，奧法木單抗，奧馬珠單抗，奧戈伏單抗，帕利珠單抗，帕尼單抗，pemtumomab，帕妥珠單抗，雷珠單抗，利妥昔單抗，rovelizumab，托珠單抗，Tositumomab，trastuzumab，ustekinumab，vedolizomab，zalutumumab和zanolimumab。
在一些實施方式中，細胞生產的產物例如蛋白質或疫苗可用作藥物製劑中的活性成分。產品的非限制性實例包括：抗hTNFα(阿達木單抗(Humira))，靶向VEGF的融合蛋白(Aflibercept(EYLEA))，促紅細胞生成素α(Epogen®)，成淋巴細胞樣干擾素α-n1(Wellferon)，(重組)凝血因子(NovoSeven)，Etanercept(Enbrel)，曲妥珠單抗(Herceptin)，Infliximab(Remicade)，Basiliximab(Simulect)，Daclizumab(Zenapaz)，(重組)凝血因子IX(Benefix)，葡萄糖腦苷脂酶(660)，葡糖腦苷脂酶(709)，G-CSF(Neupogen®Filgrastim)，干擾素α-2b(Infergen®)，重組胰島素(Humulin®)，干擾素beta 1 a(Avonex®)，凝血因子VIII(KoGENate®)，替奈普酶(TNKase)，(重組)抗凝血酶TNFα受體(Enbrel®)，促卵泡激素(Gonal-F®)，Mab abcixmab(Synagis®，ReoPro®)，Mab ritiximab(Rituxan®)，組織纖溶酶原激活劑(Act ivase ®，Actilyase®)，人類生長激素(Protropin®，Norditropin ®，GenoTropin)。此外，術語“抗體構建體”的定義包括單價，二價和多價/多價構建體，因此，僅與兩個抗原結構特異性結合的雙特異性構建體，以及與兩種以上，例如三個，四個 或更多抗原性特異性結構藉由不同的結合域結合的多特異性/多特異性構建體。此外，術語“抗體構建體”的定義包括僅由一條多肽鏈組成的分子以及由多於一條多肽鏈組成的分子，這些鏈可以相同(同二聚體，同三聚體或同低聚體)或不同(異二聚體，異三聚體或雜聚體)。上述鑒定的抗體及其變體或衍生物的實例記載在Harlow和Lane的Antibodies a laboratory manual,CSHL Press(1988)和Using Antibodies：a laboratory manual,CSHL Press(1999)，Kontermann和Dubel的Antibody Engineering,Springer,2nd ed.2010年和Little，Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press 2009。
如本文所用，術語“多肽”是指由藉由醯胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術語“多肽”是指兩個或更多個氨基酸的任何鏈，並且不指產物的特定長度。因此，在“多肽”的定義中包括肽，二肽，三肽，寡肽，“蛋白質”，“氨基酸鏈”或用於指代兩個或多個氨基酸鏈的任何其他術語。可以使用“多肽”代替這些術語中的任何術語或與它們互換使用。術語“多肽”還旨在指多肽的表達後修飾的產物，包括但不限於糖基化，乙醯化，磷酸化，醯胺化，藉由已知的保護/封閉基團衍生化，蛋白水解或非天然修飾出現的氨基酸。多肽可以源自天然生物來源或藉由重組技術產生，但不一定從指定的核酸序列翻譯而來。它可以以任何方式產生，包括藉由化學合成。本發明的多肽的大小可以為約3或更大、5或更大、10或更大、20或更大、25或更大、50或更大、75或更大、100或更大、200或更大、500或更大、1,000或更多或2,000或更多的氨基酸。多肽可以具有定義的三維結構，儘管它們不一定具有這種結構。具有確定的三維結構的多肽被稱為折疊的，不具有確定的三維結構但可以採用大量不同構象的多肽被稱為未折疊的。
術語“微噴霧器”通常是指被配置為向生物反應器罐內的細胞培養物提供氧氣和/或其他氣體的噴霧器。曝氣器或微噴霧器可以與氧氣或其他氣體源耦合，並且可以將氣體引導至細胞培養物，從而使細胞培養物中的氣泡充氣，從而使細胞培養物充氣。在一些示例中，微噴射器可以與鑽管噴射器結合使用。
如本文所述製備的生物製劑可以藉由本領域已知的技術純化，例如高效液相色譜法，離子交換色譜法，凝膠電泳，親和色譜法，尺寸排阻色譜法(SEC)等。用於純化特定蛋白質的實際條件將部分取決於諸如淨電荷，疏水性，親水性等因素，並且對本領域技術人員而言是顯而易見的。對於親和層析純化，可以使用生物結合的抗體，配體，受體或抗原。例如，對於本揭露的生物製劑(例如，免疫綴合物)的親和層析純化，可以使用具有蛋白質A或蛋白質G的基質。順序蛋白A或G親和層析和尺寸排阻層析可用於分離生物的，例如免疫綴合物，如實施例中所述。生物製劑(例如免疫綴合物)的純度可以藉由多種眾所周知的分析方法中的任一種來確定，包括凝膠電泳，高壓液相色譜法和類似方法。
在本揭露中，術語“收穫速率”是指培養產物通過過濾器1(其為至少一個過濾器，其過濾孔徑不允許該細胞通過該過濾器，但允許生物物質通過過濾器)的速率。
二．連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的設備和方法
在各種實施方式中，由培養的細胞生產的生物物質藉由本揭露的設備連續地收穫。任何類型的過濾器都可以用作本揭露的設備，只要2套過濾器之一(如過濾器1)的過濾孔徑不允許該細胞通過該過濾器，但是允許該生物物質通過該過濾器，而另一套過濾器(如過濾器2)的過濾孔徑不允許細胞和生物物質兩者通過，但保持該過濾器流體流通，其中過濾器1和過 濾器2以並聯方式與培養該細胞的設備流體連接。在一個實施方式中，過濾器1和過濾器2各自直接與該培養該細胞的設備流體連通。在另一個實施方式中，過濾器1和過濾器2經由分支管與該培養該細胞的設備流體連通。在一些實施方式中，過濾器1的過濾孔徑為約0.08μm~0.5μm，較佳為約0.1μm~0.4μm，更佳為約0.2μm。在一些實施方式中，過濾器2的分子量截留值(MWCO)是50kD以下，45kD以下，40kD以下，35kD以下，30kD以下，25kD以下，20kD以下等。以孔徑表示的孔尺寸(μm)和以分子量截留值表示的孔尺寸(kD)之間的近似對應關係如下。
Figure 110101223-A0305-02-0012-1
得益於過濾器2的分流作用，藉由過濾器1的流量降低，由此可有效減緩甚至避免過濾器1的堵塞風險，從而延長過濾器1的使用壽命。
由於藉由過濾器2去除了收穫物中的部分廢液，可有效減小收穫液的體積，由此可有效減小儲存設備的體積及存放空間。
由於藉由過濾器2去除了收穫物中的部分廢液，可有效濃縮所收穫的目的生物物質，由此可有效降低其下游純化負擔。
由於過濾器2可將一些有利於維持細胞活力的小分子生物物質(如PF68)保留在培養系統中，從而可提高培養系統中的活細胞密度(VCD)、延長培養週期、提高批次產量。
在本揭露的裝置的一些實施方式中，本揭露的裝置還包括用於調節過濾器1的過濾速率的裝置和/或用於調節過濾器2的過濾速率的裝置。得益於這樣的裝置，可根據需要調節通過過濾器1和過濾器2的細胞培養物的流量比，從而可以將收穫液中的生物物質濃縮至期望的程度。
細胞培養物在過濾器上的循環是基本上平行於過濾器表面的流，也稱為切向流，例如單向切向流過濾(TFF)或交叉流。交叉流的一個較佳示例是交替切向流(ATF)，就像使用ATF一樣，發現即使在非常高的細胞密度下，也不會(迅速)發生過濾器堵塞。“交替切向流”是指在與過濾器表面相同的方向上(即與過濾器表面相切的方向)來回流動，而在基本上垂直於該過濾器表面的方向上存在另一種流動。可以根據本領域技術人員已知的方法來實現交替的切向流(例如，如美國專利No.6,544,424所述，其全部內容藉由引用合併於此)。
適用於本揭露的過濾器的非限制性示例包括膜過濾器，陶瓷過濾器和金屬過濾器。過濾器可以以任何形狀使用。過濾器可以例如是螺旋纏繞的或管狀的，或可以以片的形式使用。在各種實施方式中，所使用的過濾器是膜過濾器。在至少一個實施方式中，過濾器是中空纖維過濾器。包含中空纖維的過濾器設備可從例如Refine Technology商業獲得。
在本揭露的設備的一些實施方式中，該過濾器1的數量是1個、2個、3個或更多，和/或該過濾器2的數量是1個、2個、3個或更多。
在另一方面，本揭露提供了連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的方法，其由如上所述的本揭露的設備進行。
三．生產生物物質的系統和方法
本揭露提供了生產生物物質的系統，其包括：(a)培養細胞的設備，其用基礎培養基和補給培養基以灌流方式培養該細胞；和(b)如上所述的本揭露的設備。
“灌流”培養過程是其中細胞培養物接受新鮮培養基的添加，並且用過的培養基從生物反應器中去除的過程。灌流可以是連續的，逐步的，間斷的或任何這些或全部的組合。
在各種實施方式中，藉由在生物反應器中接種表達感興趣的生物物質的細胞來建立細胞培養物。藉由補給基礎培養基和補給培養基來維持細胞培養。
向培養物中添加細胞培養基的速率可能影響細胞的活力和密度。術語“活細胞密度(VCD)”是指在給定體積的培養基中的活細胞數量，藉由標準活力測定法(例如錐蟲藍染料排除法)確定。
在本揭露的至少一個實施方式中，在本揭露的方法中使用微噴霧器。在本揭露的另一個實施方式中，當所需氧氣流速達到約0.5VVM時使用微噴霧器。在本揭露中，微噴霧器的實施減輕了由培養期間氣泡破裂引起的細胞損傷。
在另一方面，本揭露提供了生產生物物質的方法，其由如上所述的本揭露的系統進行。
ATF:交替切向流
PV:累積體積生產率
VCD:活細胞密度
圖1a是根據本揭露的至少一個實施方式的培養系統的示意圖。圖1b是根據本揭露的至少一個實施方式的培養系統的示意圖。
圖2顯示了製程1和製程2的活細胞密度(106/mL)與處理時間(天)的關係圖。
圖3顯示了製程1和製程2的細胞活力(%)與處理時間(天)的關係。
圖4顯示了製程1和製程2的細胞平均直徑(μm)與處理時間(天)的關係。
圖5顯示了製程1和製程2的培養物中的葡萄糖濃度(g/L)與處理時間(天)的關係。
圖6顯示了製程1和製程2的培養物中的乳酸濃度(g/L)與處理時間(天)的關係。
圖7顯示了製程1和製程2的收穫物中重組蛋白滴度(g/L)與處理時間(天)的關係。
圖8顯示了製程1和製程2的累積體積生產率(Pv)(g/L)與處理時間(天)的關係。
圖9顯示了製程1和製程2的重組蛋白截留率(%)與處理時間(天)的關係。
圖10比較了製程A和製程B中達到的峰值活細胞密度。
圖11比較了製程A和製程B中達到的細胞活力。
圖12比較了製程A和製程B中達到的細胞平均直徑。
圖13比較了製程A和製程B中達到的培養物中的葡萄糖濃度。
圖14比較了製程A和製程B中達到的培養物中的乳酸濃度。
圖15比較了製程A和製程B中達到的收穫物中重組蛋白滴度。
圖16比較了製程A和製程B中達到的累積體積生產率(Pv)。
圖17比較了製程A和製程B中達到的重組蛋白截留率。
藉由參考以下實施例，將更容易地理解如此總體上描述的本揭露，這些實施例是藉由舉例的方式提供的，並且不旨在限制本揭露。
[細胞系和培養條件]
CHO-K1宿主細胞購自ATCC(ATCC編號：CCL 61)，將小瓶解凍，生成100個主細胞庫(MCB)的小瓶，然後生成136個工作細胞庫(WCB) 的小瓶。然後將WCB小瓶解凍，並用無血清培養基進行懸浮培養。用適合懸浮液的複製CHO-K1-A4生成60瓶PCB，170瓶MCB和230瓶WCB。解凍一個CHO-K1宿主細胞CHO-K1-A4的WCB小瓶以穩定轉染。
將美國專利No.6,090,382中揭露的表達抗hTNFα抗體的cDNA序列複製到兩個載體中，它們分別包含Blasticidin和Zeocin抗性標記。使用脂質體進行穩定的轉染。轉染後，將細胞傳至選擇性培養基(含有9μg/mL Blasticidin和400μg/mL Zeocin的CD CHO培養基)中進行細胞選擇。在選擇細胞約2週後，藉由FACS分選法複製細胞。藉由在離心管中分批補給培養篩選植株。選擇了一個高產植株，命名為植株X。
[實施例1]
在本實施例中，使用植株X，評估了用本揭露的裝置和方法(但用不同的收穫速率)進行的加強型灌流培養(IPC)製程(製程1和製程2)的性能。
[製程1]
在7L Applikon容器中使用δV控制器將溫度控制在36.5℃，將pH範圍控制在7.2~6.8之間，將DO控制在40%的空氣飽和度下而進行製程1。使用以ATF-2H系統(Refine Technology)在ATF流動模式下運行的截留值為0.2μm的中空纖維過濾器(過濾器1)(Spectrum labs)保留細胞。使用以ATF-2H系統(Refine Technology)在ATF流動模式下運行的截留值為50kD(約0.008μm)的中空纖維過濾器(過濾器2)(Spectrum labs)保留細胞和重組蛋白。該過濾器1和過濾器2經由分支管以並聯方式與Applikon容器流體連通。
在補充有6.0mM L-穀氨醯胺的Excell Advanced CHO補給分批培養基(Sigma)中以0.90~1.10×106細胞/mL的初始VCD開始培養。從第0天起 每天添加約10~100ppm消泡劑。從第1天開始以0.4VVD的速率灌流基礎培養基(Excell Advanced CHO Fed分批培養基，Sigma)，並在第3天增加至1.5VVD。從第4天開始灌流補給培養基(CB7a/CB7b)，每天調整其速率以維持最低葡萄糖濃度高於2.0g/L。從第3天到培養結束，灌流速率保持在1.5VVD。當所需氧氣流量達到0.5VVM時，使用微噴霧器。在第5天將溫度從36.5℃轉變為31.0℃，並保持在31.0℃直到培養終止。
為了進行濃縮的連續收穫，連續地收集通過過濾器1的濾液(含重組蛋白(即收穫物))。同時，棄去通過過濾器2的沒有重組蛋白的濾液，以保持恆定的工作體積。在第13天之前，收穫速率等於灌流速率，在第13天之後，收穫速率降至灌流速率的三分之一。在整個培養過程中，細胞保留在生物反應器中而不流出。
[製程2]
在7L Applikon容器中使用δV控制器將溫度控制在36.5℃，將pH範圍控制在7.2~6.8之間，將DO控制在40%的空氣飽和度下而進行製程2。使用以ATF-2H系統(Refine Technology)在ATF流動模式下運行的截留值為0.2μm的中空纖維過濾器(過濾器1)(Spectrum labs)保留細胞。使用以ATF-2H系統(Refine Technology)在ATF流動模式下運行的截留值為50kD(約0.008μm)的中空纖維過濾器(過濾器2)(Spectrum labs)保留細胞和重組蛋白。該過濾器1和過濾器2經由分支管以並聯方式與Applikon容器流體連通。
在補充有6.0mM L-穀氨醯胺的Excell Advanced CHO補給分批培養基(Sigma)中以0.90~1.10×106細胞/mL的初始VCD開始培養。從第0天起每天添加約10~100ppm消泡劑。從第1天開始以0.4VVD的速率灌流基礎培養基(Excell Advanced CHO Fed分批培養基，Sigma)，並在第3天增加 至1.5VVD。從第4天開始灌流補給培養基(CB7a/CB7b)，每天調整其速率以維持最低葡萄糖濃度高於2.0g/L。從第3天到培養結束，灌流速率保持在1.5VVD。當所需氧氣流量達到0.5VVM時，使用微噴霧器。在第5天將溫度從36.5℃轉變為31.0℃，並保持在31.0℃直到培養終止。
為了進行濃縮的連續收穫，連續地收集通過過濾器1的濾液(含重組蛋白(即收穫物))。同時，棄去通過過濾器2的沒有重組蛋白的濾液，以保持恆定的工作體積。在第13天之前，收穫速率是灌流速率的三分之一，從第13天到第17天，收穫速率等於灌流速率，在第17天之後，收穫速率降至灌流速率的三分之一。在整個培養過程中，細胞保留在生物反應器中而不流出。
[製程1和製程2之間的比較]
圖2顯示，在濃縮收穫的製程(第13天之後的製程1和第13天之前的製程2)中獲得了更高的峰值活細胞密度。
圖3顯示，在濃縮收穫的製程(第13天之後的製程1和第13天之前的製程2)中，細胞的活力保持較高。
圖4顯示，製程1和製程2中的細胞平均直徑相當。
圖5顯示，製程1和製程2中的葡萄糖濃度相當。
圖6顯示，在任一製程中均未觀察到明顯的乳酸生產或積累問題。
圖7顯示，在濃縮收穫的製程(第13天之後的製程1和第13天之前的製程2)中收穫物中重組蛋白滴度明顯更高。
圖8顯示，在濃縮收穫的製程(第13天之後的製程1和第13天之前的製程2)中，累積體積生產率(Pv)略低。
圖9顯示，在濃縮收穫的製程(第13天之後的製程1和第13天之前的製程2)中，重組蛋白截留率顯著更低。
[實施例2]
在本實施例中，使用植株X，比較了用現有技術的裝置和方法進行的IPC製程(製程A)與用本揭露的裝置和方法進行的IPC製程(製程B)的性能。
[製程A]
在7L Applikon容器中使用δV控制器將溫度控制在36.5℃，將pH範圍控制在7.2~6.8之間，將DO控制在40%的空氣飽和度下而進行製程A。使用以ATF-2H系統(Refine Technology)在ATF流動模式下運行的截留值為0.2μm的中空纖維過濾器(Spectrum labs)保留細胞。
此製程在補充有4.0mM L-穀氨醯胺的CDM4培養基(Hyclone)中以0.90~1.10×106細胞/mL的初始VCD開始。從第0天起每天添加約10~100ppm消泡劑。從第1天開始以0.4VVD的速率灌流基礎培養基(CDM4培養基，Hyclone)，並在第2天增加至1.0VVD，並保持到培養結束。從第3天開始以基礎培養基的2%的速率灌流補給培養基(CB7a/CB7b)，並在第14天逐漸增加至18%，並保持到第16天。需要時使用微量噴霧器輸送氧氣。在第6天將溫度從36.5℃轉變為31.0℃，並保持在31.0℃直到培養結束。
藉由ATF連續收穫細胞培養物。在整個培養過程中，細胞保留在生物反應器中而不流出。
[製程B]
在3L Applikon容器中使用δV控制器將溫度控制在36.5℃，將pH範圍控制在7.2~6.7之間，將DO控制在40%的空氣飽和度下而進行製程B。使用以ATF-2H系統(Refine Technology)在ATF流動模式下運行的截留值為0.2μm的中空纖維過濾器(過濾器1)(Spectrum labs)保留細胞。使用以ATF-2H系統(Refine Technology)在ATF流動模式下運行的截留值為50 kD(約0.008μm)的中空纖維過濾器(過濾器2)(Spectrum labs)保留細胞和重組蛋白。該過濾器1和過濾器2經由分支管以並聯方式與Applikon容器流體連通。
此製程在補充有8.0mM L-穀氨醯胺的CDM4培養基(Hyclone)中以19.00~21.00×106細胞/mL的初始VCD開始。從第0天起每天添加約10~100ppm消泡劑。從第1天開始以1.0VVD的速率灌流基礎培養基(CDM4培養基，Hyclone)，並保持到培養結束。從第0天開始以基礎培養基的3%的速率灌流補給培養基(CB7a/CB7b)，並在第6天逐漸增加至8%。從第9天開始至第12天灌流速率逐漸降低到6%。在第2天從36.5℃轉變為31.0℃，並保持在31.0℃直至培養結束。
為了進行濃縮的連續收穫，連續地收集通過過濾器1的濾液(含重組蛋白(即收穫物))。同時，棄去通過過濾器2的沒有重組蛋白的濾液，以保持恆定的工作體積。在第2天溫度轉變後開始收穫，並且收穫速率是此後灌流速率的一半。在整個培養過程中，細胞保留在生物反應器中而不流出。
[製程A和製程B之間的比較]
為了與製程B直接比較性能，顯示自第4天起的製程A的資料。
圖10顯示，在製程A中達到的峰值活細胞密度略高。
圖11顯示，在2個製程中的細胞活力相當。
圖12顯示，在2個製程中的細胞平均直徑相當。
圖13顯示，在2個製程中的葡萄糖濃度均保持在1.00g/L以上。
圖14顯示，在任一製程中均未觀察到明顯的乳酸產生或積累問題。
圖15顯示，在具有濃縮收穫的製程B中的收穫物中重組蛋白滴度顯著高於無濃縮收穫的製程A中的收穫物中重組蛋白滴度。
圖16顯示，在2個製程中的累積體積生產率(Pv)相當。
圖17顯示，在具有濃縮收穫的製程B中的重組蛋白截留率顯著低於無濃縮收穫的製程A中的截留率。
ATF:交替切向流

Claims (24)

  1. 一種連續收穫由培養的一細胞生產的一生物物質的設備，其包括：(a)一過濾器1，其為至少一個過濾器，其過濾孔徑不允許該細胞通過該過濾器，但允許生物物質通過過濾器，及(b)一過濾器2，其為至少一個過濾器，其過濾孔徑不允許該細胞和該生物物質通過該過濾器，但保持該過濾器流體流通，其中該過濾器1和該過濾器2以並聯方式與培養該細胞的設備流體連通。
  2. 如請求項1所述的設備，其中該過濾器1和該過濾器2藉由下列方式與該培養該細胞的設備流體連通：(a)各自直接，(b)經由一分支管，或(c)(a)和(b)的組合。
  3. 如請求項1或請求項2所述的設備，其中該過濾器1的過濾孔徑為約0.08μm~0.5μm。
  4. 如請求項1或請求項2所述的設備，其中該過濾器1的過濾孔徑為約0.1μm~0.4μm。
  5. 如請求項1或請求項2所述的設備，其中該過濾器1的過濾孔徑為約0.2μm。
  6. 如請求項1或請求項2所述的設備，其中該過濾器2的分子量截留值(MWCO)為50kD以下。
  7. 如請求項1或請求項2所述的設備，還包括用於調節該過濾器1的過濾速率的裝置和/或用於調節該過濾器2的過濾速率的裝置。
  8. 如請求項1或請求項2所述的設備，其中該過濾器1和該過濾器2之一或兩者是一交替切向流(ATF)過濾器或一切向流過濾(TTF)過濾器。
  9. 如請求項8所述的設備，其中該過濾器1和該過濾器2之一或兩者是中空纖維過濾器。
  10. 如請求項1或請求項2所述的設備，其中該過濾器1的數量是1個、2個、3個或更多，和/或該過濾器2的數量是1個、2個、3個或更多。
  11. 一種生產生物物質的系統，其包括：(a)培養一細胞的設備，其用基礎培養基和補給培養基以灌流方式培養該細胞；和(b)如請求項1至請求項10中任一項所述的設備。
  12. 如請求項11所述的系統，其還包括用於從由如請求項1至請求項10中任一項所述的設備收穫的物質中連續捕獲生物物質的設備。
  13. 如請求項11或請求項12所述的系統，其還包括微噴霧器。
  14. 一種連續收穫由培養的一細胞生產的一生物物質的方法，其由如請求項1至請求項10中任一項所述的設備進行。
  15. 一種生產生物物質的方法，其由如請求項11至請求項13中任一項所述的系統進行。
  16. 如請求項14或請求項15所述的方法，其中該細胞包括一哺乳動物細胞。
  17. 如請求項16所述的方法，其中該哺乳動物細胞包括CHO(中國倉鼠卵巢)細胞、雜交瘤、BHK(幼倉鼠腎)細胞或骨髓瘤細胞。
  18. 如請求項14或請求項15所述的方法，其中該生物物質選自一受體、一酶、一融合蛋白、一血液蛋白、一多功能蛋白、一病毒或細菌蛋白和一免疫球蛋白。
  19. 如請求項18所述的方法，其中該血液蛋白來自凝血級聯反應。
  20. 如請求項18所述的方法，其中該多功能蛋白質是促紅細胞生成素。
  21. 如請求項18所述的方法，其中該病毒或細菌蛋白被用於疫苗中。
  22. 如請求項18所述的方法，其中該免疫球蛋白是抗體或多特異性抗體。
  23. 如請求項22所述的方法，其中該抗體是IgG或IgM。
  24. 如請求項22所述的方法，其中該多特異性抗體是雙特異性抗體。
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