CN114945659A - 具有一个或多个原位在线传感器的一次性细胞培养容器 - Google Patents

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Abstract

本文报告了一种小体积生物反应器，所述小体积生物反应器包括培养容器和反应器顶板，其中所述培养容器具有20ml至350ml的工作体积，并包括两个或更多个原位传感器，其中所述反应器顶板包括原位传感器端口，其中至少一个原位葡萄糖传感器和一个原位pH传感器连接到所述原位传感器端口。

Description

具有一个或多个原位在线传感器的一次性细胞培养容器
本发明属于哺乳动物细胞培养领域。更详细地，本发明尤其涉及一次性小体积细胞培养容器，也称为一次性小体积生物反应器(SUSVB)，包括一个或多个，特别是两个或更多个原位传感器，并且涉及其在哺乳动物细胞的小体积培养中的用途。
背景技术
通过自动化高通量技术可加速生物制剂和疫苗的生物工艺的开发，该自动化高通量技术可减轻来自控制复杂生物制剂的产物质量属性所需的多因素统计实验的巨大资源负担(Bareither,R.等人，Biotechnol.Bioeng.110(2013)3126-3138)。
最近，Bareither,R.等人通过根据用于使用CHO细胞培养、毕赤酵母以及大肠杆菌生产治疗性蛋白质和单克隆抗体的工业生物制剂工艺的工艺性能，建立一个类似于实验室和中试规模的那些反应器的小型搅拌槽一次性250mL反应器，为高通量上游工艺开发提供自动化一次性小型反应器的概念评估的证明(Biotechnol.Bioeng.110(2013)3126-3138)。该概念评估的证明包括类似的生长、细胞活力、产物滴度和产物质量。该技术跨多次运行表现出稳健性，并满足对于使用指数进料和复杂的事件触发工序运行高细胞密度工序(大于400g/L的湿细胞重量)的能力的要求。
一次性细胞培养容器在本领域是众所周知的，例如由Sartorius Stedim Biotech销售的
Figure BDA0003725456100000011
15和250系统。
US 2019/048305报告了一种灌注式生物反应器和一种使用该生物反应器进行连续细胞培养的方法，其中该反应器包括安装有单个传感器(254)的单个传感器端口(240)。
US 2019/153381报告了一种灌注式生物反应器和相关使用方法，其中该反应器包括作为一个传感元件的顶部空间中的RAMAN传感器，即培养基非接触式传感器。
US 8,026,096报告了使用两升或更多工作体积的生物反应器在昆虫细胞中产生的体内活性促红细胞生成素。
发明内容
市售的一次性小体积生物反应器(SUSVB)最多提供温度、溶解氧和pH的控制，并且仅具有进料添加和采样的能力。然而，没有第二原位(即与培养基直接接触)代谢物传感器的选项。因此，如果例如除了pH控制之外，还需要对葡萄糖进行额外的监测，则不可避免地必须通过采样进行离线分析。这尤其增加了处理工作以及污染培养的风险。
本发明人现已发现，通过使用根据本发明的小体积生物反应器，能缩短用于分析和开发生物工艺的时间线。另外能降低成本。这一切都是在不损害与后来的大规模工艺的可转移性的情况下实现的。
本发明的一个方面是一种小体积生物反应器，该小体积生物反应器包括一个或多个原位传感器，其中至少一个原位传感器用于葡萄糖的确定。
本发明的一个方面是一种小体积生物反应器，包括：
-培养容器(105)；
-搅拌器，该搅拌器包括搅拌器轴(108)和一个或多个叶轮(112；109)；
-作为第一原位传感器的电极或电极型传感器；
-气体喷射器(127)；
-反应器顶板(104)，该反应器顶板包括：
-电机接头(103)，该电机接头用于将电机的驱动轴连接到搅拌器轴(108)(122)；
-至少一个气体入口(116)和气体出口(117)；
-供应端口区域(133)；
-原位传感器端口(130)，该原位传感器端口用于容纳电极或电极型传感器，
其特征在于，该小体积生物反应器包括第二原位传感器。
以下是如前所述的所有方面的实施例。明确指出，每个实施例与每个其他实施例的组合以及与每个方面的组合同样包括在内，即使该组合未被记录。
在一个优选实施例中，小体积生物反应器包括两个或更多个原位传感器，其中一个原位传感器用于葡萄糖的确定，另一原位传感器用于pH值的确定。在一个优选实施例中，两个传感器都是浸没式传感器，即与培养基直接接触。
在一个实施例中，pH传感器为pH电极。
在一个实施例中，葡萄糖传感器为电化学和/或基于酶的传感器。
在一个优选实施例中，小体积生物反应器包括两个或更多个原位传感器，其中一个原位传感器用于葡萄糖的确定，另一原位传感器用于pH值的确定，其中pH传感器为pH电极并且葡萄糖传感器为电化学和/或基于酶的传感器。在一个优选实施例中，两个传感器都是浸没式传感器，即与培养基直接接触。
在一个实施例中，小体积生物反应器具有20ml至350ml的工作体积。在一个实施例中，工作体积为25ml至300ml。在一个实施例中，工作体积为50ml至280ml。在一个实施例中，工作体积为55ml至270ml。
在一个实施例中，小体积生物反应器以60ml至260ml的体积运行。在一个实施例中，小体积生物反应器以90ml至250ml的体积运行。
在一个实施例中，小体积生物反应器具有500ml或更小的总体积。在一个实施例中，小体积生物反应器具有450ml或更小的总体积。在一个实施例中，小体积生物反应器具有400ml或更小的总体积。
在一个实施例中，小体积生物反应器包括培养容器(105)和反应器顶板(104)。
在一个实施例中，至少两个原位传感器至少包括葡萄糖或乳酸传感器和pH传感器。
在一个实施例中，供应端口区域包括一至四个用于液体的入口，该入口连接到各个的进料管线(118，119，120，121)和任选地为喷射器气体入口(116)。
在一个实施例中，两个叶轮(109，112)连接到搅拌器轴。
在一个实施例中，小体积生物反应器至少包括(i)一个喷射器气体入口(116)和(ii)一个顶部空间气体入口(132)。
在一个实施例中，葡萄糖传感器每20秒确定一次葡萄糖浓度和/或葡萄糖传感器在葡萄糖浓度变化的情况下提供信号。在一个实施例中，确定的葡萄糖浓度值通过有线或无线传输到计算机。在一个实施例中，葡萄糖浓度的传输是通过WI-FI、RFID或蓝牙进行的。在一个实施例中，葡萄糖传感器具有最多至8g/l的葡萄糖或最多至3g/l的葡萄糖的工作范围。在一个实施例中，葡萄糖传感器为电化学和/或基于酶的传感器。在一个实施例中，葡萄糖传感器为涂覆有固定化酶的丝网印刷电极。在一个实施例中，葡萄糖传感器基材为USPVI类聚合物。
在一个实施例中，小体积生物反应器为一次性生物反应器。
在一个实施例中，培养容器(105)和反应器顶板(104)由非金属材料制成。在一个实施例中，培养容器(105)和反应器顶板(104)由塑料(制成)。
在一个实施例中，反应器顶板(104)进一步包括采样端口(102)。
在一个实施例中，小体积生物反应器是可灭菌的。
在一个实施例中，小体积生物反应器是经辐射灭菌的小体积生物反应器。
在一个实施例中，小体积生物反应器是经两次辐射灭菌的小体积生物反应器。
在一个实施例中，辐射为β辐射和/或γ辐射。
具体实施方式
与早期的生物治疗产品的生产相比，近年来普遍认为，对于治疗性蛋白质，诸如抗体的开发，决定性参数不仅是产物滴度，而且是特定的产物质量属性，诸如但不限于副产物分布或糖基化分布/模式(参见例如Bareither,R.and Pollard,D.,Biotech.Prog.155(2011)217-224)。
因此，需要尽早评估和设计这些特性，最好在克隆选择和工艺开发期间进行。此外，由于这不是非时间工艺，因此通常需要使用多个并行反应器来进行连续几轮的实验。因此，该方法需要适合高通量。
鉴于生态发面和经济方面的限制，不能将大规模培养用于工艺开发。因此，采用合适的按比例缩小的系统，该系统被证明能可靠地反映后来的商业(大)规模工艺和工艺性能。
根据本发明的一个独立方面为一种小体积生物反应器，包括：
培养容器(105)，所述培养容器
-具有20ml至350ml的工作体积，
-包括固定有至少一个叶轮(112)的搅拌器轴(108)，
-包括进料管道(107)，所述进料管道包括i)在其端部连接到喷射器(127)的喷射管，和ii)在其端部具有开口的至少一个进料管线(118)，
-包括两个或更多个挡板(114；126)，所述挡板在朝向所述培养容器(105)的中心的方向(垂直于所述培养容器的壁)上从所述培养容器(105)的所述壁延伸；以及
-反应器顶板(104)，
其中所述反应器顶板(104)包括：
-接头(122)，所述接头用于将电机的驱动轴连接到所述搅拌器轴(108)；
-喷射器气体入口(116)，所述喷射器气体入口连接到所述进料管道(107)中的所述喷射管，任选地为连接到顶部空间(132)的气体入口；
-气体出口(117)，所述气体出口连接到所述培养容器的所述顶部空间；
-进料管线(118)的用于液体的至少一个入口，所述进料管线为所述进料管道(107)的一部分；
-一个原位传感器端口(130)，所述原位传感器端口安装有pH电极(101)；以及
-供应端口区域(133)，所述供应端口区域包括所述喷射器气体入口和所述至少一个进料管线(118)的所述入口，
其中所述培养容器(105)和所述反应器顶板(104)两者都基本由非金属材料制成，
其特征在于，所述小体积生物反应器包括原位葡萄糖传感器。
实施例2：根据独立方面所述的小体积生物反应器，其中所述小体积生物反应器为一次性小体积生物反应器。
实施例3：根据独立方面和实施例2所述的小体积生物反应器，其中所述小体积生物反应器为经辐射灭菌的小体积生物反应器。
实施例4：根据独立方面或实施例2至3中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述小体积生物反应器为经灭菌的小体积生物反应器，并已使用辐射经过两次灭菌。
实施例5：根据独立方面或实施例3至4中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述辐射为β辐射或/和γ辐射。
实施例6：根据实施例4所述的小体积生物反应器，其中第一辐射为β辐射，并且第二辐射为γ辐射，或反之亦然。
实施例7：根据独立方面或实施例2至6中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述葡萄糖传感器为涂覆有固定化酶的丝网印刷电极。
实施例8：根据独立方面或实施例2至7中任一项所述的小体积生物反应器，其中葡萄糖传感器基材为USP VI类聚合物。
实施例9：根据独立方面或实施例2至8中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述葡萄糖传感器每20秒确定一次葡萄糖浓度和/或确定所述葡萄糖浓度的变化。
实施例10：根据独立方面或实施例2至9中任一项所述的小体积生物反应器，其中确定的葡萄糖浓度值无线地或通过缆线从所述葡萄糖传感器传输到计算机。
实施例11：根据独立方面或实施例2至10中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述反应器顶板(104)进一步包括采样端口(102)。
实施例12：根据独立方面或实施例2至11中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述原位葡萄糖传感器在所述供应端口区域(133)中或在所述供应端口区域处通过所述顶板(104)。
实施例13：一种使用根据独立方面或实施例2至12中任一项所述的小体积生物反应器培养哺乳动物细胞的方法。
实施例14：一种使用根据独立方面或实施例2至12中任一项所述的小体积生物反应器确定培养条件的方法。
一般定义
如本文所用，术语“抗体”表示由大致由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。抗体能以多种形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双体或三体，如单价、二价、三价、四价、五价和六价形式，以及单特异性、双特异性、三特异性或四特异性抗体。
“多肽”是由通过肽键接合的氨基酸组成的聚合物，无论是天然产生的还是合成产生的。少于约20个氨基酸残基的多肽可称为“肽”，而由两种或多种多肽组成或包含一种超过100个氨基酸残基的多肽的分子可称为“蛋白质”。多肽还可包含非氨基酸组分，诸如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可由产生多肽的细胞添加，并且可随着细胞的类型而变化。多肽在本文中根据它们的氨基酸骨架结构或编码其的核酸来定义。诸如碳水化合物基团之类的加成通常未指定，但仍然可能存在。
术语“原位”传感器表示已与培养基直接物理接触的传感器。
根据本发明的小体积生物反应器的实施例
市售的一次性小体积生物反应器(SUSVB)提供了最多控制温度、溶解氧和pH值的装置，其中只有pH值由原位传感器控制。此外，这些SUSVB具有用于添加营养物或修正液的端口以及采样能力。然而，由于顶板(104)的直径/尺寸和面积有限，因此无法使用第二原位代谢物传感器。因此，如果例如，除了原位pH电极之外，还需要额外监测葡萄糖，这只能通过使用采样的离线分析来完成。
本发明人现已发现，通过将附加的葡萄糖传感器安装到与用于液体和气体供应管线的区域(即供应端口区域(133))相同的区域，可以提供包括两个原位传感器的可灭菌的SUSVB。
根据本发明在SUSVB中提供葡萄糖传感器允许葡萄糖浓度的连续原位确定。从而缓解了之前所需的用于确定葡萄糖的采样，即取样。SUSVB中葡萄糖传感器的存在允许实时(即没有时间偏移)确定葡萄糖浓度。从而能更密切地监测培养物的生长行为和代谢状态，即与利用采样相比能更早地采取修正措施。
特别有利的是，使用根据本发明的SUSVB，能在不干扰培养的情况下进行葡萄糖的确定，该培养是采样所需的。
因此，通过将原位葡萄糖传感器直接集成到SUSVB中，能避免以下一个或多个缺点：细胞密度较低；产物收率较低；环境变化，诸如二氧化碳、温度、pH搅动；代谢压力；已变基因表达；培养量的变化；最重要的是污染。
在一个实施例中，葡萄糖传感器每20秒确定一次葡萄糖浓度和/或葡萄糖传感器在葡萄糖浓度变化的情况下提供信号。在一个实施例中，确定的葡萄糖浓度值通过有线或无线传输到计算机。在一个实施例中，葡萄糖浓度的传输是通过Wi-Fi、RFID或蓝牙进行的。
通过存在于SUSVB中的葡萄糖传感器，现在可以在线控制葡萄糖浓度。
在一个实施例中，葡萄糖传感器具有最多至8g/l的葡萄糖或最多至3g/l的葡萄糖的工作范围。
在一个实施例中，葡萄糖传感器为电化学和/或基于酶的传感器。在一个实施例中，葡萄糖传感器为涂覆有固定化酶的丝网印刷电极。在一个实施例中，葡萄糖传感器基材为USP VI类聚合物。
USP VI类表示官方的美国药典(USP)生物相容性VI类。其中规定了对塑料材料为生物相容性的要求。VI类是符合与药物化合物上市注册相当的最严格要求的类别。这也在德国工业标准DIN-ISO-10993中进行了规定。
使用电化学和/或基于酶的传感器检测葡萄糖是基于由葡萄糖氧化酶对葡萄糖的氧化。葡萄糖氧化酶是催化葡萄糖C1残基的不依赖氧的氧化的酶。传感器检测由此产生的过氧化氢。
在一个实施例中，葡萄糖传感器为可γ辐照灭菌的。
在一个实施例中，整个葡萄糖传感器具有40mm至500mm的总长度。在一个优选实施例中，葡萄糖传感器具有75mm至350mm的总长度。在一个实施例中，葡萄糖传感器的电极或酶覆盖区域具有5mm至20mm的宽度。
在一个优选实施例中，SUSVB(也参见图1至图7)具有以下项中的一者或多者：
-工作体积，该工作体积为20ml至350ml、25ml至300ml、50ml至280ml、55ml至270ml、或95ml至255ml；
-搅拌器，该搅拌器包括搅拌器驱动轴，该搅拌器驱动轴配备用于微生物培养的两个Rushton叶轮(直径约20mm，间距约30mm)，或用于哺乳动物细胞培养的两个斜叶叶轮(直径约25mm，间距约30mm)；
-两个或四个等间距的挡板(宽约6.25mm)，该挡板放置在反应器的(垂直)侧壁上，并在容器的中心的方向(即垂直于培养容器的内壁)上延伸；
-电机(150rpm至3,000rpm；诸如无刷电动伺服电机)，该电机直接联接到搅拌器驱动轴，在一个优选实施例中，直流电动机(例如瑞士Maxon公司的RE-max 17系列)；
-具有管线的反应器顶板，该反应器顶板具有用于在地下添加气体和液体的无菌过滤器，以及用于排气的附加的出口；
-溶解氧传感器荧光贴片(例如来自PreSens公司)，该溶解氧传感器荧光贴片嵌入反应器的底部并由级联搅动和/或充气控制；一个优选实施例中，用快速响应(小于2s)dO2探头控制；测量间隔在10至15秒之间，在一个优选实施例中，约为12秒；
-凝胶电极，该凝胶电极使用高压灭菌前执行的三点校准和培养基添加后的单点校准来确定pH；
-液体填充的温度控制夹套；或温度控制金属块(在一个优选实施例中，由铝制成)；SUSVB可以定位在其上；
-一个控制站，该控制站包含用于溶解氧传感器和温度探头的荧光读数器、用于氧气(例如电化学检测器)和二氧化碳(例如红外检测器)的排气分析的独立传感器；SUSVB可以定位在其上；
-容器壁的底部的锯齿状区段，该锯齿状区段用于测量温度；
-温度控制(夹)板(6℃)，该温度控制板适用于针对排气湿度控制的顶板的设计；
-具有独立泵(例如，注射泵)的最多至四个液体进料装置(例如，用于pH控制试剂(酸和碱)、营养物)，该液体进料装置允许单次推注型添加(例如，体积为10μL至10mL)，连续进料(例如，具有不同的分布，例如线性分布或指数分布；流速为20nL/h至20mL/h)；在一个优选实施例中，约150μL/h；
-喷射管(用于输送气体(空气))；该管可具有开口管道配置，由此气体出口直接位于底部叶轮下方；
-顶部空间气体入口，该顶部空间气体入口用于向培养基顶部空间加气；
-可多配置的入口气体歧管(例如，用于混合空气、纯空气、氧气、氮气、二氧化碳)，该可多配置的入口气体歧管包括用于每个气流的气动脉冲阀(以控制组成/共混)；1s周期，最小脉冲时间为20ms(用于控制气体脉冲的持续时间和间隔)；脉冲阀下游的质量流量传感器允许流量范围为0.0013mL/min至550mL/min。
下表描述了不同反应器大小的几何形状(转载自Bareither,R.等人，Biotechnol.Bioeng.110(2013)3126-3138；表II)。
Figure BDA0003725456100000101
Figure BDA0003725456100000102
Figure BDA0003725456100000111
合适的SUSVB应具有至少相等的HL/Di和DT/Di比率、叶轮间距以及用于大型发酵罐的挡板。输入功率应在0.01kW/m3至0.4kW/m3的范围内，并且kLa值应在1 1/h至15 1/h的范围内。溶解氧应控制在20％或更高的空气饱和度，而溶解二氧化碳(CO2)含量应在35mmHg至80mmHg的范围内。温度应控制在32℃至38℃的范围内，并且pH值在pH 6.8至pH 7.2的范围内。进料量应在20pg/细胞/天至90pg/细胞/天的范围内，并且应提供用于进料控制的自动化和不同的进料策略(线性斜坡型添加、指数型添加、恒定型添加、推注型添加)。实现并行处理和采样的工作体积应在20ml至300ml的范围内，优选在60ml至255mL的范围内，以用于开发和产物质量分析。SUSVB应允许由传感器触发营养物添加或经由pH stat或dO stat进料。
通常，对于表达单克隆抗体的CHO细胞系的进料分批培养，例如CHO K1细胞系，可以使用任何培养基，诸如商业CD-CHO培养基或任何其他无血清培养基。使用标准条件进行接种，诸如接种细胞密度为2x105活细胞/mL。SUSVB能用摇瓶种菌培养接种(例如，来自加湿培养器，36.5℃，5％CO2；在生长期每3到4天扩大一次并且高于1x106活细胞/mL)。pH应控制在约pH 6.9至约pH 7.1(1摩尔的碳酸氢钠溶液为碱，CO2为酸)，温度应控制在约36.5℃，dO2应控制在在约30％的空气饱和度，搅动应控制在特定的功率输入，并且应设置用于CO2剥采的最小空气喷射率，诸如0.0125vvm。可基于传感器读数或基于固定的进料方案，例如在第4、6、8以及11天添加多种营养物进料溶液。进料溶液不应超过预定体积，诸如工作体积的5％。应例如通过添加浓缩的葡萄糖溶液，例如40mmol/L来规避葡萄糖限制。如果需要，可添加消泡剂。对于分析，在固定时间点，例如每天移除样品以测定细胞活性、葡萄糖、乳酸、渗透压、pH，而溶解气体(dO2，dCO2)例如用血气分析仪离线确定。
通常，可使用根据本发明的SUSVB，该SUSVB可用于
-确定发酵条件；
-确定生物工艺参数。
通常，在一个优选实施例中，此类一次性小体积生物反应器(SUSVB)至少部分地由非金属、非玻璃、聚合材料制成。如US 9,938,493(通过援引以其整体并入本文)中所公开的，已知的细胞培养容器由多层构成，其中内层(即与细胞培养接触的层)由聚合物材料制成。通常至少该层由聚乙烯(PE)或醋酸乙烯酯(EVA)组成。
如本文所用，可以互换使用的术语“一次性细胞培养容器”和“一次性小体积生物反应器(SUSVB)”表示具有300mL或更小的工作体积的细胞培养容器，由用于培养用于生产生物材料的哺乳动物细胞或细菌细胞的单层或多层聚合物材料制成。根据本发明使用的细胞培养容器或小体积生物反应器可以为任何形状。如本文中所用，术语“一次性”表示细胞培养容器或小体积生物反应器仅用于培养细胞一次。这并不意味着细胞培养容器或小体积生物反应器在使用前被灭菌了不止一次。因此，在用培养基或细胞填充细胞培养容器或小体积生物反应器之前，用杀灭微生物的辐射，例如β-或γ-辐射对其进行处理。需进行以上操作以杀灭设备内存在的所有微生物，这些微生物会干扰和影响培养细胞的生长。
在一个实施例中，通过在应用灭菌辐射之前，用惰性气体处理容器或SUSVB来防止在根据本发明的使用无血清培养基在一次性细胞培养容器或SUSVB中培养哺乳动物细胞时出现迟滞期的延长。在一个实施例中，一次性细胞培养容器或SUSVB至少部分地由聚合物材料制成。在一个实施例中，灭菌辐射是β辐射或γ辐射。
实验结果
在下文中，概述了使用根据本发明的示例性SUSVB获得的实验结果。这些实验结果仅作为示例而呈现，不应被解释为限制。本发明的真实范畴在所附权利要求书中阐述。
已对根据本发明的包括原位葡萄糖传感器的SUSVB与不具有附加葡萄糖传感器(即具有单个原位传感器)的标准SUSVB进行了比较。各个实验汇总于下表中。
执行 克隆 条件 原位葡萄糖传感器
RE01 P199 标准 无
RE02 P199 1g/L的葡萄糖 低血糖传感器
RE04 P199 5g/L的葡萄糖 高血糖传感器
RE05 P438 标准 无
RE06 P438 1g/L的葡萄糖 低血糖传感器
RE07 P438 3g/L的葡萄糖 低血糖传感器
RE08 P438 5g/L的葡萄糖 高血糖传感器
RE09 P465 标准 无
RE10 P465 1g/L的葡萄糖 低血糖传感器
RE12 P465 5g/L的葡萄糖 高血糖传感器
RE01/RE05/RE09分别是10天培养，使用小体积生物反应器进行离线葡萄糖分析，即仅使用一个原位传感器，用β辐射灭菌一次。这些是比较实验。
RE02/RE04/RE06/RE07/RE08/RE10/RE12分别是16天培养，使用根据本发明的SUSVB，即使用两个原位传感器，用β辐射和γ辐射灭菌两次。
在根据本发明的SUSVB中使用了两种不同的原位葡萄糖传感器：高葡萄糖传感器和低葡萄糖传感器。两种传感器类型的差异在于传感器上的膜层类型不同。该差异导致传感器中葡萄糖对酶的扩散时间不同。
RE02/06/07/10均使用低血糖传感器，测量范围为0g/L至3g/L。RE04/08/12均使用高血糖传感器，测量范围为0g/L至8g/L。
进料1(包含葡萄糖)于第9天在容器RE02/04/06/07/08/10/12中停止，以将葡萄糖水平降低到葡萄糖传感器的测量范围，从而经由传感器开始葡萄糖控制。
RE02获得的示例性葡萄糖曲线如图8所示。绿色曲线为用原位传感器确定的葡萄糖浓度。绿色曲线的每个陡峭梯度(4月30日星期二；5月6日星期一；5月9日星期四)为传感器的重新校准步骤。可以看出，葡萄糖传感器示出了低漂移。10天内无需重新校准。红线为进料葡萄糖溶液的累积体积/量。粉线表示葡萄糖溶液进料泵的动作时间/流速。在圈出的时间点进行不含葡萄糖的推注进料。在第9天，停止同样含有葡萄糖的进料1的进行。黑点表示通过采样和Cedex BioHT离线分析获得的对照葡萄糖值。
如本文中所报告的一个方面是用于培养动物细胞的SUSVB。在一个实施例中，SUSVB包括：
a)根据本发明的一次性小体积培养容器，该一次性小体积培养容器适用于接收培养基和将在其中培养的动物细胞；
b)搅拌器系统；
c)葡萄糖传感器；
d)培养容器底部的气体入口；以及
e)至少一个入口，该入口用于添加修正溶液和/或进料溶液。
如本文中所报告的一个方面是一种用于产生多肽，尤其是抗体的方法，该方法包括以下步骤：
a)在根据本发明的SUSVB中培养包含编码多肽的核酸的细胞；
b)从培养基或细胞回收多肽；以及
c)任选地纯化多肽从而产生多肽。
如本文中所报告的一个方面是一种用于培养动物细胞或细菌细胞的方法，其特征在于，动物细胞或细菌细胞在如本文所报告的SUSVB中培养，任选地从而产生产物。
如本文中所报告的一个方面是SUSVB用于产生多肽或抗体或病毒的用途。
在一个实施例中，当搅拌器系统放置在培养容器中时，叶轮的直径d与SUSVB的直径D的比率在0.2和0.8之间的范围内，在另一实施例中，在0.3和0.6之间的范围内，在进一步的实施例中，在0.31和0.39之间的范围内，或还在一个实施例中，约为0.34。在进一步的实施例中，轴向输送叶轮的搅拌器叶片的螺距相对于轴线在10°和80°之间，在另一实施例中在24°和60°之间，或在进一步的实施例中在40°和50°之间。在一个实施例中，所有的叶轮都具有0.32至0.35的输送元件的直径d与培养容器的直径D的比率。
在一个实施例中，纯化为多级色谱分析工序。在另一实施例中，纯化包括亲和色谱分析、阳离子交换色谱分析以及阴离子交换色谱分析。
在一个实施例中，培养为半连续培养。
在一个实施例中，多肽为抗体或抗体衍生物。
在一个实施例中，培养基为水性培养基，适用于原核细胞和真核细胞的培养。在另一实施例中，培养基为牛顿液体。在一个实施例中，搅拌器系统在0.01W/kg至1W/kg的输入功率运行。在进一步的实施例中，搅拌器系统在0.04W/kg至0.5W/kg的输入功率运行。在再一实施例中，由搅拌器系统在培养基中引起的流动为湍流。在另一实施例中，培养基具有3mPas*s或更小的粘度。在另一实施例中，粘度为2mPas*s或更小。
在一个实施例中，SUSVB为浸没式经加气的搅拌槽反应器。
在另一实施例中，动物细胞为哺乳动物细胞。在再进一步的实施例中，细胞为CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、COS细胞、PER.C6细胞、Sp2/0细胞、HEK 293细胞或杂交瘤细胞。
为了实现高产物滴度和良好的产物质量，根据本发明的SUSVB的操作模式还在例如细胞系开发、培养基组成以及SUSVB的尺寸确定方面也具有重要作用。
可区分操作分批模式或分批工序、分批进料或进料工序、具有或不具有细胞保留的连续工序(例如灌注或恒化)以及半连续工序，诸如内部或外部分析。
SUSVB具有上部、中部和下部，其中SUSVB的纵轴从上部的中间或中心延伸至下部的中间或中心。
当垂直于纵轴观察时，SUSVB具有大致圆形的横截面。上部区段和下部区段的直径可以相同，或者下部区段的直径可以小于上部区段的直径。
SUSVB的上部可进一步包括排气出口装置和/或一个或多个入口装置。
SUSVB的下部可进一步包括一个或多个液体介质入口装置和/或气体入口装置。
至少SUSVB的下部或中部可进一步包括安装到培养容器的外壁的热交换夹套。
搅拌器系统的输送元件通过轴设置为旋转，该轴联接到用于引起其旋转的合适的机构。轴沿SUSVB的纵轴延伸，因此，轴具有垂直定向的旋转轴线。轴不延伸至SUSVB底部，而是延伸至SUSVB底部上方的某个点，并且还远高于处于SUSVB底部的任选的气体喷射器。轴通过合适的联接机构可操作地联接到驱动轴。除了用于将轴联接到驱动轴的装置之外，轴还可以包括用于将叶轮分别联接到轴的其他装置。一旦搅拌器系统浸没在培养基中，搅拌器系统的叶轮通常在处于/将低于SUSVB中培养基的表面的位置联接到轴。当培养基为静态(即未被循环时)确定该表面。
在一个实施例中，根据本发明的SUSVB是具有挡板的SUSVB。在另一实施例中，根据本发明的SUSVB包括两个或四个挡板。“挡板”表示在与轴线相同的方向上放置在培养容器内并朝向搅拌器径向延伸至培养容器中的板。挡板的形状通常为矩形。在一个实施例中，挡板放置在距SUSVB的内壁的距离bd处。在另一实施例中，挡板围绕SUSVB内部的圆周以彼此相等的距离间隔开。
SUSVB部件的尺寸被确定为使部件能够发挥其预期功能(即SUSVB可容纳培养基)，并且搅拌器系统可混合培养基并分散添加的化合物。因此，搅拌器系统具有允许在SUSVB内不受阻碍地旋转的直径。
使用本文中报告的SUSVB，可进行高细胞密度培养，例如灌注培养。
在一个实施例中，培养以搅拌器系统的转速进行，以该转速可实现对培养基的雷诺数独立的恒定功率输入，即在培养期间提供培养容器中的湍流培养基流。使用根据本发明的SUSVB，能以搅拌器系统的低转速培养对剪切敏感的哺乳动物细胞。
SUSVB的培养容器的形式不受限制。在一个实施例中，培养容器为圆柱形容器。在另一实施例中，培养容器为搅拌槽反应器状容器。培养容器可具有任何尺寸。在一个实施例中，培养容器具有20ml至350ml，在一个优选实施例中，55ml至265ml的工作体积。
通常，浸没式经加气的培养容器用于细胞培养。在这些情况下，主要使用一级或二级或三级轴向输送搅拌器系统。在使用一级或二级轴向输送搅拌器系统的情况下，会生成大致平行于所用搅拌器的旋转轴的流动分布。
在一个实施例中，搅拌器包括1至5个轴向输送元件，或在另一实施例中，1至3个轴向输送元件，或还在一个实施例中，1或2个轴向输送元件或甚至仅单个轴向输送元件。在一个实施例中，一个轴向输送元件位于从搅拌器头部确定的搅拌器轴的上部五分之四，并且到搅拌器头部的最大距离为h4/5。在另一实施例中，一个轴向输送元件位于0.8h的最大距离处和/或一个轴向输送元件位于0.2h的最大距离处。在进一步的实施例中，轴向输送元件一起形成单个元件。在一个实施例中，所有轴向输送元件的直径是相同的。在另一实施例中，轴向输送元件彼此独立地选自螺旋桨式搅动器、斜叶式搅动器或倾斜叶片式搅动器。
在进一步的实施例中，当搅拌器在SUSVB中运行时，所有输送元件以每单位时间围绕搅拌器的轴线以相同的转数旋转。在一个实施例中，输送元件永久地连接在一起并且搅拌器由一个部分组成，即所有元件由相同的旋转轴驱动并以每单位时间围绕搅拌器的轴线具有相同的转数。
搅拌器直径(d)与培养容器直径(D)的比率d/D在一个实施例中为0.2至0.8，在另一实施例中为0.3至0.6，并且在进一步的实施例中为0.33至0.5。在另一实施例中，叶片高度(h)与搅拌器直径(d)的比率h/d为0.5至5，在另一实施例中为1至4，并且在进一步的实施例中为1至3。在再进一步的实施例中，叶轮叶片宽度(b)与搅拌器直径(d)的比率b/d为0.05至0.3，在另一实施例中为0.1至0.25。
术语“从…到”表示包括所列边界值的范围。
在一个实施例中，搅拌器直径(d)选自5mm、6mm、7mm、8mm、10mm、12mm、14mm、16mm、18mm以及20mm。
在一个实施例中，叶轮叶片宽度(b)选自0.42mm、0.60mm、0.89mm、1.08mm、1.33mm。
在一个实施例中，一个径向输送元件为锚叶轮。
术语“约”表示给定值为范围的中心点，该范围跨越该值的正负10％。如果该值是百分比值，则“约”表示，也指正/负10％，但值不能超过100％。
在一个实施例中，轴向输送元件为倾斜叶片叶轮。
轴向输送元件的高度和/或径向输送元件的叶片的宽度的比率hSB/b为0.5至4，在另一实施例中为0.8至3，并且在进一步的实施例中为1至2。在另一实施例中，倾斜叶片叶轮的搅拌器叶片的螺距相对于搅拌器的轴线为10°至80°，在进一步的实施例中为24°至60°，并且还在一个实施例中为40°至50°。
在一个实施例中，径向输送元件具有1至8个叶片，在另一实施例中具有1至4个叶片，并且在进一步的实施例中具有4个叶片。轴向输送元件在一个实施例中具有1至10个叶片，在另一实施例中具有2至6个叶片，并且在进一步的实施例中具有4个叶片。在另一实施例中，径向输送元件和轴向输送元件具有相同数量的叶片。
在一个实施例中，搅拌器具有20mm至500mm的高度。
在一个实施例中，搅拌器和SUSVB形成功能单元(即搅拌器位于SUSVB的培养容器内)并且能在培养容器内不受任何空间限制地旋转。
在一个实施例中，根据本发明的SUSVB为搅拌槽反应器状SUSVB。
在进一步的实施例中，培养容器为充气式或浸没式经加气的搅拌反应器状容器。
在一个实施例中，培养容器包括2个(114，126)或4个挡板(114，126，125，128)。在另一实施例中，挡板围绕培养容器的内表面的圆周以彼此相等的距离间隔开。
搅拌器直径(d)与培养容器直径(D)的比率d/D在一个实施例中为0.2至0.8，在另一实施例中为0.3至0.6，并且在进一步的实施例中为0.33至0.5。在另一实施例中，培养容器的填充高度(H)与培养容器直径(D)的比率H/D为1.0至2.5，在进一步的实施例中为1.1至2.0，并且在进一步的实施例中为1.4至1.8。在一个实施例中，培养容器具有20ml至350ml的工作体积。
在一个实施例中，两个轴向输送元件的高度差(Δh)与培养容器直径(D)的比率至少为0.75。
提供以下实例、序列和附图来辅助理解本发明，本发明的真实范畴在所附权利要求书中阐述。应当理解，在不脱离本发明精神的前提下，可对阐明的程序进行修改。
缩写：
本申请中使用的缩写具有以下含义(另参见图12)：
b：径向输送元件的叶片的宽度
d：搅动器总外径
dw：轴径
h：径向输送元件的搅拌器叶片的高度
hm：紧固套的高度
hSB：轴向输送元件的高度
hu：减速器的高度
Δh：两个轴向输送元件的高度差
l：轴向输送元件的搅拌器叶片的长度
α：轴向输送元件的叶片的叶片螺距
z：每个搅拌器的搅拌器叶片数
di：径向输送元件的搅拌器叶片之间的内部距离
h4/5：h上方的4/5高度
K：搅拌器头，即搅拌器未附接到旋转轴时的搅拌器的最高点
D：培养容器内径
H：培养容器的填充高度。
附图说明
图1：根据本发明的包含葡萄糖传感器(111)的示例性一次性小体积生物反应器(SUSVB)的侧视图。
图2：根据本发明的带有尺寸和体积注释的示例性SUSVB的侧视图。
图3：根据本发明的示例性SUSVB的俯视图，示出了装配到供应端口区域(133)的葡萄糖传感器(111)。
图4：根据本发明的包含葡萄糖传感器(111)的示例性SUSVB的俯视图。
图5：根据本发明的包括葡萄糖传感器(111)的SUSVB的部分的放大图。
图6：根据本发明的包括嵌入培养基(129)中的葡萄糖传感器(111)的示例性SUSVB的下部的侧视图。
图7：示例性葡萄糖传感器(111)的示意图。
图8：在线确定的葡萄糖浓度(绿线)、离线确定的葡萄糖浓度(黑色实心圆圈)的时间图；附加培养RE02的葡萄糖溶液体积(红线)和葡萄糖泵动作(紫线)。
图9：在线确定的葡萄糖浓度(绿线)、离线确定的葡萄糖浓度(黑色实心圆圈)的时间图；附加培养RE06的葡萄糖溶液体积(红线)和葡萄糖泵动作(紫线)。
图10：在线确定的葡萄糖浓度(绿线)、离线确定的葡萄糖浓度(黑色实心圆圈)的时间图；附加培养RE10的葡萄糖溶液体积(红线)和葡萄糖泵动作(紫线)。
图11：发酵RE01至RE02和RE04至RE12的抗体浓度的时间图。
图12：根据本发明的组合搅拌器的各种实施例的示意图；b：搅拌器叶片的宽度；d：搅拌器直径；dw：旋转轴直径；h：径向输送搅拌器的搅拌叶片的高度；hm：紧固套筒的高度；hSB：轴向输送搅拌器的高度；hu：减速器的高度；l：轴向输送搅拌器的搅拌叶片的长度；α：轴向输送搅拌器的叶片螺距；z：每个搅拌器的搅拌器叶片数；di：径向输送搅拌器的搅拌器叶片之间的内部距离；h4/5：h上方的4/5高度；K：搅拌器头
实例1
用于RE01至RE12的培养条件
以在170ml的总体积中约1.5*10E7个细胞/ml的起始细胞密度进行培养。培养基为化学成分确定的无血清培养基。培养温度设置为35℃，加气速率设置为5至5.5ml/min，搅动速率设置为450至500rpm，并且pH设置为pH 7。通过以最大的加气速率添加1M的碳酸钠溶液或CO2来进行PH控制。消泡剂在培养初期和培养期间根据需要添加。以预定速率连续添加含有葡萄糖的进料1，直到停止。在第1、3和6天添加不含葡萄糖的进料2作为推注进料。
在使用根据本发明的原位葡萄糖传感器的培养中，一旦确定的原位葡萄糖浓度降至阈值以下，则在进料1结束后开始依赖于传感器的葡萄糖进料(进料3)。在该工序期间降低了阈值。
图8至图10示出了示例性培养图，并且图12描绘了产物浓度分布。

Claims (14)

1.一种小体积生物反应器，所述小体积生物反应器包括：
培养容器(105)，所述培养容器
-具有20ml至350ml的工作体积，
-包括固定有至少一个叶轮(112)的搅拌器轴(108)，
-包括进料管道(107)，所述进料管道包括i)在其端部连接到喷射器(127)的喷射管，和ii)在其端部具有开口的至少一个进料管线(118)，
-包括两个或更多个挡板(114；126)，所述挡板在朝向所述培养容器(105)的中心的方向上从所述培养容器(105)的壁垂直延伸；以及
-反应器顶板(104)，
其中所述反应器顶板(104)包括：
-接头(122)，所述接头用于将电机的驱动轴连接到所述搅拌器轴(108)；
-喷射器气体入口(116)，所述喷射器气体入口连接到所述进料管道(107)中的所述喷射管，任选地为连接到顶部空间(132)的气体入口；
-气体出口(117)，所述气体出口连接到所述培养容器的所述顶部空间；
-进料管线(118)的用于液体的至少一个入口，所述进料管线为所述进料管道(107)的一部分；
-一个原位传感器端口(130)，所述原位传感器端口安装有pH电极(101)；以及
-供应端口区域(133)，所述供应端口区域包括所述喷射器气体入口和所述至少一个进料管线(118)的所述入口，
其中所述培养容器(105)和所述反应器顶板(104)两者都基本由非金属材料制成，
其特征在于，所述小体积生物反应器包括原位葡萄糖传感器。
2.根据权利要求1所述的小体积生物反应器，其中所述小体积生物反应器为一次性小体积生物反应器。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述小体积生物反应器为经辐射灭菌的小体积生物反应器。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述小体积生物反应器为经灭菌的小体积生物反应器，并已使用辐射经过两次灭菌。
5.根据权利要求3至4中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述辐射为β辐射或/和γ辐射。
6.根据权利要求4所述的小体积生物反应器，其中第一辐射为β辐射，并且第二辐射为γ辐射，或反之亦然。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述葡萄糖传感器为涂覆有固定化酶的丝网印刷电极。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的小体积生物反应器，其中葡萄糖传感器基材为USP VI类聚合物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述葡萄糖传感器每20秒确定一次葡萄糖浓度和/或确定所述葡萄糖浓度的变化。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的小体积生物反应器，其中确定的葡萄糖浓度值无线地或通过缆线从所述葡萄糖传感器传输到计算机。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述反应器顶板(104)进一步包括采样端口(102)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的小体积生物反应器，其中所述原位葡萄糖传感器在所述供应端口区域(133)中或在所述供应端口区域处通过所述顶板(104)。
13.一种使用根据权利要求1至12中任一项所述的小体积生物反应器培养哺乳动物细胞的方法。
14.一种使用根据权利要求1至12中任一项所述的小体积生物反应器确定培养条件的方法。
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