KR20220120582A - 하나 이상의 인시튜 온라인 센서를 갖는 일회용 세포 배양 용기 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에서는 배양 용기 및 반응기 헤드 플레이트를 포함하는 소체적 생물 반응기가 보고되고, 여기서 배양 용기는 20 ml 내지 350 ml의 작업 체적을 갖고 2개 이상의 인시튜 센서를 포함하고, 여기서 반응기 헤드 플레이트는 인시튜 센서 포트를 포함하고, 여기서 인시튜 센서 포트에 적어도 하나의 인시튜 포도당 센서 및 하나의 인시튜 pH 센서가 연결된다.

Description

하나 이상의 인시튜 온라인 센서를 갖는 일회용 세포 배양 용기
본 발명은 포유동물 세포 배양 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 특히 1개 이상, 특히 2개 이상의 인시튜 센서를 포함하는, 일회용 소체적 생물 반응기(SUSVB)라고도 하는 일회용 소체적 세포 배양 용기, 뿐만 아니라 포유동물 세포의 소체적 배양에서의 사용에 관한 것이다.
생물제제 및 백신을 위한 생물공정 개발의 가속화는 자동화된 고처리량 기술에 의해 가능하게 될 수 있으며, 이는 복잡한 생물제제의 제품 품질 속성을 제어하는 데 필요한 다중 요인 통계 실험에서 상당한 자원 부담을 완화시킬 수 있다(Bareither, R., 등, Biotechnol. Bioeng. 110 (2013) 3126-3138).
최근, Bareither, R., 등은 CHO 세포 배양, 피히아 파스토리스 및 대장균을 사용하여 치료 단백질 및 모노클로날 항체 생산을 위한 산업 생물학적 공정에 대한 공정 성능과 관련하여 실험실 및 파일럿 스케일의 것들과 유사한 소규모 교반 탱크 일회용 250 ml 반응기를 확립함으로써 고 처리량 업스트림 프로세스 개발을 위한 자동화된 일회용 소규모 반응기의 개념 평가의 증명을 제공했다(Biotechnol. Bioeng. 110 (2013) 3126-3138). 여기에는 유사한 성장, 세포 생존율, 제품 역가, 및 제품 품질이 포함되었다. 이 기술은 여러 실행에 걸쳐 강력한 것으로 나타났으며, 지수 공급 및 정교한 이벤트 트리거 프로세스를 사용하여 높은 세포 밀도 프로세스(>400g/L 습식 세포 중량)를 실행할 수 있는 능력에 대한 요구 사항을 충족했다.
일회용 세포 배양 용기는 예를 들어 Sartorius Stedim Biotech에서 판매하는 ambr® 15 및 250 시스템과 같이 당업계에 잘 알려져 있다.
US 2019/048305는 관류 생물 반응기 및 이를 사용하여 연속 세포 배양을 수행하는 방법을 보고했으며, 여기서 반응기는 여기에 단일 센서(254)가 장착된 단일 센서 포트(240)를 포함한다.
US 2019/153381은 관류 생물 반응기 및 관련 사용 방법을 보고했으며, 여기서 반응기는 헤드스페이스의 RAMAN 센서, 즉, 배양 배지 비접촉 센서를 하나의 감지 요소로 포함한다.
US 8,026,096은 2리터 이상의 작업 체적의 생물 반응기를 사용하여 곤충 세포에서 생성된 생체내 활성 에리트로포이에틴을 보고했다.
상업적으로 이용 가능한 일회용 소체적 생물 반응기(SUSVB)는 기껏해야 온도, 용존 산소 및 pH 제어를 제공하며, 피드 첨가(들) 및 샘플링을 위한 기능만을 갖는다. 그러나 제2 인시튜, 즉, 배양 배지와 직접 접촉하는 대사 산물 센서에 대한 옵션은 없다. 따라서, 예를 들어 pH 제어 외에 포도당에 대한 추가 모니터링이 필요한 경우, 불가피하게 샘플링을 통한 오프라인 분석을 수행해야 한다. 이것은 무엇보다도 배양의 오염 위험뿐만 아니라 취급 노력도 증가시킨다.
현재 본 발명자들은, 본 발명에 따른 소체적 생물 반응기를 사용함으로써 분석 및 생물학적 공정 개발을 위한 타임라인이 단축될 수 있음을 발견하였다. 추가로, 비용을 절감할 수 있다. 이 모든 것은 이후의 대규모 프로세스와의 그리고 이후의 대규모 프로세스로의 이전 가능성을 잃지 않고 달성된다.
본 발명의 한 양태는 하나 이상의 인시튜 센서를 포함하는 소체적 생물 반응기이며, 여기서 적어도 하나의 인시튜 센서는 포도당의 측정을 위한 것이다.
본 발명의 한 양태는 소체적 생물 반응기이고,
- 배양 용기(105),
- 교반기 샤프트(108) 및 하나 이상의 임펠러(112; 109)를 포함하는 교반기,
- 제1 인시튜 센서로서의 전극 또는 전극 유형 센서,
- 가스 살포기(127),
- 반응기 헤드 플레이트(104)를 포함하고, 상기 반응기 헤드 플레이트는
- 모터의 구동축을 교반기 샤프트(108)(122)에 연결하기 위한 모터 피팅(103),
- 적어도 하나의 가스 주입구(116) 및 가스 배출구(117),
- 공급 포트 영역(133),
- 전극 또는 전극 유형 센서를 취하는 인시튜 센서 포트(130)를 포함하고,
소체적 생물 반응기는 제2 인시튜 센서를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다음은 이전에 요약된 모든 양태들의 실시예이다. 각 실시예와 다른 각 실시예 및 각 양태와의 조합은 기재하지 않더라도 마찬가지로 포함된다는 것이 명확히 언급된다.
하나의 바람직일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 2개 이상의 인시튜 센서를 포함하고, 여기서 하나의 인시튜 센서는 포도당 측정을 위한 것이고, 하나의 인시튜 센서는 pH 값의 측정을 위한 것이다. 하나의 바람직일 실시예에서, 두 센서 모두 침지된 센서인데, 즉 배양 배지와 직접 접촉한다.
일 실시예에서, pH 센서는 pH 전극이다.
일 실시예에서, 포도당 센서는 전기화학적 및/또는 효소 기반 센서이다.
하나의 바람직일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 2개 이상의 인시튜 센서를 포함하고, 여기서 하나의 인시튜 센서는 포도당의 측정용이고 하나의 인시튜 센서는 pH 값의 측정용이며, 여기서 pH 센서는 pH 전극이고 포도당 센서는 전기화학적 및/또는 효소 기반 센서이다. 하나의 바람직일 실시예에서, 두 센서 모두 침지된 센서인데, 즉 배양 배지와 직접 접촉한다.
일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 20 ml 내지 350 ml의 작업 체적을 갖는다. 일 실시예에서, 작업 체적은 25 ml 내지 300 ml이다. 일 실시예에서, 작업 체적은 50 ml 내지 280 ml이다. 일 실시예에서, 작업 체적은 55 ml 내지 270 ml이다.
일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 60 ml 내지 260 ml의 체적에서 작동된다. 일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 90 ml 내지 250 ml의 체적에서 작동된다.
일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 500 ml 이하의 총 체적을 갖는다. 일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 450 ml 이하의 총 체적을 갖는다. 일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 400 ml 이하의 총 체적을 갖는다.
일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 배양 용기(105) 및 반응기 헤드 플레이트(104)를 포함한다.
일 실시예에서, 적어도 2개의 인시튜 센서는 적어도 포도당 또는 락테이트 센서 및 pH 센서를 포함한다.
일 실시예에서, 공급 포트 영역은 개별 공급 라인(118, 119, 120, 121) 및 선택적으로 살포기 가스 주입구(116)에 연결된 액체를 위한 1 내지 4개의 주입구를 포함한다.
일 실시예에서 2개의 임펠러(109, 112)는 교반기 샤프트에 연결된다.
일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 적어도 (i) 하나의 살포기 가스 주입구(116) 및 (ii) 하나의 헤드스페이스 가스 주입구(132)를 포함한다.
일 실시예에서, 포도당 센서는 20초마다 포도당 농도를 측정하고 및/또는 포도당 센서는 포도당 농도의 변화가 있는 경우 신호를 제공한다. 일 실시예에서, 측정된 포도당 농도 값은 유선 또는 무선으로 컴퓨터에 전송된다. 일 실시예에서, 포도당 농도의 전송은 WI-FI, RFID 또는 블루투스에 의한 것이다. 일 실시예에서, 포도당 센서는 최대 8g/l 포도당 또는 최대 3g/l 포도당의 작동 범위를 갖는다. 일 실시예에서, 포도당 센서는 전기화학적 및/또는 효소 기반 센서이다. 일 실시예에서, 포도당 센서는 고정된 효소로 코팅된 스크린 인쇄 전극이다. 일 실시예에서, 포도당 센서 기반 물질은 중합체 USP 등급 VI이다.
일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 일회용 생물 반응기이다.
일 실시예에서, 배양 용기(105) 및 반응기 헤드 플레이트(104)는 비금속 재질로 제조된다. 일 실시예에서, 배양 용기(105) 및 반응기 헤드 플레이트(104)는 플라스틱(으로 제조)이다.
일 실시예에서, 반응기 헤드 플레이트(104)는 샘플링 포트(102)를 더 포함한다.
일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 멸균 가능하다.
일 실시예에서, 소체적 생물 반응기는 방사선 멸균된 소체적 생물 반응기이다. 일 실시예에서 소체적 생물 반응기는 2회 방사선 멸균된 소체적 생물 반응기이다. 일 실시예에서, 방사선은 베타 및/또는 감마 방사선이다.
발명의 상세한 설명
초기 바이오 치료제 생산과 달리, 최근에는, 항체와 같은 치료 단백질의 개발을 위해, 결정적인 파라미터는 제품 역가일 뿐만 아니라 부산물 프로파일 또는 글리코실화 프로파일/패턴과 같은(이에 제한되지 않음) 특정 제품 품질 속성이기도 한 것으로 받아들여졌다(예를 들어, Bareither, R. 및 Pollard, D., Biotech. Prog. 155 (2011) 217-224 참조).
따라서, 가능한 한 빨리 이러한 특성을 평가하고 엔지니어링할 필요가 있으며, 이는 이미 클론 선택 및 공정 개발 중에 가장 좋다. 또한, 이것은 비-시간 공정이 아니므로, 일반적으로 여러 병렬 반응기를 사용하여 연속적인 실험 라운드가 필요하다. 따라서, 이 방법은 높은 처리량에 적합해야 한다.
생태학적 및 경제적 제약으로 인해 대규모 배양은 공정 개발에 사용할 수 없다. 따라서, 나중에 상업적 (대형) 규모의 공정 및 공정 성능을 안정적으로 반영하는 것으로 입증된 적절한 축소 시스템이 사용된다.
본 발명에 따른 하나의 독립적인 양태는 소체적 생물 반응기에 관한 것으로서,
배양 용기(105)를 포함하고, 상기 배양 용기는
- 20ml 내지 350ml의 작업 체적을 갖고,
- 적어도 하나의 임펠러(112)가 부착된 교반기 샤프트(108)를 포함하고,
- i) 단부에서 살포기(127)에 연결된 살포 튜브, 및 ii) 단부에 개구를 갖는 적어도 하나의 공급 라인(118)을 포함하는 공급 파이프(107)를 포함하고,
- (배양 용기의 벽에 수직인) 배양 용기(105)의 중심 방향으로 배양 용기(105)의 벽으로부터 연장되는 2개 이상의 배플(114; 126), 및
- 반응기 헤드 플레이트(104)를 포함하고,
상기 반응기 헤드 플레이트(104)는
- 모터의 구동축을 교반기 샤프트(108)에 연결하기 위한 피팅(122),
- 공급 파이프(107)의 살포 튜브에 연결된 살포기 가스 주입구(116), 선택적으로 헤드스페이스(132)에 연결된 가스 주입구,
- 배양 용기(117)의 헤드스페이스에 연결된 가스 배출구,
- 공급 파이프(107)의 일부인 공급 라인(118)의 액체를 위한 적어도 하나의 주입구,
- pH 전극(101)이 장착된 하나의 인시튜 센서 포트(130), 및
- 살포기 가스 주입구 및 적어도 하나의 공급 라인(118)의 주입구를 포함하는 공급 포트 영역(133)을 포함하고,
상기 배양 용기(105) 및 반응기 헤드 플레이트(104)는 둘 다 실질적으로 비금속 재질로 제조되고,
상기 소체적 생물 반응기는 인시튜 포도당 센서를 포함하는 것을 특징으로 한다.
실시예 2: 독립적인 양태에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 상기 소체적 생물 반응기는 일회용 소체적 생물 반응기이다.
실시예 3: 독립적인 양태 및 실시예 2에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 상기 소체적 생물 반응기는 방사선 멸균된 소체적 생물 반응기이다.
실시예 4: 독립적인 양태 또는 실시예 2 내지 3 중 어느 하나에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 상기 소체적 생물 반응기는 멸균된 소체적 생물 반응기이고 방사선을 사용하여 2회 멸균되었다.
실시예 5: 독립적인 양태 또는 실시예 3 내지 4 중 어느 하나에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 상기 방사선은 베타 방사선 또는/및 감마 방사선이다.
실시예 6: 실시예 4에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 상기 제1 방사선은 베타 방사선이고 제2 방사선은 감마 방사선이거나 또는 그 반대이다.
실시예 7: 독립적인 양태 또는 실시예 2 내지 6 중 어느 하나에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 상기 포도당 센서는 고정화된 효소로 코팅된 스크린 인쇄 전극이다.
실시예 8: 독립적인 양태 또는 실시예 2 내지 7 중 어느 하나에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 상기 포도당 센서 기반 물질은 중합체 USP 등급 VI이다.
실시예 9: 독립적인 양태 또는 실시예 2 내지 8 중 어느 하나에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 상기 포도당 센서는 20초마다 포도당 농도를 측정하고 및/또는 포도당 농도의 변화를 측정한다.
실시예 10: 독립적인 양태 또는 실시예 2 내지 9 중 어느 하나에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 상기 측정된 포도당 농도 값은 포도당 센서에서 컴퓨터로 무선 또는 케이블로 전송된다.
실시예 11: 독립적인 양태 또는 실시예 2 내지 10 중 어느 하나에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 상기 반응기 헤드 플레이트(104)는 샘플링 포트(102)를 더 포함한다.
실시예 12: 독립적인 양태 또는 실시예 2 내지 11 중 어느 하나에 따른 소체적 생물 반응기에 있어서, 인시튜 포도당 센서는 공급 포트 영역(133) 내에서 또는 공급 포트 영역(133)에서 헤드 플레이트(104)를 통과한다.
실시예 13: 독립적인 양태 또는 실시예 2 내지 12 중 어느 하나에 따른 소체적 생물 반응기를 사용하여 포유동물 세포를 배양하는 방법.
실시예 14: 독립적인 양태 또는 실시예 2 내지 12 중 어느 하나에 따른 소체적 생물 반응기를 사용하여 배양 조건을 결정하는 방법.
일반 정의
용어 "항체"는 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드(들)로 구성된 단백질을 나타낸다. 인식된 면역글로불린 유전자에는 다양한 불변 영역 유전자와 수많은 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된다. 항체는 예를 들어 Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단일 사슬(scFv) 또는 디아바디 또는 트리아바디를 1가, 2가, 3가, 4가, 5가 및 6가의 형태로서, 뿐만 아니라 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성 또는 사중특이성 항체를 포함하는 다양한 형식으로 존재할 수 있다.
"폴리펩티드"는 천연 또는 합성 생산 여부에 관계없이 펩티드 결합으로 연결된 아미노산으로 구성된 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있는 반면, 2개 이상의 폴리펩티드로 구성되거나 100개 초과의 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩티드를 포함하는 분자는 "단백질"로 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 탄수화물기, 금속 이온 또는 카르복실산 에스테르와 같은 비아미노산 성분을 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 폴리펩타이드가 생성되는 세포에 의해 첨가될 수 있으며, 세포의 유형에 따라 달라질 수 있다. 폴리펩티드는 본 명세서에서 이들의 아미노산 골격 구조 또는 이를 코딩하는 핵산의 관점에서 정의된다. 탄수화물 그룹과 같은 추가는 일반적으로 지정되지 않지만 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
"인시튜" 센서라는 용어는 배양 배지와 물리적으로 직접 접촉하는 센서를 나타낸다.
본 발명에 따른 소체적 생물 반응기의 실시예
시판되는 일회용 소체적 생물 반응기(SUSVBs)는 최대 온도, 용존 산소 및 pH를 제어하는 수단을 제공하며, 여기서 pH 값만이 인시튜 센서에 의해 제어된다. 또한 이러한 SUSVBs에는 영양소 또는 수정액을 추가할 수 있는 포트와 샘플링 기능이 있다. 그럼에도 불구하고, 제2 인시튜 대사 산물 센서는 헤드 플레이트(104)의 제한된 직경/크기 및 면적으로 인해 사용할 수 없다. 따라서 예를 들어 인시튜 pH 전극 외에 포도당에 대한 추가 모니터링이 필요한 경우, 이것은 샘플링을 사용한 오프라인 분석을 통해서만 수행할 수 있다.
현재의 발명자들에, 액체 및 가스 공급 라인에 사용되는 것과 동일한 영역, 즉 공급 포트 영역(133)에 추가 포도당 센서를 장착함으로써, 2개의 인시튜 센서를 포함하는 멸균 가능한 SUSVB가 제공될 수 있다는 것이 가능한 것으로 발견되었다.
본 발명에 따른 SUSVB에 포도당 센서의 제공은 포도당 농도의 연속적인 인시튜 측정을 가능하게 한다. 따라서 포도당 측정을 위해 이전에 필요한 샘플링, 즉 샘플 채취가 완화된다. SUSVB에 포도당 센서가 있으면 시간 오프셋 없이 실시간으로 포도당 농도를 측정할 수 있다. 따라서 배양의 성장 거동과 대사 상태를 보다 면밀히 모니터링할 수 있는데, 즉, 샘플링보다 조기에 시정 조치를 취할 수 있다.
본 발명에 따른 SUSVB로 포도당의 측정이 샘플링에 의해 요구되는 배양을 방해하지 않고 이루어질 수 있다는 것이 특히 유리하다.
따라서, 인시튜 포도당 센서를 SUSVB에 직접 통합하여 다음 단점 중 하나 이상을 피할 수 있다: 낮은 세포 밀도; 낮은 제품 수율; 이산화탄소, 온도, pH 교반과 같은 환경 변화; 대사 스트레스; 변경된 유전자 발현; 배양량의 변화; 및 가장 중요하게는 오염.
일 실시예에서, 포도당 센서는 20초마다 포도당 농도를 측정하고 및/또는 포도당 센서는 포도당 농도의 변화가 있는 경우 신호를 제공한다. 일 실시예에서, 측정된 포도당 농도 값은 유선 또는 무선으로 컴퓨터에 전송된다. 일 실시예에서, 포도당 농도의 전송은 Wi-Fi, RFID 또는 블루투스에 의한 것이다.
SUSVB에 포도당 센서가 있으면, 이제 온라인으로 포도당 농도를 제어할 수 있다.
일 실시예에서, 포도당 센서는 최대 8g/l 포도당 또는 최대 3g/l 포도당의 작동 범위를 갖는다.
일 실시예에서, 포도당 센서는 전기화학적 및/또는 효소 기반 센서이다. 일 실시예에서, 포도당 센서는 고정된 효소로 코팅된 스크린 인쇄 전극이다. 일 실시예에서, 포도당 센서 기반 물질은 중합체 USP 등급 VI이다.
USP 등급 VI는 공식 USP(미국 약전) 생체 적합성 등급 VI를 나타낸다. 여기에서 생체 적합성 플라스틱 재료에 대한 요구 사항이 규제된다. 등급 VI는 제약 화합물 판매 등록에 필적하는 가장 엄격한 요구 사항을 가진 등급이다. 이는 독일 산업 표준 DIN-ISO-10993에서도 규제된다.
전기화학적 및/또는 효소 기반 센서를 사용한 포도당 검출은 포도당 산화효소에 의한 포도당 산화를 기반으로 한다. 포도당 산화효소는 포도당의 C1-잔기의 산소 비의존적 산화를 촉매하는 효소이다. 센서는 이로써 생성된 과산화수소를 감지한다.
일 실시예에서, 포도당 센서는 감마선 조사 멸균 가능하다.
일 실시예에서, 전체 포도당 센서는 40-500 mm의 전체 길이를 갖는다. 바람직한 일 실시예에서, 포도당 센서는 75 내지 350mm의 전체 길이를 갖는다. 일 실시예에서, 포도당 센서의 전극 또는 효소 덮인 영역은 5-20 mm의 폭을 갖는다.
하나의 바람직일 실시예에서, SUSVB(도 1 내지 도 7 참조)는 다음 중 하나 이상을 갖는다
- 20ml 내지 350ml, 25ml 내지 300ml, 50ml 내지 280ml, 55ml 내지 270ml, 또는 95ml 내지 255ml의 작업 체적
- 미생물 배양을 위한 2개의 러시턴 임펠러(직경 약 20mm, 간격 약 30mm), 또는 포유류 세포 배양을 위한 2개의 피치 블레이드 임펠러(직경 약 25mm, 간격 약 30mm)가 장착된 교반기 구동축을 포함하는 교반기;
- 반응기의 (수직) 측벽에 배치되고 용기의 중심 방향으로 연장되는, 즉 배양 용기의 내벽에 수직인 2개 또는 4개의 동일한 간격의 배플(약 6.25mm 폭);
- 교반기 구동축에 직접 연결된 모터(150 rpm 내지 3,000 rpm; 예를 들어 브러시리스 전기 서보 모터); 하나의 바람직일 실시예에서 전기 d.c. 모터(예를 들어, RE-max 17 시리즈, Maxon, 스위스);
- 기체와 액체의 표면 아래 추가를 위한 멸균 필터와 배기 가스를 위한 추가 배출구가 있는 튜빙 라인이 있는 반응기 헤드 플레이트;
- 반응기의 베이스에 내장되고 일련의 교반 및/또는 통기에 의해 제어되는 (예를 들어, PreSens 회사로부터의) 용존 산소 센서 형광 패치; 하나의 바람직일 실시예에서 빠른 응답(<2초) dO2 프로브; 측정 간격은 10초 내지 15초, 바람직한 일 실시예에서 약 12초임;
- 고압 증기 멸균 전에 수행된 3점 교정 및 배지 첨가 후 1점 교정을 사용하여 pH 측정을 위한 겔 전극;
- 액체로 채워진 온도 조절 재킷; 또는 온도 조절 금속 블록(하나의 바람직일 실시예에서 알루미늄으로 제조됨); SUSVB는 그 위에 위치할 수 있음;
- 용존 산소 센서 및 온도 프로브용 형광 판독기, 산소 배출 가스 분석을 위한 개별 센서(예를 들어, 전기화학적 검출기) 및 이산화탄소(예를 들어, 적외선 검출기)를 포함하는 제어 스테이션; SUSVB는 그 위에 위치될 수 있음;
- 온도 측정을 위한 용기 벽의 베이스의 움푹 들어간 부분;
- 배출 가스 습도 조절을 위한 헤드 플레이트의 설계에 맞게 조정된 온도 조절(클램프) 플레이트(6 ℃);
- 개별 펌프(예를 들어, 시린지 펌프)가 있는 최대 4개의 액체 공급(예를 들어, pH 조절 시약(산 및 염기), 영양소용)이 단일 볼루스 추가(예를 들어, 10 μL 내지 10 mL 용량), 연속 공급 (예를 들어, 선형 또는 지수와 같은 다른 프로파일을 사용하여; 20nL/h 내지 20mL/h의 유량으로)을 허용함; 하나의 바람직한 실시예에서 약 150μL/h;
- 살포 튜브(가스(공기) 전달용); 튜브는 가스 배출구가 바닥 임펠러 바로 아래에 있는 개방형 파이프 구성을 가질 수 있음;
- 배양 배지 헤드스페이스에 가스를 공급하기 위한 헤드스페이스 가스 주입구;
- (구성/혼합을 제어하기 위해) 각 가스 흐름에 대한 공압 펄싱 밸브를 포함하는 다중 구성 가능한 주입구 가스 매니폴드(예를 들어, 공기, 순수한 공기, 산소, 질소, 이산화탄소의 혼합용); 최소 펄스 시간이 20ms인 1초 주기(가스 펄싱의 지속 시간 및 간격 제어용); 0.0013mL/min 내지 550mL/min의 유량 범위를 허용하는 펄싱 밸브의 다운스트림의 질량 유량 센서.
다양한 반응기 크기의 기하학적 구조가 다음 표에 나와 있다(Bareither, R., 등, Biotechnol. Bioeng. 110 (2013) 3126-3138에서 재현; 표 II).
Figure pct00001
Figure pct00002
적합한 SUSVB는 HL/Di- 및 DT/Di-비, 임펠러 간격 및 대규모 발효기에 사용하도록 의도된 배플이 적어도 동일해야 한다. 전원 입력은 0.01kW/m3 내지 0.4kW/m3 범위에 있어야 하며, kLa 값은 1 1/h 내지 15 1/h 범위에 있어야 한다. 용존 산소는 공기 포화도 20% 이상으로 제어될 수 있어야 하며, 용존 이산화탄소(CO2) 함량은 35mmHg 내지 80mmHg 범위여야 한다. 온도는 32 ℃ 내지 38 ℃ 범위에서 제어해야 하며, pH 값은 pH 6.8 내지 pH 7.2 범위에서 조절해야 한다. 피딩은 20pg/cell/day 내지 90pg/cell/day의 범위에 있어야 하며, 피딩 제어 및 다양한 피딩 전략(선형 램프, 지수, 일정, 일시 추가)을 위한 자동화가 제공되어야 한다. 병렬 처리 및 샘플링을 가능하게 하는 작업 체적은 개발 및 제품 품질 분석을 위해 20ml 내지 300ml 범위, 바람직하게는 60ml 내지 255ml 범위여야 한다. SUSVB는 센서 또는 pH 통계 또는 dO 통계를 통한 공급에 의해 유발된 영양소 추가를 허용해야 한다.
일반적으로, CHO 세포주의 공급 배치 배양의 경우, 예를 들어 모노클로날 항체를 발현하는 CHO K1 세포주는 상업용 CD-CHO 배지 또는 다른 무혈청 배지와 같은 임의의 배지를 사용할 수 있다. 접종은 2x105 생존 세포/mL의 접종 세포 밀도와 같은 표준 조건을 사용하여 수행된다. SUSVB는 셰이커 플라스크 종자 배양으로 접종할 수 있다(예를 들어, 가습 인큐베이터, 36.5℃, 5% CO2; 성장 단계 내 및 1x106 생존 세포/mL 이상에서 3 내지 4일마다 확장). pH는 약 pH 6.9 내지 7.1로 조절되어야 하고(염기로서 중탄산나트륨 용액 1몰 및 산으로서 CO2), 온도는 약 36.5 ℃로 조절되어야 하며, dO2는 약 30% 공기 포화도에서 조절되어야 하고, 교반은 특정 전원 입력에서 제어되어야 하며, CO2 제거를 위해 최소 공기 살포 속도(예를 들어, 0.0125 vvm)를 설정해야 한다. 예를 들어 4, 6, 8, 11일에, 센서 판독값을 기반으로 하거나 고정된 피딩 계획을 기반으로 다중 영양 피드 용액을 추가할 수 있다. 피드 용액은 예를 들어 작업 체적의 5%와 같이 미리 정의된 체적을 초과해서는 안 된다. 예를 들어 40mmol/L와 같은 예를 들어 농축된 포도당 용액을 추가하는 것에 의해 포도당 제한은 피해야 한다. 필요한 경우 소포제를 추가할 수 있다. 분석을 위해 샘플은 고정된 시점에서, 예를 들어 매일 제거되어, 세포 생존율, 포도당, 젖산염, 삼투압 농도, pH를 측정하는 반면, 용존 가스(dO2, dCO2)는 예를 들어 혈액 가스 분석기로 오프라인으로 측정된다.
일반적으로 본 발명에 따른 SUSVB는 다음의 경우 사용될 수 있다
- 발효 조건을 결정하기 위해;
- 생물 공정 파라미터를 측정하기 위해.
일반적으로, 하나의 바람직일 실시예에서, 이러한 일회용 소체적 생물 반응기(SUSVB)는 비금속, 비유리, 중합체 물질로부터 적어도 부분적으로 제조된다. US 9,938,493(본 명세서에 그 전체가 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같이, 공지된 세포 배양 용기는 다중 층으로 구성되며, 여기서 내부 층, 즉 세포 배양물과 접촉하는 층은 중합체 재질로 제조된다. 일반적으로 적어도 이 층은 폴리에틸렌(PE) 또는 에틸-비닐 아세테이트(EVA)로 구성된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 혼용될 수 있는 "일회용 세포 배양 용기" 및 "SUSVB(Single-use small volume bioreactor)"라는 용어는, 생물학적 물질 생산을 위한 포유류 또는 박테리아 세포를 배양하기 위한 단층 또는 다층 고분자 물질로 만들어진 작업 체적이 300mL 이하인 세포 배양 용기를 나타낸다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 세포 배양 용기 또는 소체적 생물 반응기는 임의의 형상일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "일회용"은 세포 배양 용기 또는 소체적 생물 반응기가 세포 배양을 위해 한 번만 사용되는 것을 의미한다. 이것은 세포 배양 용기 또는 소체적 생물 반응기가 사용 전에 1회 이상 멸균된다는 사실을 부여하지 않는다. 따라서, 세포 배양 용기 또는 소체적 생물 반응기를 배양 배지 또는 세포로 채우기 전에 베타 또는 감마 방사선과 같은 미생물 사멸 방사선으로 처리된다. 이것은 배양된 세포의 성장을 방해하고 영향을 줄 수 있는 장치 내부에 존재하는 모든 미생물을 죽이기 위해 수행되어야 한다.
일 실시예에서, 무혈청 배지를 사용하는 본 발명에 따른 일회용 세포 배양 용기 또는 SUSVB에서 포유동물 세포의 배양에서 연장된 지연 단계의 발생은 멸균 방사선의 적용 전에 불활성 기체로 용기 또는 SUSVB를 처리함으로써 방지된다. 일 실시예에서, 일회용 세포 배양 용기 또는 SUSVB는 적어도 부분적으로 중합체 물질로 제조된다. 일 실시예에서, 멸균 방사선은 베타 방사선 또는 감마 방사선이다.
실험 결과
본 발명에 따른 예시적인 SUSVB로 얻어진 다음 실험 결과가 요약되어 있다. 이는 단순한 예시이며 제한으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 명시되어 있다.
인시튜 포도당 센서를 포함하는 본 발명에 따른 SUSVB는 추가 포도당 센서가 없는, 즉, 단일 인시튜 센서가 있는 표준 SUSVB와 비교되었다. 각각의 실험은 다음 표에 요약되어 있다.
Figure pct00003
RE01/RE05/RE09는 각각 소체적 생물 반응기, 즉 베타 방사선으로 한 번 멸균된 단 하나의 인시튜 센서를 사용하여 오프라인 포도당 분석으로 10일 배양했다. 이들은 비교 실험이다.
RE02/RE04/RE06/RE07/RE08/RE10/RE12는 각각 본 발명에 따른 SUSVB를 사용하여 16일 배양, 즉 베타 및 감마 방사선으로 두 번 멸균된 2개의 인시튜 센서를 사용했다.
본 발명에 따른 SUSVB에는 2개의 상이한 인시튜 포도당 센서가 사용되었다: 고 포도당 및 저 포도당 센서. 두 센서 유형의 차이점은 센서 위의 다른 유형의 멤브레인 층이다. 이 차이로 인해 센서의 효소에 대한 포도당의 확산 시간이 달라진다.
RE02/06/07/10에는 각각 측정 범위가 0 내지 3g/L인 저 포도당 센서가 있다. RE04/08/12에는 각각 측정 범위가 0 내지 8g/L인 고 포도당 센서가 있다.
피드(1)(포도당 함유)은 9일째에 용기 RE02/04/06/07/08/10/12에서 중단되어 포도당 수준을 포도당 센서의 측정 범위로 낮추어 센서를 통한 포도당 조절을 시작했다.
RE02에 대해 얻은 예시적인 포도당 곡선이 도 8에 나와 있다. 녹색 곡선은 인시튜 센서로 측정된 포도당 농도이다. 녹색 곡선의 각 가파른 단계(4월 30일 화요일, 5월 6일 월요일; 5월 9일 목요일)는 센서의 재보정 단계이다. 포도당 센서가 낮은 드리프트를 보이는 것을 알 수 있다. 10일 동안 재보정이 필요하지 않았다. 적색 선은 공급된 포도당 용액의 누적 체적/양이다. 분홍색 선은 포도당 용액 공급 펌프의 작동 시간/유량을 나타낸다. 원으로 된 시점에서 포도당이 없는 볼루스 피드를 제공하였다. 9일째에 포도당을 함유한 피드(1)의 공급을 중단하였다. 검은 점은 샘플링 및 Cedex BioHT 오프라인 분석으로 얻은 대조군 포도당 값을 나타낸다.
본 명세서에 보고된 한 양태는 동물 세포 배양을 위한 SUSVB이다. 일 실시예에서 SUSVB는 다음을 포함한다
a) 배양 배지 및 배양될 동물 세포를 수용하기에 적합한 본 발명에 따른 일회용 소체적 배양 용기,
b) 교반기 시스템,
c) 포도당 센서,
d) 배양 용기 바닥의 가스 주입구, 및
e) 수정 및/또는 피드 용액을 추가하기 위한 하나 이상의 주입구.
본 명세서에 보고된 한 양태는 하기 단계를 포함하는 폴리펩티드, 특히 항체를 생산하는 방법이다:
a) 본 발명에 따른 SUSVB에서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
b) 배양 배지 또는 세포로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계, 및
c) 선택적으로 폴리펩타이드를 정제하여 폴리펩타이드를 생산하는 단계.
본 명세서에 보고된 한 양태는 동물 또는 박테리아 세포를 본 명세서에 보고된 SUSVB에서 배양하여, 임의로 생성물을 생산하는 것을 특징으로 하는 동물 또는 박테리아 세포를 배양하는 방법이다.
본 명세서에 보고된 한 양태는 폴리펩티드 또는 항체 또는 바이러스의 생산을 위한 SUSVB의 사용이다.
일 실시예에서 교반기 시스템이 배양 용기에 배치될 때 SUSVB D의 직경에 대한 임펠러의 직경 d의 비율은 0.2와 0.8 사이의 범위에 있고, 또 다른 실시예에서 0.3 내지 0.6 범위에 있고, 추가 실시예에서 0.31 내지 0.39 범위에 있거나, 또는 또한 일 실시예에서 약 0.34이다. 추가 실시예에서 축 방향 이송 임펠러의 교반기 블레이드의 피치는 샤프트 축에 대해 10°와 80° 사이, 다른 실시예에서 24°와 60° 사이, 또는 추가의 실시예에서 40°와 50° 사이이다. 일 실시예에서, 모든 임펠러는 0.32 내지 0.35의 배양 용기(D)의 직경에 대한 이송 요소(d)의 직경의 비율을 갖는다.
일 실시예에서, 정제는 다단계 크로마토그래피 공정이다. 또 다른 실시예에서, 정제는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.
일 실시예에서, 배양은 반연속 배양이다.
일 실시예에서, 폴리펩티드는 항체 또는 항체 유도체이다.
일 실시예에서, 배양 배지는 원핵 및 진핵 세포의 배양에 적합한 수성 배지이다. 또 다른 실시예에서, 배양 배지는 뉴턴 액체이다. 일 실시예에서, 교반기 시스템은 0.01 W/kg 내지 1 W/kg의 전력 입력에서 작동된다. 추가 실시예에서, 교반기 시스템은 0.04 W/kg 내지 0.5 W/kg의 전력 입력에서 작동된다. 또 다른 실시예에서, 배양 배지에서 교반기 시스템에 의해 유도된 유동은 난류이다. 또 다른 실시예에서, 배양 배지는 3 mPas*s 이하의 점도를 갖는다. 또 다른 실시예에서 점도는 2 mPas*s 이하이다.
일 실시예에서, SUSVB는 침지 기체 교반 탱크 반응기이다.
또 다른 실시예에서, 동물 세포는 포유동물 세포이다. 추가의 실시예에서 세포는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, COS 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, HEK 293 세포 또는 하이브리도마 세포이다.
높은 제품 역가 및 우수한 제품 품질을 달성하기 위해, 본 발명에 따른 SUSVB의 작동 모드는 추가로, 예를 들어 세포주 개발, 배지 조성 및 SUSVB의 치수 측정에 중요한 역할을 한다.
작동 모드는 배치 또는 배치 공정, 공급 배치 또는 피딩 공정, 세포 보유가 있거나 없는 연속 공정(예를 들어, 관류 또는 케모스탯) 뿐만 아니라 예를 들어 내부 또는 외부 투석과 같은 반-연속 공정 간에는 구분이 이루어질 수 있다.
SUSVB는 상부 부분, 중간 부분 및 하부 부분을 가지며, 여기서 SUSVB의 종축은 상부 부분의 중간 또는 중심으로부터 하부 부분의 중간 또는 중심까지 연장된다.
SUSVB는 종축에 수직으로 보았을 때 실질적으로 원형 단면을 갖는다. 직경은 상부 및 하부 섹션에서 동일할 수 있거나 또는 하부 섹션은 상부 섹션보다 더 작은 직경을 가질 수 있다.
SUSVB의 상부 부분은 가스 배출구 수단 및/또는 하나 이상의 주입구 수단을 더 포함할 수 있다.
SUSVB의 하부 부분은 하나 이상의 액체 매질 유입 수단 및/또는 기체 유입 수단을 더 포함할 수 있다.
적어도 SUSVB의 하부 또는 중간 부분은 배양 용기의 외벽에 장착된 열교환 재킷을 더 포함할 수 있다.
교반기 시스템의 이송 요소는 회전을 유도하기 위한 적절한 기구에 연결된 샤프트에 의해 회전하도록 설정된다. 샤프트는 SUSVB의 종축을 따라 연장되므로 샤프트는 수직 방향의 회전 축을 갖는다. 샤프트는 SUSVB의 바닥까지 연장되지 않고 SUSVB의 바닥보다 훨씬 높은 지점과 SUSVB의 바닥에 있는 선택적 가스 살포기보다 훨씬 높은 지점까지 확장된다. 샤프트는 적절한 연결 기구에 의해 구동 샤프트에 작동 가능하게 연결된다. 샤프트를 구동 샤프트에 결합하기 위한 수단 외에, 샤프트에 임펠러를 개별적으로 결합하기 위한 추가 수단이 추가로 손상될 수 있다. 교반기 시스템의 임펠러는 일반적으로 교반기 시스템이 배양 배지에 잠기면 SUSVB의 배양 배지 표면 아래에 있는 위치에서 샤프트에 연결된다. 표면은 배양 배지가 정적일 때, 즉 순환되지 않을 때 측정된다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 SUSVB는 배플된 SUSVB이다. 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 SUSVB는 2개 또는 4개의 배플을 포함한다. "배플"은 샤프트 축과 동일한 방향으로 배양 용기 내부에 배치되고 교반기를 향하여 배양 용기 내로 방사상으로 연장되는 플레이트를 나타낸다. 배플은 일반적으로 형상이 직사각형이다. 일 실시예에서, 배플은 SUSVB의 내벽에 대해 거리(bd)에 배치된다. 다른 실시예에서, 배플은 SUSVB의 내부의 원주 주위에서 서로에 대해 동일한 거리로 이격된다.
SUSVB의 구성 요소는 의도한 기능을 발휘할 수 있는 방식으로 치수가 지정되는데, 즉, SUSVB는 배양 배지를 차지할 수 있고, 교반기 시스템은 배지를 혼합하고 추가된 화합물을 분산시킬 수 있다. 따라서, 교반기 시스템은 SUSVB 내에서 방해받지 않는 회전을 허용하는 직경을 가지고 있다.
본 명세서에 보고된 바와 같은 SUSVB를 사용하여, 예를 들어 관류 배양과 같은 높은 세포 밀도 배양이 수행될 수 있다.
배양은 일 실시예에서 배양 배지에 대한 레이놀즈수 독립적인 일정한 전력 입력이 달성될 수 있는 교반기 시스템의 회전 속도로, 즉 배양 동안 배양 용기에서 난류 배양 배지 흐름이 제공되는 교반기 시스템의 회전 속도로 수행된다. 본 발명에 따른 SUSVB로 교반기 시스템의 낮은 회전 속도에서 전단 민감성 포유동물 세포를 배양하는 것이 가능하다.
SUSVB의 배양 용기의 형태는 제한되지 않는다. 일 실시예에서, 배양 용기는 원통형 용기이다. 또 다른 실시예에서, 배양 용기는 교반 탱크 반응기형 용기이다. 배양 용기는 임의의 치수를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 배양 용기는 20 ml 내지 350 ml, 바람직한 일 실시예에서 55 ml 내지 265 ml의 작업 체적을 갖는다.
일반적으로, 세포 배양에는 잠긴 기체 배양 용기가 사용된다. 이러한 경우에는, 1단 또는 2단 또는 3단 축 방향 이송 교반기 시스템이 주로 사용된다. 1단 또는 2단 축 방향 이송 교반기 시스템이 사용되는 경우 이는 사용된 교반기의 회전축에 본질적으로 평행한 흐름 프로파일을 생성한다.
일 실시예에서, 교반기는 1 내지 5개의 축 방향 이송 요소, 또는 다른 실시예에서 1 내지 3개의 축 방향 이송 요소, 또는 또한 일 실시예에서 1 또는 2개의 축 방향 이송 요소 또는 심지어 단일 축 방향 이송 요소를 포함한다. 일 실시예에서, 하나의 축 방향 이송 요소는 교반기 헤드로부터 측정된 교반기 샤프트의 상부 4/5에 위치하고, 교반기 헤드까지의 h4/5의 최대 거리에 있다. 또한 일 실시예에서 하나의 축 방향 이송 요소는 0.8h의 최대 거리에 위치되고 및/또는 하나의 축 방향 이송 요소는 0.2h의 최대 거리에 위치된다. 다른 실시예에서, 축 방향 이송 요소는 함께 단일 요소를 형성한다. 일 실시예에서, 모든 축 방향 이송 요소의 직경은 동일하다. 다른 실시예에서 축 방향 이송 요소는 프로펠러 교반기, 피치 블레이드 교반기, 또는 경사 블레이드 교반기로부터 서로 독립적으로 선택된다.
추가 실시예에서, 모든 이송 요소는 교반기가 SUSVB에서 작동될 때 교반기의 샤프트 축을 중심으로 시간 단위당 동일한 회전수로 회전한다. 일 실시예에서, 이송 요소는 영구적으로 함께 결합되고 교반기는 한 부분으로 구성되는데, 즉, 모든 요소는 동일한 회전 샤프트에 의해 구동되고 교반기의 샤프트 축을 중심으로 시간 단위당 동일한 회전 수를 갖는다.
교반기 직경(d) 대 배양 용기 직경(D)의 비율(d/D)은 일 실시예에서 0.2 내지 0.8, 다른 실시예에서 0.3 내지 0.6, 추가 실시예에서 0.33 내지 0.5이다. 또 다른 실시예에서, 교반기 직경(d)에 대한 블레이드 높이(h)의 비율(h/d)은 0.5 내지 5, 다른 실시예에서는 1 내지 4, 추가 실시예에서는 1 내지 3이다. 또 다른 실시예에서, 임펠러 블레이드 폭(b) 대 교반기 직경(d)의 비율(b/d)은 0.05 내지 0.3이고, 형태의 다른 실시예에서는 0.1 내지 0.25이다.
"... 내지 "라는 용어는 나열된 경계 값을 포함하는 범위를 나타낸다.
일 실시예에서, 교반기 직경(d)은 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 10 mm, 12 mm, 14 mm, 16 mm, 18 mm 및 20 mm로부터 선택된다.
일 실시예에서 임펠러 블레이드 폭(b)은 0.42mm, 0.60mm, 0.89mm, 1.08mm, 1.33mm로부터 선택된다.
일 실시예에서, 하나의 반경 방향 이송 요소는 앵커 임펠러이다.
"대략"이라는 용어는 주어진 값이 값 주위의 플러스/마이너스 10%에 걸친 범위의 중심점임을 나타낸다. 이 값이 백분율 값인 경우, "대략"은 플러스/마이너스 10%를 의미하지만, 값 100%를 초과할 수 없다.
일 실시예에서, 축 방향 이송 요소는 경사 블레이드 임펠러이다.
축 방향 이송 요소의 높이 및/또는 반경 방향 이송 요소의 블레이드 폭의 비율(hSB/b)는 0.5 내지 4이고, 또 다른 실시예에서 0.8 내지 3 이고, 추가 실시예에서 1 내지 2이다. 다른 실시예에서, 경사 블레이드 임펠러의 교반기 블레이드의 피치는 교반기의 샤프트 축에 대해 10° 내지 80°이고, 추가 실시예에서 24° 내지 60°이고, 또한 일 실시예에서 40° 내지 50°이다.
일 실시예에서, 반경 방향 이송 요소는 1 내지 8개의 블레이드, 다른 실시예에서는 1 내지 4개의 블레이드, 추가의 실시예에서는 4개의 블레이드를 갖는다. 축 방향 이송 요소는 일 실시예에서 1 내지 10개의 블레이드, 다른 실시예에서 2 내지 6개의 블레이드, 추가의 실시예에서 4개의 블레이드를 갖는다. 다른 실시예에서, 반경 방향 이송 요소 및 축 방향 이송 요소는 동일한 수의 블레이드를 갖는다.
일 실시예에서, 교반기는 20 mm 내지 500 mm의 높이를 갖는다.
일 실시예에서, 교반기 및 SUSVB는 기능 유닛을 형성하는데, 즉, 교반기는 SUSVB의 배양 용기 내에 있고, 임의의 공간적 제한 없이 배양 용기 내에서 회전할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 SUSVB는 교반 탱크 반응기형 SUSVB이다.
추가 실시예에서, 배양 용기는 통기형 또는 침지형 기체 교반 반응기형 용기이다.
일 실시예에서, 배양 용기는 2 개의 배플(114, 126) 또는 4 개의 배플(114, 126, 125, 128)을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 배플은 배양 용기의 내부 표면의 원주 주위에서 서로에 대해 동일한 거리로 이격된다.
배양 용기 직경(D)에 대한 교반기 직경(d)의 비율(d/D)은 일 실시예에서 0.2 내지 0.8이고, 또 다른 실시예에서 0.3 내지 0.6 이고, 추가 실시예에서 0.33 내지 0.5이다. 또 다른 실시예에서, 배양 용기 직경(D)에 대한 배양 용기의 충전 높이(H)의 비율(H/D)은 1.0 내지 2.5이고, 추가 실시예에서 1.1 내지 2.0 이고, 추가 실시예에서 1.4 내지 1.8이다. 일 실시예에서, 배양 용기는 20 ml 내지 350 ml의 작업 체적을 갖는다.
일 실시예에서, 2개의 축 방향 이송 요소의 높이 차이(Δh) 대 배양 용기 직경(D)의 비율은 적어도 0.75이다.
하기 예, 시퀀스 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 설명된 절차에서 수정이 이루어질 수 있음이 이해된다.
약어
본 출원에 사용된 약어는 다음과 같은 의미를 갖는다(도 13 참조).
b: 반경 방향 이송 요소의 블레이드 폭
d: 교반기 총 외경
dw: 샤프트의 직경
h: 반경 방향 이송 요소의 교반기 블레이드의 높이
hm: 고정 슬리브의 높이
hSB: 축 방향 이송 요소의 높이
hu: 감속기의 높이
Δh: 두 개의 축 방향 이송 요소의 높이 차이
l: 축 방향 이송 요소의 교반기 블레이드의 길이
α: 축 방향 이송 요소 블레이드의 블레이드 피치
z: 교반기당 교반기 블레이드의 수
di: 반경 방향 이송 요소의 교반기 블레이드 사이의 내부 거리
h4/5: h의 위에서 4/5 높이
K: 교반기 헤드, 즉, 회전 샤프트에 부착되지 않은 경우 교반기의 가장 높은 지점
D: 배양 용기 내경
H: 배양 용기의 충전 높이.
도 1: 포도당 센서(111)를 포함하는 본 발명에 따른 예시적인 일회용 소체적 생물 반응기(SUSVB)의 측면도.
도 2: 치수 및 체적 주석이 있는 본 발명에 따른 예시적인 SUSVB의 측면도.
도 3: 공급 포트 영역(133)에 장착된 포도당 센서(111)를 보여주는 본 발명에 따른 예시적인 SUSVB의 평면도.
도 4: 포도당 센서(111)를 포함하는 본 발명에 따른 예시적인 SUSVB의 평면도.
도 5: 포도당 센서(111)를 포함하는 본 발명에 따른 SUSVB의 부분 확대도.
도 6: 배양 배지(129)에 내장된 포도당 센서(111)를 포함하는 본 발명에 따른 예시적인 SUSVB의 하부 측면도.
도 7: 예시적인 포도당 센서(111)의 개략도.
도 8: 온라인에서 측정된 포도당 농도(녹색 선), 오프라인에서 측정된 포도당 농도(검은색으로 채워진 원)의 시간 플롯; 배양 RE02의 포도당 용액 체적(적색 선) 및 포도당 펌프 작용(보라색 선)을 추가했다.
도 9: 온라인에서 측정된 포도당 농도(녹색 선), 오프라인에서 측정된 포도당 농도(검은색으로 채워진 원)의 시간 플롯; 배양 RE06의 포도당 용액 체적(적색 선) 및 포도당 펌프 작용(보라색 선)을 추가했다.
도 10: 온라인으로 측정된 포도당 농도(녹색 선), 오프라인으로 측정된 포도당 농도(검은색으로 채워진 원)의 시간 플롯; 배양 RE10의 포도당 용액 체적(적색 선) 및 포도당 펌프 작용(보라색 선)을 추가했다.
도 11: 발효 RE01-RE02 및 RE04-RE12의 항체 농도의 시간적 플롯.
도 12: 본 발명에 따른 조합 교반기의 다양한 실시예의 개략도. b: 교반기 블레이드의 폭; d: 교반기 직경; dw: 회전 샤프트의 직경; h: 반경 방향 이송 교반기의 교반기 블레이드의 높이; hm: 고정 슬리브의 높이; hSB: 축 방향 이송 교반기의 높이; hu: 감속기의 높이; l: 축 방향 이송 교반기의 교반기 블레이드의 길이; α: 축 방향 이송 교반기의 블레이드 피치; z: 교반기당 교반기 블레이드의 수; di: 반경 방향 이송 교반기의 교반기 블레이드 사이의 내부 거리; h4/5: h 위에서 4/5 높이; K: 교반기 헤드.
실시예 1
RE01-RE12의 배양 조건
배양은 170 ml의 총 체적에서 약 1.5 * 10E7 세포/ml의 출발 세포 밀도로 수행되었다. 배양 배지는 무혈청 화학적으로 정의된 배지였다. 배양 온도는 35℃로, 가스 발생 속도는 5-5.5 ml/min으로, 교반 속도는 450-500 rpm으로, pH는 pH 7로 설정했다. PH 조절은 1M 탄산나트륨 용액 또는 CO2를 가스 발생 속도 위에 추가하여 수행했다. 소포제는 초기에 그리고 배양 중에 필요할 때 첨가되었다. 포도당을 함유하는 피드(1)이 중단될 때까지 미리 정의된 속도로 연속적으로 첨가되었다. 포도당을 함유하지 않은 피드(2)가 1일, 3일 및 6일에 볼루스 피드로 첨가되었다.
본 발명에 따른 인시튜 포도당 센서를 사용한 배양에서, 일단 측정된 인시튜 포도당 농도가 임계값 아래로 떨어지면 피드(1)의 종료 후에 센서 의존적 포도당 공급이 시작되었다(피드(3)). 이 과정에서 임계값이 낮아졌다.
도 8 내지 도 10은 예시적인 배양의 플롯을 나타내고, 도 12는 생성물 농도 프로파일을 도시한다.

Claims (14)

  1. 소체적 생물 반응기로서,
    배양 용기(105)를 포함하고, 상기 배양 용기(105)는
    - 20ml 내지 350ml의 작업 체적을 갖고,
    - 적어도 하나의 임펠러(112)가 부착된 교반기 샤프트(108)를 포함하고,
    - i) 단부에서 살포기(127)에 연결된 살포 튜브, 및 ii) 단부에 개구를 갖는 적어도 하나의 공급 라인(118)을 포함하는 공급 파이프(107)를 포함하고,
    - 배양 용기(105)의 중심 방향으로 수직인 배양 용기(105)의 벽으로부터 연장되는 2개 이상의 배플(114; 126), 및
    - 반응기 헤드 플레이트(104)를 포함하고,
    상기 반응기 헤드 플레이트(104)는
    - 모터의 구동축을 교반기 샤프트(108)에 연결하기 위한 피팅(122),
    - 공급 파이프(107)의 살포 튜브에 연결된 살포기 가스 주입구(116), 선택적으로 헤드스페이스(132)에 연결된 가스 주입구,
    - 배양 용기(117)의 헤드스페이스에 연결된 가스 배출구,
    - 공급 파이프(107)의 일부인 공급 라인(118)의 액체를 위한 적어도 하나의 주입구,
    - pH 전극(101)이 장착된 하나의 인시튜 센서 포트(130), 및
    - 살포기 가스 주입구 및 적어도 하나의 공급 라인(118)의 주입구를 포함하는 공급 포트 영역(133)을 포함하고,
    상기 배양 용기(105) 및 상기 반응기 헤드 플레이트(104)는 둘 다 실질적으로 비금속 재질로 제조되고,
    상기 소체적 생물 반응기는 인시튜 포도당 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 소체적 생물 반응기.
  2. 제1항에 있어서, 상기 소체적 생물 반응기는 일회용 소체적 생물 반응기인, 소체적 생물 반응기.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소체적 생물 반응기는 방사선 멸균된 소체적 생물 반응기인, 소체적 생물 반응기.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소체적 생물 반응기는 멸균된 소체적 생물 반응기이고 방사선을 사용하여 2회 멸균된, 소체적 생물 반응기.
  5. 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사선은 베타 방사선 또는/및 감마 방사선인, 소체적 생물 반응기.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제1 방사선은 베타 방사선이고 상기 제2 방사선은 감마 방사선이거나 또는 그 반대인, 소체적 생물 반응기.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포도당 센서는 고정화된 효소로 코팅된 스크린 인쇄 전극인, 소체적 생물 반응기.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포도당 센서 기반 물질은 중합체 USP 등급 VI인, 소체적 생물 반응기.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포도당 센서는 20초마다 포도당 농도를 측정하고 및/또는 포도당 농도의 변화를 측정하는, 소체적 생물 반응기.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정된 포도당 농도 값은 포도당 센서로부터 컴퓨터로 무선 또는 케이블에 의해 전송되는, 소체적 생물 반응기.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응기 헤드 플레이트(104)는 샘플링 포트(102)를 더 포함하는, 소체적 생물 반응기.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인시튜 포도당 센서는 공급 포트 영역(133) 내에서 또는 공급 포트 영역(133)에서 헤드 플레이트(104)를 통과하는, 소체적 생물 반응기.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 소체적 생물 반응기를 사용하여 포유동물 세포를 배양하는 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 소체적 생물 반응기를 사용하여 배양 조건을 결정하는 방법.
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