KR20200062236A - 관류 바이오리액터 및 관련 사용 방법 - Google Patents

관류 바이오리액터 및 관련 사용 방법 Download PDF

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Abstract

바이오리액터 시스템을 제어하는 방법은 세포 배양물을 상기 세포 배양물이 목적 단백질(POI, protein of interest)을 생성할 수 있게 하는 조건들을 갖는 바이오리액터에 제공하는 단계, 라만(RAMAN)에 의해 상기 바이오리액터 내 상기 배양물의 공정 변수들(PP, process parameter)을 측정하는 단계로서, 상기 공정 변수들은 영양 성분 농도, 생존 세포 농도 및 단백질 속성들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 공정 변수들을 측정하는 단계, 상기 세포 배양물과 상기 세포 배양물의 미리 결정된 중량을 측정하는 단계, 제1 출력 도관을 사용하여 제1 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 무세포 폐배지를 제거하는 단계, 제2 출력 도관을 사용하여 제2 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 세포들을 제거하는 단계, 및 입력 도관을 사용하여 제3 특정 속도로 새로운 배지 또는 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 상기 세포 배양물에 도입하는 단계를 포함한다.

Description

관류 바이오리액터 및 관련 사용 방법
관련 출원(들) 상호 참조
본 특허 출원은 35 U.S.C. § 119에 따라 2017년 10 16일 출원된 미국 가 특허 출원 번호 62/572,918의 이익을 주장하는 2018년 10월 15일 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2018/ 055891의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용이 여기에 참고로 통합된다.
기술분야
본 개시 내용은 관류 바이오리액터 및 관련 사용 방법들에 관한 것이다.
바이오리액터들은 단백질과 같은 생물학적 제제들을 제조할 목적으로 세포 배양을 유지하는 데 사용될 수 있다. 유가식 바이오리액터(fed-batch bioreactor)에서는, 하나 이상의 영양 성분을 배양 중에 바이오리액터에 공급하고, 생물학적 제제들은 회분이 끝날 때까지 바이오리액터에 유지시킨다. 관류 바이오리액터들은 유가식 리액터들과 관련된 일부 성능 문제를 해결하고, 1990년대 후반에 인기를 얻기 시작했다. 그러나, 최근의 관류 바이오리액터들은 제한된 수의 이용 가능한 조절 전략, 데이터 공백 및 고비용으로 악화되고 있다.
예를 들어, 관류 리액터들을 위한 조절 용액은 펌프 편류 및 공정 변화량을 다루면서, 입력 및 출력 공급 펌프들의 체적 유량을 교정하려고 시도한다. 그러나, 임의의 소정의 두 펌프 간에 내재하는 차이(예를 들어, 제조상의 편차) 및 엄격한 조절 관철의 불능으로 인해, 생산 시행에 실패하면 바이오리액터가 과도하게 차거나 비워질 수 있다. 기존의 조절 용액들은 또한 예를 들어, 암모니아, 글루코스 및 단백질 품질 속성들과 같은 기타 매개 변수들의 측정 능력이 부족하다. 본 개시 내용의 실시 예들은 기존의 관류 바이오리액터들의 하나 이상의 한계점 및 단점을 다룬다.
본 개시 내용의 실시 예들은 특히, 단백질 생성을 위한 세포 배양 공정을 제어하는 데 유용한 바이오리액터 및 바이오리액터 시스템을 제어하는 방법에 관한다. 여기에 개시된 각각의 실시 예들은 임의의 다른 실시 예들과 관련하여 설명되는 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 바이오리액터 시스템을 제어하는 방법으로서, 세포 배양물을 바이오리액터에 제공하는 단계; 라만 프로브에 의해 상기 바이오리액터 내 상기 세포 배양물의 하나 이상의 공정 변수를 측정하는 단계; 제1 출력 도관을 사용하여 제1 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 무세포 폐배지를 제거하는 단계; 제2 출력 도관을 사용하여 제2 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 세포들을 제거하는 단계; 입력 도관을 사용하여 제3 특정 속도로 새로운 배지 또는 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 상기 세포 배양물에 도입하는 단계; 및d 상기 라만 프로브 측정값들에 기초하여 상기 제1 특정 속도, 상기 제2 특정 속도 또는 상기 제3 특정 속도 중 하나 이상을 변경하는 단계를 포함하는, 방법에 관한다.
본 개시 내용의 일 실시 예는 바이오리액터 시스템을 제어하는 방법으로서, 세포 배양물을 상기 세포 배양물이 목적 단백질(POI, protein of interest)을 생성할 수 있게 하는 조건들을 갖는 바이오리액터에 제공하는 단계, 라만(RAMAN)에 의해 상기 바이오리액터 내 상기 배양물의 공정 변수들(PP, process parameter)을 측정하는 단계로서, 상기 공정 변수들은 영양 성분 농도, 생존 세포 농도 및 단백질 속성들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 공정 변수들을 측정하는 단계, 세포 배양물 함량과 상기 세포 배양물의 중량을 측정하는 단계, 제1 출력 도관을 사용하여 제1 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 무세포 폐배지를 제거하는 단계, 제2 출력 도관을 사용하여 제2 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 세포들을 제거하는 단계, 입력 도관을 사용하여 제3 특정 속도로 새로운 배지 및 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 상기 세포 배양물에 도입하는 단계를 포함하며, 상기 입력 도관 및 상기 출력 도관들은 상기 바이오리액터의 상기 라만 프로브 측정값들 및 중량 측정값에 기초하여 (ⅰ) 상기 공정 변수들 중 하나 이상을 미리 결정된 범위들 내에, (ⅱ) 상기 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 상기 중량을 미리 결정된 범위들 내에, 그리고 (ⅲ) 상기 입력 도관의 상기 제3 특정 속도 및 각각의 상기 출력 도관들의 상기 제1 특정 속도 및 상기 제2 특정 속도를 각각의 미리 결정된 범위들 내에 유지시키도록 조절되는, 방법에 관한다.
일부 실시 예에서, 라만에 의해 상기 바이오리액터 내 상기 배양물의 상기 하나 이상의 공정 변수를 측정하는 단계는 일정한 간격을 두고, 예를 들어, 시간당 한 번 이상 일어난다. 다른 실시 예들에서, 상기 방법은 상기 세포 배양물을 정상 상태의 약 30일 이상 동안 약 3천만 세포/mL 이상의 평균 생존 세포 농도로 유지시키도록 구성된다. 일 실시 예에서, 상기 바이오리액터는 2L 이상, 3L 이상, 10L 이상, 35L 이상 또는 50L 이상의 체적을 갖고, 상기 방법은 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 상기 중량을 상기 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 초기 중량의 0.1 퍼센트 내에 유지키시도록 구성된다. 예를 들어, 상기 바이오리액터는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 방법은 상기 바이오리액터 및 상기 세포 배양물의 상기 중량을 상기 바이오리액터 및 상기 세포 배양물의 상기 초기 중량에 기초하여 결정되는 중량 범위 내, 예를 들어, 약 20 ± 2 g 범위 내에 유지키시도록 구성된다. 일부 실시 예에서, 상기 바이오리액터는 공정 변수가 각각의 목적하는 범위 내 설정치 값으로부터 편차가 생길 때 제어되며, 무세포 배지를 제거하는 단계, 세포들을 제거하는 단계 및 새로운 배지 및 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 도입하는 단계 중 하나 이상, 그리고 그 다음 상기 바이오리액터가 상기 편차를 감소시키도록 조절된다. 매일 상기 제1 출력 도관을 통해 최소 두 바이오리액터 체적의 폐배지가 제거된다. 매일 상기 제1 출력 도관을 통해 최대 세 바이오리액터 체적의 폐배지가 제거된다. 상기 공정 변수들은 상기 세포 배양물의 온도 및 상기 세포 배양물의 pH를 포함하고, 상기 온도는 약 30 내지 40℃, 또는 약 32 내지 약 38℃, 또는 약 34 내지 약 38℃로 유지되며, 상기 pH는 약 6.50 내지 약 7.50, 약 6.60 내지 약 7.40, 약 6.70 내지 약 7.40, 약 6.80 내지 약 7.30 약 6.90 내지 약 7.20, 약 7.00 내지 약 7.10, 약 6.50, 약 6.55, 약 6.60, 약 6.65, 약 6.70, 약 6.75, 약 6.80, 약 6.85, 약 6.90, 약 6.95, 약 7.00, 약 7.05, 약 7.10, 약 7.15, 약 7.20, 약 7.25, 약 7.30, 약 7.35, 약 7.40, 약 7.45, 또는 약 7.50으로 유지된다. 상기 공정 변수들은 세포별 생산성을 포함하고, 상기 방법은 세포 배양물 내 세포들을 최소 25-37일 동안 약 15-60 pg/세포/일 이상, 약 15-25 pg/세포/일, 약 17-23 pg/세포/일 이상, 또는 약 19-21 pg/세포/일 이상의 세포별 생산성으로 유지시키도록 구성된다. 상기 공정 변수들은 글루코스 농도를 포함하고, 상기 방법은 글루코스 농도를 약 5 mM 내지 약 85 mM, 또는 약 0.5 g/L 내지 약 15.5 g/L, 약 1 g/L 내지 약 15.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 8 g/L, 약 2 g/L 내지 약 6 g/L, 또는 약 3 g/L 내지 약 5 g/L로 유지시키도록 구성되는, 방법. 상기 공정 변수들은 락테이트 농도를 포함하고, 상기 방법은 락테이트 농도를 약 60 mM 미만, 또는 약 6 g/L 미만, 약 5 g/L 미만, 약 4 g/L 미만, 약 3 g/L 미만, 약 2 g/L 미만, 또는 약 1 g/L 미만으로 유지시키도록 구성된다. 상기 공정 변수들은 암모니아 농도를 포함하고, 상기 방법은 암모니아 농도를 약 15 mM 미만, 약 12 mM 미만, 약 10 mM 미만, 약 9 mM 미만, 약 8 mM 미만, 약 7 mM 미만, 약 6 mM 미만으로 유지시키도록 구성된다. 무세포 폐배지를 제거하는 단계, 세포들을 제거하는 단계 및 새로운 배지 및 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 도입하는 단계의 각각은 각각의 펌프에 의해 제어된다. 상기 바이오리액터는 세포들은 함유하고 유체가 통과할 수 있도록 구성된 필터를 포함한다.
다른 실시 예에서, 본 개시 내용은 바이오리액터 시스템을 제어하는 방법으로서, 세포 배양물을 바이오리액터에 제공하는 단계; 라만 프로브에 의해 상기 바이오리액터 내 상기 세포 배양물의 하나 이상의 공정 변수(PP)를 측정하는 단계; 및 상기 라만 프로브의 측정값들에 기초하여 상기 바이오리액터의 하나 이상의 입력 또는 출력을 조절하는 단계를 포함하는, 방법에 관한다.
본 개시 내용에 따른 방법은 다음 단계들: 세포 배양물을 상기 세포 배양물이 목적 단백질(POI)을 생성할 수 있게 하는 조건들을 갖는 바이오리액터에 제공하는 단계(302), 라만에 의해 상기 바이오리액터 내 상기 배양물의 공정 변수들을 측정하는 단계로서, 상기 공정 변수들은 적어도 영양 성분 농도, 생존 세포 농도 및 단백질 속성들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 공정 변수들을 측정하는 단계(304), 상기 세포 배양물과 상기 세포 배양물의 미리 결정된 중량을 측정하는 단계(306), 제1 출력 도관을 사용하여 제1 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 무세포 폐배지를 제거하는 단계(308), 제2 출력 도관을 사용하여 제2 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 세포들을 제거하는 단계(310), 입력 도관을 사용하여 제3 특정 속도로 새로운 배지 및 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 상기 세포 배양물에 도입하는 단계를 포함하며, 입력 도관 및 상기 출력 도관들은 상기 바이오리액터의 상기 라만 프로브 측정값들 및 중량 측정값에 기초하여 (ⅰ) 상기 공정 변수들 중 하나 이상을 미리 결정된 범위들 내에, (ⅱ) 상기 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 상기 중량을 미리 결정된 범위들 내에, 그리고 (ⅲ) 상기 입력 도관의 상기 제3 특정 속도 및 각각의 상기 출력 도관들의 상기 제1 특정 속도 및 상기 제2 특정 속도를 각각의 미리 결정된 범위들 내에 유지시키도록 조절되는 것으로 예시된다(312).
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 바이오리액터 시스템으로서, 입력 도관 및 적어도 하나의 출력 도관을 갖는 탱크; 적어도 하나의 펌프; 상기 탱크에 결합되는 필터; 상기 탱크에 결합되는 라만 프로브; 및 상기 적어도 하나의 펌프 및 상기 라만 프로브에 결합되는 제어기로서, 상기 라만 프로브로부터의 입력에 기초하여 상기 적어도 하나의 펌프를 제어하도록 구성되는, 상기 제어기를 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템에 관한다.
상기 적어도 하나의 출력 도관은 상기 탱크에서의 유체 제거를 제어하도록 구성된 제2 펌프에 연결하기 위한 제1 출력 도관, 및 상기 탱크에서의 세포 제거를 제어하도록 구성된 제3 펌프에 연결하기 위한 제2 출력 도관을 포함한다. 상기 필터는 세포들을 상기 탱크에 유지시키고 유체는 상기 필터를 통과할 수 있게 하도록 구성된다. 상기 라만 프로브는 상기 탱크 내에 배치된다. 상기 제어기는 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프에 결합된다. 상기 바이오리액터는 상기 탱크 내 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 중량을 측정하도록 구성된 스케일(scale)을 더 포함하며; 상기 제어기는 상기 스케일로부터 중량 데이터를 수신하도록 구성된다. 상기 제어기는 상기 탱크의 상기 중량을 상기 중량에 대한 설정치와 비교하고, 상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프의 출력 중 하나 이상을 조절하도록 구성된다. 상기 제어기는 상기 라만 프로브로부터 스펙트럼 데이터를 수신하고; 수신된 상기 스펙트럼 데이터에 기초하여, 상기 세포 배양물의 매개 변수를 결정하고, 결정된 상기 매개 변수를 상기 매개 변수의 설정치와 비교하며; 상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프의 출력 중 하나 이상을 조절하도록 구성된다. 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 상기 출력 조절은 결정된 상기 매개 변수와 상기 매개 변수의 설정치 간 편차, 또는 수신된 상기 중량 및 상기 중량의 설정치 간 편차를 감소시킨다. 상기 방법은 상기 세포 배양물을 정상 상태의 30일 이상 동안 3천만 세포/mL 이상의 평균 생존 세포 농도로 유지시키도록 구성된다. 상기 탱크는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 방법은 상기 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 상기 중량을 20g 범위 내에 유지키시도록 구성된다. 상기 탱크는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 방법은 상기 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 상기 중량을 상기 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 초기 중량의 0.1 퍼센트 내에 유지키시도록 구성된다. 상기 제어기는 수신된 상기 스펙트럼 데이터에 기초하여, 상기 바이오리액터 배양물의 복수의 매개 변수를 결정하고; 상기 복수의 매개 변수의 각각을 상기 복수의 매개 변수의 각각에 대한 각각의 설정치와 비교하며; 상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 상기 출력을, 결정된 상기 매개 변수들과 상기 각각의 설정치들 간 편차를 감소시키도록 조절하도록 구성된다. 상기 복수의 매개 변수는 온도, pH, 영양 성분 농도, 락테이트 농도, 암모니아 농도 및 세포별 생산성을 포함한다. 상기 필터는 세포들은 함유하고 유체가 통과할 수 있도록 구성된다. 상기 바이오리액터는 스케일을 포함하며, 이때 상기 스케일 상에 상기 탱크 및 상기 필터가 놓인다. 상기 바이오리액터는 스케일을 포함하며, 이때 상기 스케일 상에 상기 탱크가 놓인다. 상기 바이오리액터는 스케일을 포함하며, 이때 상기 스케일과 상기 탱크가 물리적으로 접촉된다.
바이오리액터 배양 시스템은: 입력 도관 및 적어도 하나의 출력 도관을 갖는 탱크; 적어도 하나의 펌프; 상기 탱크와 접촉되는 필터; 상기 탱크에 결합되는 라만 프로브; 상기 탱크와 접촉되는 스케일; 및 상기 적어도 하나의 펌프, 상기 스케일 및 상기 라만 프로브에 결합되는 제어기를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 필터 및 상기 탱크는 상기 스케일과 접촉된다. 다른 실시 예에서, 상기 필터는 망상 재료를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 필터는 0.2 μM 내지 30 μM 범위의 공극 크기들을 갖는 망을 포함한다.
또 다른 실시 예에서, 본 개시 내용은 바이오리액터 시스템으로서, 입력 도관 및 적어도 하나의 출력 도관을 갖는 탱크; 적어도 하나의 펌프; 상기 탱크에 결합되는 필터; 상기 탱크와 접촉되는 스케일; 상기 탱크에 결합되는 라만 프로브; 및 상기 적어도 하나의 펌프, 상기 스케일 및 상기 라만 프로브에 결합되는 제어기로서, 상기 라만 프로브로부터의 입력 및 상기 스케일로부터의 입력에 기초하여 상기 적어도 하나의 펌프를 제어하도록 구성되는, 상기 제어기를 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템에 관한다.
다른 실시 예에서, 바이오리액터 배양 시스템이 개시된다. 상기 바이오리액터 배양 시스템은 탱크로의 유체 전달을 제어하도록 구성된 제1 펌프에 연결하기 위한 입력 도관, 상기 탱크에서의 유체 제거를 제어하도록 구성된 제2 펌프에 연결하기 위한 제1 출력 도관, 및 상기 탱크에서의 세포 제거를 제어하도록 구성된 제3 펌프에 연결하기 위한 제3 출력 도관을 갖는, 상기 탱크, 상기 탱크에 결합되는 필터로서, 세포들을 상기 탱크에 유지시키고 유체는 상기 필터를 통과할 수 있게 하도록 구성되는, 상기 필터, 상기 탱크 내 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 중량을 측정하도록 구성된 스케일, 상기 탱크 내에 배치되는 라만 프로브를 포함한다. 상기 실시 예는 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프, 상기 제3 펌프, 상기 스케일 및 상기 라만 프로브에 결합되는 제어기를 포함하며, 이때 상기 제어기는 상기 스케일로부터 중량을 수신하고, 상기 탱크의 상기 중량을 상기 중량에 대한 설정치와 비교하고, 상기 라만 프로브로부터 스펙트럼 데이터를 수신하고, 수신된 상기 스펙트럼 데이터에 기초하여, 상기 세포 배양물의 매개 변수를 결정하고, 결정된 상기 매개 변수를 상기 매개 변수의 설정치와 비교하며, 상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 스루풋을 조절하도록 구성된다.
상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 상기 스루풋 조절은 결정된 상기 매개 변수와 상기 매개 변수의 설정치 간 편차, 또는 수신된 상기 중량 및 상기 중량의 설정치 간 편차를 감소시킨다. 상기 제어기는 상기 세포 배양물을 정상 상태의 30일 이상 동안 3천만 세포/mL 이상의 평균 생존 세포 농도로 유지시키도록 구성된다. 상기 탱크는 3L 이상의 체적을 갖고, 상기 제어기는 상기 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 상기 중량을 20g 범위 내에 유지키시도록 구성된다. 상기 탱크는 3L 이상의 체적을 갖고, 상기 제어기는 상기 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 상기 중량을 상기 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 초기 중량의 0.1 퍼센트 내에 유지키시도록 구성된다. 상기 제어기는 수신된 상기 스펙트럼 데이터에 기초하여, 상기 바이오리액터 배양물의 복수의 매개 변수를 결정하고, 상기 복수의 매개 변수의 각각을 상기 복수의 매개 변수의 각각에 대한 각각의 설정치와 비교하며, 상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 상기 스루풋을, 결정된 상기 매개 변수들과 상기 각각의 설정치들 간 편차를 감소시키도록 조절하도록 구성된다. 상기 복수의 매개 변수는 온도, pH, 영양 성분 농도, 락테이트 농도, 암모니아 농도 및 세포별 생산성을 포함한다. 상기 바이오리액터 배양 시스템은 세포들은 함유하고 유체가 통과할 수 있도록 구성된 필터를 포함한다. 상기 탱크 및 상기 필터는 상기 스케일 상에 놓인다. 상기 탱크는 상기 스케일 상에 놓인다.
특정 실시 예들에서, 본 개시 내용에 따른 상기 바이오리액터 배양 시스템은 다음 요소들: 탱크로의 유체 전달을 제어하도록 구성된 제1 펌프(30)에 연결하기 위한 입력 도관, 상기 탱크에서의 유체 제거를 제어하도록 구성된 제2 펌프(40)에 연결하기 위한 제1 출력 도관, 및 상기 탱크에서의 세포 제거를 제어하도록 구성된 제3 펌프(50)에 연결하기 위한 제3 출력 도관을 갖는, 상기 탱크(10); 상기 탱크에 결합, 연결 또는 그 외 유체 연통하게 되는 필터로서, 세포들을 상기 탱크에 유지시키고 유체는 상기 필터를 통과할 수 있게 하도록 구성되는, 상기 필터(100); 상기 탱크 내 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 중량을 측정하도록 구성된 스케일(110); 상기 탱크 내에 배치되는 라만 프로브(18); 및 상기 제1 펌프(30), 상기 제2 펌프(40), 상기 제3 펌프(50), 상기 스케일(110) 및 상기 라만 프로브(18)에 결합되는 제어기(200)를 포함하는 것으로 예시된다.
상기 바이오리액터 배양 시스템에서 상기 제어기(200)는: 상기 스케일(110)로부터 중량을 수신하고; 상기 탱크(10)의 상기 중량을 상기 중량에 대한 설정치와 비교하고; 상기 라만 프로브(18)로부터 스펙트럼 데이터를 수신하고; 수신된 상기 스펙트럼 데이터에 기초하여, 상기 세포 배양물의 매개 변수를 결정하고; 결정된 상기 매개 변수를 상기 매개 변수의 설정치와 비교하며; 상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 스루풋을 조절하도록 구성된다.
본 명세서에 포함되어 본 명세서의 일부를 이루는 첨부 도면들은 다양한 예를 도시하고 상세한 설명과 함께 개시된 예들 및 실시 예들의 원리들을 설명하는 역할을 한다.
본 개시 내용의 양태들은 첨부된 도면들에 도시된 실시 예들과 관련하여 구현될 수 있다. 이러한 도면들은 본 개시 내용의 상이한 양태들은 도시하고, 적절한 경우, 상이한 도면들에서 유사한 구조들, 구성요소들, 재료들 및/또는 요소들을 나타내는 참조 부호들이 유사하게 라벨링되어 있다. 구체적으로 도시된 것들 이외의 구조, 구성요소 및/또는 요소의 다양한 조합이 고려되고 본 개시 내용의 범위 내에 있는 것으로 이해된다.
또한, 여기에 설명되고 예시된 많은 실시 예가 있다. 본 개시 내용은 임의의 단일 양태로도 그 실시 예로도, 그러한 양태들 및/또는 실시 예들의 임의의 조합들 및/또는 치환들로도 제한되지 않는다. 또한, 본 개시 내용의 각각의 양태들 및/또는 그 실시 예들은 단독으로 또는 본 개시 내용의 하나 이상의 다른 양태 및/또는 그 실시 예와의 조합으로 채용될 수 있다. 간결성을 위해, 특정 치환들 및 조합들은 여기서 별도로 논의 및/또는 설명되지 않는다. 특히, "대표적인"것으로 여기에 설명된 실시 예 또는 구현 예는 예를 들어, 다른 실시 예들 또는 구현 예들에 비해 바람직하거나 유리한 것으로 해석되어서는 안 되며; 오히려, 실시 예(들)는 "예시적인" 실시 예(들)인 것을 반영하거나 나타내는 것으로 의도된다.
도 1은 본 개시 내용의 일례에 따른 바이오리액터 시스템의 개략도이다.
도 2는 도 1의 바이오리액터 시스템의 대표적인 제어기, 및 그것의 각각의 입력들 및 출력들의 개략도이다.
도 3은 본 개시 내용에 따른 대표적인 방법의 흐름도이다.
도 4는 회분의 37일에 관류 바이오리액터에서 측정된 생존 세포 농도를 회분의 6일에 유가식 바이오리액터에서 측정된 생존 세포 농도와 비교하는 그래프이다.
도 5는 도 4를 참조하여 설명된 관류 바이오리액터와 유가식 바이오리액터 간 시간 흐름에 따른 표준화된 세포별 생산성을 도시하는 그래프이다.
도 6은 생존 세포 농도 또는 글루코스를 제어하지 않은 관류 바이오리액터에 대한 시간 흐름에 따른 생존 세포 농도를 도시하는 그래프이다.
도 7은 도 6에 설명된 관류 바이오리액터에서의 시간 흐름에 따른 글루코스 농도를 도시하는 그래프이다.
도 8은 도 6에 설명된 관류 바이오리액터에서의 시간 흐름에 따른 세포 생존능을 도시하는 그래프이다.
도 9는 생존 세포 농도를 제어한 관류 바이오리액터에 대한 시간 흐름에 따른 생존 세포 농도를 도시하는 그래프이다.
도 10은 도 9에 설명된 관류 바이오리액터에서의 정상 상태 세포 생존능을 도시하는 그래프이다.
도 11은 도 9에 설명된 관류 바이오리액터에서의 시간 흐름에 따른 표준화된 단백질 생성(역가)을 도시하는 그래프이다.
도 12는 도 9에 설명된 관류 바이오리액터에서의 시간 흐름에 따른 글루코스 농도를 도시하는 그래프이다.
도 13은 관류 바이오리액터 및 유가식 바이오리액터로부터의 생존 세포 농도들을 비교하는 그래프이다.
도 14는 도 13에 설명된 바이오리액터들에서 달성된 표준화된 단백질 생성(역가)을 비교하는 그래프이다.
도 15는 라만 프로브를 사용하여 생존 세포 농도를 제어하는 관류 바이오리액터에 대한 시간 흐름에 따른 생존 세포 농도를 도시하는 그래프이다.
도 16은 도 15에 설명된 관류 바이오리액터에서의 시간 흐름에 따른 세포 생존능을 도시하는 그래프이다.
도 17은 도 15에 설명된 관류 바이오리액터에서의 시간 흐름에 따른 표준화된 단백질 생성(역가)을 도시하는 그래프이다.
도 18은 도 15에 설명된 관류 바이오리액터에서의 시간 흐름에 따른 글루코스 농도를 도시하는 그래프이다.
도 19는 라만 프로브를 사용하여 생존 세포 농도를 제어하는 관류 바이오리액터들에 대한 시간 흐름에 따른 생존 세포 농도를 도시하는 그래프이다.
도 20은 도 19에 설명된 관류 바이오리액터에서의 시간 흐름에 따른 표준화된 단백질 생성(역가)을 도시하는 그래프이다.
도 21은 라만 프로브를 사용하여 생존 세포 농도를 제어하는 관류 바이오리액터에 대한 시간 흐름에 따른 생존 세포 농도를 도시하는 그래프이다.
다시, 여기에 설명되고 예시된 많은 실시 예가 있다. 본 개시 내용은 임의의 단일 양태로도 그 실시 예로도, 그러한 양태들 및/또는 실시 예들의 임의의 조합들 및/또는 치환들로도 제한되지 않는다. 본 개시 내용의 각각의 양태들 및/또는 그 실시 예들은 단독으로 또는 본 개시 내용의 하나 이상의 다른 양태 및/또는 그 실시 예와의 조합으로 채용될 수 있다. 간결성을 위해, 많은 그러한 치환들 및 조합들은 여기서 별도로 논의되지 않는다.
특히, 예시의 단순성 및 명확성을 위해, 도면들의 특정 양태들은 다양한 실시 예의 일반적인 구조 및/또는 구성 방식을 도시한다. 다른 특징들을 불필요하게 모호하게 하지 않기 위해 주지의 특징들 및 기술들에 대한 설명 및 상세는 생략될 수 있다. 도면들의 요소들은 반드시 축척대로 그려지는 것은 아니다; 일부 특징부의 치수들은 예시적인 실시 예들의 이해를 향상시키기 위해 다른 요소들에 비해 과장될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 단면도들이 축척대로 그려지지 않았으며 상이한 구성요소들 간 비례 관계들을 나타내는 것으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해한다. 단면도들은 도시된 조립체의 다양한 구성요소를 예시하고 서로에 대한 상대적인 위치를 도시하기 위해 제공된다.
이제 첨부 도면들에 도시된 본 개시 내용의 예들을 상세하게 언급할 것이다. 가능한 경우, 동일하거나 유사한 부분들을 나타내기 위해 도면 전체에 걸쳐 동일한 참조 부호들이 사용될 것이다. 뒤따르는 논의에서, "약", "실질적으로", "대략" 등과 같은 상대적인 용어들은 언급된 수치 값에서 ±10%의 가능한 변량을 나타내기 위해 사용된다. 또한, 청구범위에서, 값들, 한계들 및/또는 범위들은 값, 한계 및/또는 범위 ±10% 를 의미한다.
"도관(conduit)"이라는 용어는 유체가 이동할 수 있는 채널, 튜브, 연결, 통로 등을 지칭한다. 일례에서, 도관은 Watson-Marlow의 Bioprene 열가소성 튜브를 포함할 수 있다.
"회분식 배양(Batch culture)"또는 "회분 모드(batch mode)"는 결코 교환되지 않는 세포들로 그리고 초기 작용 체적의 세포 배양 배지로 채워지는 유닛(예를 들어, 배양 용기)을 지칭한다. 그러한 회분식 배양에서, 세포 배양을 위한 모든 성분이 배양 공정의 시작시 배양 용기에 공급된다. 배양물은 영양 성분들이 고갈되거나 폐기물들이 세포자멸사(apoptosis)를 유발하는 독성 수준에 이를 때까지 시행될 수 있다.
"유가식 세포 배양(fed-batch cell culture)"또는 "유가식 배양(fed-batch culture)"이라는 구는 동물 세포들 및 배양 배지가 초기에 배양 용기에 공급되고 추가 배양 영양 성분들이 배양 종료 전 주기적인 세포 및/또는 생성물 수확의 유무에 관계 없이, 배양 중 배양물에 연속적으로 또는 불연속적인 일 회 분 첨가로 공급되는 회분식 배양을 지칭한다. 유가식 배양은 주기적으로 전체 배양물(이는 세포들 및 배지를 포함할 수 있음)이 제거되고 새로운 배지로 대체되는 "반연속 유가식 배양"을 포함한다. 유가식 배양은 성분들을 배양 중에 용기에 첨가(또는 제거)함으로써 단순한 "회분식 배양"과 구별된다. 유가식 배양은 유가식 공정 중 배지가 교환되지 않는 한에 있어서 관류 배양과 추가로 구별될 수 있는 반면, 관류 배양에서는 예를 들어, 필터 또는 세포 유지 장치를 사용하여 모든 또는 일부 세포가 배양물에 유지되고, 배양 배지가 연속적으로 또는 간헐적으로 공급되면서 성장을 저해하는 부산물들이 배양 용기에서 지속적으로 또는 주기적으로 제거된다. 관류 공정과 상이한 유가식 공정에서, 배양은 최대 또는 그 외 결정되는 작용 체적 및/또는 단백질 생성에 이른 것으로 결정될 때까지 지속된 다음 유가식 배양 산물들이 수확된다.
목적 단백질의 생성 방법으로서 관류 배양이 또한 본 개시 내용의 방법들에 사용을 위해 고려된다. 목적 단백질 또는 항체의 생성을 위한 관류 세포 배양 방법들은 당업자에게 알려져 있다.
"세포(cell)"라는 용어는 재조합 핵산 서열을 발현시키기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포들은 원핵 생물 및 진핵 생물의 세포들을 포함한다. 진핵 세포들은 효모균 및 모든 포유류 세포(인간 및 비인간), 및 예를 들어, 하이브리도마 또는 쿼드로마와 같은 융합 세포들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시 예들에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 쥐 또는 생쥐 세포이다. 다른 실시 예들에서, 세포는 다음 세포들: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, 림프구, Vero, CV1, kidney(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431(상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 및 앞서 언급한 세포로부터 유래되는 세포주로부터 선택된다. 일부 실시 예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스성 유전자, 예를 들어, 바이러스성 유전자를 발현시키는 망막 세포(예를 들어, PER.C6® 세포)를 포함한다. 일부 실시 예에서, 세포는 CHO 세포이다. 다른 실시 예들에서, 세포는 CHO K1 세포이다.
"세포주(cell line)"는 세포의 일련의 계대 배양 또는 이차 배양을 통해 특정 계통으로부터 유래된 세포 또는 세포들을 지칭한다. "세포들(cells)"이라는 용어는 "세포군(cell population)"과 통용된다.
현재의 최첨단 공급 전략들을 고려하면, CHO 세포들은 10x106 세포/mL 초과(약 1 주일 후)와 같은 세포 수 및 예를 들어, > 2 g/L 인간 IgG(약 2주 후에 수확됨의 역가를 달성하였으며, 이 수들은 CHO 세포 유가식 배양에 대한 전형적인 산업적 가치이다. Kim, B J 외, Biotechnol Bioeng. 2012.01.; 109(1):137-45 참조. 중요한 산업적 포유류 세포주로서 구축되어 있는 CHO 세포들로부터 10 g/L보다 훨씬 더 많은 항체 생성이 보고되었다. Omasa 외, Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11: 233-240 참조.
"세포 배양 배지" 및 "배양 배지"라는 용어들은 탄수화물 에너지원, 필수 아미노산, 미량 원소, 비타민 등과 같이 통상적으로 세포들의 성장을 늘리는 데 필요한 영양 성분들을 제공하는 포유류 세포들의 성장에 사용되는 영양액을 지칭한다. 세포 배양 배지는 세포 성장을 지지하는 원료들을 공급하는 추출물들, 예를 들어, 혈청 또는 펩톤(가수 분해물들)을 함유할 수 있다. 배지는 동물 유래 추출물들 대신 효모 유래 또는 콩 추출물들을 함유할 수 있다. 화학적 구명 배지(chemically defined medium)는 모든 화학 성분이 알려져 있는 세포 배양 배지를 지칭한다. 화학적 구명 배지에는 혈청 또는 동물 유래 펩톤과 같은 동물 유래 성분들이 완전히 없다. 배지에는 또한 단백질이 없을 수 있다. "새로운 배지(fresh media)"는 아직 세포 배양으로 도입되지 않았고/거나 아직 세포 배양의 세포들에 의해 이용되지 않은 배지이다. 새로운 배지는 일반적으로 높은 양분 수준을 포함하고 폐기물은 거의 포함하지 않을 수 있다. "폐배지"는 세포들에 의해 세포 배양에 사용된 배지를 지칭할 수 있고, 일반적으로 낮은 양분 수준(그러한 영양 성분들이 세포들에 의해 세포 배양에 이용될 수 있기 때문) 및 새로운 배지에 존재하는 수준보다 더 높은 폐기물 수준을 포함할 수 있다.
관류 바이오리액터에서, 배양 배지는 세포 배양에서 연속적으로 제거될 수 있고 새로운 배지로 대체될 수 있다. 폐기물들을 제거하면서 새로운 배지를 지속적으로 첨가하면 세포 배양의 세포들에 높은 세포 농도를 달성하는 데 필요한 영양 성분들이 제공될 수 있다. 회분식 및 유가식 배양 동안 끊임없이 변화하는 조건들과 달리, 관류 방법은 배양을 정상 상태로 달성하고 유지시키는 수단을 제공한다. 통상적으로 약 하루에 하나의 배양 체적이 교환되고 관류로 달성되는 세포 농도는 통상적으로 회분식 또는 유가식 배양의 피크에서 달성되는 것보다 2배 내지 10배를 초과한다. 영양 성분들의 교체 및/또는 사멸 세포들의 제거는 세포 생존능이 정상 상태에서 장기간 유지될 수 있게 한다. 정상 상태 생성시, 회분식에서 초기에 생성된 단백질(또는 다른 관심 화합물) 품질 속성들은 회분식에서 후에 생성된 단백질(또는 다른 목적 화합물들) 품질 속성들과 실질적으로 동일할 수 있다. 단백질은 글리코형, 전하 불균질성, 응집 및 다양한 순도 측정 같은 다양한 번역 후 변형에 기초하여 평가될 수 있다. 유가식 리액터들에서는 그러한 리액터들에서의 세포 배양 조건들이 지속적으로 변하기 때문에 단백질 품질의 실질적인 동일성은 달성할 수 없다.
바이오리액터에서의 배향 조건들은 일관된 단백질 물질을 제공할 것을 목표로 하여, 세포 배양물이 목적 단백질(POI, protein of interest)을 생성할 수 있게 한다. 세포 배양의 일부 배양 조건에서, 하나 이상의 공정 변수는 적어도 영양 성분 농도, 이를테면 글루코스 농도, 글루타메이트 농도 및 글루타민 농도; 암모니아 농도; 락테이트 농도; 총 세포 밀도; 생존 세포 밀도; 단백질 속성들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바이오리액터 방법은 바이오리액터 안팎으로 배지(예를 들어, 영양 성분들을 포함함), 단백질 및 세포들과 같은 다양한 성분의 유동에 대한 제어를 설정하는 것을 가능하게 한다. 바이오리액터 방법은 제1 출력 도관을 사용하여 제1 특정 속도로 세포 배양물에서 무세포 폐배지를 제거하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 제2 출력 도관을 사용하여 제2 특정 유량으로 세포 배양물에서 세포들을 제거하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 입력 도관을 사용하여 제3 특정 유량으로 새로운 배지 또는 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 세포 배양물에 도입하는 단계를 포함한다. 제1, 제2 및 제3 특정 유량들 중 하나 이상은 바이오리액터의 라만 프로브 측정값들에 기초하여 조절된다. 제1, 제2 및 제3 특정 유량들 중 하나 이상은 바이오리액터의 라만 프로브 측정값들에 기초하여 공정 변수들 중 하나 이상을 미리 결정된 범위 내에 유지시키도록 조절된다. 제1, 제2 및 제3 특정 유량들은 바이오리액터의 라만 프로브 측정값들에 기초하여 입력 도관들의 제3 특정 유량 및 각각의 출력 도관들의 제1 및 제2 특정 유량들을 각각의 미리 결정된 범위들 내에 유지시키도록 조절된다.
무세포 폐배지를 제거하는 단계, 세포들을 제거하는 단계 및 새로운 배지 또는 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 도입하는 단계의 각각은 각각의 펌프에 의해 제어된다. 바이오리액터는 세포들은 함유하고 유체가 통과할 수 있도록 구성된 필터를 포함한다.
본 개시 내용의 방법들 및 시스템들은 다른 이유들 중에서도 특히, 일관된 생성 공정을 채용하기 위해 바이오리액터의 중량 및 그 함량을 제어하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 세포 배양물 함량을 포함하는 바이오리액터의 중량을 측정하는 단계를 포함한다. 추가 실시 예에서, 상기 방법은 도관들과 관련하여 전술된 바와 같이, 유량의 제어를 위해 결합된 바이오리액터의 중량을 제어하는 단계를 사용한다. 상기 방법은 세포 배양물 함량과 바이오리액터의 중량을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 제1, 제2 및 제3 특정 유량들 중 하나 이상은 측정된 중량에 기초하여 조절된다. 제1, 제2 및 제3 특정 유량들은 측정된 중량에 기초하여 입력 도관들의 제3 특정 유량 및 각각의 출력 도관들의 제1 및 제2 특정 유량들을 각각의 미리 결정된 범위들 내에 유지시키도록 조절된다. 제1, 제2 및/또는 제3 특정 유량들은 세포 배양물 및 바이오리액터의 중량을 미리 결정된 범위 내에 유지시키도록 조절된다. 라만 프로브에 의해 바이오리액터 내 세포 배양물의 공정 변수들(PP)을 측정하는 단계는 1시간에 한 번 이상 일어난다. 상기 방법은 상기 세포 배양물을 정상 상태의 약 30일 동안 3천만 세포/mL 이상의 평균 생존 세포 농도로 유지시키도록 구성된다. 바이오리액터는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 방법은 바이오리액터 및 세포 배양물의 중량을 20g 범위 내에 유지키시도록 구성된다. 바이오리액터는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 방법은 세포 배양물과 바이오리액터의 중량을 세포 배양물과 탱크의 초기 중량의 0.1 퍼센트 내에 유지키시도록 구성된다. 공정 변수가 각각의 목적하는 범위 내 설정치 값으로부터 편차가 생길 때, 무세포 배지를 제거하는 단계, 세포들을 제거하는 단계 및 새로운 배지 또는 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 도입하는 단계 중 하나 이상이 편차를 감소시키도록 조절된다. 예를 들어, 매일 제1 출력 도관을 통해 최소 두 바이오리액터 체적의 폐배지가 제거되거나, 또는 매일 제1 출력 도관을 통해 최대 세 바이오리액터 체적의 폐배지가 제거된다.
하나 이상의 공정 변수는 세포 배양물의 온도 및 세포 배양물의 pH를 포함할 수 있고, 온도는 35℃와 36℃ 사이에 유지되며, pH는 6.85와 7.15 사이에 유지된다. 다른 실시 예들에서, pH는 약 6.50 내지 약 7.50, 약 6.60 내지 약 7.40, 약 6.70 내지 약 7.40, 약 6.80 내지 약 7.30 약 6.90 내지 약 7.20, 약 7.00 내지 약 7.10, 약 6.50, 약 6.55, 약 6.60, 약 6.65, 약 6.70, 약 6.75, 약 6.80, 약 6.85, 약 6.90, 약 6.95, 약 7.00, 약 7.05, 약 7.10, 약 7.15, 약 7.20, 약 7.25, 약 7.30, 약 7.35, 약 7.40, 약 7.45, 또는 약 7.50으로 유지된다.
하나 이상의 공정 변수는 세포별 생산성을 포함하고, 상기 방법은 세포 배양물 내 세포들을 최소 25-37일 동안 15-25 pg/세포/일 이상의 세포별 생산성으로 유지시키도록 구성된다.
하나 이상의 공정 변수는 글루코스 농도를 포함하고, 상기 방법은 글루코스 농도를 약 5 mM 내지 약 85 mM, 또는 약 1 g/L 내지 약 15.5 g/L 사이에 유지시키도록 구성된다.
하나 이상의 공정 변수는 락테이트 농도를 포함하고, 상기 방법은 락테이트 농도를 약 60 mM 미만, 또는 약 6 g/L 미만으로 유지시키도록 구성된다.
하나 이상의 공정 변수는 암모니아 농도를 포함하고, 상기 방법은 암모니아 농도를 약 15 mM 미만으로 유지시키도록 구성된다.
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"정상 상태(steady state)"라는 용어는 세포 배양물에서 영양 성분들의 농도, 공정 변수들 또는 품질 속성들을 변하지 않는, 일정하거나 안정된 수준으로 유지시키는 것을 지칭한다. 변하지 않는, 일정하거나 안정된 수준은 미리 결정된 설정치들 또는 미리 결정된 설정 범위들 내의 수준을 지칭하는 것으로 이해된다. 조작자에 의해 생성 세포 배양의 시기 동안 설정치들 그리고 그에 따라 정상 상태 수준들이 편이될 수 있다. 설정치들 또는 정상 상태 수준들은 또한 설정값들 또는 임계치들의 범위들을 포함할 수 있다.
"미리 결정된"이라는 용어는 수량 또는 설정치를 지칭할 수 있으며, 이의 값은 사용자에 의해 수동으로 또는 하나 이상의 알고리즘에 따라 제어기에 의해 고정 또는 계산된다.
특정 치료용 단백질 생성물을 제조하는 공정에 걸쳐, 제어가 필요한 생성물 속성들 또는 단백질 품질 속성들은 그것들의 잠재적인 품질 영향, 특히 임상 영향에 기초하여 식별될 수 있다. 관련 단백질 품질 속성들은 순도, 안전성 및/또는 효능에 영향을 줄 수 있다. 품질 속성들은 목적하는 생성물(단백질) 품질을 보장하기에 적절한 한계, 범위 또는 분포 내에 있어야 하는 생성되고 있는 의약품의 물리적, 화학적, 생물학적 또는 미생물학적 속성 또는 특성을 지칭한다. 예를 들어, International Council for Harmonization (ICH) Q8 (R2) Pharmaceutical Development　(ICH, 2009. 08.) 참조. 단백질 생성물들에 대한 품질 속성들은 고 분자량 종, 응집체, 전하 변이체, 외관, 색상, pH, 역가, 번역 후 변형(글리칸 함량 및 분포), 전도도, 등전점, 전하 이질성, 이황화 결합 스크램블링, 프리 시스테인, 숙주 세포 단백질을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않고, 생성물 품질에 큰 영향을 미치는 속성들로 고려될 수 있다. 특정 공정 매개 변수들은 제조 공정 동안 운영 신뢰성 및 일관성을 위해 생성물 배양 동안 적절한 한계, 범위 또는 분포 내에서 제어된다. 공정 변수들은 초기 세포 밀도, 초기 세포 생존능, 최종 세포 생존능, 총 단백질(역가), 생존 세포 수(VCC, viable cell count), 영양 성분 농도(글루코스, 포스페이트, 아미노산 등), 암모니아, pH, 락테이트 등을 포함할 수 있다. 제조 공정 동안 특정 공정 변수에 민감한 의약품은 그러한 특정 속성에 대한 임계치 위 또는 아래의 단백질 속성 변화를 유발할 수 있으므로 적절한 제어가 필요하다. 이와 같이, 공정 변수들은 또한 가변성이 위에서 나열된 임의의 품질 속성에 대해 정의된 임계치 이상의 영향을 미칠 수 있는 공정 변수들을 포함함에 따라 공정이 목적하는 품질의 물질을 생성함을 보장하도록 모니터링 또는 제어되어야 한다.
"세포별 생산성(cell specific productivity)", "세포별 속도" 등의 용어들은 예를 들어, 세포마다, 또는 세포 질량 또는 체적의 측정마다에 특이적인 생성물 발현 속도를 지칭한다. 세포별 생산성은 예를 들어, 매일 세포당 생성된 단백질 그램으로 측정된다.
바이오리액터 시스템(1)은 바이오리액터 탱크(10), 공급 저장소(28), 공급 펌프(30), 블리드 펌프(40) 및 수확 펌프(50)를 포함할 수 있다. 바이오리액터 시스템(1)은 또한 ATF 펌프(70), 블리드 탱크(80) 및 수확 탱크(90)를 포함할 수 있다. 펌프들(30, 40, 50 및 70)은 제어기(200)에 작동 가능하게 결합될 수 있다. 그러나, 일부 예에서, ATF 펌프(70)는 별도의 제어기(102)에 결합되고 그에 의해 제어될 수 있다.
바이오리액터 탱크(10)는 다수의 운용 스케일에 맞게 크기가 조절된 통, 배럴, 용기, 플라스크 또는 다른 적합한 용기일 수 있다. 예를 들어, 바이오리액터 탱크(10)의 체적은 약 1L 내지 약 20,000L, 약 5L 내지 약 10,000L, 약 10L 내지 약 1,000L, 약 20L 내지 약 100L, 약 50L, 약 1L 이상, 약 10L 이상, 약 50L 이상, 약 100L 이상, 약 200L 이상, 약 500L 이상, 약 1,000L 이상, 약 10,000L 이상, 약 20,000L 미만, 약 10,000L 미만, 약 1,000L 미만, 약 500L 미만, 약 200L 미만 또는 약 100L 미만일 수 있다. 다른 실시 예들에서, 바이오리액터(10)는 2L 이상, 3L 이상, 10L 이상, 35L 이상 또는 50L 이상의 체적을 갖는다. 바이오리액터 탱크(10)는 금속(예를 들어, 강철 또는 스테인레스 스틸), 금속 합금, 유리 및/또는 중합체(예를 들어, 사용 후 버리게 되어 있는, 일회용 바이오리액터)로 제조될 수 있다.
펌프들(30, 40 및 50)은 예를 들어, 연동 펌프, 다이어프램 펌프, 피스톤 펌프, 전동 펌프 등과 같은 임의의 적합한 펌프들을 포함할 수 있다. 일례에서, 펌프들(30, 40 및 50)은 서로 실질적으로 동일할 수 있다. 다른 예에서, 펌프들(30, 40 및 50) 중 하나 이상은 다른 펌프(들)와 상이할 수 있다. 또 다른 예에서는, 펌프(70)가 펌프들(30, 40 및 50) 중 임의의 펌프와 유사할 수 있다. 공급 저장소(28)는 바이오리액터 탱크(10)를 위한 임의의 적합한 영양 성분 공급원을 포함할 수 있고, 영양 성분 공급물은 적합한 도관을 통해 공급 펌프(30)를 통해 바이오리액터 탱크(10)로 보내질 수 있다. 영양 성분 공급물(성장 배지)은 탄소원(예를 들어, 포도당), 물, 염, 아미노산원 및/또는 다른 영양 성분들을 포함할 수 있다.
캡(12)은 바이오리액터 탱크(10)의 상부를 덮을 수 있고, 다양한 구성요소 및 기구는 캡(12)을 통해 바이오리액터 탱크(10)의 내부로 연장될 수 있다. 예를 들어, 기포기(aerator)(14), 교반기(16), 라만 프로브(18), 도관(20) 및 도관(22)이 캡(12)을 통해 연장될 수 있다. 그러나, 기포기(14), 교반기(16), 라만 프로브(18), 도관(20) 및 도관(22) 중 임의의 것 또는 전부는 예를 들어, 바이오리액터 탱크(10)의 측면을 통해서와 같이 임의의 다른 적합한 방식으로, 바이오리액터 탱크(10)에 작동 가능하게 결합될 수 있다는 것이 고려된다.
기포기(14)는 바이오리액터 탱크(10) 내의 세포 배양물에 산소 및/또는 다른 가스들을 제공하도록 구성된 살포기(sparger)일 수 있다. 기포기(14)는 산소 또는 다른 가스원에 결합될 수 있고, 가스를 세포 배양물로 보내 가스가 세포 배양물에서 거품을 일으킴으로써 세포 배양물에 산소를 공급하게 할 수 있다. 일부 예에서, 마이크로 살포기가 구멍이 뚫린 튜브 살포기와 함께 사용될 수 있다.
교반기(16)는 바이오리액터 탱크(10) 내 세포 배양물을 혼합하도록 구성된 임의의 적합한 교반기일 수 있다. 교반기(16)는 기계적 및/또는 자기 메커니즘들에 의해 상부 구동 또는 하부 구동될 수 있다. 하부 구동 교반기는 경우에 따라, 예를 들어, 온도, pH, 용존 산소, 거품, 이산화탄소 및 다른 센서들과 같은 감지 기구, 뿐만 아니라 산, 알칼리, 거품용 흡입구들, 새로운 배지 유입구 및 출구 포트들을 위한 공간을 캡(12)에 확보할 수 있기 때문에 바람직할 수 있다. 교반기(16)는 반경 방향 교반기, 축 방향 교반기, 러쉬톤 임펠러, 피치-블레이드 임펠러, 마린-블레이드 임펠러 등을 포함할 수 있다.
라만 프로브(18)는 예를 들어, 스테인레스 스틸 인클로저에 있고, 예를 들어, 사파이어 또는 글래스(glass)와 같은 투명한 창을 갖는 광섬유 라만 프로브일 수 있다. 라만 프로브(18)는 세포 배양물(20)의 라만 샘플링을 가능하게 하도록 구성될 수 있다. 라만 프로브(18)는 세포 배양물(2) 상에 단색광(예를 들어, 785 nm의 레이저 또는 다른 적합한 파장)을 비추고 세포 배양물(2)로부터 산란된 광을 검출하도록 구성될 수 있다.
라만 분광법은 샘플 식별 및 정량을 위해 원위치에 라만 프로브를 삽입함으로써 사용될 수 있는 분자 진동에 관한 정보를 제공하는 진동 분광법의 한 형태이다. 일부 실시 예에서, 공정 변수들의 모니터링은 원위치 라만 분광법을 사용하여 수행된다. 원위치 라만 분석은 라만 분광계에서의 분석을 위해 샘플의 일부를 추출하지 않고도 그 원래의 장소에서 샘플을 분석하는 방법이다. 원위치 라만 분석은 라만 분광기 분석기가 비침습적이고(이는 오염의 위험을 감소시킨다) 비파괴적이어서 세포 배양 생존능 또는 단백질 품질에 영향을 미치지 않는다는 점에서 바람직한하다. 원위치 라만 분석은 세포 배양물들에서 하나 이상의 공정 변수의 실시간 평가를 제공할 수 있다. 라만 프로브 제조사들은 tech5usa, Anton Paar, InPhotonics, Kaiser Optical Systems, Inc. 및 FiberTech Optica를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
바이오리액터 탱크(10)는 내부에 중공 섬유 필터를 갖는 필터 시스템(100)에 결합될 수 있다. 중공 필터 멤브레인(예를 들어, 폴리설폰)은 약 0.3 mm 내지 약 6.0 mm, 약 0.5 mm 내지 약 3.0 mm, 약 0.5 mm 내지 약 2.0 mm, 0.3 mm 초과, 약 0.5 mm 초과, 약 6.0 mm 미만, 약 3.0 mm 미만 또는 약 2.0 mm 미만의 내부 직경을 갖는 하나 이상의 관형 멤브레인을 포함할 수 있다. 멤브레인 내의 망상 재료는 망 내 공극들의 크기가 세포들의 세포 배양물(2)로부터의 직경에 가깝도록 선택될 수 있으며, 이는 세포 파괴물 및 폐배지가 필터를 통과할 수 있게 하면서 세포들의 높은 유지율을 보장하도록 돕는다. 일례에서, 망 공극 크기는 약 0.2 μm 내지 약 30 μm이지만, 다른 적합한 범위들 및 값들이 또한 고려된다. 목적 단백질 또는 다른 생물학적 생성물들은 필터 공극 크기(예를 들어, 0.2 μm 또는 50 kD)에 기초하여 관류 또는 유지될 수 있다.
바이오리액터 탱크(10)로부터의 유체는 도관(20) 및 펌프(70)를 통해 필터 시스템(100)으로 전달될 수 있다. 펌프(70)는 유체가 필터 시스템(100)으로부터 다시 바이오리액터 탱크(10)로 유동할 수 있게 하도록 양면을 다 이용할 수 있을 수 있다. 필터 시스템(100)은 교호 접선 유동하에서 작동할 수 있다. 일례에서, 교호 접선 유동은 중공 섬유들의 멤브레인 표면들과 동일한 방향의(예를 들어, 그러한 표면들에 접하는) 한 유동이 있고(이 유동은 앞뒤로 흐르고 있다), 상기 필터 표면에 실질적으로 수직한 방향의 다른 유동이 있음을 의미할 수 있다. 교호 접선 유동은 중공 섬유들을 포함하는 필터 모듈을 통해 세포 배양물을 순환시키기 위한 하나의 펌프(예를 들어, 펌프(70)) 및 필터 분리 전에 더 낮은 세포 밀도를 갖는 액체를 제거하기 위한 다른 펌프(예를 들어, 펌프(50))를 사용하여 이루어질 수 있다. 교호 접선 유동은 다른 세포 유지 메커니즘들의 전형적인 파울링 및 전단 변형 문제들을 방지하는 데 도움이 될 수 있다.
대안적으로, 예를 들어 한외 여과, 미세 여과 및 접선 유동 여과와 같은 다른 여과 메커니즘들(멤브레인 여과 메커니즘들을 포함도 이용될 수 있다.
블리드 펌프(40)는 바이오리액터 탱크(10)로부터 도관(22)을 통해 세포들을 제거하도록 구성될 수 있다. 도관(22)은 세포 응집 및 막힘(이는 예를 들어, 도관(22)이 배양물(2)의 점도에 비해 너무 좁은 경우에 발생할 수 있음)을 피하도록 선택된 침적 튜브(dip tube)일 수 있다. 도관(22)은 열가소성 탄성중합체 튜브(예를 들어, 바이오프렌)를 포함할 수 있다. 블리드 펌프(40)는 예를 들어, 프로세서(200)를 통해 제어될 수 있다. 블리드 펌프(40)를 통한 세포 블리드는 바이오리액터 탱크(10) 내의 세포 배양물(2)에서 세포들을 제거할 수 있다. 세포 블리드 속도(블리드 펌프(40) 및 제어기(200)의 출력에 의해 제어되는)는 세포 배양물(2) 내 세포들의 성장 속도에 기초하여 결정될 수 있다. 세포 배양물(2)에 정상 세포 밀도를 유지하기 위해, 블리드 속도 및 세포 성장 속도는 서로 대략 또는 실질적으로 동일한 것이 바람직할 수 있다. 일부 예에서, 유의 체적의 세포 배양물(2)이 가치 있는 생성물을 갖는 세포 블리드에서 제거된다면, 블리드를 수집하고 처리하여 생성물을 회수할 수 있다.
바이오리액터 탱크(10)는 바이오리액터 탱크(10) 및 세포 배양물(2)의 중량을 측정하도록 구성된 스케일(110) 상에 위치될 수 있다. 스케일(110)은 제어기(200)에 결합될 수 있고, 바이오리액터 탱크(10) 및 세포 배양물(2)의 중량을 제어기(200)에 연속적으로 전송할 수 있다. 일부 예에서, 예를 들어, 필터 하우징 및 중공 막 필터를 포함하는 필터 시스템(100)의 적어도 일부가 또한 스케일(110) 상에 위치될 수 있다. 스케일(110)은 스케일 상에 놓인 성분들의 중량을 측정하도록 구성된 임의의 적합한 스케일 또는 로드 셀일 수 있다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 제어기(200)는 라만 프로브(18), 스케일(110) 및 다른 센서들로부터 데이터를 수신하도록 구성될 수 있고, 데이터에 기초하여 공급 펌프(30), 블리드 펌프(40) 및 수확 펌프(50) 중 하나 이상을 통한 유체 유동의 속도를 제어하도록 구성될 수 있다.
제어기(200)는 예를 들어, 글루코스 농도, 글루타민 농도, 글루타메이트 농도, 암모니아 농도, 락테이트 농도, 총 세포 밀도, 역가 및 생존 세포 밀도와 같은 공정 변수들을 결정하기 위해 라만 프로브(18)로부터 원시 스펙트럼 데이터를 수신하도록 구성될 수 있다. 제어기(200)는 이러한 결정된 공정 변수들을 사용하여 공급 펌프(30), 블리드 펌프(40) 및 수확 펌프(50)를 통한 유체 유동 중 하나 이상을 조절하도록 피드백 루프를 설정할 수 있다. 즉, 제어기(200)는 글루코스 농도(예를 들어, 약 5mM 내지 약 85mM, 또는 약 0.5g/L 내지 약 15.5g/L, 약 1g/L 내지 약 15.5g/L, 약 0.5g/L 내지 약 8g/L, 약 2g/L 내지 약 6g/L, 또는 약 3g/L 내지 약 5g/L), 글루타민 농도(예를 들어, 약 8mM 미만, 약 7mM 미만, 약 6 mM 미만, 약 5 mM 미만, 또는 약 4 mM 미만), 글루타메이트 농도(예를 들어, 약 5 mM 미만, 약 4 mM 미만, 약 3 mM 미만, 약 2 mM 미만, 또는 약 1mM 미만), 암모니아 농도(예를 들어, 약 15mM 미만, 약 12mM 미만, 약 10mM 미만, 약 9mM 미만, 약 8mM 미만, 약 7mM 미만, 약 6mM 미만), 락테이트 농도(예를 들어, 약 6g/L 미만, 약 5g/L 미만, 약 4g/L 미만, 약 3g/L 미만, 약 2g/L 미만, 또는 약 1g/L 미만), 총 세포 밀도(예를 들어, 약 30MM 초과, 약 35MM 초과, 약 40MM 초과, 약 45MM 초과, 약 50MM 초과, 약 55MM 초과, 약60 MM 초과, 또는 약 65 MM 초과), 생존 세포 밀도(예를 들어, 3천만 세포/mL 이상, 3천 5백만 세포/mL 이상, 5천만 세포/mL 이상, 또는 7천 5백만 세포/mL 이상)중 하나 이상에 대한 설정치들을 설정하고, 결정된 값들(라만 프로브(18)로부터의 라만 스펙트럼에 기초하여)을 그것들 각각의 설정치들과 비교할 수 있다.
제어기(200)는 네거티브 피드백 루프를 이용하여 설정치 값(또는 설정치들의 범위)과 결정된 값 사이의 임의의 차이를 정정할 수 있다. 예를 들어, 결정된 글루코스 농도가 설정치 글루코스 농도보다 크다면, 제어기(200)는 글루코스 농도를 낮추는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 감소, 블리드 펌프(40)의 출력을 감소 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 감소시키고 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 글루타민 농도가 설정치 글루타민 농도보다 크다면, 제어기(200)는 글루타민 농도를 낮추는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 감소, 블리드 펌프(40)의 출력을 감소 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 감소시키고 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 글루타메이트 농도가 설정치 글루타메이트 농도보다 크다면, 제어기(200)는 글루타메이트 농도를 낮추는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 감소, 블리드 펌프(40)의 출력을 감소 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 감소시키고 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 암모니아 농도가 설정치 암모니아 농도보다 크다면, 제어기(200)는 암모니아 농도를 낮추는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 감소, 블리드 펌프(40)의 출력을 증가 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 증가시키고 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 락테이트 농도가 설정치 락테이트 농도보다 크다면, 제어기(200)는 락테이트 농도를 낮추는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 증가, 블리드 펌프(40)의 출력을 감소 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 감소시키고 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 총 세포 밀도가 총 세포 밀도 설정치보다 크다면, 제어기(200)는 총 세포 밀도를 낮추는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 감소, 블리드 펌프(40)의 출력을 증가 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 감소시키고 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 생존 세포 밀도가 생존 세포 밀도 설정치보다 크다면, 제어기(200)는 생존 세포 밀도를 낮추는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 감소, 블리드 펌프(40)의 출력을 증가 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 감소시키고 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있다.
예를 들어, 결정된 글루코스 농도가 설정치 글루코스 농도보다 낮다면, 제어기(200)는 글루코스 농도를 높이는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 증가, 블리드 펌프(40)의 출력을 증가 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 증가시키고 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 글루타민 농도가 설정치 글루타민 농도보다 낮다면, 제어기(200)는 글루타민 농도를 높이는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 증가, 블리드 펌프(40)의 출력을 증가 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 증가시키고 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 글루타메이트 농도가 설정치 글루타메이트 농도보다 낮다면, 제어기(200)는 글루타메이트 농도를 높이는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 증가, 블리드 펌프(40)의 출력을 증가 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 증가시키고 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 락테이트 농도가 설정치 락테이트 농도보다 낮다면, 제어기(200)는 락테이트 농도를 높이는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 증가, 블리드 펌프(40)의 출력을 증가 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 감소시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 증가시키고 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 총 세포 밀도가 총 세포 밀도 설정치보다 낮다면, 제어기(200)는 총 세포 밀도를 높이는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 증가, 블리드 펌프(40)의 출력을 감소 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 증가시키고 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 결정된 생존 세포 밀도가 생존 세포 밀도 설정치보다 낮다면, 제어기(200)는 생존 세포 밀도를 높이는데 도움이 되도록 예를 들어, 공급 펌프(30)의 출력을 증가, 블리드 펌프(40)의 출력을 감소 그리고/또는 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있거나; 또는 제어기(200)는 공급 펌프(30)의 출력을 증가시키고 수확 펌프(50)의 출력을 증가시킬 수 있다.
그러나, 시스템을 통한 총 관류는 소정의 설정치에서 유지된다(관류 속도는 리액터 내의 농도들에 따라 변하지 않을 것이다). 제어기(200)는 네거티브 피드백 루프를 사용하여 바이오리액터 중량(및 세포 배양물(2)의 중량)을 유사하게 제어할 수 있다.
리액터로 투입되는 다양한 영양 성분의 첨가 또는 제거는 리액터로 투입되는 물질의 총 질량 및/또는 체적이 동일하게 유지되도록 보장하기 위해 다른 투입물들에 상응하는 변화와 결합될 수 있음에 유의해야 한다. 즉, 관류 속도가 일정하게 유지되기 때문에, 하나의 영양 성분, 예를 들어, 글루코스 용액, 글루타민, 글루타메이트 등의 증가는 일차 영양 성분 공급 스트림의 상응하는 질량 또는 체적 감소를 동반할 수 있다.
일 실시 예에서, 시스템은 적어도 2개의 피드백 루프를 포함할 수 있으며 - 하나는 중량 제어를 위한 것이고 다른 하나는 공정 변수들(예를 들어, VCC, 글루코스, 글루타민, 글루타메이트, 암모니아, 락테이트 등)의 제어를 위한 것이다. 일례에서, 다양한 입력 및 출력 펌프는 경쟁 루프들에 의해 제어되지 않는다. 예를 들어, 관류 속도가 설정될 수 있고(예를 들어, 20 L/일), 이 후에 라만 프로브(18)는 하나 이상의 배양 값을 측정하고, 제어기(200)는 라만 프로브(18)로부터의 측정값들에 기초하여 수행할 단계들을 평가한다. 제어기(200)는 예를 들어, VCC가 너무 높다고 결정할 경우, 제어기(200)는 블리드 펌프(40)를 통해 세포들을 제거하기 시작할 수 있고, 동시에 수확 펌프(50)의 유량은 시스템을 통한 총 체적이 일정하게 유지되도록 감소될 수 있다. 다른 공정 변수들이 너무 높거나 너무 낮은 것으로 감지될 때(예를 들어, 글루코스, 글루타민, 글루타메이트, 암모니아, 락테이트 및 총 세포 밀도) 제어기(200)에 의해 취해지는 추가 단계들은 상술되었다.
글루코스, 락토스, 글루타민, 글루타메이트 등을 첨가하기 위해 제2 공급 펌프가 추가될 수 있다. 대안적인 실시 예에서 또는 추가로, 블리드 또한 세포들을 제거함으로써 암모니아 증가에 반응하도록 조절될 수 있다.
제어기(200)는 헤드리스 컴퓨터 시스템(예를 들어, 모니터, 키보드 및 마우스가없는 시스템)에 배치될 수 있다. 따라서, 제어기(200)는 네트워크 연결 또는 예를 들어, 직렬 연결과 같은 일부 다른 연결을 통해 제어되는 서버에 위치될 수 있다. 제어기(200)는 서버들 중 하나 이상에 장애가 발생하는 경우 하나 이상의 예비 서버 상에 복제될 수 있다.
제어기(200)는 칼만 필터링, 예를 들어, 선형 이산 추정(LQE, linear quadratic estimatio)을 라만 프로브(18)로부터의 라만 스펙트럼 데이터에 적용하도록 구성될 수 있다. 칼만 필터링은 단일 측정값 단독에 기초하는 것보다 정확한 경향이 있는 알려지지 않은 변수들의 추정치들을 생성하기 위해 시간에 따른 일련의 측정값을 사용하는 스펙트럼 데이터에 알고리즘을 적용하는 것을 포함할 수 있다. 그에 따라, 결정된 공정 변수들은 필터링된 모델들에 기초할 수 있다. 라만 프로브(18)로부터의 스펙트럼 데이터를 처리하기 위해 제어기(200)에 의해 다른 유형들의 필터링이 사용될 수도 있다는 것이 고려된다.
제어기(200)는 PI(공정 정보, process information) 히스토리언을 포함하거나 그 외 이에 결합될 수 있다. PI 히스토리언은 공정 제어 시스템들로부터의 데이터를 기록할 수 있는 시계열 데이터베이스가 있는 응용 프로그램일 수 있다. PI 히스토리언은 사용자들이 실시간 정보를 기록, 분석 및 모니터링할 수 있게 할 수 있다. 제어기(200)는 PI 히스토리언에 예를 들어, 스케일(110)로부터의 중량 값들, 라만 프로브(18)로부터의 스펙트럼 데이터, 및 공급 펌프(30), 블리드 펌프(40) 및 수확 펌프(50)의 펌프 속도들을 저장할 수 있다.
도 3은 본 개시 내용에 따른 방법(300)의 흐름도이다. 방법들(300)의 하나 이상의 단계는 비순차적으로 수행되거나, 다른 단계들과 동시에 수행되거나, 또는 완전히 제거될 수있다. 방법(300)은 바이오리액터 시스템이 조립될 수 있고, 세포 배양물(2)이 바이오리액터 탱크 내에 제공되고 세포주가 섞여 넣어질 수 있는 단계(302)로 시작될 수 있다. 그 다음, 방법(300)은 세포 배양물(2)의 공정 변수들이 라만 프로브(18) 및/또는 추가 또는 다른 센서들에 의해 바이오리액터 내에서 측정되는 단계(304)로 진행할 수 있다. 공정 변수들은 라만 프로브(18)에 의해 획득된 라만 스펙트럼 데이터로부터 결정된 전술한 매개 변수들 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 방법(300)은 바이오리액터 탱크(10)(안에 세포 배양물(2)을 포함하는)의 중량이 스케일(110)에 의해 측정되고 프로세서(200)로 제공되는 단계 306)로 진행할 수 있다.
단계(306)로부터, 방법(300)은 바이오리액터 탱크(10)로부터 도관(20)을 통해 세포 배양물(배지 + 세포들)을 회수하기 위해 펌프(70)를 활성화시킴으로써, 그리고 또한 필터 시스템(100)으로부터 용액을 회수하기 위해 수확 펌프 (50)를 활성화시킴으로써 세포 배양물(2)에서 무세포 폐배지가 제1 특정 속도로 제거되는 단계(308)로 진행할 수 있다. 단계(308)로부터, 방법(300)은 블리드 펌프(40)에 의해 제2 특정 속도로 출력 도관(22)을 사용하여 세포들이 세포 배양물에서 제거될 수 있는 단계(310)로 진행할 수 있다. 단 (310)로부터, 방법(300)은 새로운 배지 및 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다가 배지 및 영양 성분들이 총 입력을 블리드 펌프(40) 및 수확 펌프(50)의 조합된 출력과 동일하게 유지시키는 방식으로 입력 도관 및 공급 펌프(30)를 사용하여 제3 특정 속도로 세포 배지로 도입될 수 있는 단계(312)로 진행할 수 있다. 특정 속도는 펌프가 작동되고/거나 유지되는 속도 설정치 또는 속도 범위일 수 있다. 특정 속도들은 제어기(200)에 의해 결정될 수 있다.
단계들(302 내지 312) 각각은 임의의 순서로 발생할 수 있고, 경우에 따라, 제어기 (200)에 의해 실행되는 다수의 피드백 루프를 통해 실시간으로 동시에 발생할 수 있는 것으로 고려된다.
단계들(308, 310 및 312)은 단계(304)에서 라만 프로브(18) 및 단계(306)에서 스케일(110)로부터 수신된 데이터에 기초하여 제어기(200)에 의해 제어될 수 있다. 바이오리액터 탱크(10)(플러스 안에 함유된 세포 배양물(2))의 중량은 PID(비례-적분-미분) 루프를 통해 제어될 수 있다. 또한, 제어기(200)는 예를 들어, 글루코스 농도, 글루타민 농도, 글루타메이트 농도, 암모니아 농도, 락테이트 농도, 총 세포 밀도 및 생존 세포 밀도를 비롯한 하나 이상의 공정 변수를 결정하기 위해 라만 프로브(18)로부터 획득된 라만 스펙트럼들을 분석하도록 구성될 수 있다. 이러한 변수들 각각은 또한 네거티브 피드백 루프에 의해 제어될 수 있다.
본 개시 내용의 예들은 기존의 조절 용액에 명쾌하고 유연하며 저렴한 솔루션을 제공할 수 있고, 데이터 갭이 비교적 적을 수 있다. 본 개시 내용 내용의 제어 전략들은 일관된 바이오리액터 수준 제어를 보일 수 있다. 예를 들어, 본 개시 내용의 제어 시스템들을 사용하여 수준 분산이 +/- 0.5 L/일에서 +/- 0.01 L/일로 감소되었다. 예를 들어, 체적 교정과 같은 다른 시스템들을 사용하여 5-10% 중량 편차에서 여기에 개시된 제어 시스템들을 사용하여 0.1-0.5% 오차로 감소하는 중량 편차 개선이 또한 달성되었다. 시스템을 펌프들의 체적 교정에서 중량 및 다른 매개 변수들에 기초한 소프트웨어 제어 버전으로 변경함으로써 적어도 부분적으로 개선이 이루어질 수 있다. 또한, 본 개시 내용의 제어 시스템들은 공정 정보(PI) 경보(예를 들, 이메일 경보)와 완전히 통합될 수 있고, 원격으로 액세스 및 종료될 수 있다. 또한, 본 개시 내용의 시스템들 및 방법들은 종래의 시스템들 및 방법들보다 더 반복적이고 신뢰할 수 있는 결과들을 제공할 수 있다.
예 1(도 4 및 도 5)
예 1에 설명된 실험들은 관류 바이오리액터를 유가식 바이오리액터와 비교하고, 유가식 바이오리액터에 비해 관류 바이오리액터에서 달성 가능한 생존 세포 농도 및 세포별 생산성을 나타낸다.
한 실험에서, 15L 용량의 바이오리액터를 세포주들 및 배지를 사용하여 배양하였다. 바이오리액터 설정치들은 온도(섭씨 35.5℃), 교반(250RPM), pH(CO2 및 중탄산 나트륨을 사용하여 제어됨)(6.85 내지 7.15) 및 작용 체적(11L)을 포함했다. 0.2 ㎛ 중공 섬유 필터가 장착된 ATF4 세포 유지 장치를 바이오리액터에 결합시켰다. 중공 섬유 필터는 세포들은 유지하지만 단백질 및 영양 성분들을 통과시켰다. 2개의 리액터 체적(또는 22L의 배지)을 24시간마다 필터에 통과시켰다.
바이오리액터와 ATF는 둘 다 스케일 상에 배치하였다. 바이오리액터, 세포 배양물 및 ATF의 중량은 이더넷 연결을 통해 제어 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터로 송신되었다. 중량을 설정치(11.0 kg, 예를 들어, 바이오리액터의 작용 체적)과 비교했고, PID 제어기(MATLAB에서 설계되었지만, 제어 소프트웨어 SynTQ를 통해 실행됨)로 공급 펌프와 체결할지 여부를 결정했다. 수확 펌프를 목적하는 관류 속도와 동등한 일정한 속도로 설정하였다(매일 2개의 리액터 체적). 공급 펌프 및 관류 펌프는 OPC 신호를 Kepware 서버에 브로드캐스팅하는 SynTQ 소프트웨어를 사용하여 자동으로 제어하였다. Kepware 서버는 이러한 신호를 이더넷 연결을 통해 MODBUS 아날로그 출력 모듈로 브로드캐스팅하며, 이는 디지털 값을 4 ~ 20mA 사이의 물리적 밀리암페어 출력으로 변환하였다.
본 시스템을 사용하여, 바이오리액터 중량을 초기 11kg 중량의 10g(0.09%) 이내로 제어할 수 있었다. 본 시스템이 구현되기 전에는, 바이오리액터에서 바이오리액터 중량을 밤새 0.5kg(4.54%) 이상으로 제어할 수 없었다. 동일한 시스템 내에서, Kaiser 광학 라만 프로브를 사용하여 세포 배양물에서 라만 스펙트럼들을 캡처했다. 제어기는 이전의 회분들에서 개발되었던 모델들을 이용하여 세포 수, 글루코스, 락테이트, 암모니아 및 다른 영양 성분 농도들을 예측했다. 라만 프로브는 그 다음 컴퓨터 프로그램(예를 들어, SIMCA)에서 분석되는 수천 개의 상이한 스펙트럼을 캡처하였다. 프로그램은 다수의 성분 분석 및 소정의 매개 변수에 대한 오프라인 데이터를 사용하여, 모든 프로브 판독값에 대해 모델을 생성한다. 그 다음, 이러한 SIMCA 모델을 SynTQ에 업로드하고 프로브가 판독할 때마다(예를 들어, 15분 내지 45분마다) 실시간으로 액세스한다.
라만 프로브를 이용한 다양한 영양 성분의 제어는 세포주들의 생산성을 높이고, 장기 세포 배양에 대한 생존능을 증가시키며, 단백질의 다수 측면의 품질을 향상시킨다.
도 4는 회분 37일째 본 개시 내용에 따른 관류 바이오리액터("예" 1 을 보임)에서 최대 생존 세포 농도를 나타내며, 이는 회분 7일째(예 2)의 등가 크기의 유가식 리액터의 최대 생존 세포 농도의 대략 2배이다. 최대 생존 세포 농도가 37일(유가식 바이오리액터의 6일과 대조적으로)에 달성되었다는 사실은 관류 바이오리액터 공정의 견고성과 수명을 나타낸다.
도 5는 유가식 공정(예 2)의 1-12일 동안 cSP에 대한 관류 회분식 공정(예 1)의 12-25일 동안 세포별 생산성(cSP, cell specific productivity)을 도시한다. 관류 회분 25-37일에 유사한 생산성이 달성되었다.
관류 회분에서 VCC를 50x106 세포/mL를 지나 증가시키기 위해서는 하루에 3개 리액터 체적의 관류 속도가 요구되었으며, 이는 많은 경우 상업적이지 못할 수 있다.
"푸시-투-로우(push-to-low)" 전략을 사용한 배지 최적화는 필요한 관류 속도를 감소시킬 것이다. 예를 들어, 세포들이 20x106 세포/mL로 성장하고 정상 상태로 유지될 수 있다. 관류 속도는 5일 동안 2개의 리액터 체적/일로 설정될 수 있다. 5일째에, 관류 속도는 1.5 리액터 체적/일로 감소될 수 있다. 세포들이 지속되는 경우, 관류 속도는 5일 후에 1개의 리액터 체적/일로 감소될 수 있다. 세포가 죽기 시작하면, 아미노산 분석 또는 다른 분석을 사용하여 배지를 더 양호하게 강화시키는 방법(예를 들어, 배지에 영양 성분들을 보충하거나 영양 성분 농도를 조절)을 결정할 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 전략이 Bayer 외의 Adv. BioChem. Engin./Biotechnol. 2006, 101: 75-98 에 의해 "The Push to Low Approach for Optimization of High Density Perfusion Cultures of Animal Cells"에 설명되어 있다.
NOVA Flex 데이터가 획득될 수 있으며, 여기서 샘플을 분석함으로써 오프라인 판독이 이루어진다. 이전의 NOVA 데이터를 사용하여, 라만 모델이 구축될 수 있고, 그 시점에 프로브가 리액터에 투입될 수 있으며, 모델은 매일 1회가 아니라 NOVA와 같이 수동 샘플링이 필요한 15 내지 45분마다, 1초마다, 1분마다, 2분마다, 3분마다, 4분마다, 5분마다, 10분마다, 15분마다, 20분마다, 25분마다, 30분마다, 35분마다, 40분마다, 45분마다, 50분마다, 55분마다, 매시간, 2 시간마다, 3 시간마다, 4 시간마다, 5 시간마다 또는 6 시간마다 VCC 데이터를 제공할 수 있다. 도 5는 소정의 실행의 20일을 나타낸다. 실행의 첫 20일은 NOVA 데이터를 수집하는 데 사용하였으며, 이는 실행의 나중 부분들에 대한 라만 모델을 생성하는 데 사용하였다.
다음 예들에서, 다음은 특정 공정 변수들에 대한 일반적인 범위들이다: pH: 6.85-7.40, 용존 산소: 30-60%, 35-55%, 40-50% 또는 45%, 온도: 34-37.5 ℃ 및 교반: 벤치탑에서 150-300 RPM, 175-275 RPM, 200-250 RPM 또는 225 RPM.
예 2(도 6 내지 도 8)
예 2에 설명된 실험들은 VCC 성장 또는 글루코스에 대한 제어가 없는 관류 바이오리액터에 대한 데이터를 보여준다. VCC는 7일째에 세포들이 큰 세포 밀도로 빠르게 성장한 다음 11일까지 빠르게 감소하여 배지 내의 영양 성분들을 고갈시키는 것으로 관찰되었다(도 6). VCC의 정상 상태를 달성하기에는 중량 제어만으로는 충분하지 않았다.
또한 관류 실행 동안 글루코스는 제어되지 않았다. 배양은 세포들을 공급하기 위해 관류 실행 동안 배지 내의 글루코스에 의존하기 때문에, 이는 배양 동안 세포 사멸을 초래하였다. 세포가 성장함에 따라, 배지를 일관되게 공급하였지만 글루코스는 꾸준히 감소하였다(도 7). 10일 후에 발생하는 글루코스 검출의 급등은 완전한 세포 사멸로 인한 것이었고 따라서 세포 생존능을 모니터링할 때 볼 수 있는 바에 따른 글루코스의 소비는 도 8에 나타나지 않는다.
이 실험에서, 15L 벤치탑 바이오리액터에 mAb1을 생성하는 소정의 농도의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포들을 섞어 넣었다. 세포들을 실행 지속 기간 동안 일정하게 유지되는 특정 용존 산소, 온도, 교반 및 pH에서 배양하였다. 또한 세포들에 매일 리액터 체적의 2배의 속도로 관류 공급물 형태의 새로운 배지 및 영양 성분들을 제공하였다. Repligen XCell ATF4 시스템을 사용하여 관류액에서 제거되고 있는 동일한 양의 공급물을 리액터에 첨가함으로써 리액터 체적을 일정하게 유지하였다. 이는 바이오리액터 시스템의 중량을 모니터링하고 컴퓨터 지원 피드백 루프 제어 시스템을 사용하여 소정의 목표 중량의 0.05kg 이내로 중량을 유지함으로써 달성되었다. 이 관류 생성 실행 동안 VCC 또는 임의의 다른 바이오리액터 변수를 제어하기 위해 라만 제어도 블리드 제어도 제공하지 않았다.
유속을 또한 일일 배지 공급물마다 2개의 바이오리액터로 설정하였으나, 중량이 모니터링되지 않았던 유사한 실험(도면들에는 도시되지 않음)에서, 펌프들의 변동성을 적절히 제어할 수 없었다.
이 유사한 관류 실험에서, 공급 펌프 및 관류 펌프는 동등한 유량(펌프들의 체적 교정에 의해 결정됨)으로 설정하였다. 이 방법은 서로 일치하기에 충분히 정확했던 유속을 제공할 수 없었고, 밤새(예를 들어, 바이오리액터가 능동적으로 모니터링되지 않았던 기간), 공급 펌프는 관류 펌프가 제거할 수 있었던 것보다 많은 매질을 리액터에 첨가하였다. 이로 인해 리액터가 넘쳐 배양물이 손실되었다.
예 3(도 9 내지 도 12)
예 3에 설명된 실험은 VCC를 제어한 관류 바이오리액터에 대한 데이터를 보여준다. VCC 제어(도 9)는 생존능(도 10), 단백질 생성(도 11) 및 영양 성분들(도 12)의 일관된 정상 상태로 이어졌다.
이 실험에서는, 15L 벤치탑 바이오리액터에 mAb2를 생성하는 소정의 농도의 CHO 세포들을 섞어 넣었다. 세포들을 실행 지속 기간 동안 일정하게 유지되는 특정 용존 산소, 온도, 교반 및 pH에서 배양하였다. 또한 세포들에 매일 리액터 체적의 2배의 속도로 관류 공급물 형태의 새로운 배지 및 영양 성분들을 제공하였다. ATF4 시스템을 사용하여 관류액에서 제거되고 있는 동일한 양의 공급물을 리액터에 첨가함으로써 리액터 체적을 일정하게 유지하였다. 이는 시스템의 중량을 모니터링하고 컴퓨터 제어 시스템을 사용하여 소정의 목표의 플러스 또는 마이너스 0.05kg 이내로 중량을 유지함으로써 이루었다. 이 실행에는 라만 제어를 사용하지 않았고, VCC 샘플링 후 펌프의 블리드 속도를 수동으로 설정했다. 이 공정에는 다수의 샘플이 필요했으며 블리드 속도는 하루에 여러 번 조절해야 했다.
VCC는 관류 생성 배양 동안 42.5x106 세포/mL(40-45x106 세포/mL)의 목표 VCC로 제어되었다. 따라서, VCC가 목표보다 높아지면 블리드 속도가 증가하고 VCC가 목표 아래로 떨어지면 블리드 속도가 감소했다.
예 4(도 13 및 도 14)
이 예의 실험들은 관류 배양 방법(도 14)을 유가식 배양 방법(도 13)과 비교한다. 관류 배양 방법은 유사한 조건들 하에서 동일한 단백질에 대한 유가식 세포 배양 방법과 비교하여 대략 4배 최대 세포 수를 달성할 수 있었다(도 13). 유가식 배양은 파일럿 스케일로 수행한 한편, 관류 실험은 벤치 스케일(15L)에서 일어났다. 교반 및 기포 발생 전략은 교반을 위한 단위 체적당 힘 접근 및 기포 발생을 위한 체적별 매치 전략을 사용하여 벤치 스케일로 축소하였다.
관류 배양 방법은 동일한 시간에 유가식 리액터에서 생성된 것보다 3.5배의 단백질의 양을 생성할 수 있었다(도 14).
관류 배양 방법을 15L 벤치탑 바이오리액터에 mAb2를 생성하는 소정의 농도의 CHO 세포들을 섞어 넣어 제공함으로써 수행하였다(예 5 및 예 7). 세포들을 실행 지속 기간 동안 일정하게 유지되는 특정 용존 산소, 온도, 교반 및 pH에서 배양하였다. 또한 세포들에 매일 리액터 체적의 2배의 속도로 관류 공급물 형태의 새로운 배지 및 영양 성분들을 제공하였다. 이 실행에서 관류 실행 동안 세포들이 더 높은 세포 밀도에 놓일 수 있도록, 배지를 이전 실험들과 비교하여 증가된 농도의 필수 영양 성분들로 보충하였다. 리액터 체적은 중량 제어 시스템을 사용하여 일정하게 유지시켜 소정의 목표의 0.05 kg 이내 중량을 유지시켰다. 관류 생성 실행 동안 라만 제어도 블리드 제어도 제공하지 않았다.
유가식 세포 배양(예 6 및 8)은 유사한 조건들(용존 산소, 온도, 교반 및 pH) 하에서 수행하였다.
예 5(도 15 내지 도 18)
도 15 내지 도 18에 설명된 실험은 이 관류 시스템으로 30일 넘게 정상 상태로 유지되는 VCC뿐만 아니라 생존능, 글루코스 및 역가의 유리한 결과들을 보여준다(예를 들어, 도 15 내지 도 18 참조).
라만, 블리드 및 중량을 제어하는 관류 배양 방법을 15L 벤치탑 바이오리액터에 mAb2를 생성하는 소정의 농도의 CHO 세포들을 섞어 넣어 제공함으로써 수행하였다. 세포들을 실행 지속 기간 동안 일정하게 유지되는 특정 용존 산소, 온도, 교반 및 pH 범위에서 배양하였다. 또한 세포들에 매일 리액터 체적의 2배의 속도로 관류 공급물 형태의 새로운 배지 및 영양 성분들을 제공하였다. 이 실행에서 세포들이 더 높은 세포 밀도에 놓일 수 있도록 배지를 (예 2 및 예 3과 비교하여) 증가된 농도의 필수 영양 성분들로 보충하였다. 리액터 볼륨은 시스템의 중량을 모니터링하고 컴퓨터 피드백 제어 시스템을 사용하여 소정의 목표의 플러스 또는 마이너스 0.05kg 이내로 중량을 유지함으로써, ATF4 시스템을 사용하여 관류액에서 제거되고 있는 동일한 양의 공급물을 중량 제어 시스템을 사용하여 리액터에 첨가함으로써 일정하게 유지하였다.
이 실행에서 VCC를 제어하기 위해 라만 제어 및 라만 피드백에 기초한 자동 블리드 제어를 사용하였다(도 15). 첫 번째 실험(예 9)에서, 라만 블리드 전략은 40x106 세포/mL의 VCC를 유지하도록 설정하였다. VCC의 범위는 이전 실험(예 3)에서 수동 블리드로 발생한 목표보다 약간 더 넓은35-45x106 세포/mL였다. 그러나, 시스템은 하루에 한 번만 샘플링하였고 이 관류 실행에서 조절이 필요하지 않았다(예 3에 설명된 수동 블리드로 하루에 여러 번 다수를 조절한 것과 비교하여).
두 번째 실험(예 10)에서, 조건들은 VCC가 하루에 하나의 리액터 체적의 관류 속도로 10x106 세포/mL로 설정되었다는 점을 제외하고는 첫 번째 실험과 유사했다.
예 6(도 19 및 도 20)
한 실험에서, 세포주들 및 배지를 사용하여 3개의 상이한 바이오리액터를 배양하였다. 바이오리액터들의 용량은: 3L(예 11), 15L(예 12) 및 50L(예 13)(일회용 바이오리액터)였다. 바이오리액터 설정치들은 온도(섭씨 35.5℃), 교반(250RPM), pH(CO2 및 중탄산 나트륨을 사용하여 제어됨)(6.85 내지 7.15) 및 작용 체적(각각 2L, 10L, 35L)을 포함했다. 이러한 모든 매개 변수는 실행 지속 기간 동안 일정하게 유지하였다. 각각의 바이오리액터는 0.2 미크론 필터가 장착된 ATF(각각 ATF2, ATF4, ATF6) 세포 유지 장치와 결합하였다. 중공 섬유 필터는 세포들은 유지하지만 단백질을 24 시간 후 통과시켰다.
라만, 블리드 및 중량 제어를 사용한 각 시스템에서 관류 배양을 세 개의 스케일 모두에서 수행하였다. 예 5와 같이, 이 실험의 배지에는 추가 영양 성분들을 보충하였다. 각 시스템 내 중량은 ATF4 및 ATF6에서 +/- 0.05 kg, 그리고 소정의 목표의 +/- 1 kg(스케일 자체의 장비 제한으로 인해)으로 제어하였다.
이 실행에서 VCC를 40x10^6 세포/mL로 설정하기 위해 라만 제어 및 라만 피드백에 기초한 자동 블리드 제어를 사용하였다(도 19). 라만 프로브 변동성은 50L ATF6 시스템으로 관찰하였으며, 이는 라만 제어 모델이 아직 큰 스케일에 대해 최적화되지 않았기 때문으로 예상된다.
이러한 3회의 모든 실행 내에서, 관류 속도는 1.8 내지 2 RV/일로 설정하였고, 모든 스케일-업 변수들은 전통적인 방법들을 사용하여 설정하였다.
이러한 실험의 결과들은 5일의 지속 기간 동안 세 시스템 모두에서 비슷한 단백질 생성(도 20)이 이루어졌다는 것이다.
예 7(도 21)
한 실험에서, 하나의 바이오리액터를 세포주들 및 배지를 사용하여 배양하였다. 바이오리액터의 용량은 15L였다(예 14). 바이오리액터 설정치들은 온도(섭씨 35.5℃), 교반(250RPM), pH(CO2 및 중탄산 나트륨을 사용하여 제어됨)(6.85 내지 7.15)을 포함했다. 이러한 모든 매개 변수는 실행 지속 기간 동안 일정하게 유지하였다. 바이오리액터는 0.2 미크론 필터가 장착된 ATF 세포 유지 장치와 결합하였다. 중공 섬유 필터는 세포들은 유지하지만 단백질을 24 시간 후 통과시켰다.
라만, 블리드 및 중량 제어를 사용한 시스템에서 관류 배양을 수행하였다. 예 5와 같이, 이 실험의 배지에는 추가 영양 성분들을 보충하였다. 각 시스템 내 중량은 ATF4 및 소정의 목표의 +/- 0.05 kg으로 제어하였다.
이 실행에서 VCC를 70x10^6 세포/mL로 설정하기 위해 라만 제어 및 라만 피드백에 기초한 자동 블리드 제어를 사용하였다(도 21 참조).
이 실행에서 관류 속도는 배양물에 추가 세포들을 보충하고 배지 고갈이 발생하지 않도록 보장하기 위해 2.5 RV/일로 설정하였다.
리액터는 장치 고장으로 인해 회분이 종료되기 전에 7일 동안 70x10^6 세포/mL를 초과하는 유지할 수 있었다. 이 시간 동안 생존능은 건강한 배양물을 나타내는 90%를 초과하여 유지되었다. 본 개시 내용의 제어 시스템의 구현 전에는, 그러한 고밀도의 지속적인 생성이 불가능했을 것이다.
여기서 "일 실시 예" 또는 "실시 예"의 언급은 실시 예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 개시 내용의 하나, 일부 또는 모든 실시 예에 포함, 채용 및/또는 통합될 수 있음을 의미한다. 본 명세서에서 "일 실시 예에서" 또는 "다른 실시 예에서"라는 어구의 사용 또는 출현은 동일한 실시 예를 지칭하지 않고, 또한 별개의 또는 대안적인 실시 예들도 반드시 하나 이상의 다른 실시 예와 상호 배타적이거나 하나의 배타적인 실시 예로 제한되지 않는다. "구현" 및 "예"라는 용어들에도 동일하게 적용된다. 본 개시 내용은 임의의 단일 양태로도 그 실시 예로도, 그러한 양태들 및/또는 실시 예들의 임의의 조합들 및/또는 치환들로도 제한되지 않는다. 또한, 본 개시 내용의 각각의 양태들 및/또는 그 실시 예들은 단독으로 또는 본 개시 내용의 하나 이상의 다른 양태 및/또는 그 실시 예와의 조합으로 채용될 수 있다. 간결성을 위해, 특정 치환들 및 조합들은 여기서 별도로 논의 및/또는 설명되지 않는다.
또한, 상술한 바와 같이, "대표적인"것으로 여기에 설명된 실시 예 또는 구현 예는 예를 들어, 다른 실시 예들 또는 구현 예들에 비해 바람직하거나 유리한 것으로 해석되어서는 안 되며; 오히려, 실시 예 또는 실시 예들은은 예시적인 실시 예(들)임을 전달하거나 나타내는 것으로 의도된다.

Claims (50)

  1. 바이오리액터 시스템을 제어하는 방법으로서,
    세포 배양물을 상기 세포 배양물이 목적 단백질(POI, protein of interest)을 생성할 수 있게 하는 조건들을 갖는 바이오리액터에 제공하는 단계;
    라만 프로브(RAMAN probe)에 의해 상기 바이오리액터 내 상기 배양물의 하나 이상의 공정 변수(PP, process parameter)를 측정하는 단계로서, 상기 공정 변수들은 영양 성분 농도, 생존 세포 농도 및 단백질 속성들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 공정 변수를 측정하는 단계;
    세포 배양물 함량과 상기 세포 배양물의 중량을 측정하는 단계;
    제1 출력 도관을 사용하여 제1 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 무세포 폐배지를 제거하는 단계;
    제2 출력 도관을 사용하여 제2 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 세포들을 제거하는 단계;
    입력 도관을 사용하여 제3 특정 속도로 새로운 배지 또는 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 상기 세포 배양물에 도입하는 단계를 포함하며;
    상기 입력 도관 및 상기 출력 도관들은 상기 바이오리액터의 상기 라만 프로브 측정값들 및 중량 측정값에 기초하여 (ⅰ) 상기 공정 변수들 중 하나 이상을 미리 결정된 범위들 내에, (ⅱ) 상기 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 상기 중량을 미리 결정된 범위 내에, 그리고 (ⅲ) 상기 입력 도관의 상기 제3 특정 속도 및 각각의 상기 출력 도관들의 상기 제1 특정 속도 및 상기 제2 특정 속도를 각각의 미리 결정된 범위들 내에 유지시키도록 조절되는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 라만에 의해 상기 바이오리액터 내 상기 배양물의 상기 하나 이상의 공정 변수를 측정하는 단계는 시간당 한 번 이상 일어나는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 세포 배양물을 정상 상태의 30일 이상 동안 3천만 세포/mL 이상의 평균 생존 세포 농도로 유지시키도록 구성되는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오리액터는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 바이오리액터 및 세포 배양물의 상기 중량을 20g 범위 내에 유지키시도록 구성되는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오리액터는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 상기 중량을 상기 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 초기 중량의 0.1 퍼센트 내에 유지키시도록 구성되는, 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 공정 변수가 각각의 목적하는 범위 내 설정치 값으로부터 편차가 생길 때, 무세포 배지를 제거하는 단계, 세포들을 제거하는 단계 또는 새로운 배지 또는 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 도입하는 단계 중 하나 이상이 상기 편차를 감소시키도록 조절되는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 매일 상기 제1 출력 도관을 통해 최소 두 바이오리액터 체적의 폐배지가 제거되는, 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 매일 상기 제1 출력 도관을 통해 최대 세 바이오리액터 체적의 폐배지가 제거되는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 변수들은 상기 세포 배양물의 온도 및 상기 세포 배양물의 pH를 포함하고, 상기 온도는 35℃와 36℃ 사이에 유지되며, 상기 pH는 6.85와 7.15 사이에 유지되는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 변수들은 세포별 생산성을 포함하고, 상기 세포 배양물 내 세포들을 최소 25-37일 동안 15-25 pg/세포/일 이상의 세포별 생산성으로 유지시키도록 구성되는, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 변수들은 글루코스 농도를 포함하고, 글루코스 농도를 약 5 mM 내지 약 85 mM, 또는 약 1 g/L 내지 약 15.5 g/L 사이에 유지시키도록 구성되는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 변수들은 락테이트 농도를 포함하고, 락테이트 농도를 약 60 mM 미만, 또는 약 6 g/L 미만으로 유지시키도록 구성되는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 변수들은 암모니아 농도를 포함하고, 암모니아 농도를 약 15 mM 미만으로 유지시키도록 구성되는, 방법.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 무세포 폐배지를 제거하는 단계, 세포들을 제거하는 단계 또는 새로운 배지 또는 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 도입하는 단계의 각각은 각각의 펌프에 의해 제어되는, 방법.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오리액터는 세포들은 함유하고 유체가 통과할 수 있도록 구성된 필터를 포함하는, 방법.
  16. 바이오리액터 시스템을 제어하는 방법으로서,
    세포 배양물을 바이오리액터에 제공하는 단계;
    라만 프로브에 의해 상기 바이오리액터 내 상기 세포 배양물의 하나 이상의 공정 변수를 측정하는 단계;
    제1 출력 도관을 사용하여 제1 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 무세포 폐배지를 제거하는 단계;
    제2 출력 도관을 사용하여 제2 특정 속도로 상기 세포 배양물에서 세포들을 제거하는 단계;
    입력 도관을 사용하여 제3 특정 속도로 새로운 배지 또는 영양 성분들 중 하나 또는 둘 다를 상기 세포 배양물에 도입하는 단계; 및
    상기 라만 프로브 측정값들에 기초하여 상기 제1 특정 속도, 상기 제2 특정 속도 또는 상기 제3 특정 속도 중 하나 이상을 변경하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 바이오리액터 배양 시스템으로서,
    입력 도관 및 적어도 하나의 출력 도관을 갖는 탱크;
    적어도 하나의 펌프;
    상기 탱크에 결합되는 필터;
    상기 탱크에 결합되는 라만 프로브; 및
    상기 적어도 하나의 펌프 및 상기 라만 프로브에 결합되는 제어기로서, 상기 라만 프로브로부터의 입력에 기초하여 상기 적어도 하나의 펌프를 제어하도록 구성되는, 상기 제어기를 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 적어도 하나의 출력 도관은 상기 탱크에서의 유체 제거를 제어하도록 구성된 제2 펌프에 연결하기 위한 제1 출력 도관, 및 상기 탱크에서의 세포 제거를 제어하도록 구성된 제3 펌프에 연결하기 위한 제2 출력 도관을 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템.
  19. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 필터는 세포들을 상기 탱크에 유지시키고 유체는 상기 필터를 통과할 수 있게 하도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  20. 청구항 17 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라만 프로브는 상기 탱크 내에 배치되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  21. 청구항 17 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기는 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프에 결합되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  22. 청구항 17 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탱크 내 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 중량을 측정하도록 구성된 스케일(scale)을 더 포함하며; 상기 제어기는 상기 스케일로부터 중량 데이터를 수신하도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 제어기는 상기 탱크의 상기 중량을 상기 중량에 대한 설정치와 비교하고, 상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프의 출력 중 하나 이상을 조절하도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  24. 청구항 17 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기는 상기 라만 프로브로부터 스펙트럼 데이터를 수신하고; 수신된 상기 스펙트럼 데이터에 기초하여, 상기 세포 배양물의 매개 변수를 결정하고, 결정된 상기 매개 변수를 상기 매개 변수의 설정치와 비교하며; 상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프의 출력 중 하나 이상을 조절하도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 상기 출력 조절은 결정된 상기 매개 변수와 상기 매개 변수의 설정치 간 편차, 또는 수신된 상기 중량 및 상기 중량의 설정치 간 편차를 감소시키는, 바이오리액터 배양 시스템.
  26. 청구항 17 또는 25에 있어서, 상기 세포 배양물을 정상 상태의 30일 동안 3천만 세포/mL 이상의 평균 생존 세포 농도로 유지시키도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  27. 청구항 17 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탱크는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 상기 중량을 20g 범위 내에 유지키시도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  28. 청구항 17 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탱크는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 상기 중량을 상기 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 초기 중량의 0.1 퍼센트 내에 유지키시도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 제어기는:
    수신된 상기 스펙트럼 데이터에 기초하여, 상기 바이오리액터 배양물의 복수의 매개 변수를 결정하고;
    상기 복수의 매개 변수의 각각을 상기 복수의 매개 변수의 각각에 대한 각각의 설정치와 비교하며;
    상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 출력을, 결정된 상기 매개 변수들과 상기 각각의 설정치들 간 편차를 감소시키도록 조절하도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 복수의 매개 변수는 온도, pH, 영양 성분 농도, 락테이트 농도, 암모니아 농도 및 세포별 생산성을 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템.
  31. 청구항 17 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터는 세포들은 함유하고 유체가 통과할 수 있도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  32. 청구항 17 내지 31에 있어서, 스케일을 더 포함하며, 상기 스케일 상에 상기 탱크 및 상기 필터가 놓이는, 바이오리액터 배양 시스템.
  33. 청구항 17 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 스케일을 더 포함하며, 상기 스케일 상에 상기 탱크가 놓이는, 바이오리액터 배양 시스템.
  34. 청구항 17 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 스케일을 더 포함하며, 상기 스케일과 상기 탱크가 물리적으로 접촉되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  35. 바이오리액터 배양 시스템으로서,
    입력 도관 및 적어도 하나의 출력 도관을 갖는 탱크;
    적어도 하나의 펌프;
    상기 탱크에 결합되는 필터;
    상기 탱크와 접촉되는 스케일;
    상기 탱크에 결합되는 라만 프로브; 및
    상기 적어도 하나의 펌프, 상기 스케일 및 상기 라만 프로브에 결합되는 제어기로서, 상기 라만 프로브로부터의 입력 및 상기 스케일로부터의 입력에 기초하여 상기 적어도 하나의 펌프를 제어하도록 구성되는, 상기 제어기를 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템.
  36. 바이오리액터 배양 시스템으로서,
    탱크로의 유체 전달을 제어하도록 구성된 제1 펌프에 연결하기 위한 입력 도관, 상기 탱크에서의 유체 제거를 제어하도록 구성된 제2 펌프에 연결하기 위한 제1 출력 도관, 및 상기 탱크에서의 세포 제거를 제어하도록 구성된 제3 펌프에 연결하기 위한 제2 출력 도관을 갖는, 상기 탱크;
    상기 탱크에 결합되는 필터로서, 세포들을 상기 탱크에 유지시키고 유체는 상기 필터를 통과할 수 있게 하도록 구성되는, 상기 필터;
    상기 탱크 내 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 중량을 측정하도록 구성된 스케일;
    상기 탱크 내에 배치되는 라만 프로브; 및
    상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프, 상기 제3 펌프, 상기 스케일 및 상기 라만 프로브에 결합되는 제어기로서:
    상기 스케일로부터 중량을 수신하고;
    상기 탱크의 상기 중량을 상기 중량에 대한 설정치와 비교하고;
    상기 라만 프로브로부터 스펙트럼 데이터를 수신하도록;
    수신된 상기 스펙트럼 데이터에 기초하여, 상기 세포 배양물의 매개 변수를 결정하고;
    결정된 상기 매개 변수를 상기 매개 변수의 설정치와 비교하며;
    상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 스루풋을 조절하도록 구성되는, 상기 제어기를 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 상기 스루풋 조절은 결정된 상기 매개 변수와 상기 매개 변수의 설정치 간 편차, 또는 수신된 상기 중량 및 상기 중량의 설정치 간 편차를 감소시키는, 바이오리액터 배양 시스템.
  38. 청구항 36 또는 37에 있어서, 상기 세포 배양물을 정상 상태의 30일 동안 3천만 세포/mL 이상의 평균 생존 세포 농도로 유지시키도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  39. 청구항 36 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탱크는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 상기 중량을 20g 범위 내에 유지키시도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  40. 청구항 36 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탱크는 10L 이상의 체적을 갖고, 상기 세포 배양물과 상기 바이오리액터의 상기 중량을 상기 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 초기 중량의 0.1 퍼센트 내에 유지키시도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  41. 청구항 36 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기는:
    수신된 상기 스펙트럼 데이터에 기초하여, 상기 바이오리액터 배양물의 복수의 매개 변수를 결정하고;
    상기 복수의 매개 변수의 각각을 상기 복수의 매개 변수의 각각에 대한 각각의 설정치와 비교하며;
    상기 비교에 기초하여, 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프 중 하나 이상의 상기 스루풋을, 결정된 상기 매개 변수들과 상기 각각의 설정치들 간 편차를 감소시키도록 조절하도록 구성되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 복수의 매개 변수는 온도, pH, 영양 성분 농도, 락테이트 농도, 암모니아 농도 및 세포별 생산성을 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템.
  43. 청구항 36 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 세포들은 함유하고 유체가 통과할 수 있도록 구성되는 필터를 더 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 스케일 상에 상기 탱크 및 상기 필터가 놓이는, 바이오리액터 배양 시스템.
  45. 청구항 36 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스케일 상에 상기 탱크가 놓이는, 바이오리액터 배양 시스템.
  46. 청구항 36 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스케일과 상기 탱크가 물리적으로 접촉되는, 바이오리액터 배양 시스템.
  47. 바이오리액터 배양 시스템으로서,
    입력 도관 및 적어도 하나의 출력 도관을 갖는 탱크;
    적어도 하나의 펌프;
    상기 탱크에 결합되는 필터;
    상기 탱크에 결합되는 라만 프로브; 및
    상기 적어도 하나의 펌프 및 상기 라만 프로브에 결합되는 제어기로서, 상기 라만 프로브로부터의 입력에 기초하여 상기 적어도 하나의 펌프를 제어하도록 구성되는, 상기 제어기를 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템.
  48. 바이오리액터 배양 시스템으로서,
    탱크로의 유체 전달을 제어하도록 구성된 제1 펌프에 연결하기 위한 입력 도관, 상기 탱크에서의 유체 제거를 제어하도록 구성된 제2 펌프에 연결하기 위한 제1 출력 도관, 및 상기 탱크에서의 세포 제거를 제어하도록 구성된 제3 펌프에 연결하기 위한 제2 출력 도관을 갖는, 상기 탱크;
    상기 탱크에 결합되는 필터로서, 세포들을 상기 탱크에 유지시키고 유체는 상기 필터를 통과할 수 있게 하도록 구성되는, 상기 필터;
    상기 탱크 내 세포 배양물을 갖는 상기 탱크의 중량을 측정하도록 구성된 스케일;
    상기 탱크 내에 배치되는 라만 프로브; 및
    상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프, 상기 제3 펌프, 상기 스케일에 결합되는 제어기를 포함하는, 바이오리액터 배양 시스템.
  49. 본 개시 내용의 도 1 및 도 2에 도시되어 있는 바와 같은 바이오리액터 시스템.
  50. 본 개시 내용의 도 3에 도시되어 있는 바와 같은 바이오리액터 시스템을 제어하는 방법.
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