WO2024106442A1

WO2024106442A1 - ろ過条件の評価方法及び細胞産生物の製造方法

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Publication number: WO2024106442A1
Application number: PCT/JP2023/040996
Authority: WO
Inventors: 峻松田; 雄也杉山; 祐太齊藤
Original assignee: 旭化成メディカル株式会社
Priority date: 2022-11-15
Filing date: 2023-11-14
Publication date: 2024-05-23

Abstract

細胞の増殖が抑制される条件下において、細胞を含む培養液を収容する培養槽１１から多孔質膜１２に培養液を送り、多孔質膜１２でろ過されずに通過した培養液を培養槽１１に戻して、培養液を培養槽１１と多孔質膜１２の間で循環させることと、多孔質膜１２における一又は複数のろ過条件を評価することと、を含む、ろ過条件の評価方法。

Description

ろ過条件の評価方法及び細胞産生物の製造方法

　本発明は、ろ過技術に関し、ろ過条件の評価方法及び細胞産生物の製造方法に関する。

　細胞培養技術は、抗体、成長ホルモン、及びインスリンなどの各種バイオ医薬品の製造において必須の技術であり、近年の医療の進歩に大きく貢献している。バイオ医薬品の中でも特に抗体医薬品が注目を集めている。抗体産生細胞を培養することによって、モノクローナル抗体を高効率かつ安定的に産生することは、工業的に重要なテーマの一つである。

　抗体等の有用な細胞の産生物の産生を目的とした工業的な細胞の培養法は、大きく分けて、接着培養法と、懸濁培養法（浮遊培養法）の２つの方式に分類される。接着培養法においては、細胞は、培養槽の内表面に付着している。懸濁培養法においては、細胞は、培養液中に浮遊している。これらのうち、スケールアップの容易さ、及び大スケールでの制御の容易さなどから、懸濁培養法が主流となっている。

　懸濁培養方法において、細胞を大量かつ高密度で培養し、細胞の産生物を高効率で連続的に生産するために、新鮮な培養液を培養槽中へ一定速度で供給しつつ、細胞の産生物を含む古い培養液をろ過して培養槽外へ一定速度で排出しながら細胞を培養する方式が提案されている。この方式の培養は、一般に連続培養や灌流培養と呼ばれている(例えば、特許文献１から５参照。)。連続培養においては、培養槽に供給される培養液の量と、培養槽から排出される培養液の量が同じになるように制御され得る。連続培養において重要なことは、培養液中の細胞と、古い培養液及び細胞の産生物と、を長期にわたって効率よく分離して、古い培養液及び細胞の産生物を培養槽外へ取り出し、培養槽内の細胞生育環境を長期間最適条件下に維持し続けることである。

特開２０１８－７６２９１号公報特開２００９－４５０１９号公報特開２０２１－４８７７６号公報特許第５６９６４７９号公報特表２０２２－５１６５１６号公報

　連続培養において、培養槽の培養液中の細胞と、古い培養液及び細胞の産生物と、を分離するために、多孔質膜が用いられている。多孔質膜におけるろ過条件を適切に評価する方法が望まれている。そこで、本発明は、細胞培養液のろ過条件を適切に評価可能なろ過条件の評価方法及び細胞産生物の製造方法を提供することを課題の一つとする。

　[１]　本発明の態様によれば、細胞の増殖が抑制される条件下において、細胞を含む培養液を収容する培養槽から多孔質膜に培養液を送り、多孔質膜でろ過されずに通過した培養液を培養槽に戻して、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることと、多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価することと、を含む、ろ過条件の評価方法が提供される。

　[２]　上記[１]のろ過条件の評価方法において、多孔質膜でろ過されずに通過した培養液を培養槽に戻すことにおいて、多孔質膜でろ過されずに通過した培養液と多孔質膜でろ過された培養液を培養槽に戻してもよい。

　[３]　上記[１]又は［２］のろ過条件の評価方法が、一又は複数のろ過条件下において多孔質膜のろ過性能を評価することをさらに含み、多孔質膜のろ過性能に基づいて、多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価してもよい。

　[４]　上記[１]から[３]のいずれかのろ過条件の評価方法において、細胞の増殖が抑制される条件が、細胞周期の進行が抑制される条件であってもよい。

　[５]　上記[１]から[４]のいずれかのろ過条件の評価方法において、細胞の増殖が抑制される条件が、１５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかであってもよい。

　[６]　上記[１]から[５]のいずれかのろ過条件の評価方法において、１５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかが、１０℃以下又は５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかであってもよい。

　[７]　上記[１]から[６]のいずれかのろ過条件の評価方法において、細胞の増殖が抑制される条件が、細胞の酵素活性が抑制される条件であってもよい。

　[８]　上記[７]のろ過条件の評価方法において、酵素がサイクリン依存性キナーゼであってもよい。

　[９]　上記[１]から[８]のいずれかのろ過条件の評価方法において、細胞の増殖が抑制される条件が、培養液における細胞周期の阻害剤の存在であってもよい。

　[１０]　上記[１]から[９]のいずれかのろ過条件の評価方法において、多孔質膜における細胞の産生物の透過率に基づき、多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価してもよい。

　[１１]　上記[１]から[１０]のいずれかのろ過条件の評価方法において、多孔質膜における透過流束に基づき、多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価してもよい。

　[１２]　上記[１]から[１１]のいずれかのろ過条件の評価方法において、多孔質膜における膜間差圧に基づき、多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価してもよい。

　[１３]　上記[１]から[１２]のいずれかのろ過条件の評価方法において、ろ液の濁度に基づき、多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価してもよい。

　[１４]　上記[１]から[１３]のいずれかのろ過条件の評価方法において、一又は複数のろ過条件が、多孔質膜の構造、材料、又は物性の一又は複数の条件であってもよい。

　[１５]　上記[１]から[１４]のいずれかのろ過条件の評価方法において、一又は複数のろ過条件が、培養液の一又は複数の条件であってもよい。

　[１６]　上記[１]から[１５]のいずれかのろ過条件の評価方法において、一又は複数のろ過条件が、培養液における細胞の密度の一又は複数の条件であってもよい。

　[１７]　上記[１]から[１６]のいずれかのろ過条件の評価方法において、一又は複数のろ過条件が、多孔質膜に送られる培養液の流量の一又は複数の条件であってもよい。

　[１８]　上記[１]から[１７]のいずれかのろ過条件の評価方法において、一又は複数のろ過条件が、多孔質膜でろ過された培養液の流量の一又は複数の条件であってもよい。

　[１９]　上記[１]から[１８]のいずれかのろ過条件の評価方法において、一又は複数のろ過条件が、多孔質膜に送られる培養液の流れによる、多孔質膜の接液表面におけるせん断応力の一又は複数の条件であってもよい。

　[２０]　上記[１]から[１９]のいずれかのろ過条件の評価方法において、培養槽と多孔質膜を含む培養液が循環する経路が、温度管理槽内に配置されていてもよい。

　[２１]　上記[１]から[２０]のいずれかのろ過条件の評価方法において、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることにおいて、培養液の組成を維持するための能動的な操作をしなくともよい。

　[２２]　上記[１]から[２１]のいずれかのろ過条件の評価方法において、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることにおいて、培養槽と多孔質膜を含む、培養液が循環する経路に、培地を外部から追加しなくともよい。

　[２３]　上記[１]から[２２]のいずれかのろ過条件の評価方法において、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることにおいて、培養液の溶存酸素及びｐＨの少なくともいずれかを制御しなくともよい。

　[２４]　上記[１]から[２３]のいずれかのろ過条件の評価方法において、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることにおいて、培養槽と多孔質膜を含む、培養液が循環する経路から、細胞をブリーディングしなくともよい。

　[２５]　上記[１]から[２４]のいずれかのろ過条件の評価方法において、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることにおいて、培養槽と多孔質膜を含む、培養液が循環する経路から、サンプリングのために培養液を採取してもよい。

　[２６]　上記[２５]のろ過条件の評価方法が、サンプリングした培養液における細胞の密度を計測することをさらに含んでいてもよい。

　[２７]　上記[２５]又は[２６]のろ過条件の評価方法が、サンプリングした培養液における細胞の生存率を計測することをさらに含んでいてもよい。

　[２８]　上記[２５]から[２７]のいずれかのろ過条件の評価方法が、サンプリングした培養液における細胞の産生物の濃度を計測することをさらに含んでいてもよい。

　[２９]　上記[２５]から[２８]のいずれかのろ過条件の評価方法が、サンプリングした培養液における濁度を計測することをさらに含んでいてもよい。

　[３０]　上記[１]から[２９]のいずれかのろ過条件の評価方法において、多孔質膜が中空糸膜であってもよい。

　[３１]　上記[１]から[３０]のいずれかのろ過条件の評価方法において、多孔質膜が精密ろ過膜であってもよい。

　[３２]　本発明の態様によれば、細胞が増殖する条件下において、ろ過条件を用いて、細胞を含む培養液を収容する培養槽から多孔質膜に培養液を送り、多孔質膜でろ過されずに通過した培養液を培養槽に戻し、多孔質膜でろ過された細胞の産生物を含む培養液を回収して、培養液の少なくとも一部を培養槽と多孔質膜の間で循環させることを含む細胞産生物の製造方法であって、ろ過条件が、細胞の増殖が抑制される条件下において、細胞を含む培養液を収容する培養槽から多孔質膜に培養液を送り、多孔質膜でろ過されずに通過した培養液を培養槽に戻して、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させて、多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価して得られたろ過条件である、細胞産生物の製造方法が提供される。

　[３３]　上記[３２]の細胞産生物の製造方法において、多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する際に、多孔質膜でろ過されずに通過した培養液を培養槽に戻すことにおいて、多孔質膜でろ過されずに通過した培養液と多孔質膜でろ過された培養液を培養槽に戻してもよい。

　[３４]　上記[３２]又は［３３］の細胞産生物の製造方法において、細胞が増殖する条件が、細胞周期が進行する条件であってもよい。

　[３５]　上記[３２]から[３４]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、細胞が増殖する条件が、１５℃以上の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかであってもよい。

　[３６]　上記[３５]の細胞産生物の製造方法において、１５℃より高い雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかが、２０℃、２５℃、３０℃、又は３５℃より高い雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかであってもよい。

　[３７]　上記[３２]から[３６]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、細胞が増殖する条件が、細胞の酵素が活性化されている条件であってもよい。

　[３８]　上記[３７]の細胞産生物の製造方法において、酵素がサイクリン依存性キナーゼであってもよい。

　[３９]　上記[３２]から[３８]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、細胞が増殖する条件が、前記培養液における細胞周期の阻害剤の非存在であってもよい。

　[４０]　上記[３２]から[３９]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、細胞の増殖が抑制される条件が、細胞周期の進行が抑制される条件であってもよい。

　[４１]　上記[３２]から[４０]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、細胞の増殖が抑制される条件が、１５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかであってもよい。

　[４２]　上記[４１]の細胞産生物の製造方法において、１５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかが、１０℃以下又は５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかであってもよい。

　[４３]　上記[３２]から[４２]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、細胞の増殖が抑制される条件が、前記細胞の酵素活性が抑制される条件であってもよい。

　[４４]　上記[４３]の細胞産生物の製造方法において、酵素がサイクリン依存性キナーゼであってもよい。

　[４５]　上記[３２]から[４４]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、細胞の増殖が抑制される条件が、培養液における細胞周期の阻害剤の存在であってもよい。

　[４６]　上記[３２]から[４５]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜における細胞の産生物の透過率に基づき、多孔質膜における一又は複数のろ過条件が評価されていてもよい。

　[４７]　上記[３２]から[４６]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜における透過流束に基づき、多孔質膜における一又は複数のろ過条件が評価されていてもよい。

　[４８]　上記[３２]から[４７]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜における膜間差圧に基づき、多孔質膜における一又は複数のろ過条件が評価されていてもよい。

　[４９]　上記[３２]から[４８]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、ろ液の濁度に基づき、多孔質膜における一又は複数のろ過条件が評価されていてもよい。

　[５０]　上記[３２]から[４９]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、一又は複数のろ過条件が、多孔質膜の構造、材料、又は物性の一又は複数の条件であってもよい。

　[５１]　上記[３２]から[５０]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、一又は複数のろ過条件が、培養液の一又は複数の条件であってもよい。

　[５２]　上記[３２]から[５１]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、一又は複数のろ過条件が、培養液における細胞の密度の一又は複数の条件であってもよい。

　[５３]　上記[３２]から[５２]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、一又は複数のろ過条件が、多孔質膜に送られる培養液の流量の一又は複数の条件であってもよい。

　[５４]　上記[３２]から[５３]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、一又は複数のろ過条件が、多孔質膜でろ過された培養液の流量の一又は複数の条件であってもよい。

　[５５]　上記[３２]から[５４]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、一又は複数のろ過条件が、多孔質膜に送られる培養液の流れによる、多孔質膜の接液表面におけるせん断応力の一又は複数の条件であってもよい。

　[５６]　上記[３２]から[５５]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する際に、培養槽と多孔質膜を含む、培養液が循環する経路が、温度管理槽内に配置されていてもよい。

　[５７]　上記[３２]から[５６]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜における複数のろ過条件を評価する際に、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることにおいて、培養液の組成を維持するための能動的な操作をしなくともよい。

　[５８]　上記[３２]から[５７]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜における複数のろ過条件を評価する際に、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることにおいて、培養槽と多孔質膜を含む、培養液が循環する経路に、培地を外部から追加しなくともよい。

　[５９]　上記[３２]から[５８]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜における複数のろ過条件を評価する際に、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることにおいて、培養液の溶存酸素及びｐＨの少なくともいずれかを制御しなくともよい。

　[６０]　上記[３２]から[５９]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜における複数のろ過条件を評価する際に、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることにおいて、培養槽と多孔質膜を含む、培養液が循環する経路から、細胞をブリーディングしなくともよい。

　[６１]　上記[３２]から[６０]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する際に、培養液を培養槽と多孔質膜の間で循環させることにおいて、培養槽と多孔質膜を含む、培養液が循環する経路から、サンプリングのために培養液を採取してもよい。

　[６２]　上記[６１]の細胞産生物の製造方法が、サンプリングした培養液における細胞の密度を計測することをさらに含んでいてもよい。

　[６３]　上記[６１]又は[６２]の細胞産生物の製造方法が、サンプリングした培養液における細胞の生存率を計測することをさらに含んでいてもよい。

　[６４]　上記[６１]から[６３]のいずれかの細胞産生物の製造方法が、サンプリングした培養液における細胞の産生物の濃度を計測することをさらに含んでいてもよい。

　[６５]　上記[６１]から[６４]のいずれかの細胞産生物の製造方法が、サンプリングした培養液における濁度を計測することをさらに含んでいてもよい。

　[６６]　上記[３２]から[６５]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜が中空糸膜であってもよい。

　[６７]　上記[３２]から[６６]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、多孔質膜が精密ろ過膜であってもよい。

　[６８]　上記[３２]から[６７]のいずれかの細胞産生物の製造方法において、細胞が灌流培養されていてもよい。

　本発明によれば、細胞培養液のろ過条件を適切に評価可能なろ過条件の評価方法及び細胞産生物の製造方法を提供可能である。

実施形態に係る中空糸膜のろ過条件の評価システムを示す模式図である。実施形態に係る細胞産生物の製造システムを示す模式図である。実施例に係る培養槽と中空糸膜の間を循環する培養液における細胞の密度の時間変化を示すグラフである。実施例に係る培養槽と中空糸膜の間を循環する培養液における細胞の密度の時間変化を示すグラフである。実施例に係る培養槽と中空糸膜の間を循環する培養液における細胞の生存率の時間変化を示すグラフである。実施例に係る培養槽と中空糸膜の間を循環する培養液における細胞の生存率の時間変化を示すグラフである。実施例に係る培養槽と中空糸膜の間を循環する培養液における抗体の濃度の時間変化を示すグラフである。実施例に係る培養槽と中空糸膜の間を循環する培養液における抗体の濃度の時間変化を示すグラフである。比較例に係る培養槽と中空糸膜の間を循環する培養液における細胞の密度の時間変化を示すグラフである。比較例に係る培養槽と中空糸膜の間を循環する培養液における細胞の生存率の時間変化を示すグラフである。比較例に係る培養槽と中空糸膜の間を循環する培養液における抗体の濃度の時間変化を示すグラフである。参考例に係る培養槽内の培養液における細胞の密度の時間変化を示すグラフである。参考例に係る培養槽内の培養液における細胞の生存率の時間変化を示すグラフである。参考例に係る培養槽内の培養液における抗体の濃度の時間変化を示すグラフである。参考例に係る培養槽内の培養液における細胞の密度の時間変化を示すグラフである。参考例に係る培養槽内の培養液における細胞の生存率の時間変化を示すグラフである。参考例に係る培養槽内の培養液における抗体の濃度の時間変化を示すグラフである。参考例に係る培養槽内の培養液における細胞の密度の時間変化を示すグラフである。参考例に係る培養槽内の培養液における細胞の生存率の時間変化を示すグラフである。参考例に係る培養槽内の培養液における抗体の濃度の時間変化を示すグラフである。

　以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本実施形態は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。本発明は、本実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

　図１を参照して、本実施形態に係るろ過条件の評価方法は、細胞の増殖が抑制される条件下において、細胞を含む培養液を収容する培養槽１１から多孔質膜１２に培養液を送り、多孔質膜１２でろ過されずに通過した培養液を培養槽１１に戻して、培養液を培養槽１１と多孔質膜１２の間で循環させることと、一又は複数のろ過条件下において多孔質膜１２のろ過性能を評価することと、多孔質膜１２のろ過性能に基づき、多孔質膜１２における一又は複数のろ過条件を評価することと、を含む。多孔質膜１２でろ過されずに通過した培養液を培養槽１１に戻すことにおいて、多孔質膜１２でろ過されずに通過した培養液と多孔質膜１２でろ過された培養液を培養槽１１に戻してもよい。ただし、回収した培養液と同量の培地を培養槽１１内の培養液中に補いさえすれば、培養液の全量を培養槽１１に戻さずに培養液を回収することを妨げるものではない。培養液の回収は、多孔質膜１２でろ過された培養液を、培養槽１１に全部又は一部戻さずに回収することにより行ってもよい。回収する培養液量は限定されず、同量の培地を系中に補うことで培養槽１１内の培養液に含まれる細胞の密度及び産生物の濃度の変動が抑制される。なお当該回収は、培養液の分析を目的とした後述するサンプリングとは区別される。

　培養槽１１は、例えば、外気から閉鎖された内部空間を有する容器である。ただし、培養槽１１には、内圧を一定に保つための通気口やフィルタが設けられていてもよい。通気口やフィルタは、外部の菌が培養槽１１の内部に進入することを防ぐために、０．２μｍ以下の孔径を有することが好ましい。培養槽１１には、培養槽１１内の培養液を攪拌するための攪拌装置１６が設けられていてもよい。培養槽１１内の培養液中で、細胞が浮遊培養される。

　培養槽１１内で培養される細胞は、特に限定されない。細胞は、ヒトを含む動物由来であってもよいし、微生物由来であってもよい。細胞は真核細胞であってもよいし、原核細胞であってもよい。動物の例としては、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、及び昆虫が挙げられる。細胞は、遺伝子組換え細胞であってもよい。細胞の例としては、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、枯草菌、及び大腸菌が挙げられる。

　細胞は、例えば、医薬品として利用可能な産生物を産生し、培養液中に放出する。医薬品として利用可能な産生物の例としては、ペプチド、タンパク質、及びウイルス（ウイルス様粒子を含む）が挙げられる。タンパク質の例としては、抗体、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、及び血漿タンパク質が挙げられる。タンパク質は組換えタンパク質であってもよい。

　抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、ヒト抗体であってもよく、ヒト以外のウシ及びマウス等の哺乳動物由来抗体タンパク質であってもよい。あるいは、抗体は、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質、及びヒト化抗体であってもよい。ヒトＩｇＧとのキメラ抗体とは、可変領域がマウスなどのヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域がヒト由来の免疫グロブリンに置換された抗体である。また、ヒト化抗体とは、可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来であるが、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）がヒト由来である抗体である。ヒト化は、キメラ抗体よりも免疫原性がさらに低減される。

　多孔質膜１２の形状は特に限定されない。多孔質膜の例としては、中空糸膜、平膜及び管状膜などが挙げられる。以下においては、多孔質膜１２が中空糸膜である例を説明する。多孔質膜１２において、培養液が供給される面を、中空糸膜の一次側という。また、中空糸膜を透過した透過液が流れ出る面を、中空糸膜の二次側という。内周面にろ過される培養液が供給される実施形態では、中空糸膜の内周面が一次側、中空糸膜の外周面が二次側となる。外周面にろ過される培養液が供給される実施形態では、中空糸膜の外周面が一次側、中空糸膜の内周面が二次側となる。

　多孔質膜１２の種類は特に限定されない。多孔質膜の例としては、粗ろ過膜、精密ろ過膜、限外ろ過膜、透析膜、ナノろ過膜、逆浸透膜および正浸透膜などが挙げられる。

　多孔質膜１２におけるろ過方法は、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）方法であってもよい。タンジェンシャルフローろ過方法とは、中空糸膜一次側表面において、培養液を中空糸膜一次側表面と平行な方向に流すろ過法である。タンジェンシャルフローろ過方法は、交互タンジェンシャルフローろ過（ＡＴＦ）方法を含む。本実施形態において、単にタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）法という場合は、中空糸膜一次側表面において、培養液を一方向に流すろ過法を指す場合がある。交互タンジェンシャルフローろ過（ＡＴＦ）法とは、中空糸膜一次側表面において、往復するように培養液を流すろ過法を指す。

　図１に示す例では、培養槽１１と多孔質膜１２の間には、培養槽１１内の培養液を多孔質膜１２に送るための流路１３と、多孔質膜１２でろ過されずに多孔質膜１２を通過した培養液を培養槽１１に戻すための流路１４と、任意で、多孔質膜１２でろ過された培養液を培養槽１１に戻すための流路１５と、が配置されている。流路１３を流れる培養液は、細胞と、細胞の産生物と、を含み得る。流路１４を流れる、多孔質膜１２でろ過されずに通過した培養液は、細胞と、細胞の産生物と、を含み得る。流路１５を流れる、多孔質膜１２でろ過された培養液は、細胞の産生物を含み得る。

　流路１３には、例えば、培養槽１１内の培養液を多孔質膜１２に送るためのポンプ２３が設けられている。ポンプの例としては、ダイヤフラムポンプ、チューブポンプ、遠心ポンプ、及びロータリーポンプが挙げられるが、これらに限定されない。流路１３には、多孔質膜１２に供給される培養液の圧力を計測する圧力計３３が設けられていてもよい。流路１３には、流路１３内を流れる培養液の流速及び流量の少なくともいずれかを測定する流量計が設けられていてもよい。流路１３には、流路１３内を流れる培養液の温度を測定する温度計が設けられていてもよい。流路１３には、流路１３内を流れる培養液をサンプリングするためのサンプリング部が設けられていてもよい。サンプリング部は、サンプリング時以外は閉鎖される。

　流路１４には、多孔質膜１２の細孔部分を通過せずに中空部を通過して、多孔質膜１２でろ過されなかった培養液を培養槽１１に送るためのポンプが設けられていてもよい。なお、ポンプは、流路１３及び流路１４の両方に設けられていてもよいし、いずれか一方に設けられていてもよい。流路１４には、多孔質膜１２を通過した培養液の圧力を計測する圧力計３４が設けられていてもよい。流路１４には、流路１４内を流れる培養液の流速及び流量の少なくともいずれかを測定する流量計が設けられていてもよい。流路１４には、流路１４内を流れる培養液の温度を測定する温度計が設けられていてもよい。流路１４には、流路１４内を流れる培養液をサンプリングするためのサンプリング部が設けられていてもよい。サンプリング部は、サンプリング時以外は閉鎖される。

　流路１５には、例えば、多孔質膜１２の細孔部分を通過して多孔質膜１２でろ過された培養液を培養槽１１に送るためのポンプ２５が設けられている。流路１５には、多孔質膜１２でろ過された培養液の圧力を計測する圧力計３５が設けられていてもよい。流路１５には、流路１５内を流れる培養液の流速及び流量の少なくともいずれかを測定する流量計が設けられていてもよい。流路１５には、流路１５内を流れる培養液をサンプリングするためのサンプリング部が設けられていてもよい。サンプリング部は、サンプリング時以外は閉鎖される。

　培養槽１１と多孔質膜１２は、培養液が循環する経路の少なくとも一部をなしている。また、流路１３、１４、１５は、培養液が循環する経路の少なくとも一部をなしている。培養液が循環する経路は、外部から閉鎖されていてもよいが、上述したように、培養槽１１には、内圧を一定に保つための通気口やフィルタが設けられていてもよい。

　培養槽１１と多孔質膜１２は、内部の温度を管理する温度管理槽５０内に配置されていてもよい。流路１３、１４、１５は、温度管理槽５０内に配置されていてもよい。温度管理槽５０は、培養槽１１、多孔質膜１２、及び流路１３、１４、１５の雰囲気温度を管理する。温度管理槽５０は、恒温槽や冷蔵庫であってもよいし、恒温維持されたブースや部屋、建物であってもよい。

　細胞の増殖が抑制される条件は、特に限定されないが、例えば、細胞周期の進行が抑制される条件である。細胞周期の進行が抑制される条件は、例えば、培養槽１１及び多孔質膜１２の１５℃以下の低い雰囲気温度あるいは培養液の１５℃以下の温度である。雰囲気温度あるいは培養液の温度は、好ましくは１０℃以下又は５℃以下である。なお、細胞の死滅を抑制する観点から、培養槽１１及び多孔質膜１２の雰囲気温度あるいは培養液の温度は、０℃以上、１℃以上、２℃以上、又は３℃以上であることが好ましい。培養液の温度は、培養液の温度を直接計測してもよいし、培養槽１１及び多孔質膜１２の雰囲気温度から推定して測定してもよい。測定された培養液の温度に基づいて、培養液の温度を温度制御装置で直接制御してもよいし、培養槽１１及び多孔質膜１２の雰囲気温度を温度制御装置で制御してもよい。細胞周期の進行が抑制される条件は、例えば、細胞におけるサイクリン依存性キナーゼ等の酵素活性が抑制される条件であってもよい。細胞周期の進行が抑制される条件は、培養液における細胞周期の阻害剤の存在であってもよい。細胞の増殖が抑制される条件下では、細胞の活性が低下し、細胞周期の進行が抑制されて細胞の分裂が抑制され、かつ、産生物の産生が抑制される。

　本実施形態において、多孔質膜１２でろ過されずに通過した培養液と、多孔質膜１２でろ過された培養液と、の両方を、培養槽１１に戻してもよい。この場合、細胞の増殖が抑制される条件下では、系中の細胞の総量及び産生物の総量が維持されるので、培養槽１１と多孔質膜１２の間を循環する培養液に含まれる細胞の密度及び産生物の濃度の変動が抑制される。

　細胞の増殖が抑制される条件下では細胞の活性が低下し、細胞が必要とする培養液成分の量も低下するので、培養液が循環する経路に外部から培地を追加しなくともよい。また、培地を追加しないことにより、培養液に含まれる細胞の密度及び産生物の濃度の変動が抑制される。さらに、細胞の増殖が抑制される条件下では細胞の活性が低下し、培養液における溶存酸素濃度（ＤＯ）及びｐＨの変動が抑制されるので、培養液が循環する経路に外部から酸素や二酸化炭素等の気体を追加して溶存酸素濃度及びｐＨを制御しなくともよい。またさらに、細胞の増殖が抑制される条件下では、培養液における細胞の密度がほぼ一定になるので、培養液が循環する経路から外部に細胞をブリーディングしなくともよい。したがって、本実施形態に係るろ過条件の評価方法によれば、細胞培養のための操作を簡略化することが可能である。ただし、例えば、細胞の密度、細胞の生存率、及び細胞の産生物の濃度を監視するために、培養液の一部をサンプリングしてもよい。サンプリングは細胞の密度を調整することを目的としないため、ブリーディングとは区別される。

　多孔質膜１２における一又は複数のろ過条件は、多孔質膜１２のろ過性能に基づいて評価される。多孔質膜１２のろ過性能は、例えば、多孔質膜１２における細胞の産生物の透過率の高さ、多孔質膜１２における夾雑物の遮蔽率の高さ、多孔質膜１２における膜間差圧の低さ、多孔質膜１２における膜間差圧が上昇するまでにろ過可能な液量の多さ、多孔質膜１２における透過流束が低下し始めるまでにろ過可能な液量の多さ、多孔質膜１２における圧力損失の低さ、多孔質膜１２における流量の大きさ、多孔質膜１２における流速の速さ、及び多孔質膜１２における透過流束の速さの少なくともいずれかで表されてもよい。

　多孔質膜１２における一又は複数のろ過条件は、多孔質膜１２における一又は複数のろ過条件によって、多孔質膜１２のろ過性能が所定の基準を満たすか否か、あるいは、相対的に優れているか否かに基づいて評価される。あるいは、多孔質膜１２における複数のろ過条件のうち、多孔質膜１２のろ過性能が所定の基準を満たすか否か、あるいは、相対的に優れているか否かに基づいて、少なくとも一部のろ過条件を抽出してもよい。

　多孔質膜１２に供給される培養液に含まれる細胞の密度及び産生物の濃度が変動すると、多孔質膜１２のろ過性能を正確に評価することが困難になり得る。これに対し、上述したように、本実施形態において、細胞の増殖が抑制されており、培養液に含まれる細胞の密度及び産生物の濃度の変動が抑制される。多孔質膜１２でろ過された培養液を培養槽１１に戻すと、培養液に含まれる細胞の密度及び産生物の濃度の変動がより抑制される。そのため、本実施形態によれば、培養液に含まれる細胞の密度及び産生物の濃度を略一定に保ったまま、多孔質膜１２のろ過性能を評価することが可能である。また、多孔質膜１２でろ過された培養液を培養槽１１に戻すと、培養槽１１への培地の補充を省略することが可能になり得る。

　一又は複数のろ過条件は、例えば、多孔質膜１２の構造の一又は複数の条件である。多孔質膜１２の構造の条件とは、例えば、膜厚、内径、外径、膜表面の開口率、空隙率、孔径、平均孔径、孔径ばらつき、阻止孔径、孔径と繊維径の比、膜表面の異方性、膜孔の異方性、膜表面粗さ及び一次側から二次側への孔径の変化である。例えば、様々な構造を有する複数の多孔質膜１２を用意し、それぞれの多孔質膜１２のろ過性能が評価される。さらに、多孔質膜１２の構造の一又は複数の条件が、所定の基準を満たすろ過性能を与えるか否か、あるいは、相対的に優れているか否かが評価される。

　一又は複数のろ過条件は、例えば、多孔質膜１２の材料の一又は複数の条件である。例えば、様々な材料からなる複数の多孔質膜１２を用意し、それぞれの多孔質膜１２のろ過性能が評価される。さらに、多孔質膜１２の材料の一又は複数の条件が、所定の基準を満たすろ過性能を与えるか否か、あるいは、相対的に優れているか否かが評価される。

　一又は複数のろ過条件は、例えば、多孔質膜１２の物性の一又は複数の条件である。多孔質膜１２の物性の条件とは、例えば、親水性、疎水性、カチオン性、アニオン性、弾性限界圧力、及びバブルポイントである。例えば、様々な物性を有する複数の多孔質膜１２を用意し、それぞれの多孔質膜１２のろ過性能が評価される。さらに、多孔質膜１２の物性の一又は複数の条件が、所定の基準を満たすろ過性能を与えるか否か、あるいは、相対的に優れているか否かが評価される。

　一又は複数のろ過条件は、例えば、培養液の一又は複数の条件である。培養液の条件とは、例えば、培養液の含有物、培養液における各含有物の濃度、培養液の粘度、培養液のｐＨ、培養液の電気伝導度、及び培養液の濁度である。培養液の含有物の例としては、培養液の組成物、消泡剤、塩、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）、脂質、及び多糖類が挙げられる。例えば、条件が異なる複数の培養液を用意し、それぞれの培養液を用いた場合の多孔質膜１２のろ過性能が評価される。さらに、培養液の一又は複数の条件が、所定の基準を満たすろ過性能を与えるか否か、あるいは、相対的に優れているか否かが評価される。

　一又は複数のろ過条件は、例えば、培養液における細胞の密度の複数の条件である。例えば、細胞の密度が異なる複数の培養液を用意し、それぞれの培養液を用いた場合の多孔質膜１２のろ過性能が評価される。さらに、細胞の密度の一又は複数の条件が、所定の基準を満たすろ過性能を与えるか否か、あるいは、相対的に優れているか否かが評価される。

　一又は複数のろ過条件は、例えば、多孔質膜１２に送られる培養液の流量の一又は複数の条件である。例えば、異なる流量で培養液を多孔質膜１２に送り、それぞれの流量を用いた場合の多孔質膜１２のろ過性能が評価される。さらに、多孔質膜１２に送られる培養液の流量の一又は複数の条件が、所定の基準を満たすろ過性能を与えるか否か、あるいは、相対的に優れているか否かが評価される。流量は体積流量で表されてもよいし、質量流量で表されてもよいし、線速度で表されてもよいし、多孔質膜１２の表面におけるせん断速度で表されてもよい。

　一又は複数のろ過条件は、例えば、多孔質膜１２でろ過された培養液の流量の一又は複数の条件である。例えば、多孔質膜１２でろ過された培養液を異なる流量で送液し、それぞれの流量を用いた場合の多孔質膜１２のろ過性能が評価される。さらに、多孔質膜１２でろ過された培養液の流量の一又は複数の条件が、所定の基準を満たすろ過性能を与えるか否か、あるいは、相対的に優れているか否かが評価される。

　一又は複数のろ過条件は、例えば、多孔質膜１２の接液表面におけるせん断応力の一又は複数の条件である。接液表面とは、ろ過される液が接する多孔質膜１２の表面である。多孔質膜１２が中空糸膜である場合は、一次側の表面である。例えば、多孔質膜１２の接液表面におけるせん断応力を変化させ、それぞれのせん断応力を用いた場合の多孔質膜１２のろ過性能が評価される。さらに、多孔質膜１２の接液表面におけるせん断応力の一又は複数の条件が、所定の基準を満たすろ過性能を与えるか否か、あるいは、相対的に優れているか否かが評価される。

　本実施形態に係るろ過条件の評価方法によれば、培養槽１１と多孔質膜１２の間を循環する培養液に含まれる細胞の密度及び産生物の濃度の変動を抑制しながら、多孔質膜１２に所定の基準を満たすろ過性能を発揮させる一又は複数のろ過条件を選定することが可能である。

　次に、図２を参照して、本実施形態に係る細胞産生物の製造方法は、細胞が増殖する条件下において、上述したろ過条件の評価方法で得られたろ過条件を用いて、細胞を含む培養液を収容する培養槽１１１から多孔質膜１１２に培養液を送り、多孔質膜１１２でろ過されずに通過した培養液を培養槽１１１に戻し、多孔質膜１１２でろ過された細胞の産生物を含む培養液を回収して、培養液の少なくとも一部を培養槽１１１と多孔質膜１１２の間で循環させることを含む。

　細胞が増殖する条件は、細胞が産生物を産生し、培養液中に産生物が供給され続ける条件であれば特に限定されないが、例えば、細胞周期が進行する条件である。細胞周期が進行する条件は、例えば、培養槽１１１及び多孔質膜１１２の１５℃以上の雰囲気温度あるいは培養液の１５℃以上の温度である。雰囲気温度あるいは培養液の温度は、好ましくは２０℃、２５℃、３０℃、又は３５℃より高い温度である。また、細胞の死滅を抑制する観点から、培養槽１１１及び多孔質膜１１２の雰囲気温度あるいは培養液の温度は、６０℃以下、５０℃以下、又は４０℃以下であることが好ましい。培養液の温度は、培養液の温度を直接計測してもよいし、培養槽１１１及び多孔質膜１１２の雰囲気温度から推定して測定してもよい。測定された培養液の温度に基づいて、培養液の温度を温度制御装置で直接制御してもよいし、培養槽１１１及び多孔質膜１１２の雰囲気温度を温度制御装置で制御してもよい。細胞周期が進行する条件は、例えば、細胞におけるサイクリン依存性キナーゼ等の酵素が活性化されている条件であってもよい。細胞周期が進行する条件は、培養液における細胞周期の阻害剤の非存在であってもよい。

　培養槽１１１で培養される細胞は、ろ過条件の評価方法で用いられた細胞と同じであることが好ましいが、ろ過条件の評価方法で用いられた細胞と異なっていてもよい。また、多孔質膜１１２でろ過される細胞の産生物は、ろ過条件の評価方法でろ過された細胞の産生物と同じであることが好ましいが、ろ過条件の評価方法でろ過された細胞の産生物と異なっていてもよい。

　培養槽１１１と多孔質膜１１２の間には、培養槽１１１内の培養液を多孔質膜１１２に送るための流路１１３と、多孔質膜１１２でろ過されずに多孔質膜１１２を通過した培養液を培養槽１１１に戻すための流路１１４と、が配置されている。流路１１３を流れる培養液は、細胞と、細胞の産生物と、を含み得る。流路１１４を流れる、多孔質膜１１２の細孔部分を通過せずに中空部を通過して、多孔質膜１１２でろ過されなかった培養液は、細胞と、細胞の産生物と、を含み得る。また、多孔質膜１１２には、多孔質膜１１２でろ過された培養液を回収するための流路１１５が接続されている。流路１１５を流れる、多孔質膜１１２の細孔部分を通過して多孔質膜１１２でろ過された培養液は、細胞の産生物を含み得る。多孔質膜１１２でろ過された培養液は、例えば、容器２０１内に回収される。容器２０１は流路１１５と無菌的に接続されていてもよい。多孔質膜１１２でろ過された培養液が流れる流路１１５は、例えば、次の精製工程のために用いられるカラムへと直接接続されていてもよい。多孔質膜１１２でろ過された培養液は、培養槽１１１に戻されない。

　流路１１３には、例えば、培養槽１１１内の培養液を多孔質膜１１２に送るためのポンプ１２３が設けられている。流路１１３には、多孔質膜１１２に供給される培養液の圧力を計測する圧力計１３３が設けられていてもよい。流路１１３には、流路１１３内を流れる培養液の流速及び流量の少なくともいずれかを測定する流量計が設けられていてもよい。流路１１３には、流路１１３内を流れる培養液の温度を測定する温度計が設けられていてもよい。流路１１３には、流路１１３内を流れる培養液をサンプリングするためのサンプリング部が設けられていてもよい。サンプリング部は、サンプリング時以外は閉鎖される。

　流路１１４には、多孔質膜１１２の細孔部分を通過せずに中空部を通過して、多孔質膜１１２でろ過されなかった培養液を培養槽１１１に送るためのポンプが設けられていてもよい。なお、ポンプは、流路１１３及び流路１１４の両方に設けられていてもよいし、いずれか一方に設けられていてもよい。流路１１４には、多孔質膜１１２を通過した培養液の圧力を計測する圧力計１３４が設けられていてもよい。流路１１４には、流路１１４内を流れる培養液の流速及び流量の少なくともいずれかを測定する流量計が設けられていてもよい。流路１１４には、流路１１４内を流れる培養液の温度を測定する温度計が設けられていてもよい。流路１１４には、流路１１４内を流れる培養液をサンプリングするためのサンプリング部が設けられていてもよい。サンプリング部は、サンプリング時以外は閉鎖される。

　流路１１５には、例えば、多孔質膜１１２でろ過された培養液を送るためのポンプ１２５が設けられている。流路１１５には、多孔質膜１１２でろ過された培養液の圧力を計測する圧力計１３５が設けられていてもよい。流路１１５には、流路１１５内を流れる培養液の流速及び流量の少なくともいずれかを測定する流量計が設けられていてもよい。流路１１５には、流路１１５内を流れる培養液をサンプリングするためのサンプリング部が設けられていてもよい。サンプリング部は、サンプリング時以外は閉鎖される。

　培養槽１１１と多孔質膜１１２は、培養液が循環する経路の少なくとも一部をなしている。また、流路１１３、１１４は、培養液が循環する経路の少なくとも一部をなしている。

　培養槽１１１には、培養槽１１１に培養液を供給するための流路１１６が接続されていてもよい。流路１１６は、例えば、培養液を収容する培養液タンク２１６に接続されている。流路１１６には、例えば、培養液を培養槽１１１に送るためのポンプ１２６が設けられている。例えば、ポンプ１２５とポンプ１２６は、多孔質膜１１２でろ過されて培養槽１１１に戻らない培養液の量と、培養槽１１１に供給される培養液の量とが、同じになるように制御される。この制御は、培養槽１１１に設置された液面センサー（レベルセンサー）を用いて液面高さを観測し、液面高さが一定となるように行われてもよいし、培養液を含んだ培養槽１１１全体の重量を測定し、重量が一定となるように行われてもよい。

　培養槽１１１には、培養槽１１１に二酸化炭素を含む空気を供給するための流路１１７が接続されていてもよい。流路１１７は、例えば、二酸化炭素を含む空気を収容する容器２１７に接続されている。また、培養槽１１１には、培養槽１１１に酸素を供給するための流路１１８が接続されていてもよい。流路１１８は、例えば、酸素を収容する容器２１８に接続されている。

　培養槽１１１には、培養槽１１１内の細胞の少なくとも一部を排出するための流路１１９が接続されていてもよい。例えば、流路１１９を用いて培養槽１１１内の細胞の少なくとも一部を排出することにより、培養槽１１１内の培養液における細胞の密度が一定に保たれる。これにより、細胞の密度が上昇して、培養液中の酸素及び培養液成分が不足したり、不純物の濃度が上昇したりすることが抑制される。培養槽１１１内の細胞の少なくとも一部を排出することは、ブリーディングと呼ばれる。

　培養槽１１１には、培養槽１１１内の培養液の温度を測定するための温度計、ＤＯ（溶存酸素）を測定するためのＤＯ計、あるいはｐＨを測定するためのｐＨ計が接続されていてもよい。

　本実施形態に係る細胞産生物の製造方法によれば、予め取得されたろ過条件を用いて細胞の産生物をろ過するため、細胞の産生物を効率的に得ることが可能である。

　（実施例１）
　無血清培地へ馴化および浮遊化した細胞を選別し凍結された、モノクローナル抗体産生チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１２４４５）の株を解凍後、表１に示す組成を有する無血清培地を予め１０ｍＬ分注した１２５ｍＬ三角フラスコに入れ、三角フラスコ中で、細胞と培地を混和させた。生死細胞オートアナライザー（Ｖｉ－ＣＥＬＬ　ＸＲ、ベックマン）で細胞数を確認し、細胞の密度が３．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地で細胞を希釈した。その後、インキュベーター内で、３７℃，５％ＣＯ_２雰囲気下で４日間、細胞を振盪培養した。

　細胞を解凍してから４日目、３．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む５０ｍＬの培養液を新しい２個の１２５ｍＬ三角フラスコに入れ、インキュベーター内で、３７℃，５％ＣＯ_２雰囲気下で３日間、細胞を振盪培養した。３日後、３．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む１２０から１３０ｍＬの培養液を新しい２個の２５０ｍＬ三角フラスコに入れ、インキュベーター内で、３７℃，５％ＣＯ_２雰囲気下で３日間、細胞を振盪培養した。３日後、３．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む５００ｍＬの培養液を新しい３個の１Ｌ三角フラスコに入れ、インキュベーター内で、３７℃，５％ＣＯ_２雰囲気下で３日間、細胞を振盪培養した。

　予めオートクレーブ滅菌した１２Ｌ容量の培養槽に、５．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む６Ｌの培養液を無菌的に入れた。３７℃，５％ＣＯ_２雰囲気下でＤＯが７０％を下回らないよう酸素を吹き込みながら３日間、細胞を攪拌培養した。３日後、表２に示す組成を有する無血清培地を培養槽に添加することを、０．２８ｍＬ／分で３日間継続して実施した。

　次に、１．５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む培養液を無菌的に回収し、あらかじめオートクレーブ滅菌した培養槽としてのスピナーフラスコ中に培養液を６００ｍＬ移し入れた。接液部分の膜面積が３ｃｍ^２となるよう有効長を調整した多孔質中空糸膜（旭化成メディカル製、ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ　ＭＦ－ＳＬ、阻止孔径０．４μｍ）のミニモジュールを用意した。スピナーフラスコと多孔質中空糸膜の一次側である中空部の第１の開口を第１の流路で接続し、多孔質中空糸膜の中空部の第２の開口とスピナーフラスコを第２の流路で接続し、多孔質中空糸膜の二次側とスピナーフラスコを第３の流路で接続した。

　スピナーフラスコ及び多孔質中空糸膜の雰囲気温度を４℃にし、スピナーフラスコ内で培養液を攪拌した。磁気浮上遠心ポンプ（Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製　ＰｕｒａＬｅｖ　ｉ３０ＳＵ）によりスピナーフラスコから多孔質中空糸膜へ第１の流路を介して培養液を送液し、タンジェンシャルフローろ過を行った。多孔質中空糸膜でろ過されずに多孔質中空糸膜の中空部を通過した培養液は、第２の流路を介して、スピナーフラスコに戻された。多孔質中空糸膜でろ過された培養液は、第３の流路を介してスピナーフラスコに戻された。第１及び第３の流路は、内部の培養液をサンプリングすることが可能な構造を有していた。

　多孔質中空糸膜の一次側と二次側にはシングルユース圧力計（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ製、ＰＲＥＰＳ－Ｎ－０００又はＰＲＥＰＳ－Ｎ－０１２）を設置し、経時的に膜間差圧（ＴＭＰ）を測定した。培養液の粘度をＥＭＳ粘度計（ＥＭＳ－１０００Ｓ）で測定し、スピナーフラスコから多孔質中空糸膜への培養液の送液量は、多孔質中空糸膜の内表面におけるせん断応力が４．５８Ｎ／ｍ^２となるように設定した。多孔質中空糸膜におけるろ過流量は、ポンプにより、一定（１ＬＭＨ）となるように５μＬ／ｍｉｎに設定した。

　一日に１回又は２回、スピナーフラスコと多孔質中空糸膜の間を循環する培養液をサンプリングし、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度を測定した。その結果、図３、図５、及び図７に示すように、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度は、それぞれ、略一定であった。ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ　ＭＦ－ＳＬで培養液を３００Ｌ／ｍ^２ろ過した時点における、ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ　ＭＦ－ＳＬにおけるモノクローナル抗体の透過率は７８．８％であり、膜間差圧は４３．４ｋＰａであった。

　（実施例２）
　接液部分の膜面積が３ｃｍ^２となるよう有効長を調整した多孔質中空糸膜のミニモジュールとして、旭化成製、Ｍｉｃｒｏｚａ　ＵＭＰ、阻止孔径０．２μｍの多孔質中空糸膜を使用した以外は、実施例１と同様の方法を実施した。その結果、図３、図５、及び図７に示すように、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度は、それぞれ、略一定であった。ＭＩＣＲＯＺＡ　ＵＭＰで培養液を３００Ｌ／ｍ^２ろ過した時点における、ＭＩＣＲＯＺＡ　ＵＭＰにおけるモノクローナル抗体の透過率は８０．２％であり、膜間差圧は８１．０ｋＰａであった。

　（実施例３）
　接液部分の膜面積が３ｃｍ^２となるよう有効長を調整した多孔質中空糸膜のミニモジュールとして、旭化成製、Ｍｉｃｒｏｚａ　ＵＪＰ、阻止孔径０．６５μｍの多孔質中空糸膜を使用した以外は、実施例１と同様の方法を実施した。その結果、図３、図５、及び図７に示すように、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度は、それぞれ、略一定であった。ＭＩＣＲＯＺＡ　ＵＪＰで培養液を３００Ｌ／ｍ^２ろ過した時点における、ＭＩＣＲＯＺＡ　ＵＪＰにおけるモノクローナル抗体の透過率は９９．２％であり、膜間差圧は１．３ｋＰａであった。

　（実施例４）
　接液部分の膜面積が３ｃｍ^２となるよう有効長を調整した多孔質中空糸膜のミニモジュールとして、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製、阻止孔径０．２μｍの多孔質中空糸膜を使用した以外は、実施例１と同様の方法を実施した。その結果、図３、図５、及び図７に示すように、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度は、それぞれ、略一定であった。Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製の中空糸で培養液を３００Ｌ／ｍ^２ろ過した時点における、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製の中空糸におけるモノクローナル抗体の透過率は８６．４％であり、膜間差圧は１．０ｋＰａであった。

　（実施例５）
　接液部分の膜面積が３ｃｍ^２となるよう有効長を調整した多孔質中空糸膜のミニモジュールとして、Ｃｙｔｉｖａ製、阻止孔径０．４５μｍの多孔質中空糸膜を使用した以外は、実施例１と同様の方法を実施した。その結果、図３、図５、及び図７に示すように、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度は、それぞれ、略一定であった。Ｃｙｔｉｖａ社製の中空糸で培養液を３００Ｌ／ｍ^２ろ過した時点における、Ｃｙｔｉｖａ社製の中空糸におけるモノクローナル抗体の透過率は８０．６％であり、膜間差圧は２．０ｋＰａであった。

　（実施例６）
　無血清培地へ馴化および浮遊化した細胞を選別し凍結された、モノクローナル抗体産生チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１２４４５）の株を解凍後、表３に示す組成を有する無血清培地を予め１０ｍＬ分注した１２５ｍＬ三角フラスコに入れ、三角フラスコ中で、細胞と培地を混和させた。生死細胞オートアナライザー（Ｖｉ－ＣＥＬＬ　ＸＲ、ベックマン）で細胞数を確認し、細胞の密度が３．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地で細胞を希釈した。その後、インキュベーター内で、３７℃，５％ＣＯ_２雰囲気下で４日間、細胞を振盪培養した。

　予めオートクレーブ滅菌した１２Ｌ容量の培養槽に、５．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む５Ｌの培養液を無菌的に入れた。３７℃，５％ＣＯ_２雰囲気下でＤＯが７０％を下回らないよう酸素を吹き込みながら３日間、細胞を攪拌培養した。３日後、多孔質中空糸膜（旭化成メディカル製、ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ　ＭＦ－ＳＬ０１９０、阻止孔径０．４μｍ）によるろ過、及び培養槽への培養液の添加を伴う連続培養を開始した。

　ろ過により培養槽から抜き出された培養液の量と同じ量の新鮮培地を５０Ｌバッグ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製，　Ｐｒｏｄｕｃｔａｉｎｅｒ　ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（ＢＰＣ），５０Ｌ）から無菌的に培養槽に送液し、培養槽内の培養液の量が一定となるよう制御した。培養液の培地交換速度は１ｖｖｄ^－１（vessel volumes per day）となるように設定し、グルコース濃度が１ｇ／Ｌ以下又はグルタミン濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下になった時点で、培養液の培地交換速度を０．５ｖｖｄ^－１分上げた。

　連続培養を開始してから７日間経過後、１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む培養液を無菌的に回収し、あらかじめオートクレーブ滅菌した培養槽としてのスピナーフラスコ中に培養液を６００ｍＬ移し入れた。接液部分の膜面積が３ｃｍ^２となるよう有効長を調整した多孔質中空糸膜（旭化成メディカル製、ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ　ＭＦ－ＳＬ、阻止孔径０．４μｍ）のミニモジュールを用意した。スピナーフラスコと多孔質中空糸膜の一次側である中空部の第１の開口を第１の流路で接続し、多孔質中空糸膜の中空部の第２の開口とスピナーフラスコを第２の流路で接続し、多孔質中空糸膜の二次側とスピナーフラスコを第３の流路で接続した。

　多孔質中空糸膜の一次側と二次側にはシングルユース圧力計（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ製、ＰＲＥＰＳ－Ｎ－０００又はＰＲＥＰＳ－Ｎ－０１２）を設置し、経時的に膜間差圧（ＴＭＰ）を測定した。培養液の粘度をＥＭＳ粘度計（ＥＭＳ－１０００Ｓ）で測定し、スピナーフラスコから多孔質中空糸膜への培養液の送液量は、多孔質中空糸膜の内表面におけるせん断応力が１．６９Ｎ／ｍ^２となるように設定した。多孔質中空糸膜におけるろ過流量は、ポンプにより、一定（１ＬＭＨ）となるように５μＬ／ｍｉｎに設定した。

　一日に１回又は２回、スピナーフラスコと多孔質中空糸膜の間を循環する培養液をサンプリングし、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度を測定した。その結果、図４、図６、及び図８に示すように、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度は、それぞれ、略一定であった。

　（実施例７）
　接液部分の膜面積が３ｃｍ^２となるよう有効長を調整した多孔質中空糸膜のミニモジュールとして、旭化成製、Ｍｉｃｒｏｚａ　ＵＭＰ、阻止孔径０．２μｍの多孔質中空糸膜を使用した以外は、実施例６と同様の方法を実施した。その結果、図４、図６、及び図８に示すように、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度は、それぞれ、略一定であった。

　（実施例８）
　接液部分の膜面積が３ｃｍ^２となるよう有効長を調整した多孔質中空糸膜のミニモジュールとして、旭化成製、Ｍｉｃｒｏｚａ　ＵＪＰ、阻止孔径０．６５μｍの多孔質中空糸膜を使用した以外は、実施例６と同様の方法を実施した。その結果、図４、図６、及び図８に示すように、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度は、それぞれ、略一定であった。

　（実施例９）
　接液部分の膜面積が３ｃｍ^２となるよう有効長を調整した多孔質中空糸膜のミニモジュールとして、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製、阻止孔径０．２μｍの多孔質中空糸膜を使用した以外は、実施例６と同様の方法を実施した。その結果、図４、図６、及び図８に示すように、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度は、それぞれ、略一定であった。

　（実施例１０）
　接液部分の膜面積が３ｃｍ^２となるよう有効長を調整した多孔質中空糸膜のミニモジュールとして、Ｃｙｔｉｖａ製、阻止孔径０．４５μｍの多孔質中空糸膜を使用した以外は、実施例６と同様の方法を実施した。その結果、図４、図６、及び図８に示すように、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度は、それぞれ、略一定であった。

　（比較例１）
　実施例と同様に３．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む１２０から１３０ｍＬの培養液を新しい２個の２５０ｍＬ三角フラスコに入れ、インキュベーター内で、３７℃，５％ＣＯ_２雰囲気下で３日間、細胞を振盪培養した後、あらかじめオートクレーブ滅菌した３Ｌ容量の培養槽中に５．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む１．２８Ｌの培養液を無菌的に入れた。３７℃，５％ＣＯ_２雰囲気下でＤＯが７０％を下回らないよう酸素を吹き込みながら３日間、細胞を攪拌培養した。３日後、接液部分の膜面積が２００ｃｍ^２となるよう本数と有効長を調整した多孔質中空糸膜（旭化成メディカル製、ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ　ＭＦ－ＳＬ、阻止孔径０．４μｍ）のモジュールによるろ過、及び培養槽への培養液の添加を伴う連続培養を開始した。

　培養槽と多孔質中空糸膜の一次側である中空部の第１の開口を第１の流路で接続し、多孔質中空糸膜の中空部の第２の開口と培養槽を第２の流路で接続した。多孔質中空糸膜でろ過された培養液は、培養槽に戻さないようにした。また、培養槽には、内部の培地をサンプリングするための流出口と、新鮮培地を供給するための供給口を設けた。

　ろ過により培養槽から抜き出された培養液の量と同じ量の新鮮培地を２０Ｌバッグ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製，　Ｐｒｏｄｕｃｔａｉｎｅｒ　ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（ＢＰＣ），２０Ｌ）から無菌的に培養槽に送液し、培養槽内の培養液の量が一定となるよう制御した。培養液の培地交換速度は１ｖｖｄ^－１（vessel volumes per day）となるように設定し、グルコース濃度が１ｇ／Ｌ以下又はグルタミン濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下になった時点で、培養液の培地交換速度を０．３７５ｖｖｄ^－１分上げた。

　培養槽内に入った培養液の温度を３７℃に制御し、培養槽内で培養液を攪拌した。磁気浮上遠心ポンプ（Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製　ＰｕｒａＬｅｖ　２００ＭＵ）により培養槽から多孔質中空糸膜へ第１の流路を介して培養液を送液し、タンジェンシャルフローろ過を行った。多孔質中空糸膜でろ過されずに多孔質中空糸膜の中空部を通過した培養液は、第２の流路を介して、培養槽に戻された。培養液のＤＯが７０％を下回った場合、スパージャーを用いて、培養槽内の培養液中に酸素を導入した。また、培養槽内には５％の濃度で二酸化炭素を含む空気を常時導入した。

　多孔質中空糸膜の一次側と二次側にはシングルユース圧力計（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ製、ＰＲＥＰＳ－Ｎ－０３８）を設置し、経時的に膜間差圧（ＴＭＰ）を測定した。培養槽から多孔質中空糸膜への培養液の送液量は、多孔質中空糸膜の内表面におけるせん断応力が２．１０Ｎ／ｍ^２となるように設定した。多孔質中空糸膜におけるろ過流量は、ポンプにより、１．０ＬＭＨ、１．５ＬＭＨ、２．０ＬＭＨ、２．５ＬＭＨ、及び３．０ＬＭＨに段階的に上昇させ、細胞の増加にあわせてグルコース濃度及びグルタミン濃度の調整のために新鮮培地の導入量が増えるようにした。また、培養槽中の培養液中の細胞の密度が７．５ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにブリーディングした。さらに、培養槽に液面センサーを配置し、液面が一定となるよう、新鮮培地を培養槽内に導入した。

　一日に１回又は２回、培養槽内の培養液をサンプリングし、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度を測定した。その結果、図９に示すように、培養液における細胞の密度は、ブリーディングを開始するまで上昇し続けた。図１０に示すように、細胞の生存率は略一定であった。図１１に示すように、抗体の濃度は上昇する傾向にあった。

　（比較例２）
　接液部分の膜面積が２００ｃｍ^２となるよう本数と有効長を調整した多孔質中空糸膜のモジュールとして旭化成製、Ｍｉｃｒｏｚａ　ＵＭＰ、阻止孔径０．２μｍの多孔質中空糸膜を使用した以外は、比較例１と同様の方法を実施した。

　（参考例１から３）
　実施例１と同様に用意した１．５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む培養液を無菌的に回収し、あらかじめオートクレーブ滅菌した培養槽としてのスピナーフラスコ中に培養液を６００ｍＬ移し入れた。

　スピナーフラスコの雰囲気温度を４℃にし、スピナーフラスコ内で培養液を攪拌した。スピナーフラスコには中空糸膜を接続せず、スピナーフラスコ内のみで細胞を培養した。一日に１回又は２回、スピナーフラスコ内の培養液をサンプリングし、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度を測定した。雰囲気温度を室温（ＲＴ）にした以外は同じ条件による実験と、雰囲気温度を３７℃にした以外は同じ条件による実験も行った。その結果、図１２に示すように、室温では、細胞の密度が上昇する傾向にあった。図１３に示すように、室温及び３７℃では、細胞の生存率は低下する傾向にあった。図１４に示すように、室温及び３７℃では、抗体の濃度が上昇する傾向にあった。

　（参考例４から６）
　実施例１と同様に用意した１．５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む培養液を無菌的に回収し、あらかじめオートクレーブ滅菌した培養槽としてのスピナーフラスコ中に培養液を６００ｍＬ移し入れた。

　スピナーフラスコの雰囲気温度を８℃にし、スピナーフラスコ内で培養液を攪拌した。スピナーフラスコには中空糸膜を接続せず、スピナーフラスコ内のみで細胞を培養した。一日に１回又は２回、スピナーフラスコ内の培養液をサンプリングし、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度を測定した。雰囲気温度を１２℃にした以外は同じ条件による実験と、雰囲気温度を３７℃にした以外は同じ条件による実験も行った。その結果、図１５に示すように、３７℃では、細胞の密度が低下する傾向にあった。図１６に示すように、３７℃では、細胞の生存率は低下する傾向にあった。

　（参考例７、８）
　実施例１と同様に用意した１．５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で細胞を含む培養液を無菌的に回収し、あらかじめオートクレーブ滅菌した培養槽としてのスピナーフラスコ中に培養液を６００ｍＬ移し入れた。

　スピナーフラスコの雰囲気温度を４℃にし、スピナーフラスコ内で培養液を攪拌した。スピナーフラスコには中空糸膜を接続せず、スピナーフラスコ内のみで細胞を培養した。一日に１回又は２回、スピナーフラスコ内の培養液をサンプリングし、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度を測定した。ポンプを用いて培養液を循環する以外は同じ条件による実験も行った。磁気浮上遠心ポンプ（Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製　ＰｕｒａＬｅｖ　ｉ３０ＳＵ）によりスピナーフラスコからポンプへ第１の流路を介して培養液を送液し、ポンプを通過した培養液は、第２の流路を介して、スピナーフラスコに戻された。ポンプによる培養液の送液は５０ｍＬ／ｍｉｎで実施された。第１の流路は、内部の培養液をサンプリングすることが可能な構造を有しており、一日に１回又は２回、スピナーフラスコ内の培養液を第１の流路よりサンプリングし、培養液における細胞の密度、細胞の生存率、及び抗体の濃度を測定した。その結果、図１７から図１９に示すように、ポンプによる培養液の循環がある場合もない場合も同様に、培養液の経時変化は抑制されていた。

　（分析方法）
　上記した実施例、比較例、及び参考例において使用した分析方法を、以下、説明する。培養液に含まれる細胞の密度及び生存率は、生死細胞オートアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ製　Ｖｉ－ＣＥＬＬ　ＸＲ）により計測した。サンプルはＰＢＳ（－）（富士フイルム和光）を用いて希釈を行い、６００μＬ使用して分析した。画像解析メソッドはＶｉ－ＣＥＬＬ　ＸＲ中における「ＣＨＯ」を使用し、適宜実態に合うようにＭｉｎｉｍｕｍ　ｄｉａｍｅｔｅｒ（μｍ）・Ｃｅｌｌ　ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ（％）・Ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｐｏｔ　ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ（％）の設定値を変更したメソッドを使用した。

　抗体濃度のＨＰＬＣ測定は、下記の方法で行った。
（１）検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２８０ｎｍ）
（２）カラム：ＰＯＲＯＳ　Ｇ　２０μｍＣｏｌｕｍｎ，４．６×５０ｍｍ，０．８ｍＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）
（３）カラム温度：室温
（４）移動相
　移動相Ａ：リン酸水素二ナトリウム（無水）７．０９８ｇ、塩化ナトリウム８．７６６ｇを水８００ｍＬに溶かし、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨ７．０に調整した後、水を加えて１０００ｍＬとした。
　移動相Ｂ：１ｍｏｌ／Ｌ塩酸１２ｍＬ、塩化ナトリウム８．７６６ｇを水に溶かし、１０００ｍＬとした。
（５）移動相の送液
　流量２ｍＬ／ｍｉｎで、移動相Ａ及び移動相Ｂの割合を下記表４のように変えて送液した。

　細胞培養液を３００×ｇにて２分間遠心後、上清をサンプリングした。上記手法で市販のヒト免疫グロブリンＧ（日本血液製剤機構製　献血ヴェノグロブリンＩＨ５％静注２．５ｇ／５０ｍＬ）の段階希釈溶液９系列、及び細胞培養液上清を上記手順で送液した。ヒト免疫グロブリンＧのピーク面積９点を用いて標準曲線を作成後、標準曲線及び試料のピーク面積から各溶液中の抗体濃度を算出した。

　中空糸膜の接液表面における培養液によるせん断応力ＳＳは、下記式に示すように、中空糸膜の中空部を流れる培養液の粘度ＶＣ（Ｐａ・ｓ）と、せん断速度ＳＶ（／ｓ）と、の積で与えられる。
　　ＳＳ＝ＶＣ×ＳＶ　　　

　せん断速度は、線速度及び流路径から算出可能であり、線速度はポンプ出力から取得可能である。したがって、培養液の粘度と、線速度から算出したせん断速度に基づいて、せん断応力を算出した。

　１１、１１１・・・培養槽、１２、１１２・・・中空糸膜、１３、１４、１５、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９・・・流路、１６・・・攪拌装置、２３、２５、１２３、１２５、１２６・・・ポンプ、３３、３４、３５、１３３、１３４、１３５・・・圧力計、５０・・・温度管理槽、２０１・・・容器、２１６・・・培養液タンク、２１７・・・容器、２１８・・・容器

Claims

　細胞の増殖が抑制される条件下において、細胞を含む培養液を収容する培養槽から多孔質膜に前記培養液を送り、前記多孔質膜でろ過されずに通過した培養液を前記培養槽に戻して、前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることと、
　前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価することと、
　を含む、
　ろ過条件の評価方法。
　前記多孔質膜でろ過されずに通過した培養液を前記培養槽に戻すことにおいて、前記多孔質膜でろ過されずに通過した培養液と前記多孔質膜でろ過された培養液を前記培養槽に戻す、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記一又は複数のろ過条件下において前記多孔質膜のろ過性能を評価することをさらに含み、
　前記多孔質膜の前記ろ過性能に基づいて、前記多孔質膜における前記一又は複数のろ過条件を評価する、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記細胞の増殖が抑制される条件が、細胞周期の進行が抑制される条件である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記細胞の増殖が抑制される条件が、１５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかである、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記１５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかが、１０℃以下又は５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかである、請求項５に記載のろ過条件の評価方法。
　前記細胞の増殖が抑制される条件が、前記細胞の酵素活性が抑制される条件である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記酵素がサイクリン依存性キナーゼである、請求項７に記載のろ過条件の評価方法。
　前記細胞の増殖が抑制される条件が、前記培養液における細胞周期の阻害剤の存在である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記多孔質膜における前記細胞の産生物の透過率に基づき、前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記多孔質膜における透過流束に基づき、前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記多孔質膜における膜間差圧に基づき、前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　ろ液の濁度に基づき、前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記多孔質膜の構造、材料、又は物性の一又は複数の条件である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記培養液の一又は複数の条件である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記培養液における前記細胞の密度の一又は複数の条件である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記多孔質膜に送られる前記培養液の流量の一又は複数の条件である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記多孔質膜でろ過された前記培養液の流量の一又は複数の条件である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記多孔質膜に送られる培養液の流れによる、前記多孔質膜の接液表面におけるせん断応力の一又は複数の条件である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記培養槽と前記多孔質膜を含む、前記培養液が循環する経路が、温度管理槽内に配置されている、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることにおいて、前記培養液の組成を維持するための能動的な操作をしない、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることにおいて、前記培養槽と前記多孔質膜を含む、前記培養液が循環する経路に、培地を外部から追加しない、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることにおいて、前記培養液の溶存酸素及びｐＨの少なくともいずれかを制御しない、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることにおいて、前記培養槽と前記多孔質膜を含む、前記培養液が循環する経路から、前記細胞をブリーディングしない、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることにおいて、前記培養槽と前記多孔質膜を含む、前記培養液が循環する経路から、サンプリングのために培養液を採取することをさらに含む、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記サンプリングした培養液における前記細胞の密度を計測することをさらに含む、請求項２５に記載のろ過条件の評価方法。
　前記サンプリングした培養液における前記細胞の生存率を計測することをさらに含む、請求項２５に記載のろ過条件の評価方法。
　前記サンプリングした培養液における前記細胞の産生物の濃度を計測することをさらに含む、請求項２５に記載のろ過条件の評価方法。
　前記サンプリングした培養液における前記培養液の濁度を計測することをさらに含む、請求項２５に記載のろ過条件の評価方法。
　前記多孔質膜が中空糸膜である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　前記多孔質膜が精密ろ過膜である、請求項１に記載のろ過条件の評価方法。
　細胞が増殖する条件下において、ろ過条件を用いて、細胞を含む培養液を収容する培養槽から多孔質膜に前記培養液を送り、前記多孔質膜でろ過されずに通過した培養液を前記培養槽に戻し、前記多孔質膜でろ過された前記細胞の産生物を含む培養液を回収して、前記培養液の少なくとも一部を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることを含み、
　前記ろ過条件が、細胞の増殖が抑制される条件下において、前記細胞を含む前記培養液を収容する前記培養槽から前記多孔質膜に前記培養液を送り、前記多孔質膜でろ過されずに通過した培養液を前記培養槽に戻して、前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させて、前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価して得られたろ過条件である、
　細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する際に、前記多孔質膜でろ過されずに通過した培養液を前記培養槽に戻すことにおいて、前記多孔質膜でろ過されずに通過した培養液と前記多孔質膜でろ過された培養液を前記培養槽に戻す、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記細胞が増殖する条件が、細胞周期が進行する条件である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記細胞が増殖する条件が、１５℃以上の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかである、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記１５℃より高い雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかが、２０℃、２５℃、３０℃、又は３５℃より高い雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかである、請求項３５に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記細胞が増殖する条件が、前記細胞の酵素が活性化されている条件である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記酵素がサイクリン依存性キナーゼである、請求項３７に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記細胞が増殖する条件が、前記培養液における細胞周期の阻害剤の非存在である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記細胞の増殖が抑制される条件が、細胞周期の進行が抑制される条件である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記細胞の増殖が抑制される条件が、１５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかである、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記１５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかが、１０℃以下又は５℃以下の雰囲気温度及び培養液温度の少なくともいずれかである、請求項４１に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記細胞の増殖が抑制される条件が、前記細胞の酵素活性が抑制される条件である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記酵素がサイクリン依存性キナーゼである、請求項４３に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記細胞の増殖が抑制される条件が、前記培養液における細胞周期の阻害剤の存在である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜における前記細胞の産生物の透過率に基づき、前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件が評価されている、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜における透過流束に基づき、前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件が評価されている、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜における膜間差圧に基づき、前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件が評価されている、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　ろ液の濁度に基づき、前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件が評価されている、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記多孔質膜の構造、材料、又は物性の一又は複数の条件である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記培養液の一又は複数の条件である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記培養液における前記細胞の密度の一又は複数の条件である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記多孔質膜に送られる前記培養液の流量の一又は複数の条件である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記多孔質膜でろ過された前記培養液の流量の一又は複数の条件である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記一又は複数のろ過条件が、前記多孔質膜に送られる培養液の流れによる、前記多孔質膜の接液表面におけるせん断応力の一又は複数の条件である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する際に、前記培養槽と前記多孔質膜を含む前記培養液が循環する経路が、温度管理槽内に配置されている、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する際に、前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることにおいて、前記培養液の組成を維持するための能動的な操作をしない、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する際に、前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることにおいて、前記培養液が循環する経路に、培地を外部から追加していない、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する際に、前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることにおいて、前記培養液の溶存酸素及びｐＨの少なくともいずれかを制御していない、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する際に、前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることにおいて、前記培養槽と前記多孔質膜を含む、前記培養液が循環する経路から、前記細胞をブリーディングしていない、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜における一又は複数のろ過条件を評価する際に、前記培養液を前記培養槽と前記多孔質膜の間で循環させることにおいて、前記培養槽と前記多孔質膜を含む、前記培養液が循環する経路から、サンプリングのために培養液を採取することを含む、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記サンプリングした培養液における前記細胞の密度を計測することをさらに含む、請求項６１に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記サンプリングした培養液における前記細胞の生存率を計測することをさらに含む、請求項６１に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記サンプリングした培養液における前記細胞の産生物の濃度を計測することをさらに含む、請求項６１に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記サンプリングした培養液における前記培養液の濁度を計測することをさらに含む、請求項６１に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜が中空糸膜である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記多孔質膜が精密ろ過膜である、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。
　前記細胞が灌流培養されている、請求項３２に記載の細胞産生物の製造方法。