CN109072154A - 细胞保留装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本技术涉及细胞保留装置和用于灌注细胞培养系统中的方法，其中所述细胞保留装置包括中空纤维过滤器，其具有范围为约0.5至约20μm的平均孔径且具有在灌注细胞培养条件下操作最长达35天而不会堵塞或损失其产物筛分能力多于20％的能力。

Description

细胞保留装置和方法
领域
本技术总体涉及细胞保留装置和在灌注细胞培养系统中使用其的方法。具体而言，本技术涉及含有中空纤维过滤器的外部细胞保留装置和在灌注细胞培养系统中使用其的方法。
背景
灌注是用于产生重组生物产品诸如抗体、治疗性蛋白质、血液因子(例如凝血蛋白)和酶的细胞培养模式。与分批或补料分批模式不同，灌注模式涉及将活细胞保留在生物反应器内，同时连续地从生物反应器移除耗竭的培养基和产物并用新鲜培养基替换它们。在新鲜培养基存在的情况下，细胞继续繁殖并产生更多产物。因此，在灌注中需要分离装置，即细胞保留装置，以将活细胞保留在生物反应器内，同时允许耗竭的培养基和产物离开。
许多细胞保留装置在较小或较小程度上以小规模表现良好，包括基于离心力(离心机、水力旋流器)、过滤(旋转过滤器、切向流过滤器(TFF)、交替切向流过滤器(ATF)、动态过滤器)、重力沉降、超声波和介电泳分离的那些。但仅少数类型，例如具有旋转过滤器的ATF、细胞沉降器和离心机在较大规模上是可靠的，并且可扩展足以用于生物工业用途，参见Bonham-Carter等人,a Brief History of Perfusion Biomaufacturing,BioprocessInternational,vol.9(9):24-30,Oct.2011。
对于基于过滤操作的细胞保留装置，为了维持长期灌注培养性能，过滤器设计和操作必须减轻细胞、细胞碎片和大分子对过滤表面的结垢(堵塞)。当这些组分通过滤液通量(流过过滤器)在过滤器表面浓缩时发生结垢，该过程称为浓差极化。过滤器结垢不仅限制过滤速率，而且可以导致生物反应器内的高分子量产物的超滤保留。通常，设计过滤系统，使得细胞和细胞材料的积聚通过与过滤器表面(例如，TTF或ATF)相切的流动以不会不利地影响细胞的活力的流体剪切速率降低。作用于剪切场中的细胞的流体动力学升力也可以在减少细胞、细胞碎片和大分子的过滤器堵塞中发挥作用。
以下参考文献在该领域中是值得注意的：(1)Woodside等人Mammalian CellRetention Devices for Stirred Perfusion Bioreactors,Cytotechnology,28(1-3):163-175,November 1998；(2)US 2011/0201050和(3)WO2010/003759。
Woodside等人讨论了用于灌注生物反应器的哺乳动物细胞保留装置。Woodside等人指出灌注反应器设计和操作的一个重要问题是细胞保留装置的可靠性，因为细胞培养条件的变化可以导致蛋白质产物中的翻译后修饰不一致。他们讨论了一些不同的细胞保留技术以及它们对大规模灌注的稳定性的优点和限制。
关于交叉流过滤器诸如适用于哺乳动物细胞灌注应用的中空纤维和平板类型，Woodside等人说明大多数报道的交叉流过滤器使用具有0.2至0.65μm的孔径的微孔膜。预期此类相对小的孔比较大孔过滤器更容易堵塞。然而，5μm孔平板滤膜需要在灌注期间每隔5天更换，过滤通量为1L m-2h-1，而2和10μm直径孔膜需要在灌注期间每隔5至7天更换，过滤通量为4L m-2h-1。因此，这些较大的孔过滤器没有明显的优点，特别是考虑到10μm膜的较差的细胞保留效率(<70％)。
US2011/0201050描述了一种气体洗涤灌注过滤器，其中采用以快速行进的细小气泡来洗涤具有5微米或更小的孔径的中空纤维过滤器，以防止它们被细胞碎片和大分子结垢。通过推荐气体洗涤步骤，US2011/0201050不仅使细胞培养系统的设计更复杂，而且还没有提供关于这种步骤是否可以实际解决结垢问题的数据。其也没有提供洗涤步骤对细胞培养条件和产物产率的一致性的影响的任何数据。
WO2010/003759描述了一种细胞培养方法，其使用具有切向流的保留装置和中空纤维过滤器，其中“孔径优选为至少0.1μm，更优选至少0.2μm；作为上限，孔径优选不大于30μm，更优选不大于20μm”。WO2010/003759要求生物反应器的流体含量在循环通过保留装置之前与含氧气体组合物接触。不清楚“气流”在WO2010/003759的方法/装置中的功能是什么，或者其是否是US2011/0201050中教导的洗涤装置。在任何情况下，WO2010/003759没有提供任何支持其提出的理论的实际数据，并且看起来主要涉及氧转移至细胞培养物中。其也不能解决其方法/装置是否在实践中起作用以解决过滤器中的结垢或筛分问题的问题。
与在生物反应器内操作且在几个主要方面不同于交叉流过滤器的旋流过滤器不同，中空纤维过滤器在生物反应器的外部和之外操作。在使用时，将来自生物反应器的细胞培养液泵送至过滤器定位的壳体，并在其流过膜时被浓缩。将浓缩的悬浮液流再循环至生物反应器，而无细胞滤液形成流出流并流入下一个单元操作，例如蛋白A柱，用于进一步纯化和分离蛋白质产物。由于结垢，目前，中空纤维过滤器必须每5-7天更换，即在灌注细胞培养期间更换一次或两次。更换过滤器涉及在细胞培养条件中引入污染或变化的成本、劳动力和风险，这不利地影响灌注细胞培养操作。
因此，结垢仍然是基于过滤器的细胞保留装置的问题，特别是具有中空纤维过滤器的那些。结垢降低过滤器的效率和使用期限，并且不允许过滤器经长时间段一致地发挥功能。另一个问题是缺乏用于防止基于过滤器的细胞保留装置中的结垢或筛分的稳定且可扩展的技术。如Bonham-Carter等人所建议，一些技术诸如TFF已经由于其可扩展性限制或缺乏证明的市场接受而被放弃。
因此，需要改进的保留装置和过滤器，其克服了上面讨论的问题。
概述
本技术部分基于以下令人惊讶的发现：以TFF模式操作的大孔径(～5-10μm)中空纤维过滤器解决了灌注培养系统中的结垢问题，并且有效且一致地操作最长达35天，而没有显著失去它们的产物筛分容量。本技术的细胞保留装置和方法通过TFF实现高产物筛分，而无需特别处理(例如，气体洗涤)，无需特别设计来增加跨越过滤器的压力梯度(包括施加背压或增加剪切或流速)，无需改变灌注速率，无需维持与细胞保留装置的体积相关的特定灌注体积，或无需在使细胞培养液循环通过本技术的细胞保留装置之前用特定组合物(例如，含氧的组合物)处理细胞培养液(生物反应器内容物)。
例如，根据下面描述的各个方面，说明了本技术。
在一个方面，本技术涉及细胞保留装置，其含有具有范围为约0.5至约20μm的平均孔径的中空纤维过滤器。在与该方面直接或间接相关的一个或多个实施方案中：所述细胞保留装置在灌注细胞培养容器外部；所述中空纤维过滤器具有选自以下的平均孔径：约5至约8μm、5μm至15μm、5.2μm至12μm、5.5μm至8μm、5.2μm至7.7μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、15μm或高于5μm的任何尺寸，其可以保留活细胞，同时允许死细胞、细胞碎片或大分子通过过滤器；所述中空纤维过滤器具有等于或大于5μm、但小于在细胞培养容器中培养的活细胞的尺寸的平均孔径；所述中空纤维过滤器具有比活细胞的尺寸大5μm或更小的平均孔径；所述细胞保留装置被配置为通过切向流过滤(TFF)或通过交替切向流过滤(ATF)操作；TTF或ATF被配置为在约1000s-1至约4000s-1的低剪切速率下操作；所述中空纤维过滤器具有约1000至约10,000L/M2的过滤容量；所述细胞保留装置被配置为与灌注培养容器共同操作；所述中空纤维过滤器由陶瓷、聚合物或金属材料制成；所述中空纤维过滤器操作最长达35天而不会堵塞或损失多于10％的其产物筛分能力；所述中空纤维过滤器在2000s-1或更低的低剪切速率或等于或大于4000L/M2的灌注流速下以TTF或ATF模式操作；所述中空纤维过滤器在便于收集滤液的壳体中。
在另一个方面，本技术涉及用于从灌注培养容器收获重组蛋白质产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使灌注培养容器的细胞培养液经受细胞保留装置以便被过滤，其中所述细胞培养液包含细胞和由所述细胞产生的重组蛋白质产物，且其中所述细胞保留装置包含具有范围为约0.5至约20μm的平均孔径的中空纤维过滤器；(b)从所述细胞保留装置收集滤液，其中所述滤液包含重组蛋白质产物；和(c)将过滤的细胞培养液再循环至所述灌注培养容器。在与该方面直接或间接相关的一个或多个实施方案中：所述细胞保留装置在灌注细胞培养容器外部；所述中空纤维过滤器通过切向流过滤(TFF)或交替切向流过滤(ATF)过滤细胞培养液；所述中空纤维过滤器具有选自以下的平均孔径：约5至约8微米、5μm至15μm、5.2μm至12μm、5.5μm至8μm、5.2μm至7.7μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、15μm或高于5μm的任何尺寸，其可以保留活细胞，同时允许死细胞、细胞碎片或大分子通过过滤器；所述中空纤维过滤器具有等于或大于5微米、但小于所述细胞的尺寸的平均孔径；所述中空纤维过滤器具有比所述细胞的尺寸大5μm或更小的平均孔径；所述中空纤维过滤器具有约为所述细胞的尺寸的平均孔径；所述中空纤维过滤器由陶瓷、金属或聚合物材料制成；所述滤液包含重组蛋白质产物，但缺乏活细胞；所述中空纤维过滤器操作最长达35天而不会堵塞或损失多于10％的其产物筛分能力；所述细胞保留装置在约1000s-1至约4000s-1的低剪切速率下以TTF或ATF模式操作；所述中空纤维过滤器具有约1000至约10,000L/M2的过滤容量。在另一个实施方案中，本技术涉及根据该方面或其任何实施方案制备的蛋白质。
在另一个方面，本技术涉及灌注培养系统，其包括：(a)配置为含有细胞培养液的灌注培养容器，其中所述细胞培养液包含液体培养基、细胞和由所述细胞产生的重组蛋白质产物；(b)细胞保留装置，其被配置为接收细胞培养液并将其过滤以提供包含重组蛋白质产物的滤液，其中所述细胞保留装置包含具有范围为约0.5至约20μm的平均孔径的中空纤维过滤器；和(c)泵和流体连接器，其用于将细胞培养液从灌注培养容器循环至细胞保留装置且返回至灌注培养容器。在与该方面直接或间接相关的一个或多个实施方案中：所述细胞保留装置在灌注细胞培养容器外部；所述细胞保留装置通过切向流过滤(TFF)或交替切向流过滤(ATF)操作；所述中空纤维过滤器具有选自以下的平均孔径：约5至约8微米、5μm至15μm、5.2μm至12μm、5.5μm至8μm、5.2μm至7.7μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、15μm或高于5μm的任何尺寸，其可以保留活细胞，同时允许死细胞、细胞碎片或大分子通过过滤器；所述中空纤维过滤器具有等于或大于5微米、但小于所述细胞的尺寸的平均孔径；所述中空纤维过滤器具有比所述细胞的尺寸大5μm或更小的平均孔径；所述中空纤维过滤器具有约为所述细胞的尺寸的平均孔径；所述滤液包含重组蛋白质产物，但缺乏活细胞；所述中空纤维过滤器由陶瓷、金属或聚合物材料或其组合制成；所述中空纤维过滤器操作最长达约35天而不会堵塞或损失多于10％的其产物筛分能力；所述细胞保留装置在约1000s-1至约4000s-1的低剪切速率下以TTF或ATF模式操作；所述中空纤维过滤器具有约1000至约10,000L/M2的过滤容量；所述中空纤维过滤器在使用5天后允许具有等于或大于50kD的分子量的大分子通过，而不会损失多于10％的其产物筛分能力；所述中空纤维过滤器在使用10天后允许具有等于或大于50kD的分子量的大分子通过，而不会损失多于10％的其产物筛分能力；所述滤液在没有深度过滤步骤的情况下经受蛋白A柱；在经受蛋白A柱前，所述滤液经受絮凝步骤；所述细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；所述细胞包括BHK(幼仓鼠肾)细胞、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、HKB(肾和B细胞杂交)细胞、HEK(人胚肾)细胞和NSO细胞；所述重组蛋白质产物是单克隆抗体或其片段；所述重组蛋白质产物是治疗性蛋白质、激素或酶。
附图简述
当参考附图阅读以下详述时，更好地理解请求保护的方法、设备和系统的这些和其他特征、方面和优点：
图1是在典型的灌注细胞培养系统中显示的本技术的细胞保留装置6的示意图。下面将给出所示元件的详细解释。
图2(左小图)是操作中允许细胞碎片和产物作为滤液通过、同时保留活细胞(典型直径为12-15μm)的滤膜(0.2μm)的示意图。图2(右小图)是显示0.2μm过滤器的过滤概况作为在两种不同流动条件(TTF和ATF)下筛分的量度的图。
图3显示实施例2中描述的关于(A)0.2μm过滤器的滤液中、(B)重悬浮于滤液中的细胞培养颗粒中和(C)细胞培养上清液中存在的颗粒/碎片(A)的粒径的发现。图3(A)、左小图显示，对于来自另一个0.2μm膜的滤液的颗粒，％筛分是高的。图3(A)、右小图是滤液中存在的颗粒的尺寸分布。图3(B)、左小图显示，对于来自重悬浮于另一个0.2μm膜的滤液中的CHO细胞培养沉淀的颗粒，％筛分继续保持高水平。图3(B)、右小图显示来自重悬浮于另一个0.2μm膜的滤液中的CHO细胞培养沉淀的颗粒的尺寸分布。图3(C)、左小图显示，对于来自生物反应器的细胞培养上清液的颗粒，％筛分是低的。图3(C)、右小图显示来自生物反应器的细胞培养上清液的颗粒的尺寸分布。
图4是作为使细胞培养上清液通过具有不同孔径的中空纤维的结果的示意性产物筛分。
图5显示使用动态光散射的滤液的粒径分析的结果。小图(A)显示显著更大的主峰，表明通过5μm和7.7μm的材料由更大尺寸的颗粒组成。小图(A)显示利用0.2μm、5μm或7.7μm孔径中空纤维过滤器从灌注培养物随时间累积的细胞培养上清液中的颗粒(即，不能使其穿过膜的材料)的近似数量。
图6是显示在灌注细胞培养系统中使用的平均孔径为5和7.7μm的中空纤维过滤器的随时间的滤液浊度的图。
图7显示其中细胞保留装置含有7μm孔径中空纤维过滤器的灌注过程(根据本技术的原型灌注过程)中与其中细胞保留装置含有.2μm孔径中空纤维过滤器的灌注过程(标准灌注过程)相比的产物筛分百分比。
图8是连接至本技术的细胞保留装置的灌注培养容器的照片。照片显示具有不锈钢壳体的5.0微米陶瓷TFF过滤器。也称为“吸管”，其具有7mm的内腔ID和25cm的长度。
图9显示两个图，其显示过滤器容量取决于在生物反应器中培养的细胞系。图(A)显示细胞保留装置中使用的过滤器对于专有重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系1具有大于4000L/m2的过滤容量。图(B)显示与(A)中相同的过滤器对于专有重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系2具有大于8000L/m2的过滤容量。
图10是显示图9(A)和(B)中使用的中空纤维过滤器的％产物筛分的图。如所示，本技术的中空纤维过滤器的％产物筛分持续保持高水平，直至达到过滤容量。
详述
如上所提供，本技术部分基于以下令人惊讶的发现：-与待纯化的产物的尺寸相关-以TFF或ATF模式操作的相对大孔径(～5-10μm平均孔径)中空纤维过滤器解决了灌注培养系统中的结垢问题，有效且一致地操作最长达35天，而没有显著失去它们的产物筛分容量。
申请人已经令人惊讶地发现，使用较大孔径(～5-10μm或～5.2至7.7μm平均孔径)TFF膜用于灌注CHO细胞培养物保留减少或消除由于如今常用的膜类型中固有的分子筛分导致的产物损失。这进而实现非常长的膜使用期限(最长达35天)。产物产率的改进可以最高达50％，导致生产某些生物药品的成本降低。
进一步令人惊讶的是，本技术的装置和方法通过其他人已经放弃的简化操作TFF实现了它们的有益效果。本技术的装置和方法的操作是简单的，因为其不涉及特别处理(例如，气体洗涤)，不涉及特别设计来增加跨越过滤器的压力梯度(包括施加背压或增加剪切或流速)，无需改变灌注速率，无需维持与细胞保留装置的体积相关的特定灌注体积，或无需在使细胞培养液循环通过本技术的细胞保留装置之前用特定组合物(例如，含氧的组合物)处理细胞培养液(生物反应器内容物)。
在以下详述中，阐述了许多具体细节以提供对本技术的完全理解。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是，可以在没有这些具体细节中的一些的情况下实践本技术。在其他情况下，没有详细显示众所周知的结构和技术，以免模糊本技术。
定义：
为了便于理解本主题术语，下面定义许多术语和短语：
除非另有说明，否则如本文所用的语法冠词“一个/种(one)”、“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该”旨在包括“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”。因此，所述冠词在本文中用于指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)冠词的语法对象。通过实例的方式，“一种组分”意指一种或多种组分，且因此，可能预期多于一种组分，并且可以在所述实施方案的实现中采用或使用。
如本文所用的短语“将生物反应器的细胞培养液或内容物循环或再循环至细胞保留装置，和从细胞保留装置循环或再循环”或其等同物意味着来自生物反应器的细胞培养液(即，灌注容器的内容物)从生物反应器转移向保留装置并进入保留装置，其中培养液以TTF或ATF模式过滤，且然后转移或返回至生物反应器。
如本文所用的术语“保留装置(retention device)”意在包括具有基于尺寸或分子量分离颗粒的能力的所有装置。具体而言，本技术的细胞保留装置和方法包括中空纤维过滤器。选择本技术的过滤器的平均孔径或截止分子量(MWCO)，使得可以建立活细胞和细胞培养液中的死细胞、细胞碎片和/或大分子中的至少一种之间的所需分离。适用于本技术中的过滤器的实例包括膜过滤器、陶瓷过滤器和金属过滤器。所述过滤器可以以管状或圆柱形使用。在一个实施方案中，在本技术的细胞保留装置或方法中使用的过滤器是膜过滤器，优选中空纤维过滤器。
如本文所用的术语“中空纤维过滤器”是指管状或圆柱形膜或过滤器，其可以由氧化铝或其他陶瓷、不锈钢或多种聚合物制成。中空纤维过滤器具有内腔，其内径的尺寸可以根据通过其的培养液的体积而变化。选择中空纤维过滤器的平均孔径，使得孔的尺寸接近或在一些情况下大于灌注培养容器中细胞的尺寸。下面描述了本技术的中空纤维的合适的平均孔径。在一个实例实施方案中，本技术的中空纤维的内径在0.2和10mm之间。本技术的中空纤维的长度在10mm和10m之间。本技术的中空纤维的表面积是50cm2和25m2之间的倍数。本技术的中空纤维中的平均孔径范围为约0.5μm至且直至细胞直径或20μm。
如本文所用的术语“切向流”是指基本上平行于过滤器表面的流动，例如，单向切向流(TFF)或交叉流。
如本文所用的术语“交替切向流”是指其中切向流沿中空纤维过滤器的膜表面来回行进、而另一流以基本上垂直于所述过滤器表面的方向行进的流动布置。可以根据本领域技术人员已知的方法实现切向流或交替切向流。例如，US 6,544,424描述了用于在中空纤维过滤器中产生交替切向流的方法。
如本文所用的术语“产物筛分”是指以百分比显示的筛分的量度，其为滤液中产物的浓度除以培养容器中产物的浓度。100％的产物筛分表明良好的筛分条件，100％的产物应当通过过滤器。然而，随着时间，通过过滤器的产物量由于结垢而降低至低于100％。
在一个方面，本技术涉及流体过滤系统，其包含细胞培养装置，其包括至少一个过滤器容纳壳体；用于将细胞培养液从细胞培养容器(生物反应器)引导至细胞培养装置的流体连接器；至少一个泵，其通过过滤器容纳壳体在一个或交替的方向为流体提供动力；和至少一个流体收获端口。该系统可用于进行快速、低剪切、切向流过滤。这种系统可应用于灌注细胞培养系统或需要在生物反应器内保留活细胞的任何其他培养系统。
参考图1，显示了在典型灌注生物反应器内的根据本技术的流体过滤系统。处理容器2经由流体连接器4连接至过滤器容纳壳体6。容器1可以是用于待过滤的流体的任何合适的容器。例如，其可以是生物反应器、发酵罐或任何其他容器，非排他性地包括可以容纳液体的大桶、桶、罐、瓶、烧瓶、容器等。所述容器可以由任何合适的材料诸如塑料、金属诸如不锈钢、玻璃等构成。流体连接器用于将流体从处理容器引导至过滤器容纳壳体6的入口末端中。
泵8用于将流体从容器2通过流体连接器4移动至过滤器容纳壳体6中的中空纤维过滤器中并通过流体连接器10返回至容器2。在一个实施方案中，另一个泵可以沿着流体连接器10定位，以与泵8共同操作，以使流体反向移动，从而在允许流体返回至容器2之前产生通过过滤器容纳壳体6的交替(来回)切向流。图1中所示的整个过滤途径是光滑的，其没有裂缝、尖锐边缘、收缩或转弯，这会不利地影响细胞生命力或活力。
过滤器容纳壳体6还具有至少一个开口12，其适合作为流体收获端口。在一个实施方案中，滤液泵16连接至收获管线14。滤液泵16适合作为用于控制从系统除去过滤的流体且用作止回阀以调节来自过滤器容纳壳体6的滤液的不受限制的流量的装置。然后，滤液泵16将滤液移动至下一个单元操作，其可以是储罐18或蛋白A柱。
简而言之，图1显示了一种系统，其中灌注容器的细胞培养液或内容物以TTF或ATF模式泵送通过本技术的细胞保留装置以便被过滤，且然后再循环回灌注容器。同时将滤液转移至下一个单元操作，其可以是蛋白A柱、储罐、后续过滤单元或絮凝单元。在一个实施方案中，储罐18或等效隔室中的滤液可以经受絮凝(例如，液体提取)，例如与絮凝剂诸如100％PEG400(707kg/627L)和/或40％wt.磷酸盐(以1553kg/1128L)混合。作为絮凝的结果，滤液将分离成1:1的轻相和重相。根据重组蛋白质产物在何种相中(例如，抗体产物将保持在轻相中)，该相将经受蛋白A柱色谱用于产物纯化。
在另一个方面，本技术涉及具有范围为0.5μm至20μm的平均孔径的细胞保留装置。
在另一个方面，本技术涉及从灌注培养容器收获培养的重组蛋白质产物的方法，所述方法包括使来自培养容器的细胞培养液经受细胞保留装置以便被过滤，从所述细胞保留装置收集收获产物输出物，和将过滤的细胞培养液再循环回至所述培养容器；其中所述收获产物输出物是来自所述细胞保留装置的滤液，且包含培养的重组蛋白质产物。
在另一个方面，本技术涉及灌注细胞培养系统，其含有：灌注培养容器，其被配置为含有细胞培养液，所述细胞培养液包含液体培养基和细胞以及由所述细胞产生的重组蛋白质产物；细胞保留装置，其被配置为过滤所述细胞培养液，以及泵和流体连接器，其用于将细胞培养液从灌注培养容器循环至细胞保留装置且返回至灌注培养容器。
在涉及本技术的任何上述方面的一个实施方案中，所述细胞保留装置包括中空纤维过滤器，其具有范围为0.5μm至20μm或该范围内的任何固定参数或间隔、诸如5μm至15μm或5.2μm至12μm或5.5μm至8μm或5.2μm至7.7μm的平均孔径。在一个相关实施方案中，所述中空纤维过滤器的平均孔径为例如5μm或6μm或7μm或8μm或9μm或10μm或11μm或12μm或13μm或15μm或高于5μm的任何尺寸，其可以保留活细胞，同时允许死细胞、细胞碎片或大分子通过过滤器。在一个相关实施方案中，本技术的中空纤维过滤器的平均孔径具有约50kD或约100kD或约500kD、约1000kD的分子量截止(MWCO)值。在另一个相关实施方案中，本技术的中空纤维过滤器的平均孔径接近于活细胞的尺寸(例如，15至20μm)。在另一个相关实施方案中，本技术的中空纤维过滤器的平均孔径比活细胞的尺寸大约5μm或约4μm或约3μm或约2μm或约1μm或约0.5μm。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，本技术的中空纤维过滤器具有大于或等于10cm2的表面积。在一个相关实施方案中，本技术的中空纤维过滤器的表面积为50cm2和50m2之间，或100cm2和25m2之间，或150cm2和20m2之间，或200cm2和15m2之间，或500cm2和10m2之间，或700cm2和70m2之间，或900cm2和90m2之间，或在所述范围内的任何固定参数或间隔。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，本技术的中空纤维过滤器具有范围为0.2mm至20cm或该范围内的任何固定参数或间隔、诸如0.2mm至10cm或0.2mm至5cm或0.2mm至1cm或0.2mm至7mm的内径(ID)。在一个相关实施方案中，所述内径是例如0.2mm或2mm或4mm或6mm或8mm或20mm或200mm。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，本技术的中空纤维过滤器具有约15米或更短的长度。在一个相关实施方案中，本技术的中空纤维过滤器具有约25cm或约50cm或约1m或约2m或约3m或约4m或约5m或约6m或约7m或约8m或约9m或约10m或约11m或约12m或约13m或约14m或约15m的长度。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，本技术的中空纤维过滤器由聚合物、陶瓷、金属材料或其组合制成。可以由其制备本技术的中空纤维过滤器的聚合物树脂的实例包括，但不限于，改性或未改性的聚醚砜(PES)、改性或未改性的聚乙烯(PE)、纤维素聚合物、改性或未改性的聚酰胺聚合物、改性或未改性的聚砜(PSF)、改性或未改性的聚醚酮(PEK)、改性或未改性的聚醚醚酮(PEEK)、改性或未改性的聚偏二氟乙烯(PVDF)、改性或未改性的聚四氟乙烯(PTFE)、改性或未改性的聚氯乙烯(PVC)、改性或未改性的聚偏二氯乙烯(PVDC)或其混合物。可用于生产本技术的中空纤维过滤器的陶瓷材料的实例包括，但不限于，I型和II型陶瓷羟基磷灰石(CHT I、II)、α-氧化铝、氧化锆、二氧化钛或任何其他含有磷、二氧化硅、氧化钙、氧化铝、氧化锌、氧化钛等的陶瓷材料。可以根据本技术使用的陶瓷过滤器的实例是过滤器(来自Pall Corporation)或等效过滤器。可用于生产本技术的中空纤维过滤器的金属材料的实例包括，但不限于，不锈钢、低碳钢、铜。陶瓷或金属过滤器可以用作单次或多次使用。γ灭菌、高压灭菌或SIP(就地蒸汽)是可接受的使用前灭菌的方法。可以在CIP(就地清洁)或COP(非就地清洁)模式下实施清洁。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，本技术的中空纤维过滤器通过切向流过滤(TFF)过滤细胞培养液。在一个相关实施方案中，本技术的中空纤维过滤器通过交替切向流过滤(ATF)过滤细胞培养液。在一个相关实施方案中，TFF交叉流速大于零，但小于可以对细胞引起损害的流速，例如高压或高剪切条件可以引起细胞裂解或对细胞培养条件具有负面影响。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，所述细胞保留装置在TTF或ATF条件下使用约1000s-1至4000s-1的低剪切速率操作。在一个相关实施方案中，所述剪切速率为约1000s-1或约1500s-1或约2000s-1或约2500s-1或约3000s-1或约3500s-1或约4000s-1。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，本技术的中空纤维过滤器具有约500L/m2至约10,000L/m2的过滤容量。在一个相关实施方案中，本技术的中空纤维过滤器具有约1000L/m2或约2000L/m2或约3000L/m2或约4000L/m2或约5000L/m2或约6000L/m2或约7000L/m2或约8000L/m2或约9000L/m2或约10,000L/m2的过滤容量。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，本技术的中空纤维过滤器可以通过滤液/滤液经受周期性反冲以减少过滤器结垢。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，所述细胞保留装置在灌注容器的外部或之外操作。在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，所述细胞保留装置容纳本技术的中空纤维过滤器。在一个相关实施方案中，容纳本技术的中空纤维过滤器的过滤器壳体由材料诸如不锈钢、玻璃、PVDF或其他塑料材料制成。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，用于使细胞培养液循环通过本技术的细胞保留装置或用于从所述细胞保留装置抽取滤液的泵类型可以是离心的，蠕动的，ATF，正弦的，旋转凸轮，液环或活塞或任何其他低剪切等效物。在一个相关实施方案中，使用正排量泵调节滤液流量，其中泵入口上的表压大于零。在另一个相关实施方案中，再循环泵送系统应当是低剪切设计的，以便维持高细胞活力并减少溶液中悬浮颗粒的形成。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，在结垢可以使其产物筛分百分比降低多于10％或多于20％前，在其需要更换或清洁之前，本技术的中空纤维过滤器具有最长达35天的使用期限。在一个相关实施方案中，本技术的中空纤维过滤器具有大于8天且最长达35天的使用期限，或具有大于10天且最长达15天的使用期限，或具有大于17天且最长达35天的使用期限，或具有大于21天且最长达35天的使用期限，或具有大于25天且最长达35天的使用期限。在一个相关实施方案中，本技术的中空纤维过滤器具有10至35天或12至35天或15至35天或17至35天或20至35天或25至35天或27至35天的使用期限。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，本技术的中空纤维过滤器在使用5天后允许具有等于或大于50kD的分子量的大分子通过，而不会损失多于10％的其产物筛分能力。在一个相关实施方案中，所述中空纤维过滤器在使用10天后允许具有等于或大于50kD的分子量的大分子通过，而不会损失多于10％的其产物筛分能力。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，可以采用已知的下游实践来纯化产生的重组蛋白质。典型的纯化方法可以包括细胞分离、浓缩、沉淀、色谱和过滤等。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，在适用的情况下，来自细胞保留装置或中空纤维过滤器的滤液在没有深度过滤步骤的情况下经受蛋白A柱。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，在适用的情况下，来自细胞保留装置或中空纤维过滤器的滤液在经受蛋白A柱之前经受絮凝或提取步骤。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，所述细胞培养液包括液体细胞培养基、细胞和重组蛋白质产物。通常，所述细胞培养液可以包括氨基酸、盐类(诸如氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠、氯化镁、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、硝酸铁、二氧化硒、氯化钙和/或其他可以在细胞培养液中发现的盐)、维生素(例如生物素、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、次黄嘌呤、肌醇、烟酰胺、维生素C、吡哆醇、核黄素、硫胺素、胸苷、维生素B-12、吡哆醛、腐胺和/或可以在细胞培养液中发现的其他维生素)或其他组分、诸如右旋糖、甘露糖、丙酮酸钠、酚红、谷胱甘肽、亚油酸、硫辛酸、乙醇胺、巯基乙醇、邻磷酸乙醇胺和/或可以在组织培养液中发现的其他组分。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，在本技术的培养容器中使用的产生重组蛋白质产物的细胞可以是任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，诸如例如BHK(幼仓鼠肾)细胞、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、HKB(肾和B细胞的杂交)细胞、HEK(人胚肾)细胞和NSO细胞。所述哺乳动物细胞可以是表达单克隆抗体的重组细胞。
在涉及本技术的任何上述方面的另一个实施方案中，所述重组蛋白质产物可以是任何蛋白质产物，包括抗体分子、单克隆抗体或其片段、重组蛋白质产物诸如凝血因子，包括例如因子VII、因子VIII、因子IX和因子X。
实施例
实施例1细胞保留膜和培养液流动概况
用于灌注细胞培养的细胞保留膜经常以切向流过滤模式(TFF)操作，并且由聚合物材料、诸如改性或未改性的聚苯乙烯(PS)、聚醚砜(PES)、聚(偏二氟乙烯)(PVDF)等构成，其中孔径小于0.2微米。对于许多方法，期望细胞保留在生物反应器内，并且耗竭的培养基和产物分子通过过滤材料，其中可以捕获和纯化所述产物分子。图2(左小图)。当在灌注细胞培养中操作时，并且由于细胞碎片和大分子的结垢(堵塞)，过滤膜逐渐丧失其筛分容量并且表现为抑制甚至产物分子转运通过膜的分子筛，由此急剧减少产品回收率。图2(右小图)。如图2(右小图)中所示，在0.2微米过滤膜中测量筛分容量，作为滤液中产物浓度与生物反应器中产物浓度的比率。
对于良好的筛分条件，100％的产物应当通过过滤器。然而，随着时间，通过过滤器的产物量减少。在交替切向流(ATF)过滤模式系统中，筛分比TFF系统更好。ATF系统是一种泵系统，其看起来降低结垢的影响。它不是优选的系统，并且不能完全减少结垢，如在第15天所示，其中50％的产物通过膜。可以使滤液脉冲或回流以试图减少筛分，但该方法的成功有限。其他已试图主要通过改变流动特征和在较小程度上改变滤膜结构来解决筛分问题。
实施例2粒径分布和分析
本实施例的目标是测定0.2微米过滤器的滤液中存在的颗粒/碎片、重悬浮于滤液中的细胞培养沉淀和细胞培养上清液的粒径。图3。
为了确定哪种粒径范围对产物筛分贡献最大，将细胞培养物分成三组，并分别评价使用新的0.2μm中空纤维的离线产物筛分。为了实施本实施例，在开始细胞流出(cellbleed)之前，在培养的第8天从灌注反应器收集滤液和细胞培养物。将培养物离心以通过尺寸分离细胞培养材料。因此获得三种不同的样品：A)滤液流中的材料(直径<10nm)，B)滤液中重悬浮的细胞沉淀(直径<10nm且>1um)，和C)反应器上清液中的材料。
然后使每个单独的部分循环通过模拟灌注装置的未使用的0.2μm PS中空纤维。在指定的时间点从滤液和进料管线取样。使用Cedex BioHT测量产物的浓度，并且产物筛分表示为滤液中的IgG浓度相比于进料中的IgG浓度。使用Malvern Zetasizer Nano ZS进行粒径分析。
粒径分布以及随后的差的筛分概况显示于图3中。样品(A)和(B)在实验的整个持续时间没有导致任何显著的产物筛分。图3(A)和(B)。当样品(C)，主要含有100nm尺寸范围的颗粒的细胞培养上清液被引入全新的0.2μm中空纤维时，产物筛分是严重的且几乎是瞬间的。图3(C)。
结果显示，当通过TFF系统时，来自反应器上清液的材料/碎片在通过的0.4小时和6小时时导致差的筛分，而较大和较小的粒径不显示差的筛分。然后得出结论，上清液中含有的具有范围为约80nm至200nm或者可能多达500nm的颗粒/碎片引起0.2μm过滤器中的孔阻塞，导致筛分不良。
实施例3范围为0.45μm至500KD的孔径的过滤器
基于在实施例2中进行的粒径分布分析，假设具有比碎片更大或更小的孔的过滤膜不应当阻塞孔。
研究了从0.45um直至500kD的一系列孔径。所有都表明在实验的整个时间过程中产物回收率降低。然而，实验结果显示，较小孔径膜没有产生可接受的筛分概况。此外，筛分概况与具有较大孔径(例如0.45μm)的膜中的0.2μm过滤器相比一样差或甚至较差。图4。
得出结论，小于0.2μm的孔径对产物筛分现象没有帮助。有趣的是，利用名义上较大的孔径(0.45μm)看起来没有有益的影响，且甚至在某些时间点与0.2um相比加剧了产物筛分。
实施例4具有较大孔径的过滤器
尽管实施例3的结果涉及具有大于0.2μm的孔径的过滤器以及本领域关于缺乏较大孔过滤器的优点的教导，申请人开始确定具有甚至更大孔径(例如，5至7.7μm)的中空纤维过滤器的筛分特征。具有5μm和以上的孔径的中空纤维滤筒获得自SpectrumLaboratories,Inc.(Rancho Dominguez,CA)。
预期较大的孔将被活细胞阻塞，因为细胞本身为约相同的尺寸(～10至15μm)。由于膜孔径具有宽范围，所以具有5μm的名义上的孔径的膜可以具有1μm至15μm的孔。还预期，由于孔径分布，细胞将穿过膜或在膜中裂解并使膜快速结垢。预期膜的使用期限短(小于100-500L/m2)。还预期较大的孔径会引起活细胞裂解或损坏，因为孔在细胞的长度尺寸上是有效粗糙的，并且可以刺穿或破坏细胞。还预期较小的孔随着较小的碎片快速结垢，并显示筛分或低使用期限(小于或等于100-500L/m2)。
然而，结果是令人惊讶的。确定在灌注细胞培养中利用的正常范围之外达到甚至更大的孔径(例如，5至7.7μm)显示优异的筛分特征。图5。假设细胞碎片通过过滤器，并且如图5中所示，确定滤液中材料的粒径分布对于较大孔径过滤器更大。
然而，尽管较大量的较大材料通过较大孔径膜，但滤液的浊度令人惊讶地不太高。令人惊讶地，大孔径膜未被活细胞阻塞。细胞活力也没有被显著负面影响。图6。
实施例5比较灌注过程中的7μm和0.2μm过滤器
在本实施例中，在相似的灌注细胞培养条件下，将根据本技术的具有7μm的平均孔径的中空纤维过滤器的产物筛分百分比与标准0.2μm中空纤维过滤器的产物筛分百分比进行比较。
如图7中所示，7μm孔径允许在灌注过程(即原型灌注)的整个持续时间过程中的优异的筛分特征。此外，令人惊讶地，7μm膜的使用期限(或容量)相当高，超过1000L/m2，对于某些过程，运行超过16,000L/m2。该膜使用期限令人惊讶地高，特别是考虑到含有细胞、碎片、产物和耗竭的培养基的进料的肮脏性质。
实施例6滤液对蛋白A柱的影响
如前所讨论，假设阻塞细胞碎片的孔通过过滤器，并且如上图5中所示，可以看出，对于较大孔径，滤液中的材料的粒径分布更大。但令人惊讶地，这种额外的碎片负荷可以由蛋白A柱处理，而行为没有显著的负面变化。可以预期可以运行蛋白A柱的循环次数的显著减少，但没有观察到这一点，因为在没有出现任何异常的情况下进行最多达42个循环。参见表1。
表1.来自7.71μm中空纤维过滤器的滤液的蛋白A柱负载数据
令人惊讶地，由细胞分泌的或由于细胞裂解而分泌的其他大分子量材料也通过5μm过滤器。该通过导致更好和更一致的细胞培养条件。作为实例，酶LDH通过5μm过滤器，但不像通过0.2μm过滤器那样容易(数据未显示)。
较大的孔径确实允许杂质通过过滤器并进入下游。尽管这种碎片的影响不会显著影响蛋白A柱，但可以设想处理滤液以减少碎片负荷的方法。方法诸如深度过滤、死端过滤、TFF、声泳过滤(accoustophoretic filtration)或使用絮凝剂或低pH处理可用于减少下游的碎片负荷。图8提供了操作中的本技术的细胞保留装置的照片。
实施例7过滤容量
该实验的目的是确定使用两种不同细胞系的5μm中空纤维过滤器的过滤容量。
过滤容量被定义为在过滤器表面积上通过中空纤维灌注的液体体积。在本实施例中，两种不同的产生单克隆抗体的内部专有重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(细胞系1和2)以TFF灌注模式在两个单独的灌注生物反应器中运行，所述灌注生物反应器各自配备有含有具有5μm的平均孔径的中空纤维过滤器的细胞保留装置，由α氧化铝材料(购自Pall,Deland,FL的Membralox微滤过滤器)构成，其中管腔直径为7mm，且表面积为50cm2。
如图9、小图(A)和(B)中所示，在两种细胞系之间观察到过滤容量的几乎2倍差异。然而，两种情况下的过滤容量都令人惊讶地高(高于4000L/m2)。在两个生物反应器中，细胞培养活力都被维持>90％。
因此，确定过滤容量取决于保留的细胞系。然而，结果显示，根据本技术使用的5μm中空纤维过滤器的过滤容量令人惊讶地高(高于4000L/m2)。
实施例8产物筛分概况
该实验的目的是确定实施例7中使用的中空纤维过滤器的产物筛分(回收)概况。
在本实施例中，产生单克隆抗体的内部专有重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系1以TFF灌注模式在灌注生物反应器中运行，所述灌注生物反应器配备有含有具有5μm的平均孔径的中空纤维过滤器的细胞保留装置，由α氧化铝材料(购自Pall,Deland,FL的Membralox微滤过滤器)构成，其中管腔直径为7mm，且表面积为50cm2(如实施例7中)。
如图10中所示，与0.2μm中空纤维的产物筛分的逐渐减少不同，根据本技术的中空纤维过滤器的产物筛分保持在接近100％直至达到过滤容量。该行为或筛分概况是令人惊讶的，并且允许产物几乎完全通过，直到当达到膜容量时。换言之，本技术的过滤器可以持续长时间段使用，其中产物回收很少减少或没有减少，直至达到过滤容量，其提供了回收最大量的产物的可预测性和效力。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离请求保护的方法的精神和范围的情况下，可以对所述实施方案进行各种修改和变化。因此，本请求保护的方法旨在覆盖本文所述的实施方案的修改和变化，条件是它们落入所附权利要求及其等同物的范围内。
产业实用性
本文公开的装置和方法可用于灌注生物制造，且因此用于改进制造重组治疗性蛋白质的工业方法。

Claims (46)

1.细胞保留装置，其包含具有范围为约0.5至约20μm的平均孔径的中空纤维过滤器。
2.权利要求1的细胞保留装置，其中所述细胞保留装置在灌注细胞培养容器外部。
3.权利要求1的细胞保留装置，其中所述中空纤维过滤器具有选自以下的平均孔径：约5至约8μm、5μm至15μm、5.2μm至12μm、5.5μm至8μm、5.2μm至7.7μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、15μm或高于5μm的任何尺寸，其可以保留活细胞，同时允许死细胞、细胞碎片或大分子通过过滤器。
4.权利要求1的细胞保留装置，其中所述中空纤维过滤器具有等于或大于5μm、但小于在细胞培养容器中培养的活细胞的尺寸的平均孔径。
5.权利要求1的细胞保留装置，其中所述中空纤维过滤器具有比活细胞的尺寸大5μm或更小的平均孔径。
6.权利要求1的细胞保留装置，其中所述细胞保留装置被配置为通过切向流过滤(TFF)或通过交替切向流过滤(ATF)操作。
7.权利要求5的细胞保留装置，其中TTF或ATF被配置为在约1000s-1至约4000s-1的低剪切速率下操作。
8.权利要求1的细胞保留装置，其中所述中空纤维过滤器具有约1000至约10,000L/M2的过滤容量。
9.权利要求1的细胞保留装置，其中所述细胞保留装置被配置为与灌注培养容器共同操作。
10.权利要求1的细胞保留装置，其中所述中空纤维过滤器由陶瓷、聚合物或金属材料制成。
11.权利要求1的细胞保留装置，其中所述中空纤维过滤器操作最长达35天，而不会堵塞或损失多于10％的其产物筛分能力。
12.权利要求10的细胞保留装置，其中所述中空纤维过滤器在2000s-1或更低的低剪切速率或等于或大于4000L/m2的灌注流速下，以TTF或ATF模式操作。
13.权利要求10的细胞保留装置，其中所述中空纤维过滤器在便于收集滤液的壳体中。
14.用于从灌注培养容器收获重组蛋白质产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.使灌注培养容器的细胞培养液经受细胞保留装置以便被过滤，其中所述细胞培养液包含细胞和由所述细胞产生的重组蛋白质产物，且其中所述细胞保留装置包含具有范围为约0.5至约20μm的平均孔径的中空纤维过滤器；
b.从所述细胞保留装置收集滤液，其中所述滤液包含重组蛋白质产物；
c.将过滤的细胞培养液再循环至所述灌注培养容器。
15.权利要求14的方法，其中所述细胞保留装置在所述灌注细胞培养容器外部。
16.权利要求14的方法，其中所述中空纤维过滤器通过切向流过滤(TFF)或交替切向流过滤(ATF)过滤细胞培养液。
17.权利要求14的方法，其中所述中空纤维过滤器具有选自以下的平均孔径：约5至约8微米、5μm至15μm、5.2μm至12μm、5.5μm至8μm、5.2μm至7.7μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、15μm或高于5μm的任何尺寸，其可以保留活细胞，同时允许死细胞、细胞碎片或大分子通过过滤器。
18.权利要求14的方法，其中所述中空纤维过滤器具有等于或大于5微米、但小于所述细胞的尺寸的平均孔径。
19.权利要求14的方法，其中所述中空纤维过滤器具有比所述细胞的尺寸大5μm或更小的平均孔径。
20.权利要求14的方法，其中所述中空纤维过滤器具有约为所述细胞的尺寸的平均孔径。
21.权利要求14的方法，其中所述中空纤维过滤器由陶瓷、金属或聚合物材料制成。
22.权利要求14的方法，其中所述滤液包含重组蛋白质产物，但缺乏活细胞。
23.权利要求14的方法，其中所述中空纤维过滤器操作最长达35天，而不会堵塞或损失多于10％的其产物筛分能力。
24.权利要求14的方法，其中所述细胞保留装置在约1000s-1至约4000s-1的低剪切速率下，以TTF或ATF模式操作。
25.权利要求14的方法，其中所述中空纤维过滤器具有约1000至约10,000L/m2的过滤容量。
26.根据权利要求14至25中任一项所述的方法制备的蛋白质。
27.灌注培养系统，其包含：
a.配置为含有细胞培养液的灌注培养容器，其中所述细胞培养液包含液体培养基、细胞和由所述细胞产生的重组蛋白质产物；
b.细胞保留装置，其被配置为接收细胞培养液并将其过滤以提供包含重组蛋白质产物的滤液，其中所述细胞保留装置包含具有范围为约0.5至约20μm的平均孔径的中空纤维过滤器；和
c.泵和流体连接器，其用于将细胞培养液从灌注培养容器循环至细胞保留装置且返回至灌注培养容器。
28.权利要求27的灌注培养系统，其中所述细胞保留装置在所述灌注细胞培养容器外部。
29.权利要求27的灌注培养系统，其中所述细胞保留装置通过切向流过滤(TFF)或交替切向流过滤(ATF)操作。
30.权利要求27的灌注培养系统，其中所述中空纤维过滤器具有选自以下的平均孔径：约5至约8微米、5μm至15μm、5.2μm至12μm、5.5μm至8μm、5.2μm至7.7μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、15μm或高于5μm的任何尺寸，其可以保留活细胞，同时允许死细胞、细胞碎片或大分子通过过滤器。
31.权利要求27的灌注培养系统，其中所述中空纤维过滤器具有等于或大于5微米、但小于所述细胞的尺寸的平均孔径。
32.权利要求27的灌注培养系统，其中所述中空纤维过滤器具有比所述细胞的尺寸大5μm或更小的平均孔径。
33.权利要求27的灌注培养系统，其中所述中空纤维过滤器具有约为所述细胞的尺寸的平均孔径。
34.权利要求27的灌注培养系统，其中所述滤液包含重组蛋白质产物，但缺乏活细胞。
35.权利要求27的灌注培养系统，其中所述中空纤维过滤器由陶瓷、金属或聚合物材料或其组合制成。
36.权利要求27的灌注培养系统，其中所述中空纤维过滤器操作最长达约35天，而不会堵塞或损失多于10％的其产物筛分能力。
37.权利要求27的灌注培养系统，其中所述细胞保留装置在约1000s-1至约4000s-1的低剪切速率下，以TTF或ATF模式操作。
38.权利要求27的灌注培养系统，其中所述中空纤维过滤器具有约1000至约10,000L/M2的过滤容量。
39.权利要求27的灌注培养系统，其中所述中空纤维过滤器在使用5天后允许具有等于或大于50kD的分子量的大分子通过，而不会损失多于10％的其产物筛分能力。
40.权利要求27的灌注培养系统，其中所述中空纤维过滤器在使用10天后允许具有等于或大于50kD的分子量的大分子通过，而不会损失多于10％的其产物筛分能力。
41.权利要求27的灌注培养系统，其中所述滤液在没有深度过滤步骤的情况下经受蛋白A柱。
42.权利要求27的灌注培养系统，其中在经受蛋白A柱前，所述滤液经受絮凝步骤。
43.权利要求27的灌注培养系统，其中所述细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞。
44.权利要求27的灌注培养系统，其中所述细胞包括BHK(幼仓鼠肾)细胞、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、HKB(肾和B细胞杂交)细胞、HEK(人胚肾)细胞和NSO细胞。
45.权利要求27的灌注培养系统，其中所述重组蛋白质产物是单克隆抗体或其片段。
46.权利要求27的灌注培养系统，其中所述重组蛋白质产物是治疗性蛋白质、激素或酶。
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