KR102414290B1 - 세포 보유 장치 및 방법 - Google Patents

Abstract

대상 기술은 세포 보유 장치 및 관류 세포 배양 시스템에서 이를 사용하는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 세포 보유 장치는 약 0.5 내지 약 20㎛ 범위의 평균 공극 크기를 갖고 막히거나 상기 필터의 생성물 체질 능력의 20% 초과를 잃지 않으면서 35일 이하 동안 관류 세포 배양 조건 하에 작동하는 능력을 갖는 중공-섬유 필터를 포함한다.

Description

세포 보유 장치 및 방법

대상 기술은 일반적으로 세포 보유 장치 및 관류 세포 배양 시스템에서 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 대상 기술은 중공-섬유 필터를 함유하는 외부 세포 보유 장치 및 관류 세포 배양 시스템에서 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

관류는 항체, 치료학적 단배질, 혈액 인자(예를 들면, 응고 단백질) 및 효소와 같은 재조합 생물학적 생성물의 생산을 위한 세포 배양 방식이다. 회분식(batch) 또는 유가식(fed-batch)과는 달리, 관류 방식은 생물반응기로부터 소비된 배지 및 생성물을 연속적으로 제거하고 이들을 신선한 배지로 대체하면서 생물반응기 내에 생존가능한 세포를 보유하는 것을 포함한다. 신선한 배지의 존재시에, 세포는 계속해서 증식하여 보다 많은 생성물을 생산한다. 따라서, 분리 장치, 즉 세포 보유 장치는 소비된 배지 및 생성물을 배출되도록 하면서 생물반응기 내에 생존가능한 세포를 보유하기 위해 관류에 요구된다.

다수의 세포 보유 장치는 원심력(원심분리, 하이드로사이클론(hydrocyclone)), 여과(회전-필터, 접선 유동 필터(TFF: tangential flow filter), 교번 접선 유동 필터(ATF: alternating tangentail flow filter), 동적 필터(dynamic filter)), 중력 침강(gravitational settling), 초음파 및 유전체 분리에 기반한 것들을 포함하는 소규모로, 보다 큰 또는 보다 적은 정도로 잘 수행된다. 그러나, 단지 몇몇의 유형, 예를 들면, 회전 필터, 세포 침강기 및 원심 분리기를 갖는 ATF만이 더 큰 규모에서 신뢰할 수 있고 생물 산업에 사용하기에 충분히 확장될 수 있음이 문헌[Bonham-Carter et al., a Brief History of Perfusion Biomaufacturing, Bioprocess International, vol. 9(9):24-30, Oct. 2011]에 진술된다.

여과에 기반하여 작동하는 세포 보유 장치의 경우, 장기간 관류 배양 성능을 지속시키기 위해 필터 설계 및 작동은 세포, 세포 잔해 및 거대분자에 의한 여과 표면의 파울링(fouling)(막힘)을 완화시켜야만 한다. 파울링은 이들 구성성분이 여과물 흐름(filtrate flux)(필터를 통한 유동)에 의해 필터 표면에 농축되므로 발생하고, 이 프로세스는 농도 분극(concentration polarization)으로서 공지되어 있다. 필터 파울링은 여과 속도를 제한하는 것뿐만 아니라 생물반응기 내의 고분자량 생성물의 한외여과 정체(retention)도 초래할 수 있다. 일반적으로, 여과 시스템은 세포 및 세포성 물질의 축적이 세포의 생존력(viability)에 부정적 영향을 미치지 않는 유체 전단 속도로 필터 표면에 접하는 유동에 의해(예를 들면, TFF 또는 ATF로) 감소되도록 설계된다. 전단계(shear field)에서 세포에 작용하는 유체역학적 양력(hydrodynamic lift force)은 또한 세포, 세포 잔해 및 거대분자에 의한 필터 막힘을 감소시키는 역할을 할 수 있다.

이 영역에서는 하기 참조 문헌이 중요하다: (1) Woodside et al. Mammalian Cell Retention Devices for Stirred Perfusion Bioreactors, Cytotechnology, 28(1-3):163-175, November 1998; (2) US 2011/0201050 및 (3) WO2010/003759.

우드사이드(Woodside) 등은 관류 생물반응기용 포유동물 세포 보유 장치를 논의한다. 우드사이드 등은 세포 배양 조건의 변화는 단백질 생성물에서 일관성이 없는 번역-후 변형을 초래할 수 있으므로 관류 반응기 설계 및 작동에 관한 중요한 문제가 세포 보유 장치의 신뢰성임을 지적한다. 이들은 대규모 관류에 대한 세포 보유 및 안정성을 위한 몇몇의 상이한 기술들의 장점과 한계에 대해 논의한다.

포유동물 세포 관류 적용에 적합한 중공-섬유 및 평판형(flat-plate type)과 같은 교차-유동 필터에 관해서, 우드사이드 등은 보고된 교차-유동 필터의 대다수가 0.2 내지 0.65㎛ 공극을 갖는 미세다공성 멤브레인(membrane)을 사용함을 언급한다. 이러한 상대적으로 작은 공극은 보다 큰 공극 필터보다 더 쉽게 막히는 것으로 예상될 수 있다. 그러나, 5㎛ 공극 평판 필터 멤브레인은 1 L m^-2 h^-1의 필터 흐름으로의 관류 동안 5일마다 교체를 필요로 하였지만, 2 및 10㎛ 직경 공극 멤브레인은 4 L m^-2 h^-1의 필터 흐름으로의 관류 동안 5 내지 7일마다 대체되었다. 따라서, 특히 10㎛ 멤브레인의 좋지 않은 보유 효율(< 70%)을 고려하면 이들 큰 공극 필터들에 대한 명백한 이점은 없다.

US2011/0201050은 빠른 속도로 이동하는 미세 기포를 사용하여 5 미크론 이하의 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터를 스크러빙하여 세포 잔해 및 거대분자에 의한 이들의 파울링을 방지하는 기체 스크러빙된 관류 필터를 기술한다. 기체 스크러빙 단계를 권장함으로써, US2011/0201050은 세포 배양 시스템의 설계를 보다 복잡하게 만드는 것뿐만 아니라 이러한 단계가 실제로 파울링 문제를 해소할 수 있는지의 여부에 대한 데이터도 제공하지 않는다. 세포 배양 조건에 대한 그리고 생성물 수율의 일관성에 대한 스크러빙 단계의 영향에 관한 임의의 데이터도 제공하지 않는다.

WO2010/003759는 "공극 크기가 바람직하게는 적어도 0.1㎛, 보다 바람직하게는 적어도 0.2㎛이고; 상한으로서 공극 크기가 바람직하게는 30㎛ 이하, 보다 바람직하게는 20㎛ 이하인" 중공-섬유 필터 및 접선 유동 필터를 갖는 보유 장치를 사용하는 세포 배양 방법을 기술한다. WO2010/003759는 생물반응기의 내용물이 보유 장치를 통해 순환되기 전에 산소를 함유하는 기체 조성물과 접촉되게 하는 것을 요구한다. WO2010/003759의 방법/장치에서 "기류(airflow)"의 기능이 무엇인지 또는 US2011/0201050에서 교시된 바와 같이 스크러빙 수단인지의 여부는 불명확하다. 임의의 사건에서, WO2010/003759는 이가 제안하는 이론을 지지하는 임의의 실제 데이터도 제공하지 않고, 주로 세포 배양에의 산소의 이동과 관련되어 있는 것으로 보인다. 또한 필터의 파울링 또는 체질 문제를 해소하기 위해 실제로 방법/장치가 작동하는지 여부에 대한 질문에 대한 대답도 아니다.

생물반응기 내에서 작동하고 몇몇의 주요 양상들에서 교차-유동 필터와는 별개인 회전-유동 필터와 달리, 중공-섬유 필터는 생물반응기의 외적으로 그리고 외부에서 작동한다. 사용시, 생물반응기로부터의 세포 배양액은 필터가 위치되어 있는 하우징으로 펌핑되고, 멤브레인을 통해 유동함에 따라 농축된다. 농축된 현탁 스트림(stream)은 생물반응기로 재순환되고, 한편 세포-불포함(cell-free) 여과물은 용출물 스트림을 형성하고 단백질 생성물의 추가 정제 및 분리를 위해 다음 단위 조작, 예를 들면 단백질 A 컬럼으로 유동한다. 파울링 때문에, 현재 중공-섬유 필터는 5 내지 7일마다, 즉 관류 세포 배양 동안 1 내지 2회 교체되어야만 한다. 필터를 교체하는 것은 비용, 노동력 및 관류 세포 배양 작업에 부정적 영향을 미치는 세포 배양 조건의 오염 또는 변화를 유발할 위험을 포함한다.

따라서, 파울링은 필터-기반 세포 보유 장치, 특히 중공-섬유 필터를 갖는 장치에 대한 문제로 남아 있다. 파울링은 필터의 효율성과 수명을 감소시키고 장기간의 시간에 걸쳐 필터가 일관되게 기능하도록 하지 않는다. 다른 문제는 필터-기반의 세포 보유 장치에서 파울링 또는 체질을 방지하기 위한 안정적이고 확장가능한 기술이 없다는 것이다. 본햄-카터(Bonham-Carter) 등은 TFF와 같은 일부 기술은 확장성(scalability) 한계 또는 입증된 시장 수용성의 결여 때문에 포기되었음을 시사하였다.

따라서, 상기 논의된 문제들을 극복하는 개선된 보유 장치 및 필터에 대한 필요성이 존재한다.

간략한 요약

대상 기술은 부분적으로 TFF 방식으로 작동하는 큰 공극 크기(약 5 내지 10㎛)의 중공-섬유 필터가 관류 배양 시스템의 파울링 문제를 해결하고 35일 이하 동안 이들의 생성물 체질 능력을 유의하게 상실하지 않고 효율적이고 일관되게 작동한다는 놀라운 발견에 기반한다. 대상 기술의 세포 보유 장치 및 방법은 TFF에 의해 특정 처리(예를 들면, 기체 스크러빙)의 필요 없이, 필터에 걸친 압력 구배를 증가시키기 위한 특정 설계(배압의 적용 또는 전단 또는 유동 속도의 증가를 포함함)의 필요 없이, 관류 속도를 변화시킬 필요 없이, 세포 보유 장치의 용적과 관련하여 특정 관류 용적을 유지하는 것을 필요로 하지 않거나, 또는 세포 배양액(생물반응기 내용물)을 대상 기술의 세포 보유 장치를 통해 순환시키기 전에 상기 세포 배양액을 특정 조성물(예를 들면, 산소를 함유하는 조성물)로 처리할 필요 없이 높은 생성물 체질을 달성한다.

대상 기술은 예를 들면, 하기 기술된 각종 양상들에 따라 설명된다.

한 양상에서, 대상 기술은 약 0.5 내지 약 20㎛ 범위의 평균 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터를 포함하는 세포 보유 장치에 관한 것이다. 이러한 양상에 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있는 하나 이상의 실시형태들에서: 상기 세포 보유 장치는 관류 세포 배양 용기의 외부에 존재하고; 상기 중공-섬유 필터는 약 5 내지 약 8㎛, 5㎛ 내지 15㎛, 5.2㎛ 내지 12㎛, 5.5㎛ 내지 8㎛, 5.2㎛ 내지 7.7㎛, 5㎛, 6㎛, 7㎛, 8㎛, 9㎛, 10㎛, 11㎛, 12㎛, 13㎛, 15㎛ 또는 사멸 세포, 세포 잔해 또는 거대분자를 상기 필터를 통해 통과되도록 하면서 생존가능한 세포를 보유할 수 있는 5㎛ 초과의 임의의 크기로부터 선택되는 평균 공극 크기를 갖고; 상기 중공-섬유 필터는 5㎛ 이상이지만 세포 배양 용기에서 배양되는 생존가능한 세포의 크기 미만인 평균 공극 크기를 갖고; 상기 중공-섬유 필터는 생존가능한 세포의 크기보다 5㎛ 이하만큼 더 큰 평균 공극 크기를 갖고; 상기 세포 보유 장치는 접선-유동 여과(TFF)에 의해 또는 교번 접선 유동 여과(ATF)에 의해 작동하도록 구성되고; 상기 TFF 또는 ATF는 약 1000s^-1 내지 약 4000s^-1의 낮은 전단 속도 하에 작동하도록 구성되고; 상기 중공-섬유 필터는 약 1000 내지 약 10,000L/M²의 필터 수용력(capacity)을 갖고; 상기 세포 보유 장치는 관류 배양 용기와 협력하여 작동하도록 구성되고; 상기 중공-섬유 필터는 세라믹, 중합체 또는 금속성 재료로 이루어지고; 상기 중공-섬유 필터는 막히거나 상기 필터의 생성물 체질 능력(product sieving ability)의 10% 초과를 잃지 않으면서 35일 이하 동안 작동하고; 상기 중공-섬유 필터는 2000s^-1 이하의 낮은 전단 속도 또는 4000L/㎡ 이상의 관류 유동 속도 하에 TFF 또는 ATF 방식으로 작동하고; 상기 중공-섬유 필터는 여과물의 수집을 용이하게 하는 하우징(housing) 내에 존재한다.

다른 양상에서, 상기 대상 기술은, 관류 배양 용기로부터 재조합 단백질 생성물을 수거하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 관류 배양 용기의 세포 배양액을 세포 보유 장치에 보내어 여과되도록 하는 단계(여기서, 상기 세포 배양액은 세포 및 상기 세포에 의해 생산된 재조합 단백질 생성물을 포함하고, 상기 세포 보유 장치는 약 0.5 내지 약 20㎛ 범위의 평균 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터를 포함한다); (b) 상기 세포 보유 장치로부터 여과물을 수집하는 단계(여기서, 상기 여과물은 재조합 단백질 생성물을 포함한다); 및 (c) 상기 여과된 세포 배양액을 상기 관류 배양 용기에 재순환시키는 단계를 포함하는, 관류 배양 용기로부터 재조합 단백질 생성물을 수거하는 방법에 관한 것이다. 이러한 양상에 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있는 하나 이상의 실시형태들에서: 상기 세포 보유 장치는 관류 세포 배양 용기의 외부에 존재하고; 상기 중공-섬유 필터는 접선-유동 여과(TFF) 또는 교번 접선 유동 여과(ATF)에 의해 세포 배양액을 여과하고; 상기 중공-섬유 필터는 약 5 내지 약 8미크론, 5㎛ 내지 15㎛, 5.2㎛ 내지 12㎛, 5.5㎛ 내지 8㎛, 5.2㎛ 내지 7.7㎛, 5㎛, 6㎛, 7㎛, 8㎛, 9㎛, 10㎛, 11㎛, 12㎛, 13㎛, 15㎛ 또는 사멸 세포, 세포 잔해 또는 거대분자를 상기 필터를 통해 통과되도록 하면서 생존가능한 세포를 보유할 수 있는 5㎛ 초과의 임의의 크기로부터 선택되는 평균 공극 크기를 갖고; 상기 중공-섬유 필터는 5㎛ 이상이지만 상기 세포의 크기 미만인 평균 공극 크기를 갖고; 상기 중공-섬유 필터는 상기 세포의 크기보다 5㎛ 이하만큼 더 큰 평균 공극 크기를 갖고; 상기 중공-섬유 필터는 약 상기 세포의 크기인 평균 공극 크기를 갖고; 상기 중공-섬유 필터는 세라믹, 중합체 또는 금속성 재료로 이루어지고; 상기 여과물은 재조합 단백질 생성물을 포함하지만 생존가능한 세포는 없고; 상기 중공-섬유 필터는 막히거나 상기 필터의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 잃지 않으면서 35일 이하 동안 작동하고; 상기 세포 보유 장치는 약 1000s^-1 내지 약 4000s^-1의 낮은 전단 속도 하에 TFF 또는 ATF 방식으로 작동하고; 상기 중공-섬유 필터는 약 1000 내지 약 10,000L/M²의 필터 수용력을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 대상 기술은 이러한 양상 또는 이의 실시형태들 중 어느 하나에 따라 제조된 단백질에 관한 것이다.

다른 양상에서, 상기 대상 기술은 (a) 세포 배양액을 함유하도록 구성된 관류 배양 용기(여기서, 상기 세포 배양액은 액체 배지, 세포 및 상기 세포에 의해 생산된 재조합 단백질 생성물을 포함한다); (b) 상기 세포 배양액을 수용하고 상기 세포 배양액을 여과하여 재조합 단백질 생성물을 포함하는 여과물을 제공하도록 구성된 세포 보유 장치(여기서, 상기 세포 보유 장치는 약 0.5 내지 약 20㎛ 범위의 평균 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터를 포함한다); 및 (c) 상기 세포 배양액을 상기 관류 배양 용기로부터 상기 세포 보유 장치로 순환시키고 상기 관류 배양 용기로 되돌리기 위한 펌프 및 유체 커넥터(fluid connector)를 포함하는, 관류 배양 시스템에 관한 것이다. 이러한 양상에 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있는 하나 이상의 실시형태들에서: 상기 세포 보유 장치는 관류 세포 배양 용기의 외부에 존재하고; 상기 세포 보유 장치는 접선-유동 여과(TFF) 또는 교번 접선 유동 여과(ATF)에 의해 작동하고; 상기 중공-섬유 필터는 약 5 내지 약 8미크론, 5㎛ 내지 15㎛, 5.2㎛ 내지 12㎛, 5.5㎛ 내지 8㎛, 5.2㎛ 내지 7.7㎛, 5㎛, 6㎛, 7㎛, 8㎛, 9㎛, 10㎛, 11㎛, 12㎛, 13㎛, 15㎛ 또는 사멸 세포, 세포 잔해 또는 거대분자를 상기 필터를 통해 통과되도록 하면서 생존가능한 세포를 보유할 수 있는 5㎛ 초과의 임의의 크기로부터 선택되는 평균 공극 크기를 갖고; 상기 중공-섬유 필터는 5미크론 이상이지만 상기 세포의 크기 미만인 평균 공극 크기를 갖고; 상기 중공-섬유 필터는 상기 세포의 크기보다 5㎛ 이하만큼 더 큰 평균 공극 크기를 갖고; 상기 중공-섬유 필터는 약 상기 세포의 크기인 평균 공극 크기를 갖고; 상기 여과물은 재조합 단백질 생성물을 포함하지만 생존가능한 세포는 없고; 상기 중공-섬유 필터는 세라믹, 금속성 또는 중합체 재료 또는 이들의 조합으로 이루어지고; 상기 중공-섬유 필터는 막히거나 상기 필터의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 잃지 않으면서 35일 이하 동안 작동하고; 상기 세포 보유 장치는 약 1000s^-1 내지 약 4000s^-1의 낮은 전단 속도 하에 TFF 또는 ATF 방식으로 작동하고; 상기 중공-섬유 필터는 약 1000 내지 약 10,000L/M²의 필터 수용력을 갖고; 상기 중공-섬유 필터는 이의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 상실하지 않으면서 사용 5일 후에 50kD 이상의 분자량을 갖는 거대분자의 통과를 가능하게 하고; 상기 중공-섬유 필터는 이의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 상실하지 않으면서 사용 10일 후에 50kD 이상의 분자량을 갖는 거대분자의 통과를 가능하게 하고; 상기 여과물은 심층 여과(depth filtration) 단계없이 단백질 A 컬럼에 보내어지고; 상기 여과물은 단백질 A 컬럼에 보내어지기 전에 응집(flocculation) 단계가 행해지고; 상기 세포는 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 또는 세균 세포를 포함하고; 상기 세포는 BHK(baby Hamster kidney: 새끼 햄스터 신장) 세포, CHO(Chinese Hamster ovary: 차이니즈 햄스터 난소) 세포, HEK(human embryonic kidney: 사람 배아 신장) 세포, 및 NSO 세포를 포함하고; 상기 재조합 단백질 생성물은 모노클로날 항체 또는 이의 단편이고; 상기 재조합 단백질 생성물은 치료학적 단백질, 호르몬 또는 효소이다.

청구된 방법, 기기 및 시스템의 이들 및 다른 특징들, 양상들 및 이점들은 하기 상세한 설명을 수반되는 도면을 참조하여 읽을 때 더 잘 이해된다.
도 1은 전형적인 관류 세포 배양 시스템에서 보여지는 대상 기술의 세포 보유 장치(6)의 개략도이다. 도시된 요소들의 상세한 설명은 이하에 주어질 것이다.
도 2(좌측 패널)는 생존가능한 세포(12 내지 15㎛의 보통 직경을 가짐)를 보유하면서 세포 잔해 및 생성물을 여과물로서 통과되도록 하는 조작에서의 필터 멤브레인(0.2㎛)의 개략도이다. 도 2(우측 패널)는 2개의 상이한 유동 조건(TFF 및 ATF) 하의 체질의 수단으로서의 0.2㎛ 필터의 여과 프로파일을 보여주는 플롯이다.
도 3은 (A) 0.2㎛ 필터의 여과물에, (B) 여과물에 재-현탁된 세포 배양 펠렛에 그리고 (C) 세포 배양 상청액에 존재하는 입자/잔해의 입자 크기에 관한 실시예 2에 기술된 발견을 보여준다. 도 3(A), 좌측 패널은 체질 %가 다른 0.2㎛ 멤브레인의 여과물로부터의 입자에 대해 높음을 보여준다. 도 3(A), 우측 패널은 여과물에 존재하는 입자들의 크기 분포이다. 도 3(B), 좌측 패널은 체질 %가 다른 0.2㎛ 멤브레인의 여과물에 재현탁된 CHO 세포 배양 펠렛으로부터의 입자에 대해 계속해서 높게 유지됨을 보여준다. 도 3(B), 우측 패널은 다른 0.2㎛ 멤브레인의 여과물에 재현탁된 CHO 세포 배양 펠렛으로부터의 입자들의 크기 분포를 보여준다. 도 3(C), 좌측 패널은 체질 %가 생물반응기의 세포 배양 상청액으로부터의 입자들에 대해 낮음을 보여준다. 도 3(C), 우측 패널은 생물반응기의 세포 배양 상청액으로부터의 입자들의 크기 분포를 보여준다.
도 4는 세포 배양 상청액을 상이한 공극 크기를 갖는 중공 섬유를 통해 통과시킨 결과로서의 도식적 생성물 체질이다.
도 5는 동적 광 산란(dynamic light scattering)을 이용한 여과물의 입자 크기 분석의 결과를 보여준다. 도 5a는 유의하게 보다 큰 1차 피크를 보여주고, 이는 5㎛ 및 7.7㎛를 통해 통과된 재료가 보다 큰 크기의 입자로 구성된다는 것을 입증한다. 도 5a는 0.2㎛, 5㎛ 또는 7.7㎛ 공극 크기 중공 섬유 필터 중 어느 하나를 이용하여 관류 배양으로부터 시간 경과에 따라 빌드 업(bulid up)되는 세포 배양 상청액의 입자(즉, 멤브레인을 통과할 수 없는 물질)의 대략적 수를 보여준다.
도 6은 관류 세포 배양 시스템에서 사용된 평균 공극 크기 5 및 7.7㎛를 갖는 중공 섬유 필터에 대한 시간 경과에 따른 여과물 탁도를 보여주는 플롯이다.
도 7은 세포 보유 장치가 2㎛ 공극-크기 중공 섬유 필터를 포함한 관류 프로세스(표준 관류 프로세스)에 대해 비교한 세포 보유 장치가 7㎛ 공극-크기 중공 섬유 필터를 포함한 관류 프로세스(대상 기술에 따른 원형 관류 프로세스)에서의 생성물 체질 백분율을 보여준다.
도 8은 대상 기술의 세포 보유 장치에 연결된 관류 배양 용기의 사진이다. 해당 사진은 작동시 스테인리스 스틸 하우징을 갖는 5.0미크론 세라믹 TFF 필터를 보여준다. "스트로(straw)"라고도 칭하는 것은 7mm의 내강(lumen) ID 및 25cm의 길이를 갖는다.
도 9는 필터 수용력이 생물반응기에서 배양되는 세포주에 의존한다는 것을 보여주는 2개의 플롯을 나타낸다. 도 9a는 세포 보유 장치에 사용된 필터가 등록 상표(proprietary) 재조합 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주 1에 대해 4000L/㎡보다 더 큰 필터 수용력을 가짐을 보여준다. 도 9b는 도 9a에서와 동일한 필터가 등록 상표 재조합 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주 2에 대해 8000L/㎡보다 더 큰 필터 수용력을 가짐을 보여준다.
도 10은 도 9a 및 도 9b에서 사용된 중공-섬유 필터의 생성물 체질 %를 보여주는 플롯이다. 나타내어지는 바와 같이, 대상 기술의 중공-섬유 필터의 생성물 체질 %는 필터 수용력이 도달될 때까지 연속적으로 높게 유지된다.

상기 제공된 바와 같이, 대상 기술은 부분적으로 - 정제되는 생성물의 크기와 관련하여 - TFF 또는 ATF 방식으로 작동하는 비교적 큰 공극 크기(약 5 내지 10㎛의 평균 공극 크기)의 중공-섬유 필터가 관류 배양 시스템에서의 파울링 문제를 해소하고, 이들의 생성물 체질(sieving) 능력을 유의하게 잃지 않으면서 35일 이하 동안 효율적이고 일관되게 작동한다는 놀라운 발견에 기초한다.

출원인은 놀랍게도 관류 CHO 세포 배양 보유를 위한 보다 큰 공극 크기(약 5 내지 10㎛ 또는 약 5.2 내지 7.7㎛ 평균 공극 크기) TFF 멤브레인의 사용이 현재 통상적으로 사용되는 멤브레인 유형에 내재된 분자 체질로 인한 생성물 손실을 감소시키거나 제거한다는 것을 발견하였다. 이는 결국 매우 긴 멤브레인 수명(35일 이하)을 가능하게 한다. 생성물 수율의 향상은 50%까지 증가될 수 있고, 이는 몇몇의 생물약제를 생산하기 위한 비용을 감소시킬 수 있다.

대상 기술의 장치 및 방법이 다른 사람들이 포기한 간단화된 조작인 TFF를 통해 이로운 효과를 달성한다는 것은 더욱 놀랍다. 대상 기술의 장치 및 방법의 조작은 특정 처리(예를 들면, 기체 스크러빙), 필터에 걸친 압력 구배를 증가시키기 위한 특정 설계(배압의 적용 또는 전단 또는 유동 속도의 증가를 포함함)를 포함하지 않고, 관류 속도를 변경할 필요가 없고, 세포 보유 장치의 용적과 관련하여 특정 관류 용적을 유지할 필요가 없고, 세포 배양액을 대상 기술의 세포 보유 장치를 통해 순환시키기 전에 세포 배양액(생물반응기 내용물)을 특정 조성물(예를 들면, 산소를 함유하는 조성물)로 처리할 필요가 없기 때문에 간단하다.

하기의 상세한 설명에서, 대상 기술의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 대상 기술은 이들 특정 세부사항들 중 일부의 부재 하에 실행될 수 있음은 당해 분야 숙련가에게 명백할 것이다. 다른 경우, 익히 공지되어 있는 구조 및 기술은 대상 기술을 모호하게 하지 않도록 상세하게 설명되어 있지 않다.

정의:

본 발명의 대상 기술의 이해를 용이하게 하기 위해서, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의된다:

본원에서 사용된 문법적인 관사 "하나(one)", "한(a, an)" 및 "상기(the)"는 달리 명시되지 않는 한 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 관사는 본원에서 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)의 해당 관사의 문법적 대상을 나타내는 것으로 사용된다. 예로서, "구성성분"은 하나 이상의 구성성분을 의미하고, 따라서 아마도 하나 초과의 구성성분이 고려되고 기술된 실시형태들의 실행에 사용되거나 이용될 수 있다.

본원에서 사용되는 어구 "세포 보유 장치로 또는 세포 보유 장치로부터 생물반응기의 세포 배양액 또는 내용물을 순환시키거나 재순환시키는 것" 또는 이의 등가는 생물반응기로부터의 세포 배양액(즉, 관류 용기의 내용물)이 생물반응기로부터 보유 장치를 향하여 그리고 보유 장치로 이동됨을 의미하고, 여기서, 배양액은 TFF 또는 ATF 방식으로 여과되고, 이어서 생물반응기로 이동되거나 되돌아온다.

본원에서 사용되는 용어 "보유 장치"는 크기 또는 분자량에 기초하여 입자를 분리하는 능력을 갖는 모든 장치를 포함하는 것을 의미한다. 특히, 대상 기술의 세포 보유 장치 및 방법은 중공-섬유 필터를 포함한다. 대상 기술의 필터의 평균 공극 크기 또는 분자량 컷-오프(MWCO: molecular weight cut-off)는 세포배양액에서 생존가능한 세포와 사멸 세포, 세포 잔해 및/또는 거대분자 중 적어도 하나 사이의 원하는 분리가 확립될 수 있도록 선택된다. 대상 기술에서 사용하기에 적합한 필터의 예로는 멤브레인 필터, 세라믹 필터 및 금속 필터가 포함된다. 상기 필터는 튜브 또는 실린더 형태로 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 대상 기술의 세포 보유 장치 또는 방법에서 사용되는 필터는 멤브레인 필터, 바람직하게는 중공-섬유 필터이다.

본원에서 사용되는 용어 "중공-섬유 필터"는 알루미늄 옥사이드 또는 기타 세라믹, 스테인리스 스틸, 또는 다수의 중합체들로 만들어질 수 있는 튜브 또는 실린더-형태의 멤브레인 또는 필터를 말한다. 중공-섬유 필터는 이를 통해 통과하는 배양액의 용적에 따라 크기가 다를 수 있는 내경을 갖는 내강을 갖는다. 중공-섬유 필터의 평균 공극 크기는 공극의 크기가 관류 배양 용기 내의 세포 크기에 가깝거나 일부 경우에는 상기 세포 크기보다 더 크도록 선택된다. 대상 기술의 중공-섬유의 적합한 평균 공극 크기는 하기에 기술된다. 한 예시 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유의 내경은 0.2 내지 10mm이다. 대상 기술의 중공-섬유의 길이는 10mm 내지 10m이다. 대상 기술의 중공-섬유의 표면적은 50㎠ 내지 25㎡의 배수이다. 대상 기술의 중공-섬유의 평균 공극 크기는 약 0.5㎛ 내지 세포 직경 또는 20㎛의 범위이다.

본원에서 사용되는 용어 "접선 유동(tangential flow)"은 필터 표면에 대해 실질적으로 평행한 유동, 예를 들면 단방향 접선 유동(TFF) 또는 교차-유동을 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "교번 접선 유동(alternating tangential flow)"은 접선 유동이 중공-섬유 필터의 멤브레인 표면을 따라 앞뒤로 이동하고 다른 유동이 상기 필터 표면에 실질적으로 수직인 방향으로 이동하는 유동 배열을 말한다. 접선 유동 또는 교번 접선 유동은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,544,424호는 중공 섬유 필터에서 교번 접선 유동을 생성하는 방법을 기술한다.

본원에서 사용되는 용어 "생성물 체질"은 여과물 중의 생성물의 농도를 배양 용기 내의 생성물의 농도로 나눈 백분율로 나타낸 체질(sieving)의 측정을 말한다. 100%의 생성물 체질은 생성물의 100%가 필터를 통해 통과해야만 하는 양호한 체질 조건을 시사한다. 그러나, 시간 경과에 따라 필터를 통해 통과하는 생성물의 양은 파울링으로 인해 100% 미만으로 감소한다.

한 양상에서, 대상 기술은 하우징을 포함하는 적어도 하나의 필터를 포함하는 세포 배양 장치, 세포 배양 용기(생물반응기)로부터 세포 배양액을 세포 배양 장치로 보내기 위한 유체 커넥터(connector), 하우징을 포함하는 필터를 통해 한 방향 또는 교번 방향(들)로 상기 유체에 동력을 공급하는 적어도 하나의 펌프 및 적어도 하나의 유체 수거 포트(port)를 포함하는 유체 여과 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 신속한 낮은 전단의 접선 유동 여과를 수행하는데 유용하다. 이러한 시스템은 관류 세포 배양 시스템 또는 생물반응기 내의 생존가능한 세포의 보유를 요구하는 임의의 다른 배양 시스템에서의 적용을 갖는다.

도 1을 참조하면, 전형적인 관류 생물반응기 내의 대상 기술에 따른 유체 여과 시스템이 도시되어 있다. 프로세스 용기(2)는 유체 커넥터(4)를 통해 하우징을 포함하는 필터(6)에 연결되어 있다. 용기(1)는 여과될 유체를 위한 임의의 적합한 컨테이너(container)일 수 있다. 예를 들면, 액체를 함유할 수 있는 배트(vat), 배럴(barrel), 탱크, 보틀, 플라스크, 및 컨테이너 등을 비배타적으로 포함하는 생물반응기, 발효기 또는 임의의 다른 용기일 수 있다. 상기 용기는 플라스틱, 스테인리스 스틸과 같은 금속, 또는 유리 등과 같은 임의의 적합한 재료로 구성될 수 있다. 유체 커넥터는 프로세스 용기로부터 하우징을 포함하는 필터(6)의 입구 말단으로 유체를 보내는 작용을 한다.

펌프(8) 유체를 용기(2)로부터 유체 커넥터(4)를 통해 하우징을 포함하는 필터(6) 내의 중공-섬유 필터로 이동시키고 유체 커넥터(10)를 통해 용기(2)로 되돌려 보내기 위해 사용한다. 한 실시형태에서, 다른 펌프는 유체 커넥터(10)를 따라 위치하여 펌프(8)와 협력하여 작동하여 유체가 역으로 이동하게 하여, 유체가 용기(2)로 다시 복귀되도록 하기 전에 하우징을 포함하는 필터(6)를 통해 교번(전후) 접선 유동을 생성할 수 있다. 도 1에 도시된 전체 여과 경로는 균열, 날카로운 모서리, 수축 또는 굴곡이 없이 매끄럽고, 이는 세포의 활력 또는 생존력에 불리한 영향을 미칠 수 있다.

하우징을 포함하는 필터(6)는 또한 유체 수거 포트로서 적합한 적어도 하나의 개구(12)를 갖는다. 한 실시형태에서, 여과물 펌프(16)는 수거 라인(14)에 연결된다. 여과물 펌프(16)는 시스템으로부터의 여과된 유체의 제거를 제어하기 위한 수단으로서 적합하고, 하여 하우징을 포함하는 필터(6)로부터 여과물의 비제한적 유동을 조절하는 확인 밸브(check valve)로서 작용한다. 이어서, 여과물 펌프(16)는 여과물을 저장 탱크(18) 또는 단백질 A 컬럼일 수 있는 다음 단위 작업으로 이동시킨다.

간략하게, 도 1은 관류 용기의 세포 배양액 또는 내용물이 대상 기술의 세포 보유 장치를 통해 TFF 또는 ATF 방식으로 펌핑되어 여과되고, 이어서 관류 용기로 다시 재순환되는 시스템을 도시한다. 한편, 여과물은 단백질 A 컬럼, 저장 탱크, 후속 여과 유닛 또는 응집 유닛일 수 있는 다음 단위 조작으로 이동된다. 한 실시형태에서, 저장 탱크(18) 또는 등가의 구획(compartment) 내의 여과물은 응집(예를 들면, 액체 추출), 예를 들면, 100% PEG400(707kg/627L) 및/또는 40% wt. 포스페이트(1553kg/1128L)와 같은 응집제와 혼합시킬 수 있다. 응집의 결과로서, 여과물은 1:1 가벼운 페이즈(phase) 및 무거운 페이즈로 분리될 것이다. 재조합 단백질 생성물이 어느 페이즈에 있는지에 따라(예를 들면, 항체 생성물은 가벼운 페이즈에 머물 것이다), 해당 페이즈는 생성물 정제를 위한 단백질 A 컬럼 크로마토그래피에 적용될 것이다.

다른 양상에서, 대상 기술은 0.5㎛ 내지 20㎛ 범위의 평균 공극 크기를 갖는 세포 보유 장치에 관한 것이다.

다른 양상에서, 대상 기술은 관류 배양 용기로부터 배양된 재조합 단백질 생성물을 수거하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 배양 용기로부터 세포 배양액을 세포 보유 장치에 보내어 여과되도록 하는 단계, 상기 세포 보유 장치로부터 수거 생성물 산출(output)을 수집하는 단계, 및 상기 여과된 세포 배양액을 상기 배양 용기에 다시 재순환시키는 단계를 포함하고; 여기서 상기 수거 생성물 산출은 상기 세포 보유 장치로부터의 여과물이고 상기 배양된 재조합 단백질 생성물을 포함하는, 관류 배양 용기로부터 재조합 단백질 생성물을 수거하는 방법에 관한 것이다.

다른 양상에서, 대상 기술은 액체 배지 및 세포 및 상기 세포에 의해 생산된 재조합 단백질 생성물을 포함하는 세포 배양액을 함유하도록 구성된 관류 배양 용기, 상기 세포 배양액을 여과하도록 구성된 세포 보유 장치, 및 상기 관류 배양 용기로부터 상기 세포 배양액을 세포 보유 장치로 순환시키고 상기 관류 배양 용기로 다시 순환시키기 위한 펌프 및 유체 커넥터를 포함하는 관류 세포 배양 시스템에 관한 것이다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 한 실시형태에서, 상기 세포 보유 장치는 0.5㎛ 내지 20㎛ 범위, 또는 이러한 범위 내의 임의의 고정된 파라미터 또는 간격, 예를 들면 5㎛ 내지 15㎛, 또는 5.2㎛ 내지 12㎛, 또는 5.5㎛ 내지 8㎛ 또는 5.2㎛ 내지 7.7㎛의 평균 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터를 포함한다. 한 관련 실시형태에서, 상기 중공-섬유 필터의 평균 공극 크기는 예를 들면, 5㎛, 또는 6㎛, 또는 7㎛, 또는 8㎛, 또는 9㎛, 또는 10㎛, 또는 11㎛, 또는 12㎛, 또는 13㎛, 또는 15㎛, 또는 사멸 세포, 세포 잔해 또는 거대분자를 상기 필터를 통해 통과되도록 하면서 생존가능한 세포를 보유할 수 있는 5㎛ 초과의 임의의 크기이다. 한 관련 실시형태에서, 대상 기술의 상기 중공-섬유 필터의 평균 공극 크기는 약 50kD, 또는 약 100kD, 또는 약 500kD, 약 1000kD의 분자량 컷-오프(MWCO) 값을 갖는다. 다른 관련 실시형태에서, 대상 기술의 상기 중공-섬유 필터의 평균 공극 크기는 생존가능한 세포의 크기(예를 들면, 15 내지 20㎛)에 가깝다. 다른 관련 실시형태에서, 대상 기술의 상기 중공-섬유 필터의 공극 크기는 생존가능한 세포의 크기보다 약 5㎛ 만큼, 또는 약 4㎛ 만큼, 또는 약 3㎛ 만큼, 또는 약 2㎛ 만큼, 또는 약 1㎛ 만큼, 또는 약 0.5㎛ 만큼 더 크다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 10㎠ 이하의 표면적을 갖는다. 한 관련 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터의 표면적은 50㎠ 내지 50㎡, 또는 100㎠ 내지 25㎡, 또는 150㎠ 내지 20㎡, 또는 200㎠ 내지 15㎡, 또는 500㎠ 내지 10㎡, 또는 700㎠ 내지 70㎡, 또는 900㎠ 내지 90㎡, 또는 상기 범위 내의 임의의 고정된 파라미터 또는 간격이다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 0.2mm 내지 20cm 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 고정된 파라미터 또는 간격, 예를 들면 0.2mm 내지 10cm, 또는 0.2mm 내지 5cm, 또는 0.2mm 내지 1cm, 또는 0.2mm 내지 7mm인 내경(ID: internal diameter)을 갖는다. 한 관련 실시형태에서, 상기 내경은 예를 들면, 0.2mm, 또는 2mm, 또는 4mm, 또는 6mm, 또는 8mm, 또는 20mm, 또는 200mm이다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 약 15미터 이하의 길이를 갖는다. 한 관련 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 약 25cm, 또는 약 50cm, 또는 약 1m, 또는 약 2m, 또는 약 3m, 또는 약 4m, 또는 약 5m, 또는 약 6m, 또는 약 7m, 또는 약 8m, 또는 약 9m, 또는 약 10m, 또는 약 11m, 또는 약 12m, 또는 약 13m, 또는 약 14m, 또는 약 15m의 길이를 갖는다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 중합체, 세라믹, 금속성 재료 또는 이들의 조합으로 제조된다. 대상 기술의 중공-섬유 필터가 제조될 수 있는 중합체 수지의 예로는 변형된 또는 비변형된 폴리에테르설폰(PES), 변형된 또는 비변형된 폴리에틸렌(PE), 셀룰로스 중합체, 변형된 또는 비변형된 폴리아미드 중합체, 변형된 또는 비변형된 폴리설폰(PSF), 변형된 또는 비변형된 폴리에테르케톤(PEK), 변형된 또는 비변형된 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 변형된 또는 비변형된 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 변형된 또는 비변형된 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 변형된 또는 비변형된 폴리비닐클로라이드(PVC), 변형된 또는 비변형된 폴리비닐리덴 클로라이드(PVDC) 또는 이들의 혼합물이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 대상 기술의 중공-섬유 피터를 생산하는데 사용될 수 있는 세라믹 재료의 예로는 세라믹 하이드록시아파타이트 I형 및 II형(CHT I, II), 알파-알루미나, 지르코니아, 티타니아, 또는 인, 실리카, 칼슘 옥사이드, 알루미늄 옥사이드, 아연 옥사이드, 및 티타늄 옥사이드 등을 함유하는 임의의 기타 세라믹 재료가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 대상 기술에 따라 사용될 수 있는 세라믹 필터의 예로는 Membralox® 필터(Pall Corporation 유래) 또는 등가의 필터가 있다. 대상 기술의 중공-섬유 필터를 생산하는데 사용될 수 있는 금속성 재료의 예로는 스테인레스 스틸, 저 탄소 스틸, 구리가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 세라믹 또는 금속성 필터는 단일 또는 다중 사용으로서 이용될 수 있다. 감마 살균, 오토클레이브(autoclave), 또는 SIP(steam-in-place: 스팀 인 플레이스)는 사용하기 전에 허용되는 살균 방법이다. 세정은 CIP(Clean-In-Place: 클린-인-플레이스) 또는 COP(Clean Out-of-Place: 클린 아웃 오브 플레이스) 방식으로 수행할 수 있다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 접선 유동 여과(TFF)에 의해 세포 배양액을 여과한다. 한 관련 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 교번 접선 유동 여과(ATF)에 의해 세포 배양액을 여과한다. 한 관련 실시형태에서, 상기 TFF 교차 유동 속도는 0보다 크지만 세포에 손상을 야기할 수 있는 것보다 적고, 예를 들면 고압 또는 고 전단 조건은 세포 용해를 야기하거나 세포 배양 조건에 부정적인 영향을 가질 수 있다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 세포 보유 장치는 약 1000s^-1 내지 약 4000s^-1의 낮은 전단 속도를 사용하는 TFF 또는 ATF 조건 하에 작동한다. 한 관련 실시형태에서, 상기 전단 속도는 약 1000s^-1, 또는 약 1500s^-1, 또는 약 2000s^-1, 또는 약 2500s^-1, 또는 약 3000s^-1, 또는 약 3500s^-1, 또는 약 4000s^-1이다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 약 500L/㎡ 내지 약 10,000L/㎡의 필터 수용력을 갖는다. 한 관련 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 약 1000L/㎡, 또는 약 2000L/㎡, 또는 약 3000L/㎡, 또는 약 4000L/㎡, 또는 약 5000L/㎡, 또는 약 6000L/㎡, 또는 약 7000L/㎡, 또는 약 8000L/㎡, 또는 약 9000L/㎡, 또는 약 10,000L/㎡의 필터 수용력을 갖는다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 여과물/여과물에 의한 주기적 역류(periodic backflushing)를 행하여 필터 파울링을 감소시킬 수 있다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 상기 세포 보유 장치는 관류 용기의 외적으로 또는 외부에서 작동한다. 대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 상기 세포 보유 장치는 대상 기술의 중공-섬유 필터를 수용한다(house). 한 관련 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터를 수용하는 필터 하우징은 스테인레스 스틸, 유리, PVDF 또는 기타 플라스틱 재료와 같은 재료들로 제조된다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 세포 보유 장치를 통해 세포 배양액을 순환시키기 위해 또는 상기 세포 보유 장치로부터 여과물을 인출하기 위해 사용되는 펌프 유형은 원심분리형, 연동형, ATF, 사인곡선형(sinusoidal), 회전 로브형, 액체 링형 또는 피스톤형 또는 임의의 기타 저 전단 등가물일 수 있다. 한 관련 실시형태에서, 여과물 유동은 펌프 주입구의 게이지 압력이 0보다 큰 양변위 펌프(positive displacement pump)를 이용하여 조절한다. 다른 관련 실시형태에서, 재순환 펌핑 시스템은 높은 세포 생존력을 유지하고 용액 중의 현탁된 입자의 형성을 감소시키기 위해 저-전단 설계로 이루어져야만 한다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 교체되거나 세정될 필요가 있기 전에 파울링이 이의 생성물 체질 백분율을 10% 이상 또는 20% 이상 감소시킬 수 있기 전에 35일 이하의 수명을 갖는다. 한 관련 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 8일 초과 35일 이하의 수명을 갖거나, 10일 초과 15일 이하의 수명을 갖거나, 17일 초과 35일 이하의 수명을 갖거나, 21일 초과 35일 이하의 수명을 갖거나, 또는 25일 초과 35일 이하의 수명을 갖는다. 한 관련 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 10 내지 35일 또는 12 내지 35일, 또는 15 내지 35일, 또는 17 내지 35일, 또는 20 내지 35일, 또는 25 내지 35일, 또는 27 내지 35일의 수명을 갖는다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 대상 기술의 중공-섬유 필터는 사용 5일 후에 이의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 잃지 않으면서 50kD 이상의 분자량을 갖는 거대분자의 통과를 가능하게 한다. 한 관련 실시형태에서, 중공-섬유 필터는 사용 10일 후에 이의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 잃지 않으면서 50kD 이상의 분자량을 갖는 거대분자의 통과를 가능하게 한다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 공지의 다운스트림 관행(downstream practice)을 사용하여 생성된 재조합 단백질을 정제할 수 있다. 전형적인 정제 프로세스는 세포 분리, 농축, 침전, 크로마토그래피 및 여과 등을 포함할 수 있다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 적용가능한 경우, 상기 세포 보유 장치 또는 상기 중공-섬유 필터로부터의 여과물은 심층 여과(depth filtration) 단계없이 단백질 A 컬럼으로 보내어진다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 적용가능한 경우, 상기 세포 보유 장치 또는 상기 중공-섬유 필터로부터의 여과물은 단백질 A 컬럼으로 보내기 전에 응집 또는 추출 단계를 행한다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 상기 세포 배양액은 세포 배양 배지, 세포 및 재조합 단백질 생성물을 포함한다. 일반적으로, 상기 세포 배양액은 아미노산, 염(예를 들면, 염화 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 인산 나트륨, 염화 마그네슘, 황산 구리, 황산 철, 황산 아연, 질산 철, 이산화 셀레늄, 염화 칼슘 및/또는 세포 배양액 중에 발견될 수 있는 기타 염), 비타민(예를 들면, 비오틴, 콜린 클로라이드, 칼슘 판토테네이트, 엽산, 하이포크산틴, 이노시톨, 니아신아미드, 비타민 C, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 티미딘, 비타민 B-12, 피리독살, 푸트레신 및/또는 세포 배양액 중에 발견될 수 있는 기타 비타민) 또는 기타 구성성분들, 예를 들면 덱스트로스, 만노스, 피루브산 나트륨, 페놀 레드, 글루타티온, 리놀레산, 리포산, 에탄올아민, 메르캅토에탄올, 오르토 포스포릴에탄올아민 및/또는 조직 배양액 중에 발견될 수 있는 기타 구성성분들을 포함할 수 있다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 재조합 단백질 생성물을 생산하는 대상 기술의 배양 용기에 사용된 세포는 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포 및 세균 세포를 포함하는 임의의 진핵생물 또는 원핵생물 세포일 수 있다. 몇몇의 실시형태들에서, 상기 세포는 포유동물 세포, 예를 들면 BHK(새끼 햄스터 신장) 세포, CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포, HKB(신장 및 B 세포의 하이브리드) 세포, HEK(사람 배아 신장) 세포, 및 NSO 세포이다. 상기 포유동물 세포는 모노클로날 항체를 발현하는 재조합 세포일 수 있다.

대상 기술의 상기 양상들 중 어느 하나에 관련되어 있는 다른 실시형태에서, 재조합 단백질 생성물은 항체 분자, 모노클로날 항체 또는 이들의 단편, 재조합 단백질 생성물, 예를 들면 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX 및 인자 X를 포함하는 응고 인자를 포함하는 임의의 단백질 생성물일 수 있다.

실시예

실시예 1

세포 보유 멤브레인 및 배양액 유동 프로파일

관류 세포 배양에 사용된 세포 보유 멤브레인은 보통 접선 유동 여과 방식(TFF)으로 작동되고, 0.2 미크론 미만의 공극을 갖는 변형된 또는 비변형된 폴리스티렌(PS), 폴리에테르설폰(PES), 폴리(비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 등과 같은 중합체 재료로 이루어진다. 다수의 프로세스들의 경우, 세포는 생물반응기 내에 보유되고, 소비된 배지 및 생성물 분자는 포획 및 정제될 수 있는 필터 재료를 통해 통과하는 것이 바람직하다. 도 2(좌측 패널). 관류 세포 배양에서 작동시에 그리고 세포 잔해 및 거대분자에 의한 파울링(막힘)으로 인하여 필터 멤브레인은 점차적으로 이들의 체질 수용력을 잃어 멤브레인을 통해 심지어 생성물 분자의 이동도 억제하는 분자 체(molecular sieve)로서 작용하고, 이에 의해 생성물 회수가 현저하게 감소된다. 도 2(우측 패널). 도 2(우측 패널)에 도시된 바와 같이, 체질 능력은 생물반응기 내의 생성물 농도에 대한 여과물 중의 생성물 농도의 비로서 0.2 미크론 필터 멤브레인에서 측정된다.

양호한 체질 조건을 위해, 생성물의 100%가 필터를 통해 통과해야만 한다. 그러나, 시간 경과에 따라 필터를 통해 통과하는 생성물의 양이 감소한다. 체질은 TFF 시스템보다 교번 접선 유동(ATF) 여과 방식 시스템에서 더 우수하다. ATF 시스템은 파울링의 영향을 감소시키는 것으로 밝혀진 펌프 시스템이다. 이는 바람직한 시스템은 아니고, 생성물의 50%가 멤브레인을 통해 통과하는 15일째에 표시된 바와 같이 파울링을 완전히 감소시키는 것은 아니다. 체질을 감소시키기 위한 시도로서 여과물을 펄싱하거나(pulse) 역류(backflow)시킬 수 있지만, 이러한 방법은 제한된 성공을 거두었다. 다른 사람들은 유동 특성의 변화 및 필터 멤브레인 구조에 대한 보다 적은 정도의 변형을 통해 체질 문제를 해소하는 것을 시도하였다.

실시예 2

입자 크기 분포 및 분석

이 실시예의 목표는 0.2 미크론 필터의 여과물, 여과물 중에 재현탁된 세포 배양 펠렛, 및 세포 배양 상청액 중의 입자들/잔해의 입자 크기를 측정하는 것이었다. 도 3.

생성물 체질에 가장 크게 기여하는 입자 크기 범위를 결정하기 위해, 세포 배양을 3개의 그룹으로 나누었고, 새로운 0.2㎛ 중공 섬유를 사용하여 오프라인으로 생성물 체질하는 것을 개별적으로 평가하였다. 이 실시예를 수행하기 위해, 세포 방출의 개시 전에 배양의 8일째에 관류 반응기로부터 여과물 및 세포 배양물을 수집하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 크기에 따라 세포 배양 물질을 분리하였다. 따라서 3개의 별개의 샘플들이 얻어졌다: A) 여과물 스트림 중의 물질(10nm 미만의 직경), B) 여과물 중에 재현탁된 세포 펠렛(10nm 미만 및 1um 초과의 직경), 및 C) 반응기 상청액 중의 물질.

이어서, 각각의 분리된 섹션을 관류 설정(setup)을 모방한 미사용 0.2㎛ PS 중공 섬유를 통해 순환시켰다. 여과물 및 공급 라인으로부터의 샘플을 명시된 시점에서 채취하였다. 생성물의 농도는 Cedex BioHT를 사용하여 측정하였고, 생성물 체질은 공급물 중의 IgG 농도를 초과하는 여과물 중의 IgG 농도로서 표현되었다. 입자 크기 분석은 Malvern Zetasizer Nano ZS를 사용하여 수행하였다.

입자 크기 분포 및 후속적인 좋지 않은 체질 프로파일은 도 3에 도시된다. 샘플 (A) 및 (B)는 실험의 전체 지속기간 동안 임의의 유의한 생성물 체질을 초래하지 않았다. 100nm 크기 범위의 1차 입자를 함유하는 세포 배양 상청액인 샘플 (C)를 새로운 0.2㎛ 중공 섬유에 도입했을 때, 생성물 체질은 극심하였고 거의 즉각적이었다. 도 3(C).

결과는 반응기 상청액으로부터의 물질/재료는 TFF 시스템을 통해 통과했을 때 통과의 0.4시간째 및 6시간째에 좋지 않은 체질을 초래하고, 한편 보다 큰 입자 크기 및 보다 작은 입자 크기는 좋지 않은 체질을 나타내지 않음을 보여준다. 이어서, 약 80nm 내지 200nm 범위의 크기 또는 아마도 거의 500nm의 크기를 갖는 상청액 중에 함유된 입자/잔해는 0.2㎛ 필터에서 공극 차단(blockage)을 야기하여 좋지 못한 체질을 유도한다고 결론을 내렸다.

실시예 3

0.45㎛ 내지 500KD 범위의 공극 크기를 갖는 필터

실시예 2에서 수행된 입자 크기 분포 분석에 기초하여, 잔해보다 더 크거나 더 작은 공극을 갖는 필터 멤브레인이 공극을 차단하지 않아야만 한다고 가정되었다.

0.45um 하한(down) 내지 500kD의 공극 크기의 범위가 조사되었다. 전부 실험의 전체 시간 과정에 걸쳐 생성물 회수가 감소한 것으로 입증되었다. 그러나, 실험 결과는 보다 작은 공극 크기 멤브레인이 허용가능한 체질 프로파일을 초래하지 않았음을 보여주었다. 또한, 체질 프로파일은 보다 큰 공극 크기, 예를 들면 0.45㎛를 갖는 멤브레인에서 0.2um 필터만큼 좋지 않거나 또는 그보다 더 좋지 않았다. 도 4.

0.2㎛보다 더 작은 공극 크기가 생성물 체질 현상에 도움이 되지 않았다고 결론 내렸다. 흥미롭게도, 보다 큰 공칭 공극 크기(0.45㎛)를 사용하는 것은 이로운 영향을 갖지 않는 것으로 밝혀졌고, 0.2um에 비해 소정 시점에서 생성물 체질을 심지어 악화시켰다.

실시예 4

보다 큰 공극 크기를 갖는 필터

0.2㎛보다 더 큰 공극 크기를 갖는 필터에 관한 실시예 3의 결과 및 보다 큰 공극 필터의 이점의 부족에 관한 당해 분야의 교시에도 불구하고, 출원인은 보다 더 큰 공극 크기(예를 들면, 5 내지 7.7㎛)를 갖는 중공-섬유 필터의 체질 특성을 결정하는 것으로 설정하였다. 5㎛ 이상의 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터 카트릿지(cartridge)는 Spectrum Laboratories, Inc.(Rancho Dominguez, CA)로부터 수득하였다.

세포 자체가 거의 동일한 크기(약 10 내지 15㎛)였으므로 상기 보다 큰 공극이 살아있는 세포에 의해 차단될 것으로 예상되었다. 멤브레인 공극 크기는 넓은 범위를 가지므로, 5㎛의 공칭 공극 크기를 갖는 멤브레인은 1㎛ 내지 15㎛의 공극을 가질 수 있다. 또한, 공극 크기 분포로 인하여 세포가 멤브레인을 통과하거나 멤브레인에서 용해되어 멤브레인을 신속하게 파울링시킬 것으로 예상되었다. 멤브레인의 수명은 짧을 것(100 내지 500L/㎡ 미만)으로 예상되었다. 또한, 더 큰 공극 크기는 공극이 세포의 길이 규모에 따라 사실상 고르지 않기 때문에 생존가능한 세포를 용해시키거나 손상시킬 것이고, 세포를 천공시키거나 손상시킬 수 있는 것으로 예측되었다. 또한, 더 작은 공극은 더 작은 잔해로 신속하게 파울링되어 체질 또는 낮은 수명(100 내지 500L/㎡ 이하)을 보일 것으로 예상되었다.

그러나, 결과는 놀라웠다. 관류 세포 배양에 사용된 정상 범위 밖의 보다 더 큰 공극 크기(예를 들면, 5 내지 7.7㎛)로 가는 것이 우수한 체질 특성을 나타낸 것으로 측정되었다. 도 5. 세포 잔해가 필터를 통해 통과하는 것으로 추정되었고, 도 5에 도시된 바와 같이 여과물 중의 물질의 입자 크기 분포가 보다 큰 공극 크기 필터에 대해 더 큰 것으로 측정되었다.

그러나, 더 큰 공극 크기 멤브레인을 통해 통과하는 더 큰 물질의 양이 더 많은 양에도 불구하고, 놀랍게도 여과물의 탁도는 그다지 높지 않았다. 놀랍게도, 큰 공극 크기의 막은 생존가능한 세포에 의해 차단되지 않았다. 세포 생존력에 대한 심각한 부정적 영향도 없었다. 도 6.

실시예 5

관류 프로세스에서의 7㎛ 및 0.2㎛ 필터의 비교

이 실시예에서, 대상 기술에 따른 7㎛의 평균 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터의 생성물 체질 백분율을 유사한 관류 세포 배양 조건 하의 표준 0.2㎛ 중공-섬유 필터의 것과 비교하였다.

도 7에 도시된 바와 같이, 7㎛ 공극-크기는 관류 프로세스(즉, 원형 관류)의 지속기간에 걸쳐 우수한 체질 특성을 허용한다. 또한, 놀랍게도 7㎛ 멤브레인의 수명(또는 수용력)은 1000L/㎡를 초과하여 상당이 높았고, 소정 프로세스에 대해서는 16,000L/㎡ 이상으로 실행되었다. 이러한 멤브레인 수명은 특히 세포, 잔해, 생성물 및 소비된 배지를 함유한 공급물의 오염된 특성이 고려하면 매우 높았다.

실시예 6

단백질 A 컬럼에 대한 여과물의 영향

앞서 논의한 바와 같이, 공극 차단 세포 잔해가 필터를 통해 통과하는 것으로 추정되었고, 상기 도 5에서 나타내어진 바와 같이 여과물 중의 물질의 입자 크기 분포가 보다 큰 공극 크기에 대해 더 크다는 것을 알 수 있었다. 놀랍게도, 이러한 여분의 잔해 부하는 거동의 유의한 부정적 변화 없이 단백질 A 컬럼에 의해 취급될 수 있다. 단백질 A 컬럼을 작동시킬 수 있는 사이클 횟수가 현저하게 감소할 것으로 예상되지만, 이는 임의의 비정상적인 현상 없이 최대 42 사이클이 수행되었으므로 관찰되지 않았다. 표 1을 참조한다.

놀랍게도, 세포에 의해 또는 세포 용해의 결과로서 분비된 다른 큰 분자량 물질도 5㎛ 필터를 통해 통과한다. 이러한 통과는 보다 우수하고 보다 일관된 세포 배양 조건을 초래한다. 일례로서, 효소 LDH는 5㎛ 필터를 통해 통과하지만, 0.2㎛ 필터를 통해 쉽게 통과하지 못한다(데이터 도시하지 않음).

보다 큰 공극 크기는 불순물이 필터를 통해 통과하여 다운스트림으로 통과하도록 한다. 이러한 잔해의 영향이 단백질 A 컬럼에 유의한 영향을 미치는 것은 아니지만, 잔해 부하를 감소시키기 위해 여과물을 처리하는 방법을 생각할 수 있다. 심층 여과, 데드 엔드(dead end) 여과, TFF, 음향영동(accoustophoretic) 여과 또는 응집제의 사용 또는 저 pH 처리와 같은 방법을 사용하여 다운스트림의 잔해 부하를 감소시킬 수 있다. 도 8은 작동중인 대상 기술의 세포 보유 장치의 사진을 제공한다.

실시예 7

필터 수용력

이러한 실험의 목적은 2개의 상이한 세포주를 사용하여 5μm 중공-섬유 필터의 필터 수용력을 측정하는 것이었다.

필터 수용력은 필터 표면적에 대한 중공 섬유를 통해 관류된 액체 용적으로서 정의된다. 이 실시예에서, 모노클로날 항체를 생산하는 2개의 상이한 인-하우스 등록 상표 재조합 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주(세포주 1 및 세포주 2)를, 7mm의 내강 직경 및 50㎠의 표면적을 갖는, 알파 알루미나 재료로 이루어진 5㎛의 평균 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터(Pall, Deland, FL로부터 구매한 Membralox 미세여과 필터)를 포함하는 세포 보유 장치가 각각 구비된 2개의 개별 관류 생물반응기에서 TFF 관류 방식으로 실행하였다.

도 9a 및 도 9b에 도시한 바와 같이, 2개의 세포주 사이에 거의 2배의 필터 수용력 차이가 관찰된다. 그러나, 상기 경우 둘 다에서의 필터 수용력은 매우 높았다(4000L/㎡ 초과). 세포 배양 생존력은 상기 생물반응기 둘 다에서 90% 초과를 유지하였다.

따라서, 필터 수용력은 보유되는 세포주에 의존한 것으로 측정되었다. 그러나, 당해 결과는 대상 기술에 따라 사용된 5㎛ 중공-섬유 필터의 필터 수용력이 매우 높았음(4000L/㎡ 초과)을 보여주었다.

실시예 8

생성물 체질 프로파일

이 실험의 목적은 실시예 7에서 사용된 중공-섬유 필터의 생성물 체질(회수) 프로파일을 측정하기 위한 것이었다.

이 실시예에서, 모노클로날 항체를 생산하는 인-하우스 등록 상표 재조합 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주 1를, 7mm의 내강 직경 및 50㎠의 표면적을 갖는, 알파 알루미나 재료로 이루어진 5㎛의 평균 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터(Pall, Deland, FL로부터 구매한 Membralox 미세여과 필터)를 포함하는 세포 보유 장치가 구비된 관류 생물반응기에서 TFF 관류 방식으로 실행하였다(실시예 7에서와 같음).

도 10에 나타낸 바와 같이, 0.2㎛ 중공-섬유 필터의 생성물 체질의 점진적 감소와 달리, 대상 기술에 따른 중공-섬유 필터의 생성물 체질은 거의 100%까지 그리고 필터 수용력에 도달할 때까지 유지된다. 이러한 거동 또는 체질 프로파일은 놀라운 것이었고, 멤브레인 수용력에 도달할 때까지 생성물의 거의 완전한 통과를 허용한다. 즉, 대상 기술의 필터는 필터 수용력에 도달할 때까지 생성물 회수가 거의 또는 전혀 감소하지 않고 오랜 기간 동안 사용될 수 있으며, 이는 최대량의 생성물을 회수하는데 예측가능성 및 효율성을 제공한다.

청구된 방법의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 기술된 실시형태들에 대해 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있음은 당해 분야 숙련가들에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 청구된 방법은 첨부된 청구범위 및 이들의 등가 범위 내에 있는 한, 본원에 기술된 실시형태들의 수정 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에 개시된 장치 및 방법은 연결된 관류 생물제조(biomanufacturing)에 유용하고, 따라서 재조합, 치료학적 단백질을 제조하기 위한 산업적 방법을 개선시키는데 유용하다.

Claims (46)

1. 5 내지 8㎛ 범위의 평균 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터를 포함하는 세포 보유 장치로서, 상기 중공-섬유 필터가 1000 내지 10,000L/M²의 필터 수용력(capacity)을 갖고, 상기 중공-섬유 필터가 막히거나 상기 필터의 생성물 체질 능력(product sieving ability)의 10% 초과를 잃지 않으면서 10일 이하 동안 작동하는, 세포 보유 장치.
2. 제1항에 있어서, 상기 세포 보유 장치가 관류 세포 배양 용기 외부에 존재하는, 세포 보유 장치.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가, 5㎛ 이상이지만 세포 배양 용기에서 배양되는 생존가능한 세포의 크기 미만인 평균 공극 크기를 갖는, 세포 보유 장치.
5. 제1항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 생존가능한 세포의 크기보다 5㎛ 이하만큼 더 큰 평균 공극 크기를 갖는, 세포 보유 장치.
6. 제1항에 있어서, 상기 세포 보유 장치가 접선 유동 여과(TFF: tangential-flow filtration)에 의해 또는 교번 접선 유동 여과(ATF: alternating tangential flow filtration)에 의해 작동하도록 구성된, 세포 보유 장치.
7. 제6항에 있어서, 상기 TFF 또는 ATF가 1000s^-1 내지 4000s^-1의 낮은 전단 속도 하에 작동하도록 구성된, 세포 보유 장치.
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 상기 세포 보유 장치가 관류 배양 용기와 협력하여 작동하도록 구성된, 세포 보유 장치.
10. 제1항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 세라믹, 중합체 또는 금속성 재료로 이루어진, 세포 보유 장치.
11. 제1항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 막히거나 상기 필터의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 잃지 않으면서 35일 이하 동안 작동하는, 세포 보유 장치.
12. 제10항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 2000s^-1 이하의 낮은 전단 속도 또는 4000L/㎡ 이상의 관류 유동 속도 하에 TFF 또는 ATF 방식으로 작동하는, 세포 보유 장치.
13. 제10항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 여과물의 수집을 용이하게 하는 하우징(housing) 내에 존재하는, 세포 보유 장치.
14. 관류 배양 용기로부터 재조합 단백질 생성물을 수거하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 관류 배양 용기의 세포 배양액을 세포 보유 장치에 보내어 여과되도록 하는 단계(여기서, 상기 세포 배양액은 세포 및 상기 세포에 의해 생산된 재조합 단백질 생성물을 포함하고, 상기 세포 보유 장치는 5 내지 8㎛ 범위의 평균 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터를 포함하고, 상기 중공-섬유 필터는 1000 내지 10,000L/M²의 필터 수용력을 갖고, 상기 중공-섬유 필터는 막히거나 상기 필터의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 잃지 않으면서 10일 이하 동안 작동한다);
    b. 상기 세포 보유 장치로부터 여과물을 수집하는 단계(여기서, 상기 여과물은 재조합 단백질 생성물을 포함한다);
    c. 상기 여과된 세포 배양액을 상기 관류 배양 용기에 재순환시키는 단계
    를 포함하는, 관류 배양 용기로부터 재조합 단백질 생성물을 수거하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 세포 보유 장치가 상기 관류 배양 용기 외부에 존재하는, 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 접선-유동 여과(TFF) 또는 교번 접선 유동 여과(ATF)에 의해 상기 세포 배양액을 여과하는, 방법.
17. 삭제
18. 제14항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 5미크론 이상이지만 상기 세포의 크기 미만인 평균 공극 크기를 갖는, 방법.
19. 제14항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 상기 세포의 크기보다 5㎛ 이하만큼 더 큰 평균 공극 크기를 갖는, 방법
20. 제14항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 상기 세포의 크기인 평균 공극 크기를 갖는, 방법.
21. 제14항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 세라믹, 금속성 또는 중합체 재료로 이루어진, 방법.
22. 제14항에 있어서, 상기 여과물이 상기 재조합 단백질 생성물을 포함하지만 생존가능한 세포는 없는, 방법.
23. 제14항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 막히거나 상기 필터의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 잃지 않으면서 35일 이하 동안 작동하는, 방법.
24. 제14항에 있어서, 상기 세포 보유 장치가 1000s^-1 내지 4000s^-1의 낮은 전단 속도 하에 TFF 또는 ATF 방식으로 작동하는, 방법.
25. 삭제
26. 삭제
27. a. 세포 배양액을 함유하도록 구성된 관류 배양 용기(여기서, 상기 세포 배양액은 액체 배지, 세포 및 상기 세포에 의해 생산된 재조합 단백질 생성물을 포함한다);
    b. 상기 세포 배양액을 수용하고 상기 세포 배양액을 여과하여 재조합 단백질 생성물을 포함하는 여과물을 제공하도록 구성된 세포 보유 장치(여기서, 상기 세포 보유 장치는 5 내지 8㎛ 범위의 평균 공극 크기를 갖는 중공-섬유 필터를 포함하고, 상기 중공-섬유 필터는 1000 내지 10,000L/M²의 필터 수용력을 갖고, 상기 중공-섬유 필터는 막히거나 상기 필터의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 잃지 않으면서 10일 이하 동안 작동한다); 및
    c. 상기 세포 배양액을 상기 관류 배양 용기로부터 상기 세포 보유 장치로 순환시키고 상기 관류 배양 용기로 되돌리기 위한 펌프 및 유체 커넥터(fluid connector)
    를 포함하는, 관류 배양 시스템.
28. 제27항에 있어서, 상기 세포 보유 장치가 상기 관류 배양 용기의 외부에 존재하는, 관류 배양 시스템.
29. 제27항에 있어서, 상기 세포 보유 장치가 접선-유동 여과(TFF) 또는 교번 접선 유동 여과(ATF)에 의해 작동하는, 관류 배양 시스템.
30. 삭제
31. 제27항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 5미크론 이상이지만 상기 세포의 크기보다 작은 평균 공극 크기를 갖는, 관류 배양 시스템.
32. 제27항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 상기 세포의 크기보다 5㎛ 이하만큼 더 큰 평균 공극 크기를 갖는, 관류 배양 시스템.
33. 제27항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 상기 세포의 크기인 평균 공극 크기를 갖는, 관류 배양 시스템.
34. 제27항에 있어서, 상기 여과물이 상기 재조합 단백질 생성물을 포함하지만 생존가능한 세포는 없는, 관류 배양 시스템.
35. 제27항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 세라믹, 금속성 또는 중합체 재료 또는 이들의 조합으로 이루어진, 관류 배양 시스템.
36. 제27항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 막히거나 상기 필터의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 잃지 않으면서 35일 이하 동안 작동하는, 관류 배양 시스템.
37. 제27항에 있어서, 상기 세포 보유 장치가 1000s^-1 내지 4000s^-1의 낮은 전단 속도 하에 TFF 또는 ATF 방식으로 작동하는, 관류 배양 시스템.
38. 삭제
39. 제27항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 이의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 상실하지 않으면서 사용 5일 후에 50kD 이상의 분자량을 갖는 거대분자의 통과를 가능하게 하는, 관류 배양 시스템.
40. 제27항에 있어서, 상기 중공-섬유 필터가 이의 생성물 체질 능력의 10% 초과를 상실하지 않으면서 사용 10일 후에 50kD 이상의 분자량을 갖는 거대분자의 통과를 가능하게 하는, 관류 배양 시스템.
41. 제27항에 있어서, 상기 여과물이 심층 여과(depth filtration) 단계없이 단백질 A 컬럼에 보내어지는, 관류 배양 시스템.
42. 제27항에 있어서, 상기 여과물이 단백질 A 컬럼에 보내어지기 전에 응집(flocculation) 단계가 행해지는, 관류 배양 시스템.
43. 제27항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 세균 세포를 포함하는, 관류 배양 시스템.
44. 제27항에 있어서, 상기 세포가 BHK(새끼 햄스터 신장) 세포, CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포, HKB(신장 및 B 세포의 하이브리드) 세포, HEK(사람 배아 신장) 세포 및 NSO 세포를 포함하는, 관류 배양 시스템.
45. 제27항에 있어서, 상기 재조합 단백질 생성물이 모노클로날 항체 또는 이의 단편인, 관류 배양 시스템.
46. 제27항에 있어서, 상기 재조합 단백질 생성물이 치료학적 단백질, 호르몬 또는 효소인, 관류 배양 시스템.

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