JP7043125B2 - 連続培養における有用物質の回収方法 - Google Patents
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Description
300≦X2/X1≦6000 (I)
(A)培養槽内で、培養液中の有用物質産生細胞が有用物質を産生する工程、
(B)培養液の一部を培養槽から多孔膜に送液する工程、
(C)多孔膜を用いて培養液のタンジェンシャルフロー濾過(TFF)を行い、有用物質を含む透過液を得る濾過工程、
(D)多孔膜内部を透過せずに残った残培養液を培養槽に返液する工程、
(E)培養槽に新鮮培地の供給を継続的に行う工程、及び
(F)培養槽から培養液を排出し、排出した培養液と同量の新鮮培地を培養槽に加えるブリーディング工程。
上記の各工程は必ずしも記載順番通りに行われる必要はない。上記の各工程の順番は、適宜、培養槽内の有用物質産生細胞の成育環境を最適条件下に維持しながら、長期間、高密度培養を行えるように設定される。また、本実態形態に係る有用物質の回収方法は、上記以外の工程を含んでいてもよい。
(A)培養槽内で、培養液中の有用物質産生細胞が有用物質を産生する工程、
(B)培養液の一部を培養槽から多孔膜に送液する工程、
(C)多孔膜の一次側表面上で培養液を往復させながら培養液を濾過して有用物質を含む透過液を得る交互タンジェンシャルフロー濾過工程、
(D)多孔膜内部を透過せずに残った残培養液を培養槽に返液する工程、
(E)培養槽に新鮮培地の供給を継続的に行う工程、及び
(F)培養槽から培養液を排出し、排出した培養液と同量の新鮮培地を培養槽に加えるブリーディング工程。
上記の各工程は必ずしも記載順番通りに行われる必要はない。上記の各工程の順番は、適宜、培養槽内の有用物質産生細胞の成育環境を最適条件下に維持しながら、長期間、高密度培養を行えるように設定される。また、本実態形態の別の例に係る有用物質の回収方法は、上記以外の工程が含まれてもよい。
300≦X2/X1≦6000 (II)
なお、多孔膜に供給される培養液の速度とは、培養槽から多孔膜に送られる培養液の速度を意味する。透過液の速度を1.0LMH以下にすると、上記式(II)が満たされる。
Cout/Cin≧2 (III)
親水性高分子の含有割合が上記式(III)の関係を満たす分布を示す多孔膜は、一次側領域における、デプス濾過の効果と、二次側領域における、除去物の吸着による膜孔の閉塞防止効果とに優れる傾向にある。
凍結乾燥した中空糸多孔膜の内側面(一次側表面)を、電子顕微鏡(株式会社キーエンス製、VE-9800)を用いて1視野において10個以上の孔が観測可能な倍率で観察した。得られた顕微鏡写真における細孔10個を円形近似処理し、その面積から求めた直径の平均を内側面孔径(一次側表面の平均孔径)とした。凍結乾燥した中空糸多孔膜の断面を内側面側から外側面側へ向かって連続して顕微鏡観察し、断面孔径が最小になる層(最小孔径層)の位置を確認した。また、中空糸多孔膜の最内面の構造を顕微鏡観察し、内側面孔径から緻密層の有無を確認した。
ポリスチレンラテックス粒子(JSR株式会社製、SIZE STANDARD PARTICLES)を、0.5質量%のドデシル硫酸ナトリウム水溶液(和光純薬工業株式会社製)に、粒子濃度が0.01質量%になるように分散させ、ラテックス粒子分散液を調整した。
中空糸多孔膜を円管状に薄く切りそれを光学顕微鏡(株式会社キーエンス製、VH6100)で観察し、中空糸多孔膜の内径(μm)、外径(μm)を測定した。得られた内径DI、外径DOから下記の式(IV)を用いて膜厚Th(μm)を算出した。
Th=(DO-DI)/2 (IV)
連続培養時の濾過工程後の透過液のタンパク質濃度CT、及び透過液をサンプリングした際の培養槽内の培養液のタンパク質濃度CCをELISA法で定量分析を行った。また、中空糸多孔膜におけるタンパク質の透過率X(%)については、下記の式(V)を用いて算出した。
X=CT/CC×100 (V)
連続培養中の培養槽の培養液をサンプリングして、細胞数自動計測装置(GE Healthcare製 CYTORECON)を使用して総細胞密度及び細胞生存率を測定した。
連続培養中の培養槽の培養液をサンプリングして、1倍から10倍の希釈率にて、濁度計(HECH社製2100Q濁度計)を使用して、濁度を測定した。
AE6F4抗体(モノクロナール抗体)産生チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を無血清培地(Invitrogen社 CD opti CHO AGT with 2ME)で培養して、AE6F4抗体産生CHO細胞懸濁液を得て、ブリーディング工程を含み、透過液の速度を1.0LMH以下に制御した条件下で、中空糸多孔膜(MF-SL、旭化成メディカル社製)を用いて連続培養を実施した。
V={(NC/550×105)-1}×VC (VI)
AE6F4抗体(モノクロナール抗体)産生チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を無血清培地(Invitrogen社 CD opti CHO AGT with 2ME)で培養して、AE6F4抗体産生CHO細胞懸濁液を得て、ブリーディング工程を含まず、透過液の速度を1.5LMH以上に制御した条件下で、MF-SLを用いて連続培養を実施した。
中空糸多孔膜として、Repligen社製MFホロファイバーモジュール(阻止孔径0.2μm、膜面積0.13m2)を使用し、実施例1と同様にしてATFシステムを用いた連続培養を行った。Repligen社製MFホロファイバーは緻密層を有する、平均孔径0.2μmの中空糸膜である。
中空糸多孔膜として、Repligen社製 MFホロファイバーモジュール(阻止孔径0.2μm、膜面積0.13m2)を使用し、比較例1と同様にしてATFシステムを用いた連続培養を行った。
AE6F4抗体(モノクロナール抗体)産生チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を無血清培地(Invitrogen社 CD opti CHO AGT with 2ME)で培養して、AE6F4抗体産生CHO細胞懸濁液を得て、ブリーディング工程を含み、透過液の速度を1.5LMH以上に制御した条件下で、MF-SLを用いてATFシステムによる連続培養を実施した。
AE6F4抗体(モノクロナール抗体)産生チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を無血清培地(Invitrogen社 CD opti CHO AGT with 2ME)で培養して、AE6F4抗体産生CHO細胞懸濁液を得て、ブリーディング工程を含み、透過液の速度を1.0LMH以下に制御した条件下で、中空糸多孔膜(MF-SL、旭化成メディカル社製)を用いて培養液を一方向に流すTFFシステムによる連続培養連続培養を実施した。
AE6F4抗体(モノクロナール抗体)産生チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を無血清培地(Invitrogen社 CD opti CHO AGT with 2ME)で培養して、AE6F4抗体産生CHO細胞懸濁液を得て、ブリーディング工程を含み、透過液の速度を1.0LMH以下に制御した条件下で、中空糸多孔膜してSpectrum社製MFホロファイバーモジュール(阻止孔径0.2μm、膜面積0.16m2)を使用し、TFFシステムによる連続培養を実施した。
AE6F4抗体(モノクロナール抗体)産生チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を無血清培地(Invitrogen社 CD opti CHO AGT with 2ME)で培養して、AE6F4抗体産生CHO細胞懸濁液を得て、ブリーディング工程を含み、透過液の速度を1.5LMH以上に制御した条件下で、MF-SLを用いてTFFシステムによる連続培養を実施した。
実施例1、2、及び比較例1から6の結果を図1及び図2に示す。有用タンパク質を産生する細胞の連続培養において、培養槽から培養液を排出し、排出した培養液と同量の新鮮培地を培養槽に加えるブリーディング工程を含み、緻密層を有しない中空糸多孔膜を使用し、膜透過液の速度を1.0LMH以下に制御すると、有用タンパク質の透過率は、実施例1では膜処理量950L/m2まで80%以上を維持し、実施例2では膜処理量650L/m2まで80%以上を維持した。
Claims (15)
- 有用物質を産生する細胞の連続培養において、培養液から前記有用物質を回収する方法であって、
前記細胞の培養槽から前記培養液を排出し、当該排出した培養液と同量の新鮮培地を前記培養槽に加えるブリーディング工程と、
前記培養槽から抽出した培養液を、一次側表面の平均孔径が20μm以上100μm以下である多孔膜を用いて濾過して前記培養液中の前記有用物質を透過させる濾過工程と、
を含み、
前記濾過工程における濾過がタンジェンシャルフロー濾過であり、
前記濾過工程における透過液の速度が1.0LMH以下であり、
前記濾過工程において、前記透過液の速度(X 1 )と、前記多孔膜に供給される前記培養液の流速(X 2 )と、の関係が、下記の式(I)を満たす、
300≦X 2 /X 1 ≦6000 (I)
有用物質を回収する方法。 - 前記ブリーディング工程において、前記培養液の濁度が6000NTU以下に制御される、請求項1に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記タンジェンシャルフロー濾過が、前記多孔膜の一次側表面上で前記培養液を往復させる交互タンジェンシャルフロー濾過である、請求項1又は2に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記ブリーディング工程において、前記培養槽における細胞の総数が、400×105細胞/mL以上700×105細胞/mL以下の範囲に維持される、請求項1から3のいずれか1項に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記透過液の累積量が400L/m2になった時点における、前記多孔膜における前記有用物質の透過率が80%以上である、請求項1から4のいずれか1項に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記透過液の累積量が650L/m2になった時点における、前記多孔膜における前記有用物質の膜透過率が80%以上である、請求項1から4のいずれか1項に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記多孔膜が中空糸膜である、請求項1から6のいずれか1項に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記中空糸膜の膜厚が300μm以上1000μm以下である、請求項7に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記多孔膜の一次側表面の平均孔径が、二次側表面の平均孔径より大きい、請求項1から8のいずれか1項に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記多孔膜が、疎水性高分子と、親水性高分子と、を含む混合物からなる、請求項1から9のいずれか1項に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記疎水性高分子がポリスルホンである、請求項10に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記多孔膜の一次側表面を含む一次側領域の方が、前記多孔膜の二次側表面を含む二次側領域よりも疎水性である、請求項1から11のいずれか1項に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記有用物質が生理活性物質である、請求項1から12のいずれか1項に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記有用物質が、タンパク質、ウイルス、エクソソーム、及び核酸からなる群から選択される、請求項1から13のいずれか1項に記載の有用物質を回収する方法。
- 前記有用物質がモノクローナル抗体である、請求項1から14のいずれか1項に記載の有用物質を回収する方法。
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Citations (3)
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---|---|---|---|---|
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Patent Citations (3)
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---|---|---|---|---|
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WO2015188009A1 (en) | 2014-06-04 | 2015-12-10 | Amgen Inc. | Methods for harvesting mammalian cell cultures |
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