JP7330834B2 - 培養方法および培養装置 - Google Patents

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Description

本発明は、灌流培養に用いられる培養方法および培養装置に関する。
抗体医薬品をはじめとするバイオ医薬品は、培養液中で細胞を培養した後、細胞が産生した物質を精製することによって製造されている。物質の生産には、抗体遺伝子をはじめ、目的の物質を産生させる遺伝子を導入した細胞株が用いられている。物質の生産に用いる細胞株としては、遺伝子導入された形質転換体の中から、目的の物質を高効率で分泌するものが選抜されている。
細胞を培養する方法としては、回分培養、流加培養（半回分培養）、連続培養（灌流培養）がある。回分培養は、培養中に培地を供給しない培養法である。流加培養は、培養中に培地を供給するが培養が終わるまで排出しない培養法である。連続培養は、培養中に連続的に培地を供給し、且つ、同量の培地を連続的に排出する培養法である。
回分培養によると、培養装置の構造や運転が簡略化されるため、コンタミネーションのリスクを低減することができる。その一方で、培養初期の栄養過剰、培養後期の栄養不足、老廃物の蓄積等が起こるため、細胞の増殖が制限されるデメリットがある。流加培養によると、回分培養と比較して、栄養過剰や栄養不足がある程度解消されるため、長期間の培養が可能であるが、老廃物の蓄積の問題は残る。
これに対し、灌流培養によると、培養環境が一定に保たれ易くなり、物質の生産を安定的に行うことができる。また、灌流培養によると、細胞を高い細胞密度まで増殖させることが可能である。物質の生産に必要な細胞密度を確保しつつ、培養スケールの縮小や拡大培養の簡略化を図ることが可能であるため、培養設備の小規模化が可能になる利点もある。未変性で純度が高い高品質な生産物を、設備コストや製造コストを削減しつつ、効率的に生産できる培養法として期待されている。
一般に、灌流培養は、培養槽内の細胞を培養液と共に細胞分離装置に排出し、細胞分離装置によって細胞と老廃物等の低分子とを互いに分離し、細胞を培養槽に返送しながら行われる。培養槽には、排出される培養液と等量の新鮮培地が連続的に供給される。細胞分離装置としては、分離膜を用いた濾過を行う装置が一般的である。
灌流培養中の培養槽は、培養液の細胞密度が一定の範囲になるように制御される。培養槽内の培養液の細胞密度が高くなりすぎると、酸素・栄養が不足したり、細胞死によって不純物が増加したりする。そのため、灌流培養中、培養槽内で増殖した細胞の一部は、培養液と共に培養系外に排出される。このような生細胞の一部を培養液と共に排出する操作は、ブリーディング（Bleeding）と呼ばれている。
特許文献１には、灌流培養に使用可能な技術として、細胞培養物を分離システムに循環させる技術が記載されている（段落００２８等参照）。分離システムのフィルタに対する循環の流れとしては、フィルタ表面に対して実質的に垂直の流れであるデッドエンドフローや、フィルタ表面に対して実質的に平行な流れであるクロスフロー（タンジェンシャルフロー）が挙げられている。
クロスフローによる濾過を行う接線流濾過（Tangential Flow Filtration：ＴＦＦ）方式は、分離膜に付着したファウラントを洗い流す効果が高いことが知られている。一般に、細胞分離に用いる分離膜は、細胞に由来するファウラントが付着・堆積し易いため、灌流培養を続けると膜孔が閉塞して分離能が低下していく。細胞破砕、細胞死等が原因で発生する微粒子等は、分離膜の膜孔径よりも小さい場合であっても、ゲル状物等を形成してファウリングを引き起こすことが知られている。
ＴＦＦ方式によると、分離膜に付着したファウラントが洗い流され易く、デッドエンドフロー濾過と比較して、分離膜が閉塞し難くなる。また、ファウラントが付着・堆積して膜間差圧が上昇したとしても、分離膜の逆洗が容易であるため、分離膜の使用寿命が長くなる。また、デッドエンドフロー濾過と比較して、せん断力が加わり難く、細胞が損傷し難い傾向がある。そのため、細胞分離の方法としては、ＴＦＦ方式による膜分離処理が広く用いられている。
特許文献２には、灌流培養に使用可能な技術として、交互接線流濾過（Alternating Tangential Flow Filtration：ＡＴＦ）方式による密閉濾過システムが記載されている（特許請求の範囲、段落０００９～００１１等参照）。交互接線流濾過方式では、クロスフローの向きを交互に逆向きに反転させながら濾過が行われる。
ＡＴＦ方式によると、ポンプによる吸引と吐出が交互に繰り返されるため、膜面に沿う流れが反転を繰り返して、ファウラントを洗い流す高い効果が得られる。また、ポンプによる吸引と吐出が繰り返されると、分離膜を透過する流れも反転を繰り返すことになるため、分離膜に対して逆洗作用を加えることができる。そのため、ＡＴＦ方式によると、通常のＴＦＦ方式と比較して、膜間差圧の上昇が進行し難くなり、分離膜の閉塞がより低減するため、分離膜の使用寿命が長くなる。
特許文献３には、灌流培養に使用可能な技術として、培養槽に二つの抜出口を設ける技術が記載されている。この技術では、細胞分離装置からの培地抜出口と、培地と細胞の混合液の抜出口とを、培養槽に対して別々に設けている。ブリーディング液（ブリーディングの目的で培養系外に排出する培養液）は、培養槽に設けられた培地と細胞の混合液の抜出口から抜き出されている。
特開２０１４－２１７３９５号公報 特許第６１６４４８７号公報 特開平４－１２６０７２号公報
従来の灌流培養においては、培養液の細胞密度を調整するためのブリーディングが、特許文献３のように、培養槽に対して直接行われている。灌流培養中の培養槽内で増殖した過剰な細胞は、一定量の培養液と共に、培養槽から直接抜き取られている。しかし、ブリーディング液を培養槽から直接抜き取ると、培養液中に産生された物質や、培養に必要な栄養も、培養系外に抜き取られるという問題がある。
ブリーディング液を培養槽から抜き取ると、細胞が産生した物質の少なくとも一部が、細胞分離装置に送られることなく、培養系外に排出されることになるため、細胞が産生した物質の適切な分離・回収が難しくなる。細胞が産生した物質は、細胞分離装置で分離・回収されず、系外に回収されるため、物質生産の効率が悪くなる問題がある。細胞が産生した物質は、ブリーディング液から個別に分離・回収することも可能であるが、このような分離・回収には、余計なコストがかかる。
また、ブリーディング液を培養槽から抜き取ると、培養槽内の栄養の少なくとも一部が、培養系外に排出されることになるため、培地コストが余計にかかる問題を生じる。抜き取ったブリーディング液を廃棄せず、再利用することも考えられるが、再利用する場合、別の分離・回収系統が必要になるため、余計な設備コストや運転コストがかかる。また、栄養の排出に伴い、新鮮培地の追加が必要になるため、栄養濃度の変動が大きくなる虞もある。
特許文献１や特許文献２に記載されているように、ＴＦＦ方式やＡＴＦ方式の膜分離処理は、クロスフローを利用しており、分離膜の逆洗が容易であるため、細胞分離に有効であるといえる。しかし、これらの技術を単に灌流培養に適用したとしても、ブリーディングが生産物や栄養の多量な排出を伴うため、灌流培養の効率に改善の余地がある。また、分離膜の逆洗を行ったとしても、濾液を用いた場合には、ファウラントが再導入されることになり、培養系内にファウラントが残留するため、膜間差圧の上昇の抑制の点でも改善の余地がある。
他方、特許文献３に記載されているように、細胞分離装置からの培地抜出口と、培地と細胞の混合液の抜出口とを設けると、培養槽内の培養液量を一定に保つことができる。このとき、互いの流量比を適切に調節すると、培養槽内の培養液の細胞密度についても一定の範囲に調整することができる。しかし、培養液中に産生された物質の排出量や、培養に必要な栄養の排出量を削減する手段については明らかでない。
そこで、本発明は、培養系外に排出するブリーディング液の排出量を抑制して、灌流培養を安定的且つ効率的に行うことができる培養方法および培養装置を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討した結果、細胞分離処理によって濃縮された細胞濃縮液を、ブリーディング液として培養系外に抜き取ると、灌流培養における細胞密度を一定の範囲に制御するにあたり、培養系外に排出すべき細胞量当たりのブリーディング液の排出量が抑制されることを見出した。細胞密度が高くなった細胞濃縮液をブリーディング液として排出すると、灌流培養中に増殖した過剰な細胞を培養槽から直接抜き取る場合と比較して、培養系外に抜き取るべき細胞量に対する、培養系外に抜き取られる培養液量の比率が小さくなるため、細胞が産生した有用物質（生産物）の排出量や、栄養の排出量も抑制されることになり、コストが抑制された安定的で効率的な灌流培養が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、前記課題を解決するために本発明に係る培養方法は、生細胞の一部を培養液と共に排出するブリーディングを行いながら細胞を灌流培養する培養方法であって、細胞を培養している培養槽から前記細胞を含む培養液を抜き出して細胞分離処理し、前記細胞分離処理で生じた細胞濃縮液を前記培養槽に返送することにより灌流培養を行い、前記灌流培養中に、前記細胞濃縮液を培養系外に排出して前記培養液の細胞密度を調整し、前記培養液の細胞密度は、前記培養槽に供給される新鮮培地の単位時間当たり平均供給量が、前記培養槽から前記細胞分離処理に抜き出される前記培養液の単位時間当たり平均抜出量と、前記細胞分離処理から前記培養槽に返送される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量との差分と等しくなる制御の下で、前記培養系外に排出される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均排出量と、前記細胞分離処理から前記培養槽に返送される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量と、前記細胞分離処理から前記培養系外に抜き出される分離液の単位時間当たり平均抜出量との合計が、前記培養槽から前記細胞分離処理に抜き出される前記培養液の単位時間当たり平均抜出量と等しくなる運転で、前記培養系外に排出される前記細胞濃縮液の排出量を変える操作、または、前記細胞分離処理における濃縮率を変える操作によって目標範囲に調整されるものである。
また、本発明に係る培養装置は、生細胞の一部を培養液と共に排出するブリーディングを行いながら細胞を灌流培養する培養装置であって、細胞を培養するための培養槽と、前記培養槽から抜き出された前記細胞を含む培養液を細胞分離処理して細胞濃縮液を生じる細胞分離装置と、前記培養槽から前記培養液を抜き出して前記細胞分離装置に送り、前記細胞濃縮液を前記細胞分離装置から前記培養槽に返送して前記細胞を循環させる循環配管と、前記細胞濃縮液を循環系外に排出するための排出配管と、を備え、前記灌流培養中に、前記細胞濃縮液を培養系外に排出して前記培養液の細胞密度を調整し、前記培養液の細胞密度は、前記培養槽に供給される新鮮培地の単位時間当たり平均供給量が、前記培養槽から前記細胞分離処理に抜き出される前記培養液の単位時間当たり平均抜出量と、前記細胞分離処理から前記培養槽に返送される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量との差分と等しくなる制御の下で、前記循環系外に排出される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均排出量と、前記細胞分離処理から前記培養槽に返送される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量と、前記細胞分離処理から前記循環系外に抜き出される分離液の単位時間当たり平均抜出量との合計が、前記培養槽から前記細胞分離処理に抜き出される前記培養液の単位時間当たり平均抜出量と等しくなる運転で、前記培養系外に排出される前記細胞濃縮液の排出量を変える操作、または、前記細胞分離処理における濃縮率を変える操作によって目標範囲に調整される。
本発明によると、培養系外に排出するブリーディング液の排出量を抑制して、灌流培養を安定的且つ効率的に行うことができる培養方法および培養装置を提供することができる。
本発明の第１実施形態に係る培養装置の一例を示す模式図である。 中空糸膜フィルタを備える膜分離装置を示す模式図である。 本発明の第１実施形態に係る培養装置の一例を示す模式図である。
以下、本発明の一実施形態に係る培養方法および培養装置について、図を参照しながら説明する。なお、以下の各図において共通する構成については同一の符号を付し、重複した説明を省略する。
本実施形態に係る培養方法は、細胞を灌流培養する培養方法に関する。灌流培養では、細胞を培養している培養槽から細胞を含む培養液を抜き出して細胞分離処理し、この細胞分離処理で生じた細胞濃縮液を培養槽に返送することによって、目的の細胞を連続的に培養する。
培養対象の細胞は、特に制限されるものではない。培養対象の細胞は、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微細藻類、ラン藻類、細菌、酵母、真菌、藻類、酵母等のいずれであってもよい。培養対象の細胞としては、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体等の各種の抗体や、各種の生理活性物質や、医薬品原料、化学原料、食品原料等として有用な各種の有用物質を産生する細胞が好ましく、抗体を産生する細胞が特に好ましい。また、培養対象としては、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary：ＣＨＯ）細胞等の浮遊細胞が好ましい。
灌流培養中には、培養槽内の培養液の細胞密度が一定の範囲になるように、ブリーディングを行う。しかし、従来の灌流培養では、過剰に増殖した細胞が、培養槽から直接抜き取られている。ブリーディング液を培養槽から直接抜き取ると、培養液中に分泌された有用物質や、培養に必要な栄養についても、培養系外に大量に抜き取られてしまう。
このような場合、抜き取られた生産物や栄養が無駄になるし、これらを分離・回収するとしても、別の系統・処理が必要になりコストがかかる。また、新鮮培地の追加が必要になるため、培養槽内の栄養濃度の変動が大きくなり、培養環境が安定しなくなる虞もある。
そこで、本実施形態に係る培養方法では、灌流培養中に、細胞分離処理で生じた細胞濃縮液をブリーディング液として培養系外に排出する。なお、細胞分離処理は、培養液中に含まれる細胞と、細胞よりも小さい低分子等、例えば、細胞が産生した有用物質（生産物）、老廃物等とを、互いに分離する処理である。
灌流培養中に、細胞濃縮液をブリーディング液として培養系外に排出すると、細胞を培養している培養液の細胞密度を調整することができる。細胞濃縮液は、培養槽内の培養液よりも細胞密度が高い状態に濃縮されているため、細胞が産生した有用物質の排出量や、栄養の排出量が抑制される。
以下、灌流培養に用いる培養装置と共に、本実施形態に係る培養方法について具体的に説明する。
図１は、本発明の実施形態に係る培養装置の一例を示す模式図である。
図１に示すように、本実施形態に係る培養装置１００は、培養槽１と、培地供給配管６と、循環配管１１（抜出配管１１ａ，返送配管１１ｂ）と、細胞分離装置１３と、分離液排出配管１４と、ブリーディング液排出配管（排出配管）１７と、逆洗液供給配管２０と、抜出配管バルブ２３と、返送配管バルブ２４と、排出配管バルブ２５と、これらに付随する機器等を備えている。
培養装置１００は、細胞を灌流培養するための装置である。培養装置１００は、培養槽１で培養されている細胞を培養液と共に細胞分離装置１３に抜き出し、細胞分離装置１３で細胞分離処理し、細胞分離処理で分離された細胞を培養槽１に返送する構成とされている。
培養装置１００は、細胞分離処理を行う細胞分離装置１３として、分離膜を用いた濾過（膜分離処理）を行う膜分離装置を備えている。図１に示す細胞分離装置１３は、接線流濾過（ＴＦＦ）方式の膜分離装置とされている。
培養槽１は、細胞を培養液中で培養するための槽である。培養槽１は、細胞の灌流培養に必要な各種の機器を備えることができる。図１において、培養槽１内には、通気用のスパージャ２や、機械攪拌用の攪拌機３や、培養槽１の細胞密度を計測するための挿入型の細胞密度計４が備えられている。但し、培養槽１には、通気装置、攪拌装置、培養環境や細胞量のモニタリング用のセンサとして、適宜の装置を備えることができる。
攪拌装置としては、細胞の浮遊、酸素の溶解、培養液の均一化等を促進する観点から、培養槽１の径方向、周方向および高さ方向のそれぞれに培養液を流動させることが可能な装置が好ましく用いられる。このような攪拌装置としては、攪拌翼を上下運動または三次元運動させる装置、培養槽を上下運動または三次元運動させる装置、複数の方向に多軸化された複数の攪拌軸を持つ装置、攪拌流の方向を転換するバッフルを備えた装置等が挙げられる。
培養槽１は、ステンレス鋼、アルミニウム合金等の金属や、プラスチックや、ガラス等の適宜の材料で形成することができる。ステンレス鋼製の槽は、洗浄性や滅菌性に優れており、繰り返しの使用に適している。樹脂製の槽は、ディスポーザブル品としての使用に適しており、培養槽１の洗浄や滅菌が省略化される。
培養槽１は、可撓性の培養バックとして設けることもできる。可撓性の培養バックは、ディスポーザブル品としての使用が可能である。可撓性の培養バックは、例えば、エチレンビニルアセテート、エチレンビニルアルコール、低密度ポリエチレン、ポリアミド等の樹脂製の多層フィルムを用いて形成することができる。
図１に示すように、培養槽１には、培地供給配管６を介して、培地供給タンク７が接続されている。培地供給配管６には、培地供給ポンプ８が備えられている。培地供給タンク７は、灌流培養に必要な新鮮培地が用意される容器である。培地供給タンク７に用意された新鮮培地は、灌流培養中、培地供給ポンプ８によって培養槽１に供給される。
また、培養槽１には、酸素ガス供給配管９を介して、酸素ガス供給装置１０が接続されている。酸素ガス供給装置１０は、細胞の培養に必要な酸素ガスを供給する装置である。酸素ガスは、灌流培養中、酸素ガス供給装置１０から培養槽１のスパージャ２に供給されて、培養液中に散気される。
また、培養槽１には、循環配管１１を介して、細胞分離装置１３が接続されている。循環配管１１は、培養槽１から培養液を抜き出して細胞分離装置１３に送り、細胞分離装置１３で細胞が濃縮された培養液（細胞濃縮液）を細胞分離装置１３から培養槽１に返送して、閉環状の循環系内で細胞を循環させる配管である。
循環配管１１は、培養槽１から培養液を抜き出すための抜出配管１１ａと、細胞濃縮液を培養槽１に返送するための返送配管１１ｂと、によって構成されている。循環配管１１は、細胞分離装置１３と共に、細胞を含む培養液を培養槽１に対して循環させる循環系を形成している。
抜出配管１１ａの一端は、培養槽１に接続している。抜出配管１１ａの他端は、細胞分離装置１３の液入口に接続している。抜出配管１１ａには、培養液抜出ポンプ１２と抜出配管バルブ２３が、上流側から順に備えられている。
返送配管１１ｂの一端は、細胞分離装置１３の一次側の液出口に接続している。返送配管１１ｂの他端は、培養槽１に接続している。返送配管１１ｂには、返送配管バルブ２４が備えられている。返送配管バルブ２４としては、流量を調整可能な流量制御弁および全開と全閉を切り替える切換弁のいずれを用いることもできる。
灌流培養時、培養槽１には、細胞が懸濁している培養液が、所定の液量となるように張り込まれる。抜出配管バルブ２３および返送配管バルブ２４は、灌流培養中の通常時には、開放状態に制御される。培養槽１内の培養液は、培養液抜出ポンプ１２によって細胞分離装置１３に抜き出される。
細胞分離装置１３は、培養槽１から抜き出された培養液を細胞分離処理して、培養液中に含まれる細胞と、細胞よりも小さい低分子等とを、互いに分離するために備えられている。図１において、細胞分離装置１３としては、ＴＦＦ方式の膜分離装置が備えられている。膜分離装置の分離膜としては、細胞の大きさよりも小さい膜孔径を持つ限外濾過膜が用いられる。
細胞分離装置１３には、分離液排出配管１４を介して、分離液タンク１５が接続されている。分離液排出配管１４には、分離液ポンプ１６が備えられている。分離液タンク１５は、細胞分離装置１３において細胞から分離された低分子、例えば、細胞が産生した有用物質（生産物）、老廃物等を回収するための容器である。細胞分離装置１３に流入した培養液は、灌流培養中、分離液ポンプ１６によって分離膜を介して吸引される。分離膜の二次側が陰圧となり、分離膜の膜間に操作圧力が加えられる。
図２は、中空糸膜フィルタを備える膜分離装置を示す模式図である。
図２に示すように、細胞分離装置１３としては、例えば、中空糸膜フィルタを備える内圧濾過方式の膜分離装置１３０を用いることができる。膜分離装置１３０は、ケーシング１３１と、複数の中空糸膜フィルタ１３２と、を備えている。
ケーシング１３１は、例えば、筒状に設けられて、一端側に入口側ヘッダ１３３、他端側に出口側ヘッダ１３４が取り付けられる。入口側ヘッダ１３３には、中空糸膜フィルタ１３２の一次側の液入口が設けられ、各中空糸膜フィルタ１３２の一端側が接続される。また、出口側ヘッダ１３４には、中空糸膜フィルタ１３２の一次側の液出口が設けられ、各中空糸膜フィルタ１３２の他端側が接続される。
中空糸膜フィルタ１３２の内空は、入口側ヘッダ１３３に設けられた一次側の液入口と、出口側ヘッダ１３４に設けられた一次側の液出口とに、それぞれ連通するように設けられる。入口側ヘッダ１３３には、抜出配管１１ａを接続することができる。また、出口側ヘッダ１３４には、返送配管１１ｂを接続することができる。ケーシング１３１の他端側の内部の空間には、中空糸膜フィルタ１３２の二次側の液出口１３５が設けられる。この液出口１３５には、分離液排出配管１４を接続することができる。
ＴＦＦ方式の膜分離装置では、被処理液が、中空糸膜フィルタ１３２の内空に流入して長さ方向に沿って流れる。二次側の陰圧で膜間に所定の操作圧力が加えられると、中空糸膜フィルタ１３２の孔径よりも小さい物質は、一次側から二次側に透過してケーシング１３１の内部の空間から流出する。一方、中空糸膜フィルタ１３２の孔径よりも大きい物質は、一次側から二次側に透過せず、中空糸膜フィルタ１３２の内空を長さ方向に沿って流れて出口側ヘッダ１３４から流出する。
中空糸膜フィルタ１３２を備える内圧濾過方式の膜分離装置１３０によると、被処理液として流入する培養液中の細胞が、中空糸膜フィルタ１３２の内空を長さ方向に沿って流れるため、摩擦、衝突等によるせん断力で細胞が損傷されることが少なくなる。また、被処理液の流速を高くして膜分離処理を行うことができるため、細胞分離の速度的効率を高くすることができる。
このような細胞分離装置１３によると、培養槽１から抜き出された培養液が細胞分離処理されて、目的の細胞が濃縮された培養液（細胞濃縮液）と、目的の細胞を実質的に含まず、有用物質、老廃物等の低分子を含む培養液（分離液）と、に分離される。分離膜の二次側に透過した分離液は、分離液排出配管１４に流出して分離液タンク１５に回収される。一方、分離膜を透過せず一次側に濃縮した細胞濃縮液は、返送管１１ｂに流出する。
図１に示すように、細胞分離装置１３には、逆洗液供給配管２０を介して、逆洗液供給タンク２１が接続されている。逆洗液供給配管２０は、分離膜の二次側に逆洗液を供給するための配管である。逆洗液供給配管２０は、例えば、細胞分離装置１３の分離膜の二次側に設けられる洗浄液入口１３６（図２参照）に接続することができる。逆洗液供給配管２０には、逆洗液供給ポンプ２２が備えられている。逆洗液供給タンク２１は、分離膜を逆洗するための逆洗液が用意される容器である。逆洗液供給タンク２１に用意された逆洗液は、所定の時期に、逆洗液供給ポンプ２２によって細胞分離装置１３の分離膜の二次側に圧送される。
培養装置１００において、循環系を構成する返送配管１１ｂには、ブリーディング液排出配管１７が接続されている。ブリーディング液排出配管１７は、返送配管１１ｂから分岐しており、ブリーディング液タンク１８に接続している。ブリーディング液排出配管１７には、排出配管バルブ２５とブリーディング液ポンプ１９が、上流側から順に備えられている。排出配管バルブ２５としては、流量を調整可能な流量制御弁および全開と全閉を切り替える切換弁のいずれを用いることもできる。ブリーディング液排出配管１７は、細胞分離装置１３で生じた細胞濃縮液を循環系外に排出するためのブリーディング用の配管である。
細胞を含む培養液を培養槽１に対して循環させる循環系において、細胞分離装置１３よりも後段にブリーディング液排出配管１７を設けると、培養槽１に返送される細胞濃縮液をブリーディング液として循環系外に排出することができる。すなわち、灌流培養における細胞密度を一定の範囲に制御するにあたり、細胞が濃縮された細胞濃縮液を循環系外に排出して、培養槽１内の培養液の細胞密度を減少側に調整することができる。
細胞濃縮液は、培養槽１内の培養液と比較して、単位液量当たりの細胞量が多い高細胞密度の状態に濃縮されている。そのため、細胞濃縮液をブリーディング液とすると、培養槽１内の培養液を直接抜き取る場合と比較して、培養系外に抜き取るべき細胞量に対する、培養系外に抜き取られる培養液量の比率が、小さくなる。細胞が産生した有用物質の排出量や、栄養の排出量が抑制されるため、コストが抑制された安定的で効率的な灌流培養を行うことができる。
培養装置１００においては、ブリーディング液排出配管１７を通じて循環系外に排出するブリーディング液（細胞濃縮液）の排出量を調節して、培養槽１内の培養液の細胞密度を調整することができる。例えば、培養槽１内の培養液の細胞密度が高くなりすぎると、細胞死や不要な分化等が起こるため、ブリーディング液の排出量を増加させて、培養槽１内の培養液の細胞密度を減少させることができる。
培養装置１００においては、培養液等の液量や細胞量の収支に関して、以下の数式（１）～（２）が成り立つ。
Ｆ３＝Ｆ０－Ｆ１－Ｆ２・・・（１）
Ｖ・（Ｎ－Ｎ０）＝Ｆ２・Δｔ・Ｎ・Ｆ０／（Ｆ０－Ｆ１）・・・（２）
但し、数式中の各記号は、次のとおりである。Δｔは、細胞の倍加時間よりも十分に短い時間であるものとする。
Ｖ：培養槽１に対する培養液の張込量［ｍ３］
Ｎ：培養槽１の細胞密度［cells／ｍ３］
Ｎ０：培養槽１の細胞密度の制御目標値［cells／ｍ３］
Ｆ０：抜出配管１１ａの流量［ｍ３／ｓ］
Ｆ１：分離液排出配管１４の流量［ｍ３／ｓ］
Ｆ２：ブリーディング液排出配管１７の流量［ｍ３／ｓ］
Ｆ３：培地供給配管６の流量［ｍ３／ｓ］
Δｔ：ブリーディング液ポンプ１９の運転時間［ｓ］
細胞分離装置１３における濃縮率は、Ｆ０／（Ｆ０－Ｆ１）で表されるため、濃縮による細胞密度の増分は、Ｎ・Ｆ０／（Ｆ０－Ｆ１）で表される。数式（２）で表されるとおり、この細胞密度の増分をブリーディング液排出配管１７を通じて循環系外に排出すると、培養槽１内の培養液の細胞密度は増加しなくなる。
Ｆ３は、細胞当たりの培地消費量（Cell Specific Perfusion Rate：ＣＳＰＲ）を用いると、Ｆ３＝ＣＳＰＲ・Ｎ０・Ｖで表される。したがって、ブリーディング液ポンプ１９の運転に必要な排出流量Ｆ２や運転時間Δｔは、以下の数式（３）～（４）で表される。
Ｆ２＝Ｆ０－Ｆ１－ＣＳＰＲ・Ｎ０・Ｖ・・・（３）
Δｔ＝Ｖ・（Ｎ－Ｎ０）・（Ｆ０－Ｆ１）
／｛（Ｆ０－Ｆ１－ＣＳＰＲ・Ｎ０・Ｖ）・Ｎ・Ｆ０｝・・・（４）
また、ブリーディング液排出配管１７を通じて循環系外に排出すべきブリーディング液の排出量Ｆ２・Δｔは、次の数式（５）で表される。
Ｆ２・Δｔ＝Ｖ・（Ｎ－Ｎ０）・（Ｆ０－Ｆ１）／（Ｎ・Ｆ０）・・・（５）
一方、従来のように、ブリーディング液を培養槽１から直接抜き取る場合には、その抜取量をＶ１［ｍ３］とすると、以下の数式（６）が成り立つ。
Ｖ・（Ｎ－Ｎ０）＝Ｖ１・Ｎ・・・（６）
数式（５）の排出量Ｆ２・Δｔと、数式（６）の抜取量Ｖ１とを比較すると、灌流培養における細胞密度を一定の範囲に制御するにあたり、ブリーディング液排出配管１７を通じて循環系外に排出すべきブリーディング液の排出量Ｆ２・Δｔは、ブリーディング液を培養槽１から直接抜き取る場合と比較して、（Ｆ０－Ｆ１）／Ｆ０倍で小さくなることが分かる。
（Ｆ０－Ｆ１）／Ｆ０という倍率は、細胞分離装置１３における濃縮率の逆数を表す。この倍率は、ブリーディング液排出配管１７を通じてブリーディング液を排出した場合、培養槽１から直接抜き取る場合と比較して、排出流量Ｆ１に相当する流量分が削減されることを意味している。ブリーディング液排出配管１７を使用すると、分離液排出配管１４を通じて排出される分離液の流量分が、循環系内に留められることを意味する。
また、ブリーディング液の排出量Ｆ２・Δｔは、（Ｆ０－Ｆ１）／Ｆ０倍で小さくなるため、Ｆ１を固定してＦ０を小さくしたり、Ｆ０を固定してＦ１を大きくしたりすると、更に小さい排出量になることが分かる（但し、Ｆ１＜Ｆ０）。Ｆ０を小さくしたり、Ｆ１を大きくしたりすると、より少ないブリーディング液で培養液の細胞密度を下げることができるため、有用物質の排出量や栄養の排出量が、より抑制されることになる。
培養装置１００において、制御装置５は、細胞密度計４によって計測される培養槽１の細胞密度の計測結果（Ｎ）と、現在の抜出配管１１ａの流量（Ｆ０）および現在の分離液排出配管１４の流量（Ｆ１）とに基づいて、ブリーディング液排出配管１７の流量（Ｆ２）、ブリーディング液ポンプ１９の運転時間（Δｔ）、ブリーディング液の排出量（Ｆ２・Δｔ）を演算する機能を備えることができる。
また、制御装置５は、ブリーディング液排出配管１７の流量（Ｆ２）、ブリーディング液ポンプ１９の運転時間（Δｔ）、ブリーディング液の排出量（Ｆ２・Δｔ）等の演算結果を、表示装置に表示することができる。表示装置としては、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、有機ＥＬディスプレイ、ブラウン管等が挙げられる。このような表示を行うと、培養装置１００の使用者によるブリーディングの手動操作や、ブリーディングの監視を行うことができる。
また、制御装置５は、培地供給ポンプ８、培養液抜出ポンプ１２、分離液ポンプ１６およびブリーディング液ポンプ１９の出力や、抜出配管バルブ２３、返送配管バルブ２４および排出配管バルブ２５の開度や、その他の送液系統・通気系統を制御する機能を備えることができる。ブリーディング液ポンプ１９の出力、返送配管バルブ２４および排出配管バルブ２５の開度は、Ｆ２、Δｔ、Ｆ２・Δｔ等の演算結果に基づいて制御することができる。
培養装置１００においては、灌流培養中、細胞分離装置１３から流出した細胞濃縮液を、間欠的に循環系外に排出することもできるし、連続的に循環系外に排出することもできる。すなわち、返送配管バルブ２４と排出配管バルブ２５とを、交互に開閉させることもできるし、返送配管バルブ２４と排出配管バルブ２５との両方を、中間開度に維持することもできる。
間欠的なブリーディングを行う場合は、返送配管バルブ２４を全閉に制御し、排出配管バルブ２５を全開に制御する。返送配管バルブ２４および排出配管バルブ２５は、開閉のデューティー比を、所定のブリーディング液排出配管１７の流量（Ｆ２）の下で、ブリーディング液排出配管１７側が開放される開時間の合計が、ブリーディング液ポンプ１９の運転時間（Δｔ）と略等しくなるように設定することができる。
間欠的なブリーディングは、灌流培養中、適宜の時間間隔で行うことができる。ブリーディングを行う際には、細胞分離装置１３から流出した細胞濃縮液の実質的に略全部を、返送配管１１ｂからブリーディング液排出配管１７に流し、ブリーディング液排出配管１７を通じて循環系外に排出する。この間に、細胞分離処理は継続されるが、培養槽１への返送は中断される。間欠的なブリーディングによると、返送配管バルブ２４や排出配管バルブ２５の制御を容易に行うことができる。
一方、連続的なブリーディングを行う場合は、返送配管バルブ２４および排出配管バルブ２５を中間開度に制御する。ブリーディング液ポンプ１９の運転時間（Δｔ）を細胞の倍加時間の範囲内で設定し、その下で、ブリーディング液排出配管１７の流量（Ｆ２）を設定することができる。返送配管バルブ２４および排出配管バルブ２５のそれぞれの開度の設定や、ブリーディング液ポンプ１９の出力の選定を行うことができる。
連続的なブリーディングを行う際には、細胞分離装置１３から流出した細胞濃縮液の一部を、返送配管１１ｂからブリーディング液排出配管１７に分流し、ブリーディング液排出配管１７を通じて循環系外に排出する。この間に、細胞分離処理および培養槽１への返送は継続される。連続的なブリーディングによると、培養液の細胞密度の変動や、培養槽１内の培養環境の変動を小さくすることができる。
培養装置１００は、循環系の収支に関して、ブリーディング液排出配管１７を通じて排出されるブリーディング液の単位時間当たり平均排出量と、細胞分離装置１３から培養槽１に返送される細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量と、細胞分離装置１３から分離液排出配管１４に抜き出される分離液の単位時間当たり平均抜出量との合計が、培養槽１から細胞分離装置１３に抜き出される培養液の単位時間当たり平均抜出量と略等しくなるように運転される。
そのため、培養装置１００の培地供給ポンプ８は、培地供給配管６を通じて供給される新鮮培地の単位時間当たり平均供給量が、培養槽１から細胞分離装置１３に抜き出される培養液の単位時間当たり平均抜出量と、細胞分離装置１３から培養槽１に返送される細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量との差分と略等しくなるように制御することができる。間欠的なブリーディングを行う場合、培地供給ポンプ８による新鮮培地の供給流量は、可変的に制御することもできる。
培養装置１００においては、細胞分離装置１３における濃縮率を、一定に制御してもよいし、可変的に制御してもよい。ブリーディング液の排出量Ｆ２・Δｔは、濃縮率の逆数を意味する（Ｆ０－Ｆ１）／Ｆ０倍で小さくなるため、Ｆ０を小さくしたり、Ｆ１を大きくしたりすると、より少ないブリーディング液で培養槽１内の培養液の細胞密度を下げることができる。
このようなブリーディング液の排出量を減らす観点から、ブリーディング液（細胞濃縮液）を培養系外に排出するとき、細胞分離処理における細胞の濃縮率を高くする操作を行い、培養系外に排出される細胞濃縮液の細胞密度を高くすることもできる。例えば、間欠的なブリーディングを行う場合、返送配管バルブ２４および排出配管バルブ２５と同期するように、細胞分離処理における細胞の濃縮率を高くする操作を行うことができる。
細胞の濃縮率を高くする操作としては、例えば、培養槽１から抜き出す培養液の流量を小さくする操作、細胞分離処理に用いる分離膜の膜間差圧を高くする操作、複数の系統を備えた細胞分離装置１３について使用系統を制限する操作等が挙げられる。これらの操作は、一種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
培養槽１から抜き出す培養液の流量を小さくする操作としては、例えば、培養液抜出ポンプ１２の流量を減少方向に調整する操作や、抜出配管バルブ２３の開度を閉鎖方向に制御する操作を用いることができる。また、細胞分離処理に用いる分離膜の膜間差圧を高くする操作としては、例えば、分離液ポンプ１６の流量を増加方向に調整する操作を用いることができる。
また、培養装置１００においては、逆洗液供給配管２０の系統を使用して、細胞分離装置１３の分離膜を逆洗することができる。分離膜の逆洗は、灌流培養の開始前に行うこともできるし、灌流培養の終了後に行うこともできるし、灌流培養中に間欠的に行うこともできる。灌流培養中に行う場合、培養液抜出ポンプ１２および分離液ポンプ１６と、逆洗液供給ポンプ２２とを、交互に稼働させて間欠的に逆洗を行う。
一般に、分離膜を用いた細胞分離処理では、宿主細胞由来タンパク質（Host Cell Protein：ＨＣＰ）等のファウラントが、分離膜に付着し、処理の継続に伴って膜面上に堆積することがある。分離膜は、ファウラントによるゲル状物等で覆われるため、次第に膜間差圧が上昇し、最終的には破過に至り、分離能を喪失する。
これに対し、逆洗液供給配管２０の系統を設けると、細胞分離処理に用いる分離膜を、培養系外から供給される逆洗液で間欠的に逆洗して、ファウラントを細胞濃縮液中に浮遊させることができる。細胞分離装置１３の分離膜の二次側に逆洗液を圧送すると、逆洗液が分離膜の二次側から一次側に流れ、分離膜に付着しているファウラントが、細胞濃縮液側に剥離することになる。そのため、ファウラントを一次側の細胞濃縮液と共に細胞分離装置１３から流出させることができる。
逆洗液としては、例えば、新鮮培地、緩衝液等を用いることができる。新鮮培地や緩衝液は、細胞や、ＨＣＰ等の微粒子を含まず、培養環境に与える影響が小さい液体である。そのため、新鮮培地、緩衝液等を用いると、循環系内に新たなファウラントが導入されることが少なく、分離膜の逆洗に伴う膜間差圧の上昇が抑制される。また、分離膜の逆洗に伴う培養環境の変動が生じ難くなる。
細胞分離装置１３の分離膜の逆洗は、間欠的なブリーディングと同時期に行うこともできるし、間欠的なブリーディングと異なる時期に行うこともできるし、連続的なブリーディングの間に間欠的に行うこともできる。分離膜の逆洗を、間欠的なブリーディングと同時期や、連続的なブリーディングの間に行うと、細胞濃縮液中に浮遊させたファウラントが、ブリーディング液排出配管１７を通じて循環系外に排出されるため、膜間差圧が上昇し難くなり、分離膜の使用寿命が長くなる。
細胞分離装置１３の分離膜の逆洗は、例えば、分離膜の膜間差圧が、予め設定されている閾値を超えたときに行うことができる。分離膜のファウリングが進行すると、分離膜の膜孔の多くが閉塞し、逆洗を実行しても膜間差圧が下がらなくなる。このような場合、分離膜の交換が必要になるが、開放作業を伴う交換は、コンタミネーションの虞がある。そのため、分離膜の交換の頻度を少なくする観点からは、通常の膜間差圧の最大値のような通常の圧力範囲に近い小さい膜間差圧値を閾値とすることが好ましい。
分離膜の膜間差圧は、例えば、細胞分離装置１３の出口に差圧計２６を設定して計測することができる。分離膜の膜間差圧は、例えば、細胞分離装置１３の入出口間の圧力差のような見かけ値や、培養液の流量、細胞濃縮液の流量、分離液の流量、静水圧等に基づいて解析される実効値として求めることもできる。
培養装置１００においては、ブリーディング液排出配管１７を通じて培養系外に排出された細胞濃縮液を、適宜の分離・精製処理に供して、細胞が産生した物質を回収することができる。分離・精製処理としては、半透膜分離処理または遠心分離処理が好ましく用いられる。半透膜分離処理としては、デッドエンドフロー濾過による全量濾過が特に好ましい。これらの分離・精製処理を用いると、細胞が濃縮された状態の細胞濃縮液から、不純物が少ない高純度の有用物質を効率的に回収することができる。
以上の培養装置１００や、これを用いた培養方法によると、灌流培養中に、細胞分離処理で生じた細胞濃縮液を培養系外に排出して、培養槽内の培養液の細胞密度を調整することができる。そのため、増殖した過剰な細胞を培養槽から直接抜き取る場合と比較して、灌流培養中に培養系外に排出する細胞当たりのブリーディング液の排出量を抑制することができる。培養液の排出量が抑制されることによって、細胞が産生した有用物質の排出量や、栄養の排出量も抑制されるため、分離・回収に多大なコストをかける必要や、多量の新鮮培地を追加する必要が無くなる。例えば、ブリーディング液用の分離・回収設備を個別に設けなくとも、生産物の回収負荷や培地の無駄を削減することができる。そのため、このような分離・回収設備の簡略化が可能であるし、生産物や培地の逸失価値が分離・回収設備の運用コストを下回るような場合には、分離・回収設備の省略化も可能になる。すなわち、コストや新鮮培地の供給を抑制しつつ、培養環境や物質生産性を安定させることができるため、灌流培養を安定的且つ効率的に行うことができる。
また、以上の培養装置１００や、これを用いた培養方法によると、循環系内のファウラントがブリーディングと共に系外に排出されるため、細胞分離処理に用いる分離膜の使用寿命を延ばすことができる。このようなファウラントを排出する作用は、細胞分離処理に用いる分離膜の二次側に逆洗液を供給することによって更に高められる。そのため、分離膜の交換コストや、交換作業に伴うコンタミネーションのリスクを低減することができる。細胞分離装置１３は、ＴＦＦ方式の膜分離装置とされているため、細胞分離処理と有用物質の回収を、脈動少なく連続的に行うことができる。
図３は、本発明の実施形態に係る培養装置の一例を示す模式図である。
図３に示すように、本実施形態に係る培養装置２００は、前記の培養装置１００と同様に、培養槽１と、培地供給配管６と、細胞分離装置１３と、分離液排出配管１４と、ブリーディング液排出配管（排出配管）１７と、逆洗液供給配管２０と、排出配管バルブ２５と、これらに付随する機器等を備えている。
本実施形態に係る培養装置２００が、前記の培養装置１００と異なる点は、細胞分離装置１３の方式が変更されている点である。培養装置２００においては、循環配管１１（抜出配管１１ａ，返送配管１１ｂ）、培養液抜出ポンプ１２、抜出配管バルブ２３および返送配管バルブ２４に代えて、往復配管２９、ダイアフラムポンプ３０、往復配管バルブ３１が備えられている。
培養装置２００は、細胞分離処理を行う細胞分離装置１３として、分離膜を用いた濾過（膜分離処理）を行う膜分離装置を備えている。図３に示す細胞分離装置１３は、交互接線流濾過（ＡＴＦ）方式の膜分離装置とされている。
培養装置２００において、培養槽１には、往復配管２９を介して、細胞分離装置１３が接続されている。往復配管２９は、培養槽１から培養液を抜き出して細胞分離装置１３に送り、細胞分離装置１３で細胞が濃縮された培養液（細胞濃縮液）を細胞分離装置１３から培養槽１に返送して、直線状の流路内の往復で細胞を循環させる配管である。往復配管２９は、細胞分離装置１３と共に、細胞を含む培養液を培養槽１に対して往復動で循環させる循環系を形成している。
往復配管２９の一端は、培養槽１に接続している。往復配管２９の他端は、細胞分離装置１３の液入出口に接続している。往復配管２９は、例えば、膜分離装置１３０の入口側ヘッダ１３３に接続される。往復配管２９には、往復配管バルブ３１が備えられている。往復配管バルブ３１としては、流量を調整可能な流量制御弁および全開と全閉を切り替える切換弁のいずれを用いることもできる。
培養装置２００の細胞分離装置１３には、培養装置１００と同様に、分離液排出配管１４を介して、分離液タンク１５が接続されている。また、培養装置２００の細胞分離装置１３には、培養装置１００と同様に、逆洗液供給配管２０を介して、逆洗液供給タンク２１が接続されている。
培養装置２００の細胞分離装置１３は、培養装置１００と同様に、培養槽１から抜き出された培養液を細胞分離処理して、培養液中に含まれる細胞と、細胞よりも小さい低分子等とを、互いに分離するために備えられている。図３において、細胞分離装置１３としては、ＡＴＦ方式の膜分離装置が備えられている。膜分離装置の分離膜としては、細胞の大きさよりも小さい膜孔径を持つ限外濾過膜が用いられる。
培養装置２００の細胞分離装置１３には、エアー駆動型のダイアフラムポンプ３０が配管を介して接続されている。ダイアフラムポンプ３０は、送液を駆動するチャンバ３０ａと、チャンバ３０ａに圧縮空気を供給するコンプレッサ３０ｂと、を備えている。
チャンバ３０ａは、中空構造であり、その内部が、柔軟性を有するダイアフラムによって、被処理液室と、駆動流体室と、に区画されている。被処理液室は、細胞分離装置１３の分離膜の一次側と連通している。被処理液室は、例えば、膜分離装置１３０の出口側ヘッダ１３４に配管等を介して接続される。駆動流体室は、コンプレッサ３０ｂの流体出口と連通している。
ダイアフラムポンプ３０では、駆動流体室内の圧縮空気が排気されると、ダイアフラムが変形して、駆動流体室の容積が縮小し、被処理液室の容積が拡張する。被処理液室の容積が拡張することにより、被処理液が吸引される。一方、駆動流体室内にコンプレッサ３０ｂから圧縮空気が導入されると、ダイアフラムが変形して、駆動流体室の容積が拡張し、被処理液室の容積が縮小する。被処理液室の容積が縮小することにより、被処理液が吐出される。
灌流培養時、培養槽１には、細胞が懸濁している培養液が、所定の液量となるように張り込まれる。往復配管バルブ３１は、灌流培養中の通常時には、開放状態に制御される。培養槽１内の培養液は、ダイアフラムポンプ３０の吸引動作によって細胞分離装置１３に抜き出される。細胞分離装置１３に流入した培養液は、灌流培養中、分離液ポンプ１６によって分離膜を介して吸引される。分離膜の二次側が陰圧とされて、分離膜の膜間に操作圧力が加えられる。
培養槽１から抜き出された培養液は、操作圧力が加えられることにより、細胞濃縮液と、分離液と、に分離される。分離膜の二次側に透過した分離液は、分離液排出配管１４に流出して分離液タンク１５に回収される。一方、分離膜を透過せず一次側に濃縮した細胞濃縮液は、ダイアフラムポンプ３０の吐出動作によって往復配管２９に流出する。吐出動作の間には、分離膜の二次側に透過した分離液の一部が一次側に移動して、分離膜に逆洗作用が加えられる。往復配管２９に流出した細胞濃縮液は、灌流培養中の通常時には、培養槽１に戻される。
培養装置２００において、循環系を構成する往復配管２９には、ブリーディング液排出配管１７が接続されている。ブリーディング液排出配管１７は、往復配管２９から分岐しており、ブリーディング液タンク１８に接続している。ブリーディング液排出配管１７には、培養装置１００と同様に、排出配管バルブ２５とブリーディング液ポンプ１９が、上流側から順に備えられている。培養装置２００の排出配管バルブ２５としては、全開と全閉を切り替える切換弁が好ましく用いられる。
培養装置２００のように、往復配管２９にブリーディング液排出配管１７を接続すると、培養槽１に返送される細胞濃縮液をブリーディング液として循環系外に排出することができる。すなわち、灌流培養における細胞密度を一定の範囲に制御するにあたり、細胞が濃縮された細胞濃縮液を循環系外に排出して、培養槽１内の培養液の細胞密度を減少側に調整することができる。
培養装置２００においては、培養装置１００と同様に、ブリーディング液排出配管１７を通じて循環系外に排出するブリーディング液（細胞濃縮液）の排出量を調節して、培養槽１内の培養液の細胞密度を調整することができる。また、制御装置５は、抜出配管１１ａの流量（Ｆ０）に代えて、往復配管２９における単位時間当たりの平均流量を用いて、ブリーディング液排出配管１７の流量（Ｆ２）、ブリーディング液ポンプ１９の運転時間（Δｔ）、ブリーディング液の排出量（Ｆ２・Δｔ）を演算することができる。
培養装置２００の制御装置５は、培地供給ポンプ８、分離液ポンプ１６およびブリーディング液ポンプ１９の出力や、ダイアフラムポンプ３０の出力および動作や、排出配管バルブ２５および往復配管バルブ３１の開度や、その他の送液系統・通気系統を制御する機能を備えることができる。ブリーディング液ポンプ１９の出力、排出配管バルブ２５および往復配管バルブ３１の開度は、Ｆ２、Δｔ、Ｆ２・Δｔ等の演算結果に基づいて制御することができる。
培養装置２００においては、灌流培養中、細胞分離装置１３から流出した細胞濃縮液を、間欠的に循環系外に排出することができる。すなわち、往復配管バルブ３１と排出配管バルブ２５とを、交互に開閉させることができる。排出配管バルブ２５は、ダイアフラムポンプ３０が吐出動作を行っている期間に開放され、ダイアフラムポンプ３０が吸引動作を行っている期間に閉鎖される。
間欠的なブリーディングを行う場合は、往復配管バルブ３１を全閉に制御し、排出配管バルブ２５を全開に制御する。往復配管バルブ３１および排出配管バルブ２５は、開閉のデューティー比を、所定のブリーディング液排出配管１７の流量（Ｆ２）の下で、ブリーディング液排出配管１７側が開放される開時間の合計が、ブリーディング液ポンプ１９の運転時間（Δｔ）と略等しくなるように設定することができる。
間欠的なブリーディングは、灌流培養中、適宜の時間間隔で行うことができる。ブリーディングを行う際には、細胞分離装置１３から流出した細胞濃縮液の実質的に略全部を、往復配管２９からブリーディング液排出配管１７に流し、ブリーディング液排出配管１７を通じて循環系外に排出する。この間に、細胞分離処理は継続されるが、培養槽１への返送は中断される。
培養装置２００は、循環系の収支に関して、培養装置１００と同様に、ブリーディング液排出配管１７を通じて排出されるブリーディング液の単位時間当たり平均排出量と、細胞分離装置１３から培養槽１に返送される細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量と、細胞分離装置１３から分離液排出配管１４に抜き出される分離液の単位時間当たり平均抜出量との合計が、培養槽１から細胞分離装置１３に抜き出される培養液の単位時間当たり平均抜出量と略等しくなるように運転される。
そのため、培養装置２００の培地供給ポンプ８は、培養装置１００と同様に、培地供給配管６を通じて供給される新鮮培地の単位時間当たり平均供給量が、培養槽１から細胞分離装置１３に抜き出される培養液の単位時間当たり平均抜出量と、細胞分離装置１３から培養槽１に返送される細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量との差分と略等しくなるように制御される。培地供給ポンプ８による新鮮培地の供給流量は、可変的に制御することもできる。
また、培養装置２００においては、培養装置１００と同様に、細胞分離装置１３における濃縮率を、一定に制御してもよいし、可変的に制御してもよい。培養装置１００と同様に、ブリーディング液（細胞濃縮液）を培養系外に排出するとき、細胞分離処理における細胞の濃縮率を高くする操作を行い、培養系外に排出される細胞濃縮液の細胞密度を高くすることもできる。
細胞の濃縮率を高くする操作としては、培養装置１００と同様に、培養槽１から抜き出す培養液の流量を小さくする操作、細胞分離処理に用いる分離膜の膜間差圧を高くする操作、複数の系統を備えた細胞分離装置１３について使用系統を制限する操作等が挙げられる。
培養槽１から抜き出す培養液の流量を小さくする操作としては、例えば、ダイアフラムポンプ３０の単位時間当たりの平均吸引流量を減少方向に調整する操作や、ダイアフラムポンプ３０の吸引動作中に往復配管バルブ３１の開度を閉鎖方向に制御する操作を用いることができる。
また、培養装置２００においては、培養装置１００と同様に、逆洗液供給配管２０の系統を使用して、細胞分離装置１３の分離膜を逆洗することができる。分離膜の逆洗は、灌流培養の開始前に行うこともできるし、灌流培養の終了後に行うこともできるし、灌流培養中に間欠的に行うこともできる。灌流培養中に行う場合、ダイアフラムポンプ３０および分離液ポンプ１６と、逆洗液供給ポンプ２２とを、交互に稼働させて間欠的に逆洗を行う。
細胞分離装置１３の分離膜の逆洗は、間欠的なブリーディングと同時期に行うこともできるし、間欠的なブリーディングと異なる時期に行うこともできる。分離膜の逆洗を、間欠的なブリーディングと同時期に行うと、細胞濃縮液中に浮遊させたファウラントが、ブリーディング液排出配管１７を通じて循環系外に排出されるため、膜間差圧が上昇し難くなり、分離膜の使用寿命が長くなる。
培養装置２００においては、培養装置１００と同様に、ブリーディング液排出配管１７を通じて培養系外に排出された細胞濃縮液を、適宜の分離・精製処理に供して、細胞が産生した物質を回収することができる。分離・精製処理としては、半透膜分離処理または遠心分離処理が好ましく用いられる。半透膜分離処理としては、デッドエンドフロー濾過による全量濾過が特に好ましい。
以上の培養装置２００や、これを用いた培養方法によると、前記の培養装置１００や培養方法と同様に、灌流培養中に、細胞分離処理で生じた細胞濃縮液を培養系外に排出して、培養槽内の培養液の細胞密度を調整することができる。そのため、増殖した過剰な細胞を培養槽から直接抜き取る場合と比較して、灌流培養中に培養系外に排出する細胞当たりのブリーディング液の排出量を抑制することができる。コストや新鮮培地の供給を抑制しつつ、培養環境や物質生産性を安定させることができるため、灌流培養を安定的且つ効率的に行うことができる。
また、以上の培養装置２００や、これを用いた培養方法によると、循環系内のファウラントがブリーディングと共に系外に排出されるため、細胞分離処理に用いる分離膜の使用寿命を延ばすことができる。このようなファウラントを排出する作用は、細胞分離処理に用いる分離膜の二次側に逆洗液を供給することによって更に高められる。そのため、分離膜の交換コストや、交換作業に伴うコンタミネーションのリスクを低減することができる。細胞分離装置１３は、ＡＴＦ方式の膜分離装置とされているため、循環系内に付着したファウラントを洗い流す作用が、ＴＦＦ方式と比較して高くなる。
以上、本発明について説明したが、本発明は、前記の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。例えば、本発明は、必ずしも前記の実施形態が備える全ての構成を備えるものに限定されない。或る実施形態の構成の一部を他の構成に置き換えたり、或る実施形態の構成の一部を他の形態に追加したり、或る実施形態の構成の一部を省略したりすることができる。
例えば、前記の培養装置１００，２００は、培養槽、細胞分離装置等の形状・型式や、ポンプ、バルブ等の機器の型式・配置や、配管の接続等を、発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜の形態に変更することができる。例えば、ブリーディング液排出配管１７を、細胞分離装置１３に直結することもできる。また、逆洗液供給配管２０を、細胞分離装置１３の分離膜の二次側の適宜の位置に接続させることもできる。前記の培養装置１００，２００は、細胞分離装置１３として、膜分離装置を備えているが、細胞分離処理は、重力沈降分離、遠心分離、音響分離等の他の原理に基づく装置で行うこともできる。
以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
＜比較例１＞
灌流培養中に、細胞を含む培養液を培養槽から直接抜き取る方法で培養を行った。
培養装置としては、図１に示すような循環系を備える培養装置を用いた。培養対象の細胞としては、ＣＨＯ細胞を用いた。培養槽に対する培養液の張込量は、２Ｌとした。培養槽の細胞密度の制御目標値は、生細胞について、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。培養槽から細胞分離装置への抜出流量・循環系内の循環流量は、４０Ｌ／ｄ（一日当たり培養槽の張込量の２０倍量）とした。
灌流培養は、培養液を培養槽から直接抜き取る方法でブリーディングを行いながら、数日間にわたって継続した。培養したＣＨＯ細胞の細胞当たりの培地消費量（ＣＳＰＲ）は、１．０×１０－１０Ｌ／ｃｅｌｌｓ・ｄである。灌流率は、１．０ｖ／ｖ・ｄとなった。ＣＨＯ細胞の倍加時間は、約２日であったため、約２日が経過する毎に、培養液を培養槽から直接抜き取り、培養系外に排出して、培養槽内の生細胞量を維持した。この間に培養系外に排出したブリーディング液の量は、１Ｌであった。
＜実施例１＞
灌流培養中に、細胞が分離・濃縮された細胞濃縮液を培養系外に排出する方法で培養を行った。
培養装置としては、図１に示すような循環系を備える培養装置を用いた。培養対象の細胞としては、ＣＨＯ細胞を用いた。培養槽に対する培養液の張込量は、２Ｌとした。培養槽の細胞密度の制御目標値は、生細胞について、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。培養槽から細胞分離装置への抜出流量・循環系内の循環流量は、４０Ｌ／ｄ（一日当たり培養槽の張込量の２０倍量）とした。
灌流培養は、細胞濃縮液を培養系外に排出する方法でブリーディングを行いながら、数日間にわたって継続した。培養したＣＨＯ細胞の細胞当たりの培地消費量（ＣＳＰＲ）は、１．０×１０－１０Ｌ／ｃｅｌｌｓ・ｄである。灌流率は、１．０ｖ／ｖ・ｄとなった。ＣＨＯ細胞の倍加時間は、約２日であったため、約２日が経過する毎に、循環系外に排出する細胞濃縮液の流量を３７Ｌ／ｄ、排出時間を０．６ｈとして、ブリーディングを行うと、培養槽内の生細胞量が維持された。この間に培養系外に排出したブリーディング液の量は、９５０ｍＬであった。
以上のとおり、実施例１のブリーディング液の量は、比較例１に対して、５％低減する結果となった。
１００ 培養装置
１ 培養槽
２ スパージャ
３ 攪拌機
４ 細胞密度計
５ 制御装置
６ 培地供給配管
７ 培地供給タンク
８ 培地供給ポンプ
９ 酸素ガス供給配管
１０ 酸素ガス供給装置
１１ 循環配管
１１ａ 抜出配管
１１ｂ 返送配管
１２ 培養液抜出ポンプ
１３ 細胞分離装置
１４ 分離液排出配管
１５ 分離液タンク
１６ 分離液ポンプ
１７ ブリーディング液排出配管（排出配管）
１８ ブリーディング液タンク
１９ ブリーディング液ポンプ
２０ 逆洗液供給配管
２１ 逆洗液供給タンク
２２ 逆洗液供給ポンプ
２３ 抜出配管バルブ
２４ 返送配管バルブ
２５ 排出配管バルブ
２９ 往復配管
３０ ダイアフラムポンプ
３０ａ チャンバ
３０ｂ コンプレッサ
３１ 往復配管バルブ
１３０ 膜分離装置
１３１ ケーシング
１３２ 中空糸膜フィルタ
１３３ 入口側ヘッダ
１３４ 出口側ヘッダ
１３５ 液出口
１３６ 洗浄液入口

Claims (10)

  1. 生細胞の一部を培養液と共に排出するブリーディングを行いながら細胞を灌流培養する培養方法であって、細胞を培養している培養槽から前記細胞を含む培養液を抜き出して細胞分離処理し、前記細胞分離処理で生じた細胞濃縮液を前記培養槽に返送することにより灌流培養を行い、前記灌流培養中に、前記細胞濃縮液を培養系外に排出して前記培養液の細胞密度を調整し、
    前記培養液の細胞密度は、前記培養槽に供給される新鮮培地の単位時間当たり平均供給量が、前記培養槽から前記細胞分離処理に抜き出される前記培養液の単位時間当たり平均抜出量と、前記細胞分離処理から前記培養槽に返送される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量との差分と等しくなる制御の下で、前記培養系外に排出される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均排出量と、前記細胞分離処理から前記培養槽に返送される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量と、前記細胞分離処理から前記培養系外に抜き出される分離液の単位時間当たり平均抜出量との合計が、前記培養槽から前記細胞分離処理に抜き出される前記培養液の単位時間当たり平均抜出量と等しくなる運転で、前記培養系外に排出される前記細胞濃縮液の排出量を変える操作、または、前記細胞分離処理における濃縮率を変える操作によって目標範囲に調整される培養方法。
  2. 請求項１に記載の培養方法であって、
    前記灌流培養中に、前記細胞濃縮液を間欠的に前記培養系外に排出するか、または、前記細胞濃縮液の一部を連続的に前記培養系外に排出する培養方法。
  3. 請求項２に記載の培養方法であって、
    前記灌流培養中に、前記細胞濃縮液を間欠的に前記培養系外に排出し、
    前記細胞濃縮液を前記培養系外に排出するとき、前記細胞分離処理における前記細胞の濃縮率を高くする操作を行い、前記培養系外に排出される前記細胞濃縮液の細胞密度を高くする培養方法。
  4. 請求項３に記載の培養方法であって、
    前記細胞の濃縮率を高くする操作は、前記培養槽から抜き出す前記培養液の流量を小さくする操作、または、前記細胞分離処理に用いる分離膜の膜間差圧を高くする操作である培養方法。
  5. 請求項１に記載の培養方法であって、
    前記培養系外に排出された前記細胞濃縮液を、半透膜分離処理または遠心分離処理して、前記細胞が産生した物質を回収する培養方法。
  6. 請求項１に記載の培養方法であって、
    前記灌流培養中に、前記細胞分離処理に用いる分離膜を、前記培養系外から供給される新鮮培地または緩衝液で間欠的に逆洗して、前記分離膜のファウラントを前記細胞濃縮液中に浮遊させる培養方法。
  7. 生細胞の一部を培養液と共に排出するブリーディングを行いながら細胞を灌流培養する培養装置であって、
    細胞を培養するための培養槽と、
    前記培養槽から抜き出された前記細胞を含む培養液を細胞分離処理して細胞濃縮液を生じる細胞分離装置と、
    前記培養槽から前記培養液を抜き出して前記細胞分離装置に送り、前記細胞濃縮液を前記細胞分離装置から前記培養槽に返送して前記細胞を循環させる循環配管と、
    前記細胞濃縮液を循環系外に排出するための排出配管と、を備え、
    前記灌流培養中に、前記細胞濃縮液を培養系外に排出して前記培養液の細胞密度を調整し、
    前記培養液の細胞密度は、前記培養槽に供給される新鮮培地の単位時間当たり平均供給量が、前記培養槽から前記細胞分離処理に抜き出される前記培養液の単位時間当たり平均抜出量と、前記細胞分離処理から前記培養槽に返送される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量との差分と等しくなる制御の下で、前記循環系外に排出される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均排出量と、前記細胞分離処理から前記培養槽に返送される前記細胞濃縮液の単位時間当たり平均返送量と、前記細胞分離処理から前記循環系外に抜き出される分離液の単位時間当たり平均抜出量との合計が、前記培養槽から前記細胞分離処理に抜き出される前記培養液の単位時間当たり平均抜出量と等しくなる運転で、前記培養系外に排出される前記細胞濃縮液の排出量を変える操作、または、前記細胞分離処理における濃縮率を変える操作によって目標範囲に調整される培養装置。
  8. 請求項７に記載の培養装置であって、
    前記循環配管は、前記培養槽と前記細胞分離装置の液入口との間を接続する抜出配管と、前記細胞分離装置の液出口と前記培養槽との間を接続する返送配管と、であり、
    前記細胞分離装置は、分離膜による膜分離処理を行う装置であり、
    前記膜分離処理は、接線流濾過方式である培養装置。
  9. 請求項７に記載の培養装置であって、
    前記循環配管は、前記培養槽と前記細胞分離装置の液入出口との間を接続する往復配管であり、
    前記細胞分離装置は、分離膜による膜分離処理を行う装置であり、
    前記膜分離処理は、交互接線流濾過方式である培養装置。
  10. 請求項７に記載の培養装置であって、
    前記細胞分離装置は、分離膜による膜分離処理を行う装置であり、前記分離膜の二次側に新鮮培地または緩衝液を供給するための供給配管が接続しており、
    前記細胞の灌流培養中に、前記分離膜を前記新鮮培地または前記緩衝液で間欠的に逆洗して、前記分離膜に付着しているファウラントを前記細胞濃縮液中に浮遊させる培養装置。
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