ES2385639T3 - Producción de una proteína de unión a IL-18 recombinante - Google Patents

Abstract

Un proceso para producir una proteína de unión a interleuquina-18 (IL-18BP) recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO) en un biorreactor en condiciones de cultivo sin suero, en el que el proceso es un proceso discontinuo que comprende las etapas de: a) una fase de propagación celular a 37 ºC; b) opcionalmente, una fase intermedia a 33 ºC; c) una fase de producción a 29 ºC.

Description

Producci6n de una proteina de uni6n a IL-18 recombinante.

Campo de la inveneian

La presente invenci6n pertenece al campo de la producci6n de proteinas. De modo mas especifico, se refiere a un proceso para la producci6n de una proteina de uni6n a IL-18 recombinante (IL-18BP). La invenci6n se refiere ademas a una composici6n de IL-18BP que se caracteriza por un perfil de glicosilaci6n especifico.

Anteeedentes de la inveneian

Las proteinas se han vuelto importantes desde el punto de vista comercial como farmacos que tambien se denominan en general "biol6gicos". Uno de los mayores retos es el desarrollo de procesos eficaces y rentables para la producci6n de proteinas recombinantes a escala comercial.

La industria de la biotecnologia utiliza con profusi6n celulas de mamifero para la fabricaci6n de glicoproteinas recombinantes para la terapia humana.

En la actualidad, los cultivos semicontinuos y de perfusi6n son los dos modos dominantes de funcionamiento industrial para los procesos de cultivo de celulas de mamifero que requieren grandes cantidades de proteinas (Hu y Aunins, 1997). Cualquiera que sea la elecci6n de la tecnologia de producci6n, los intentos de desarrollo se dirigen a la obtenci6n de procesos de producci6n que garanticen una alta productividad volumetrica, una coherencia entre los lotes, y una calidad homogenea del producto a bajo coste.

La decisi6n entre el modo de producci6n semicontinuo o de perfusi6n viene dictada principalmente por la biologia del clon y por la propiedad del producto, y se realiza basandose en cada caso durante el transcurso del desarrollo de un nuevo producto de farmaco (Kadouri y Spier, 1997).

Cuando se selecciona el proceso de perfusi6n, uno de los sistemas de cultivo que puede elegirse es un biorreactor de lecho cargado estacionario, en el que las celulas se inmovilizan sobre vehiculos s6lidos. Este sistema es facil de manejar y puede lograrse una densidad celular muy alta (aproximadamente 107-108 celulas.ml1) con los vehiculos y las condiciones de cultivo apropiadas.

Una consecuencia de esta alta densidad celular es la necesidad de una velocidad de perfusi6n del medio intensiva (alimentaci6n y recolecci6n), que debe utilizarse para mantener a las celulas viables y productivas. Parece que la velocidad de perfusi6n es uno de los parametros fundamentales para dicho proceso: conduce la productividad de proteinas volumetrica, la calidad del producto de proteinas, y tiene un impacto muy fuerte sobre el coste econ6mico global del proceso.

Por tanto, a escala industrial, el proceso del biorreactor de lecho cargado estacionario 6ptimo deberia funcionar con una velocidad de perfusi6n lo mas baja posible sin comprometer la cantidad y la calidad del producto.

En el transcurso de la reducci6n de la velocidad de perfusi6n se han realizado varios estudios en los que se emple6 la concentraci6n de la glucosa (Wang et al., 2002) (Dowd et al., 2001) como indicador del nivel de otros nutrientes en el medio de alimentaci6n para hacer funcionar el biorreactor a una velocidad de perfusi6n baja sin acumular en el cultivo altos niveles de subproductos t6xicos, tales como lactato y amoniaco (Sugiura y Kakuzaki, 1998) (Racher et al., 1993). La modificaci6n de los parametros del cultivo, tales como pH y temperatura (Chuppa et al., 1997) tambien es una estrategia habitual para optimizar las condiciones del cultivo y reducir las necesidades de perfusi6n del medio.

Para lograr una velocidad de perfusi6n 6ptima pueden considerarse tres estrategias:

a) Fijar la velocidad de perfusi6n a un valor constante durante la totalidad de la ejecuci6n de la producci6n. Esta estrategia normalmente se prefiere en procesos de producci6n industrial, puesto que es mas sencillo su funcionamiento de una manera robusta y constante. Tambien tiene la ventaja de definir un coste medio del proceso porque no hay variaci6n en la velocidad de perfusi6n de una ejecuci6n a otra.

b) Ajustar la velocidad de perfusi6n en respuesta al numero de celulas y/o al consumo de nutrientes, tales como glucosa (Oh et al., 1994) (Dowd et al., 2001) (Gorenflo et al., 2003), glutamina (Gorenflo et al., 2002) u oxigeno (Kyung et al., 1994). Aunque esta estrategia proporciona un fundamento mas cientifico para ajustar la velocidad de perfusi6n, puede conducir un sobrecrecimiento del cultivo y a un aumento "fuera de control" de la velocidad de perfusi6n. Cuando las celulas se cultivan en el modo de suspensi6n se realiza un "sangrado del cultivo" para evitar el sobrecrecimiento del cultivo, pero esto no es posible cuando las celulas estan inmovilizadas sobre un vehiculo. Por tanto, en general esta estrategia no se prefiere para operaciones de fabricaci6n, porque es dificil de ejecutar de una manera robusta y constante, y la velocidad de perfusi6n del medio debe reajustarse a diario.

c) Combinar ambas estrategias a) y b) con una fase de propagaci6n celular inicial (o "fase de crecimiento"), en la

que la velocidad de perfusi6n aumenta de modo progresivo segun las necesidades de crecimiento de las celulas durante la fase de crecimiento, seguido de un desplazamiento de las condiciones de cultivo, tales como la temperatura y/o el pH, para estabilizar y mantener el metabolismo celular a un nivel relativamente bajo y constante. En esta etapa, la velocidad de perfusi6n puede reducirse hasta un valor fijo, que se corresponde con las menores necesidades de las celulas a lo largo de la fase de producci6n.

Se sabe que la modificaci6n de la velocidad de perfusi6n durante un proceso de perfusi6n, asi como la modificaci6n de otros factores del bioproceso, puede influir en la calidad de la proteina recombinante y, en particular, en su patr6n de glicosilaci6n (Jenkins et al., 1996) (Andersen et al., 2000). La glicosilaci6n habitualmente se reconoce como una funci6n importante para la solubilidad, la inmunogenicidad, y las propiedades farmacocineticas de las glicoproteinas humanas, y estas son parametros clave en la seguridad y la eficacia clinica de un producto (Goochee et al., 1991). En particular, la glicosilaci6n afecta al plegamiento y a la secreci6n de muchas glicoproteinas, asi como a su semivida plasmatica, teniendo por tanto un impacto importante en la biologia y la actividad in vivo de las proteinas glicosiladas.

En general, el termino "glicosilaci6n" de una proteina se refiere a la formaci6n de un enlace azucar-aminoacido. La glicosilaci6n es un acontecimiento crucial en la biosintesis de las unidades carbohidrato de las glicoproteinas (segregadas). Pone en marcha una serie compleja de etapas enzimaticas postraduccionales que conducen a la formaci6n de una multitud de oligosacaridos unidos a proteinas con diversas funciones biol6gicas.

Las glicoproteinas de mamifero normalmente contienen tres tipos de glicanos constituyentes: los glicanos Nenlazados, que se unen a la asparagina a traves de un resto N-acetilglucosamina (GlcNAc) en un motivo Asn-Xxx(Ser, Thr), en el que Xxx puede ser cualquier aminoacido excepto prolina; los que estan unidos a serina o treonina, denominados glicanos O-enlazados; y los componentes de carbohidrato del glicosilfosfatidilinositol. Aunque son posibles muchas variaciones, las antenas de los glicanos maduros consisten habitualmente en una o mas unidades de N-acetil-lactosamina, terminando las cadenas en acido sialico o en galactosa α-enlazada. Con frecuencia se encuentra a la fucosa unida al resto GlcNAc unido a asparagina, y a menudo tambien en las antenas. Otras modificaciones habituales en la estructura basica incluyen un resto GlcNAc unido en la posici6n 4 del resto manosa ramificado de la parte central, denominado resto GlcNAc "bisecante", y grupos sulfato que pueden estar en una diversidad de localizaciones, en la parte central y en las antenas.

La biosintesis de estos compuestos implica la uni6n de la asparagina a un glicano que contenga la parte central de trimanosilquitobiosa, junto con seis restos manosa y tres restos glucosa adicionales, seguido de la eliminaci6n de la glucosa y de los cuatro restos manosa. Entonces diversas otras glicosil transferasas y glicosidasas procesan la estructura de (GlcNAc)2(Man)5 para producir el glicano maduro. Este proceso produce tres tipos generales de glicanos N-enlazados dependiendo del grado de procesamiento: glicanos "con alto contenido en manosa", en los que s6lo hay restos manosa en las dos antenas; "glicanos hibridos", en los que una antena se procesa; y glicanos "complejos", en que se modifican ambas antenas. Los glicanos O-enlazados, por otra parte, son mucho mas diversos, y varian de monosacaricos a grandes polisacaridos sulfatados sin una estructura central ni secuencia consenso de aminoacidos comunes en el sitio de uni6n (Harvey, 2001).

Una de estas proteinas glicosiladas de interes terapeutico es la proteina de uni6n a interleuquina-18.

La proteina de uni6n a la interleuquina-18 (IL-18BP) es una proteina natural soluble que se purific6 por primera vez por afinidad en una columna de IL-18 a partir de la orina (Novick et al., 1999). La IL-18BP suprime la inducci6n por IL-18 de IFN-γ y la activaci6n por IL-18 de NF-xB in vitro. Ademas, la IL-18BP inhibe la inducci6n de IFN-γ en ratones inyectados con LPS.

El gen de IL-18BP se localiz6 sobre el cromosoma 11 humano, y no se han encontrado exones que codifiquen un dominio transmembrana en la secuencia gen6mica de 8,3 kb que comprende el gen de IL-18BP. Hasta la fecha, en los seres humanos se han identificado cuatro isoformas de la IL-18BP generadas por un corte y empalme alternativo del ARNm. Se han denominado IL-18BP a, b, c y d, y todas comparten el mismo N-terminal y se diferencian en el Cterminal (Novick et al., 1999). Estas isoformas varian en su capacidad para unirse a IL-18 (Kim et al., 2000). De las cuatro isoformas de la IL-18BP humana (hIL-18BP), se sabe que las isoformas a y c tienen una capacidad neutralizante de la IL-18. La isoforma de IL-18BP mas abundante, la isoforma a, muestra una alta afinidad por IL-18 con una constante de afinidad ("on-rate") rapida y de disociaci6n ("off-rate") lenta, y una constante de disociaci6n (Kd) de aproximadamente 0,4 nM (Kim et al., 2000).

La IL-18BP pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas.

Los restos implicados en la interacci6n de IL-18 con IL-18BP se han descrito mediante el uso de modelos informaticos (Kim et al., 2000) y se basan en la interacci6n entre la proteina similar IL-1β con IL-1R de tipo I (Vigers et al., 1997).

La IL-18BP esta presente constitutivamente en muchas celulas (Puren et al., 1999) y circula en seres humanos sanos, representando un fen6meno exclusivo en la biologia de las citoquinas. Debido a la alta afinidad de la IL-18BP por la IL-18 (Kd = 0,4 nM), asi como la alta concentraci6n de IL-18BP que se encuentra en la circulaci6n (un exceso

molar en 20 veces frente a IL-18), se ha especulado que la mayoria, sino todas, de las moleculas de IL-18 en la circulaci6n estan unidas a IL-18BP. Por tanto, la IL-18BP circulante que compite con los receptores para IL-18 de la superficie celular puede actuar como un antiinflamatorio natural y como molecula inmunosupresora.

Se ha sugerido la IL-18BP como proteina terapeutica en una serie de enfermedades y trastornos, tales como la psoriasis, la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoide, la artritis psoriatica, los dafos hepaticos, la sepsis, la aterosclerosis, las enfermedades cardiacas isquemicas, las alergias, etc; veanse, por ejemplo, los documentos WO9909063, WO0107480, WO0162285, W00185201, WO02060479, WO02096456, WO03080104, WO02092008, WO02101049, WO03013577.

La tecnica anterior no describe un proceso para la producci6n de IL-18BP recombinante en celulas CHO, ni composiciones de IL-18BP caracterizadas por un perfil de glicosilaci6n especifico.

Sumario de la inveneian

La presente invenci6n se refiere al desarrollo de un proceso para producir una proteina de uni6n a interleuquina-18 (IL-18BP) recombinante en celulas de ovario de hamster chino (CHO) en un biorreactor en condiciones de cultivo sin suero, que comprende una fase de propagaci6n celular a 37,5 °C y una fase de producci6n a 29°C.

Se ha desarrollado un proceso discontinuo eficaz para la producci6n de IL-18BP en celulas CHO en condiciones de cultivo sin suero comprende:

a) una fase de propagaci6n celular a 37 °C;

b) opcionalmente, una fase intermedia a 33 °C;

c) una fase de producci6n a 29 °C.

Breve deseripeian de los dibujos

Figura 1: Velocidad de perfusi6n del medio durante cultivos continuos de celulas CHO en un biorreactor de lecho cargado segun el ejemplo 1, con unos niveles de perfusi6n de 2,6 vvd (e), 2,0 vvd (0), y 1,3 vvd (.). Las ejecuciones del biorreactor se han marcado como ejeeueian-100 para 100% de perfusi6n (e), ejeeueian-75 para 75% de perfusi6n (0), y ejeeueian-50 para 50% de perfusi6n (.). La velocidad de perfusi6n maxima de 100% se corresponde con 2,6 vvd que fue utilizada como condici6n de referencia.

Figura 2: Perfiles de concentraci6n de glucosa (A) y lactato (B) durante cultivos continuos de celulas CHO en un biorreactor de lecho cargado segun el ejemplo 1, con unas velocidades de perfusi6n del medio de 100% (e), 75%

(0)

y 50% (.).

Figura 3: Perfil de velocidad de consumo de glucosa (GCR) durante cultivos continuos de celulas CHO en un biorreactor de lecho cargado segun el ejemplo 1, con unas velocidades de perfusi6n del medio de 100% (e), 75%

(0)

y 50% (.). LaGCR se expresa en gramos de glucosa consumidos por dia y por kg de vehiculo Fibra-Cel.

Figura 4: Perfil de la proporci6n de conversi6n molar de lactato desde glucosa aparente durante cultivos continuos de celulas CHO en un biorreactor de lecho cargado segun el ejemplo 1, con unas velocidades de perfusi6n del medio de 100% (e), 75% (0) y 50% (.).

Figura 5: Datos de productividad normalizados, (A) productividad volumetrica en unidades de producto por volumen total del cultivo por dia, (B) producto acumulado en unidades de producto, (C) valoraci6n en unidades de producto por volumen total del cultivo, para r-IL-18BP que se produce durante cultivos continuos de celulas CHO en un biorreactor de lecho cargado segun el ejemplo 1, con unas velocidades de perfusi6n del medio de 100% (e), 75%

(0) y 50% (.). Para normalizar los datos, elvalor medio obtenido con una velocidad de perfusi6n de 100% a lo largo de la fase de producci6n de 60 dias se consider6 100% de la productividad (linea de puntos).

Figura 6: Sialilaci6n mediante cartografiado de N-glicanos (perfiles de RP-HPLC) en muestras de la masa intermedias en el dia de producci6n 47-48 en la ejecuci6n-50, ejecuci6n-75 y ejecuci6n-100.

Figura 7: Actuaci6n del proceso de semicontinuo segun el ejemplo 2 en terminos de (A) la densidad celular total, (B) la viabilidad, (C) la concentraci6n de glucosa residual, y (D) la valoraci6n de r-hIL-18BP.

Figura 8: Sialilaci6n mediante cartografiado de N-glicanos (perfiles de RP-HPLC) en IL-18BP purificada preparada en un proceso de perfusi6n (panel superior) o en un proceso semicontinuo (panel inferior).

Figura 9: Comparaci6n de los perfiles de electroforesis capilar de zonas (CZE) obtenidos a partir de dos secuencias analiticas distintas, para una muestra recolectada bruta (pretratada) del proceso semicontinuo (superior), y una muestra recolectada (pretratada) del proceso de perfusi6n (inferior).

Figura 10: Distribuci6n de las isoformas (indicadas como porcentaje de todas las formas de la molecula diana)

mediante una electroforesis capilar de zonas (CZE) en muestras recolectadas brutas pretratadas (punteadas y grises) y muestras purificadas (rayadas y negras) de IL-18BP para ejecuciones con perfusi6n (punteadas y rayadas) y ejecuciones semicontinuas (grises y negras). Las barras de error se corresponden con la variabilidad ±10% del metodo de CZE.

Deseripeian detallada de la inveneian

La presente invenci6n se basa en el desarrollo de procesos eficaces para la producci6n de IL-18BP recombinante en un biorreactor en condiciones de cultivo celular sin suero. Por tanto, la presente invenci6n se refiere a un proceso para producir una proteina de uni6n a interleuquina-18 (IL-18BP) recombinante en celulas CHO en un biorreactor en condiciones de cultivo sin suero, que comprende una fase de propagaci6n celular a 37 °C y una fase de producci6n a 29 °C.

Cualquier temperatura entre aproximadamente 29 °C a aproximadamente 34 °C sera adecuada en el marco de la presente descripci6n, tal como, por ejemplo, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 30,5, 31, 31,5, 32, 32,5, 33, 33,5, 34, 34,5, 35 °C.

Se describe un proceso de perfusi6n para producir una proteina de uni6n a interleuquina-18 (IL-18BP) recombinante en celulas de mamifero en un biorreactor en condiciones de cultivo sin suero, que comprende:

a) una fase de propagaci6n celular a 37 °C con una velocidad de perfusi6n dada (100%);

b) una fase de producci6n I a 33,5 °C con una velocidad de perfusi6n que varia de aproximadamente 85% a aproximadamente 65%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 70% o aproximadamente 75% de la velocidad de perfusi6n de la etapa a);

c) una fase de producci6n II a 32,5 °C con una velocidad de perfusi6n que varia de aproximadamente 85% a aproximadamente 65%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 70% o aproximadamente 75% de la velocidad de perfusi6n de la etapa a).

Los expertos en la tecnica apreciaran que la velocidad de perfusi6n de la fase de producci6n (I, II o ambas) puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66 6 65% de la velocidad de perfusi6n inicial en la etapa a).

Tal como se muestra en los ejemplos que aparecen a continuaci6n, se ha descubierto de modo sorprendente que, a pesar de la velocidad de perfusi6n reducida, la productividad celular de la IL-18BP se conserv6 sustancialmente.

Los expertos en la tecnica tambien apreciaran que la temperatura puede variar dentro de ciertos limites, de forma que puede ser, por ejemplo, aproximadamente 37,5 °C en la etapa (a), o 34-33 °C en la etapa (b), o 32-33 °C en la etapa (c).

Generalmente, la concentraci6n de oxigeno disuelto (DO) de un cultivo celular se mantiene de aproximadamente 50% al 70% de saturaci6n de aire, y los valores de pH varian entre 6,5 y 7,5, preferiblemente aproximadamente 7,0.

El termino "biorreactor", tal como se emplea en la presente, se refiere a un aparato o recipiente cerrado que se utiliza para generar biomoleculas, tales como proteinas segregadas, empleando la capacidad de conversi6n quimica o sintetica de una celula. Los biorreactores incluyen los fermentadores y los sistemas de perfusi6n de cultivos celulares clasicos. Los biorreactores permiten controlar diversos parametros durante el proceso del cultivo celular tales como, por ejemplo, el bucle de flujo de circulaci6n, la temperatura, la sobrepresi6n y/o la velocidad de perfusi6n del medio.

La expresi6n "medio sin suero", tal como se emplea en la presente, se refiere a cualquier medio que no tenga componentes derivados de suero animal tales como, por ejemplo, suero de ternera fetal. Los ejemplos de medios sin suero disponibles en el mercado que pueden utilizarse segun la presente invenci6n incluyen, por ejemplo, SFM 90 (JRH, 67350), SFM 90.1 (JRH, 67350), Supmed300 o Supmed300 modificado (JRH, 67350), DMEM (Gibco, 7490571), DMEM/F12 (Gibco, 99.5043), SFM CHO 3a (BioWhittaker), CHO PFM (Sigma, C6970), ProCHO 5, medios EX-CELL, tales como EX-CELL 302 (JRH, n° de catalogo 14312-1000M) o EX-CELL 325 (JRH, n° de catalogo 14335-1000M), CHO-CD3 (Sigma, n° de catalogo C-1490), CHO III PFM (Gibco, n° de catalogo 960334SA), CHO-S-SFM II (Gibco, n° de catalogo 12052-098), CHO-DHFR (Sigma, n° de catalogo C-8862), ProCHO 5 (Cambrex, n° de catalogo BE12-766Q), SFM4CHO (HyClone, n° de catalogo SH30549.01), Ultra CHO (Cambrex, n° de catalogo 12-724Q), HyQ PF CHO (HyClone, n° de catalogo SH30220.01), HyQ SFX CHO (HyClone, n° de catalogo SH30187.01), HyQ CDM4CHO (HyClone, n° de catalogo SH30558.01), IS CHO-CD (Irvine Scientific, n° de catalogo 91119), IS CHO-V (Irvine Scientific, n° de catalogo 9197) y sus derivados. La composici6n de SFM 90, SFM 90.1, SupMed300, DMEM, DMEM/F12, SFM CHO 3a y CHP PFM se muestra en la tabla 1 que aparece a continuaci6n.

El medio sin suero puede ser preferiblemente un medio quimicamente definido, es decir, un medio preparado a partir de ingredientes purificados y, por tanto, cuya composici6n exacta se conoce. De modo especifico, los medios quimicamente definidos no contienen componentes derivados de animales ni hidrolizados no definidos.

Segun el proceso de perfusi6n, en una realizaci6n preferida, la velocidad de perfusi6n de la etapa a) tiene una velocidad de diluci6n en el intervalo de aproximadamente 2 a 3 vvd, preferiblemente de aproximadamente 2,5 vvd.

La expresi6n "velocidad de diluci6n", segun se define en la presente, se refiere a la velocidad de diluci6n D expresada en vvd, calculada como litro de medio por litro de volumen de trabajo del sistema total por dia (volumen total = lecho cargado + volumen del tanque de acondicionamiento).

Los expertos en la tecnica apreciaran que la velocidad de perfusi6n de la etapa a) puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0 6 3,1 vvd.

Unas velocidades de perfusi6n iniciales de aproximadamente 2,6 6 2,5 6 2,75 vvd han demostrado ser particularmente ventajosas.

La longitud de la fase de propagaci6n celular de la etapa a), la fase de producci6n I de la etapa b), y la fase de producci6n II de la etapa c) puede ser determinada con facilidad por los expertos en la tecnica basandose en parametros, tales como la siembra celular inicial, el tipo de celulas utilizadas, la velocidad de consumo de glucosa medida a diario, la velocidad de diluci6n, y el tiempo del proceso. Segun la presente invenci6n, se prefiere que las celulas se asocien a vehiculos en el biorreactor, y que la fase de producci6n I de la etapa b) comience a una velocidad de consumo de glucosa de aproximadamente 250 a 350 g de glucosa por kilogramo de vehiculo.

El vehiculo que puede utilizarse segun los procesos de la presente invenci6n puede ser, por ejemplo, un microvehiculo. Los microvehiculos son particulas s6lidas pequefas sobre las cuales pueden crecer celulas en un cultivo en suspensi6n. Las celulas son capaces de adherirse y propagarse sobre la superficie de los microvehiculos. Generalmente, los microvehiculos consisten en esferas, cuyo diametro esta comprendido entre 90 μm y 300 μm. Los microvehiculos pueden estar fabricados de diversos materiales que han demostrado ser adecuados para la adhesi6n y la propagaci6n de celulas tales como, por ejemplo, vidrio, poliestireno, polietileno, dextrano, gelatina y celulosa. Ademas, la superficie de los microvehiculos puede revestirse con un material que estimule la adhesi6n y el crecimiento de las celulas tales como, por ejemplo, N,N-dietilaminoetilo, vidrio, colageno, o proteinas recombinantes. Existen microvehiculos macroporosos y no porosos. Las superficies macroporosas ofrecen a las celulas un acceso facil al interior del microvehiculo despues de la inoculaci6n, y cuando ya estan dentro del microvehiculo, las celulas estan protegidas frente a las fuerzas de cizallamiento generadas por la agitaci6n mecanica y la aireaci6n en el biorreactor.

Otro vehiculo s6lido que puede utilizarse segun la presente invenci6n puede ser, por ejemplo, un disco Fibra-Cel®. Los discos Fibra-Cel® son discos con un diametro de 6 mm que estan compuestos de fibra no tejida de poliester unida a una lamina de malla de polipropileno (vease, por ejemplo, la patente de EEUU n° 5.266.476 y las paginas de la red nbsc.com/products/miscellaneous/fibracel/ y nbsc.com/support/faqs/#fibra). Los discos Fibra-Cel® habitualmente se tratan de modo electrostatico para que sea mas facil que las celulas en suspensi6n se adhieran a los discos y queden atrapadas en el sistema de fibras, en donde permanecen a lo largo del proceso de cultivo. La densidad celular y la productividad logradas con celulas cultivadas en discos Fibra-Cel® puede ser hasta diez veces mayor que con celulas cultivadas sobre microvehiculos.

Las celulas que expresan IL-18BP, que pueden cultivarse en el biorreactor segun los procesos descritos en la presente, pueden ser cualquier celula de mamifero, incluyendo celulas animales o humanas tales como, por ejemplo, celulas 3T3, celulas COS, celulas de osteosarcoma humano, celulas MRC-5, celulas BHK, celulas VERO, celulas CHO, celulas rCHO-tPA, celulas rCHO-antigeno de la superficie de Hep B, celulas CHO-S, celulas HEK 293, celulas rHEK 293, celulas rC127-antigeno de la superficie de Hep B, celulas de fibroblastos humanos normales, celulas estromaticas, celulas de hepatocitos, y celulas PER.C6.

Se emplean celulas de ovario de hamster chino (CHO) para la expresi6n de IL-18BP en un proceso segun la invenci6n.

Los procesos para la producci6n de IL-18BP de la invenci6n preferiblemente comprenden ademas una etapa de recolectar el sobrenadante del cultivo celular (recolecci6n).

En otra realizaci6n preferida, el proceso comprende ademas una o mas etapas de purificaci6n de la IL-18BP. Puede utilizarse cualquier metodo adecuado para la purificaci6n de la IL-18BP tal como, por ejemplo, los procesos de purificaci6n descritos para la IL-18BP en los documentos WO 2006/003134 o WO 2005/049649.

El producto de IL-18BP purificada preferiblemente entonces puede formularse en una composici6n farmaceutica.

La descripci6n tambien se refiere a una composici6n de IL-18BP que se caracteriza por un perfil de sialilaci6n que comprende de aproximadamente 15% a aproximadamente 25%, preferiblemente de aproximadamente 19% a aproximadamente 21% de N-glicanos no sialilados, de aproximadamente 15% a aproximadamente 30%, preferiblemente de aproximadamente 20% a aproximadamente 25% de glicanos monosialilados, de aproximadamente 35% a aproximadamente 55%, preferiblemente de aproximadamente 39% a aproximadamente 44% de N-glicanos disialilados, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, preferiblemente de

aproximadamente 7% a aproximadamente 10% de N-glicanos trisialilados, y de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, preferiblemente de aproximadamente 2% a aproximadamente 3% de N-glicanos tetrasialilados.

Dicha composici6n de IL-18BP se obtiene preferiblemente mediante los procesos de producci6n de la invenci6n.

La presente invenci6n se refiere a un proceso semicontinuo para producir la proteina de uni6n a interleuquina-18 (IL18BP) recombinante en celulas CHO en un biorreactor en condiciones de cultivo sin suero, que comprende las etapas de:

a.

una fase de propagaci6n celular a 37 °C;

b.

opcionalmente, una fase intermedia a 33 °C;

c.

una fase de producci6n a 29 °C.

Los expertos en la tecnica pueden determinar con facilidad la longitud de las fases (a), opcionalmente (b), y (c). La fase (a) continuara hasta que se haya generado un numero adecuado de celulas tal como, por ejemplo, en el intervalo de 105 a 106. La fase (b) preferiblemente sera corta, puesto que es una fase transitoria que actua para adaptar a las celulas a unas temperaturas mas bajas.

En una realizaci6n preferida, la densidad celular total en la fase de producci6n varia entre 4 a 8 x 106 celulas por ml por dia, preferiblemente a lo largo de al menos 10 dias de cultivo celular.

En otra realizaci6n preferida, la viabilidad varia entre 100% y 80%, preferiblemente a lo largo de al menos 10 dias de cultivo celular.

Tambien se prefiere que la productividad de proteinas sea mayor que aproximadamente 150 mg o aproximadamente 250 mg o aproximadamente 350 mg por l por dia.

Las celulas de mamifero para utilizarse en el marco del proceso de la presente invenci6n son las celulas de ovario de hamster chino (CHO).

El proceso preferiblemente comprende ademas las etapas de recolectar el sobrenadante del cultivo celular y/o purificar la IL-18BP y/o formular la IL-18BP en una composici6n farmaceutica.

La descripci6n tambien se refiere a una composici6n de IL-18BP que tiene un perfil de glicoformas que comprende de aproximadamente 0% a aproximadamente 15% de glicoformas basicas, de aproximadamente 15% a aproximadamente 30% de glicoformas menos acidas, de aproximadamente 45% a aproximadamente 65% de glicoformas acidas, y de aproximadamente 10% a aproximadamente 25% de glicoformas muy acidas.

El perfil de glicoformas se caracteriza mediante una electroforesis capilar de zonas (CZE), que indica el grado de glicoformas basicas, menos acidas, acidas y muy acidas de la IL-18BP. El metodo, y una definici6n de las glicoformas basicas, menos acidas, acidas y muy acidas, puede extraerse de los ejemplos que aparecen a continuaci6n.

El numero de carga hipotetico Z es un parametro calculado segun una f6rmula conocida (Hermentin et al., 1996; Gervais et al., 2003; veanse tambien los ejemplos que aparecen a continuaci6n), y caracteriza el grado de sialilaci6n de las glicoproteinas.

La composici6n de IL-18BP se caracteriza por un numero Z que varia entre aproximadamente 130 a aproximadamente 160, preferiblemente entre aproximadamente 140 y 155, mas preferiblemente entre aproximadamente 145 y aproximadamente 150. Los numeros Z preferidos para IL-18BP son, por ejemplo, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 6 156.

Aunque las composiciones de IL-18BP pueden producirse mediante cualquier proceso tal como, por ejemplo, procesos de perfusi6n ejecutados con ajustes de parametros diferentes a los descritos en la presente, por ejemplo a unas velocidades de perfusi6n mayores, las composiciones de IL-18BP se producen preferiblemente con el proceso discontinuo de la presente invenci6n.

Segun la presente invenci6n, la IL-18BP que se va a producir puede ser cualquier IL-18BP de cualquier especie. Preferiblemente, es la IL-18BP humana.

Puesto que la IL-18BP es una proteina soluble segregada, se libera hacia el sobrenadante del cultivo celular, a traves de su peptido sefal natural, o a traves de un peptido sefal heter6logo, es decir, un peptido sefal derivado de otra proteina segregada que puede ser mas eficaz en el sistema de expresi6n particular utilizado tal como, por ejemplo, el peptido sefal GH.

La expresi6n "proteina de uni6n a IL-18" se emplea en la presente como sin6nimo de "IL-18BP". Esta expresi6n se

refiere a proteinas de uni6n a IL-18, tales como las definidas en el documento WO 99/09063, o en Novick et al., 1999. El termino IL-18BP incluye los variantes de corte y empalme y/o isoformas de las proteinas de uni6n a IL-18, como las definidas en Kim et al., 2000, en particular las isoformas humanas a y c de IL-18BP.

El termino "IL-18BP", tal como se emplea en la presente, incluye tambien muteinas, derivados funcionales, fracciones activas, proteinas condensadas, proteinas circularmente permutadas, y sales de IL-18BP, segun se define en el documento WO 99/09063.

Tal como se emplea en la presente, el termino "muteinas" se refiere a analogos de una IL-18BP, o analogos de una IL-18BP virica, en los que uno o mas de los restos aminoacidos de una IL-18BP natural o una IL-18BP virica estan reemplazados por restos aminoacidos diferentes, o estan delecionados, o uno o mas restos aminoacidos se afaden a la secuencia natural de una IL-18BP o de una IL-18BP virica, sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes comparado con la IL-18BP de tipo salvaje o la IL-18BP virica. Estas muteinas se preparan mediante sintesis conocidas y/o mediante tecnicas de mutagenesis dirigida a sitio, o mediante cualquier otra tecnica adecuada para ello.

Las muteinas incluyen proteinas codificadas por un acido nucleico, tal como ADN o ARN, que se hibrida con ADN o ARN, que codifica una IL-18BP o que codifica una IL-18BP virica. (WO 99/09063) bajo condiciones rigurosas. La expresi6n "condiciones rigurosas" se refiere a unas condiciones de hibridaci6n y posterior lavado que los expertos en la tecnica denominan de modo convencional "rigurosas". Vease Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 y 6.4 (1987, 1992). Sin limitaci6n, los ejemplos de condiciones rigurosas incluyen unas condiciones de lavado 12-20 °C por debajo de la Tm calculada del hibrido que se esta estudiando, por ejemplo en 2 x SSC y SDS al 0,5% durante 5 minutos, 2 x SSC y SDS al 0,1% durante 15 minutos; 0,1 x SSC y SDS al 0,5% a 37 °C durante 30-60 minutos, y despues 0,1 x SSC y SDS al 0,5% a 68 °C durante 30-60 minutos. Los expertos en la tecnica comprenderan que las condiciones rigurosas dependen tambien de la longitud de las secuencias de ADN, las sondas oligonucleotidicas (tales como de 10-40 bases) o las sondas oligonucleotidicas mixtas. Si se emplean sondas mixtas resulta preferible utilizar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de SSC. Vease Ausubel, supra.

La coincidencia refleja una relaci6n entre dos o mas secuencias polipeptidicas, o dos o mas secuencias polinucleotidicas, determinada mediante la comparaci6n de las secuencias. En general, la coincidencia se refiere a la correspondencia exacta nucle6tido a nucle6tido, o aminoacido a aminoacido, de las dos secuencias polinucleotidicas o polipeptidicas, respectivamente, a lo largo de la longitud de las secuencias que se estan comparando.

Para secuencias en que no existe una correspondencia exacta, puede determinarse un "porcentaje de coincidencia". En general, las dos secuencias que se van a comparar se alinean para producir una correlaci6n maxima entre las secuencias. Esto puede incluir insertar "huecos" en una o ambas secuencias, para potenciar el grado de alineamiento. Puede determinarse un porcentaje de coincidencia a lo largo de la longitud completa de cada una de las secuencias que se estan comparando (denominado alineamiento global), que resulta particularmente adecuado para secuencias con la misma longitud o con una longitud similar, o a lo largo de unas longitudes mas cortas, definidas (denominado alineamiento local), que resulta mas adecuado para secuencias con longitud desigual.

Los metodos para comparar la coincidencia y la homologia de dos o mas secuencias son muy conocidos en la tecnica. Asi, por ejemplo, pueden utilizarse los programas informaticos disponibles en the Wisconsin Sequence Analysis Package, versi6n 9.1 (Devereux J. et al., 1984), por ejemplo los programas informatico BESTFIT y GAP, para determinar el porcentaje de coincidencia entre dos polinucle6tidos, y el porcentaje de coincidencia y el porcentaje de homologia entre dos secuencias polipeptidicas. BESTFIT emplea el algoritmo de "homologia local" de Smith and Waterman (1981), y encuentra la mejor regi6n individual de similitud entre las dos secuencias. Otros programas para determinar la coincidencia y/o la similitud entre secuencias tambien se conocen en la tecnica, por ejemplo la familia de programas BLAST (Altschul S.F. et al, 1990; Altschul S.F. et al, 1997, accesibles desde la pagina principal de NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W.R., 1990).

Cualquier de estas muteinas preferiblemente tiene una secuencia de aminoacidos suficientemente duplicativa de la de una IL-18BP, o suficientemente duplicativa de la de una IL-18BP virica, de forma que tenga una actividad sustancialmente similar a la IL-18BP. Una actividad de IL-18BP es su capacidad para unirse a IL-18. Siempre que la muteina tenga una actividad de uni6n a IL-18 sustancial puede utilizarse para la purificaci6n de IL-18, por ejemplo mediante una cromatografia de afinidad y, por tanto, puede considerarse que tiene una actividad sustancialmente similar a la IL-18BP. Por tanto, puede determinarse si cualquier muteina dada tiene sustancialmente la misma actividad que la IL-18BP mediante la experimentaci6n habitual, que comprende someter a dicha muteina, por ejemplo, a un ensayo de competici6n simple de "sandwich" para determinar si se une o no a una IL-18 marcada de modo apropiado, tal como un radioinmunoensayo o un ensayo ELISA.

En una realizaci6n preferida, cualquiera de estas muteinas tiene al menos 40% de coincidencia u homologia con la secuencia de una IL-18BP o de un hom6logo de IL-18BP codificado por un virus, segun se define en el documento WO 99/09063. Mas preferiblemente, tiene al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o, mas preferiblemente, al menos 90% de coincidencia u homologia con esta.

Las muteinas de polipeptidos de IL-18BP o las muteinas de IL-18BP viricas que pueden utilizarse, o el acido nucleico que las codifica, incluyen un conjunto finito de secuencias sustancialmente correspondientes como polinucle6tidos o peptidos de sustituci6n que pueden ser obtenidos de modo habitual por los expertos en la tecnica, sin experimentaci6n indebida, basandose en las ensefanzas y las guias presentadas en la presente.

5 Los cambios preferidos para muteinas son las conocidas como sustituciones "conservativas". Las sustituciones de aminoacidos conservativas de polipeptidos o proteinas de IL-18BP, o de IL-18BP viricas, pueden incluir aminoacidos sin6nimos dentro de un grupo que tengan propiedades fisicoquimicas suficientemente similares de forma que una sustituci6n entre miembros del grupo conservara la funci6n biol6gica de la molecula (Grantham, 1974). Es evidente que tambien pueden realizarse inserciones y deleciones de aminoacidos en las secuencias definidas anteriormente

10 sin alterar su funci6n, en particular si las inserciones o las deleciones s6lo implican a unos pocos aminoacidos, por ejemplo, a menos de treinta, y preferiblemente a menos de diez, y si no eliminan o desplazan a aminoacidos que sean criticos para una conformaci6n funcional, por ejemplo restos cisteina. Las proteinas y las muteinas producidas mediante estas deleciones y/o inserciones estan dentro del ambito de la presente descripci6n.

Preferiblemente, los grupos de aminoacidos sin6nimos son los que se definen en la tabla 4. Mas preferiblemente, los

15 grupos de aminoacidos sin6nimos son los que se definen en la tabla 5, y lo mas preferiblemente, los grupos de aminoacidos sin6nimos son los que se definen en la tabla 6.

Tabla I: Grupos preferidos de aminoacidos sin6nimos

Aminoacido

Grupo sin6nimo

Ser

Ser, Thr, Gly, Asn

Arg

Arg, Gln, Lys, Glu, His

Leu

Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro

Gly, Ala, Thr, Pro

Thr

Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala

Gly, Thr, Pro, Ala

Val

Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly

Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Ile

Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Phe

Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr

Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys

Ser, Thr, Cys

His

Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln

Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn

Gln, Asp, Ser, Asn

Lys

Glu, Gln, His, Arg, Lys

Asp

Glu, Asn, Asp

Glu

Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met

Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp

Trp

Tabla II: Grupos mas preferidos de aminoacidos sin6nimos Tabla III: Grupos aun mas preferidos de aminoacidos sin6nimos

Aminoacido

Grupo sin6nimo

Ser

Ser

Arg

His, Lys, Arg

Leu

Leu, Ile, Phe, Met

Pro

Ala, Pro

Thr

Thr

Ala

Pro, Ala

Val

Val, Met, Ile

Gly

Gly

Ile

Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe

Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr

Phe, Tyr

Cys

Cys, Ser

His

His, Gln, Arg

Gln

Glu, Gln, His

Asn

Asp, Asn

Lys

Lys, Arg

Asp

Asp, Asn

Glu

Glu, Gln

Met

Met, Phe, Ile, Val, Leu

Trp

Trp

Aminoacido

Grupo sin6nimo

Ser

Ser

Arg

Arg

Leu

Leu, Ile, Met

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Ala

Val

Val

Gly

Gly

Ile

Ile, Met, Leu

Phe

Phe

Tyr

Tyr

Cys

Cys, Ser

His

His

Gln

Gln

Asn

Asn

Lys

Lys

Asp

Asp

Glu

Glu

Met

Met, Ile, Leu

Trp

Trp

Los ejemplos de producci6n de sustituciones de aminoacidos en proteinas que pueden utilizarse para obtener muteinas de polipeptidos o proteinas de IL-18BP, o de muteinas de IL-18BP viricas, incluyen cualquier etapa de un metodo, tales como las presentadas en las patentes de EEUU 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462, de Mark et al.; 5.116.943, de Koths et al., 4.965.195, de Namen et al.; 4.879.111, de Chong et al.; y 5.017.691, de Lee et al.; y las proteinas sustituidas con lisina presentadas en la patente de EEUU n° 4.904.584 (Shaw et al.).

La expresi6n "proteina de fusi6n" se refiere a un polipeptido que comprende una IL-18BP, o una IL-18BP virica, o su muteina o fragmento, condensado con otra proteina que, por ejemplo, tenga un tiempo de permanencia prolongado en los fluidos corporales. Una IL-18BP, o una IL-18BP virica, puede por tanto estar condensada con otra proteina, polipeptido o similares, por ejemplo una inmunoglobulina o un fragmento de esta.

Los "derivados funcionales", tal como se emplean en la presente, abarcan a derivados de IL-18BP, o de una IL-18BP virica, y sus muteinas y proteinas condensadas, que pueden prepararse a partir de grupos funcionales que aparecen en las cadenas laterales sobre los restos o los grupos N- o C-terminales, por medios conocidos en la tecnica, y se incluyen en la descripci6n con la condici6n de que sigan siendo farmaceuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la actividad de la proteina que es sustancialmente similar a la actividad de la IL-18BP, o de IL-18BP viricas, y que no confieran propiedades t6xicas a las composiciones que las contienen.

Estos derivados pueden incluir, por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden ocultar los sitios antigenicos y extender la permanencia de una IL-18BP o de una IL-18BP virica en los fluidos corporales. Otros derivados incluyen esteres alifaticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo mediante una reacci6n con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los restos aminoacidos formados con restos acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo, o aroilo carbociclico) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, los de los restos serilo o treonilo) formados con restos acilo.

Como "fracciones activas" de una IL-18BP, o de una IL-18BP virica, sus muteinas y proteinas condensadas, la presente descripci6n cubre cualquier fragmento o precursor de la cadena polipeptidica de la molecula de proteina por si sola o junto con moleculas asociadas o restos unidos a ella, por ejemplo restos azucar o fosfato, o agregados de la molecula de proteina o los restos azucar por si solos, con la condici6n de que dicha fracci6n tenga una actividad sustancialmente similar a la IL-18BP.

El termino "sales" en la presente se refiere a sales de grupos carboxilo y a sales de adici6n de acidos de grupos amino de una molecula inhibidora de IL-18 o sus analogos. Las sales de un grupo carboxilo pueden formarse por medios conocidos en la tecnica e incluyen sales inorganicas, por ejemplo sales de sodio, calcio, amonio, sales ferricas o de cinc y similares, y sales con bases organicas como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaina y similares. Las sales de adici6n de acidos incluyen, por ejemplo, sales con acidos minerales tales como, por ejemplo, acido clorhidrico o acido sulfurico, y sales con acidos organicos tales como, por ejemplo, acido acetico o acido oxalico. Por supuesto, todas estas sales deben mantener la actividad biol6gica del inhibidor de IL-18, tal como la inducci6n de IFN-gamma en celulas sanguineas.

Las secuencias de la IL-18BP y sus variantes de corte y empalme/isoformas puede obtenerse en el documento WO 99/09063 o en Novick et al., 1999, asi como en Kim et al., 2000.

Los derivados funcionales de la IL-18BP pueden conjugarse con polimeros para mejorar las propiedades de la proteina, tales como la estabilidad, la semivida, la biodisponibilidad, la tolerancia por el cuerpo humano, o la inmunogenicidad. Para lograr este objetivo, la IL-18BP puede unirse, por ejemplo, a polietilenglicol (PEG). La pegilaci6n puede realizarse mediante metodos conocidos, descritos en el documento WO 92/13095, por ejemplo.

Una proteina de fusi6n de IL-18BP puede comprender, por ejemplo, una fusi6n de una inmunoglobulina, es decir, el inhibidor de IL-18 es una proteina condensada que comprende toda o parte de una proteina de uni6n a IL-18, que

esta condensada con toda o con una parte de una inmunoglobulina. Los metodos para fabricar proteinas de fusi6n de inmunoglobulinas son muy conocidos en la tecnica, tales como los descritos en el documento WO 01/03737, por ejemplo. Los expertos en la tecnica apreciaran que la proteina de fusi6n resultante sustancialmente mantiene la actividad biol6gica de IL-18BP tal como, por ejemplo, la uni6n a IL-18, que puede medirse en ensayos in vitro descritos en la tecnica anterior tal como, por ejemplo, el documento WO 99/09063. La fusi6n puede ser directa o a traves de un peptido conector corto, que puede ser tan corto como de 1 a 3 restos aminoacidos de longitud, o mayor, por ejemplo 13 restos aminoacidos de longitud. Dicho conector puede ser un tripeptido con la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una secuencia conectora de 13 aminoacidos que comprende Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gin-Phe-Met introducida entre la secuencia de IL-18BP y la secuencia de la inmunoglobulina. La proteina de fusi6n resultante tiene mejores propiedades, tales como un mayor tiempo de permanencia en los fluidos corporales (semivida), una mayor actividad especifica, un mayor nivel de expresi6n, o bien se facilita la purificaci6n de la proteina de fusi6n.

En una realizaci6n preferida, la IL-18BP se condensa con la regi6n constante de una molecula de Ig, por ejemplo una porci6n Fc de una inmunoglobulina. Preferiblemente, se condensa con las regiones de cadena pesada, como los dominios CH2 y CH3, opcionalmente con la regi6n bisagra de la IgG1 humana, por ejemplo. La parte Fc puede estar mutada, por ejemplo, para evitar actividades no deseadas, tales como la uni6n al complemento, la uni6n a receptores de Fc, o similares.

La generaci6n de proteinas de fusi6n especificas que comprendan IL-18BP y una porci6n de una inmunoglobulina se describe en el ejemplo 11 del documento WO 99/09063, por ejemplo. Otras isoformas de moleculas de Ig tambien son adecuadas para la generaci6n de proteinas de fusi6n, tales como las isoformas IgG2 o IgG4, u otras clases de Ig, como IgM o IgA, por ejemplo. Las proteinas de fusi6n pueden ser monomericas o multimericas, hetero-u homodimericas.

Otras proteinas de fusi6n de IL-18BP pueden prepararse mediante la condensaci6n de dominios aislados a partir de otras proteinas que permiten la formaci6n de dimeros, trimeros, etc. Los ejemplos de secuencias de proteinas que permiten la multimerizaci6n de los polipeptidos son los dominios aislados a partir de proteinas tales como hCG (documento WO 97/30161), colageno X (documento WO 04/33486), C4BP (documento WO 04/20639), proteinas Erb (documento WO 98/02540), o peptidos de espiral helicoidal (documento WO 01/00814).

La IL-18BP producida segun el proceso de la invenci6n, o la composici6n segun se describe en la presente, puede estar prevista para un uso terapeutico, es decir, para la administraci6n a pacientes. Si la IL-18BP se administra a pacientes, preferiblemente se administra por via sistemica, y preferiblemente por via subcutanea o intramuscular, o t6pica, es decir, de modo local. Tambien puede resultar adecuada la administraci6n rectal o intratecal, dependiendo del uso especifico de la IL-18BP.

Con este objetivo, la IL-18BP producida puede formularse como composici6n farmaceutica, es decir, junto con un vehiculo o excipiente farmaceuticamente aceptable, o similares.

La definici6n de "farmaceuticamente aceptable" pretende incluir cualquier vehiculo que no interfiera con la eficacia de la actividad biol6gica del ingrediente activo, y que no sea t6xico para el receptor al cual se le administra. Por ejemplo, para la administraci6n parenteral, la proteina o proteinas activas pueden formularse en una forma de dosificaci6n unitaria para inyecci6n en vehiculos tales como disoluci6n salina, disoluci6n de dextrosa, albumina de suero y disoluci6n de Ringer.

Los ingredientes activos de la composici6n farmaceutica segun se describe en la presente pueden administrarse a un individuo en una diversidad de formas. Las vias de administraci6n incluyen la administraci6n intradermica, transdermica (por ejemplo, en formulaciones de liberaci6n lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, oral, intracraneal, epidural, t6pica, rectal e intranasal. Puede utilizarse cualquier otra via de administraci6n terapeuticamente eficaz, por ejemplo la absorci6n a traves de tejidos epiteliales o endoteliales, o mediante terapia genica, en la que una molecula de ADN que codifica el agente activo se administra al paciente (por ejemplo, a traves de un vector), que provoca que el agente activo se exprese y se segrege in vivo. Ademas, la proteina o proteinas pueden administrarse junto con otros componentes de agentes biol6gicamente activos, tales como tensioactivos, excipientes, portadores, diluyentes y vehiculos farmaceuticamente aceptables.

Para la administraci6n parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutanea, intramuscular), la proteina o proteinas activas pueden formularse como una disoluci6n, suspensi6n, emulsi6n o polvo liofilizado en asociaci6n con un vehiculo parenteral farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, agua, disoluci6n salina, disoluci6n de dextrosa) y aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o la estabilidad quimica (por ejemplo, conservantes y tampones). La formulaci6n se esteriliza mediante tecnicas que se emplean habitualmente.

Las cantidades terapeuticamente eficaces de la proteina o proteinas activas estaran en funci6n de muchas variables, incluyendo el tipo de antagonista, la afinidad del antagonista por IL-18, cualquier actividad citot6xica residual que muestren los antagonistas, la via de administraci6n, la condici6n clinica del paciente (incluyendo el deseo de mantener un nivel no t6xico de actividad IL-18 end6gena).

Una "cantidad terapeuticamente eficaz" es aquella que cuando se administra, el inhibidor de IL-18 produce la inhibici6n de la actividad biol6gica de IL-18. La dosificaci6n administrada, como una dosis unica o multiple, a un individuo varia dependiendo de una diversidad de factores, que incluyen la propiedades farmacocineticas del inhibidor de IL-18, la via de administraci6n, las condiciones y caracteristicas del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamafo), el grado de los sintomas, los tratamientos concurrentes, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulaci6n de los intervalos de dosificaci6n establecidos estan dentro de la capacidad de los expertos en la tecnica, asi como los metodos in vitro e in vivo para determinar la inhibici6n de la IL-18 en un individuo.

La IL-18BP puede utilizarse en cantidades dentro de intervalos de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 1 a 3 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal.

La IL-18BP puede administrarse a diario o en dias alternos, o tres veces por semana o una vez por semana, en dosis similares, o en dosis que aumentan o disminuyen con el tiempo.

Las dosis diarias habitualmente se administran en dosis divididas o en una forma de liberaci6n sostenida eficaz para obtener los resultados deseados. La segunda o posteriores administraciones pueden realizarse a una dosificaci6n que sea la misma, menor o mayor que la dosis inicial o previa administrada al individuo. La segunda o posterior administraci6n puede administrarse durante la enfermedad o antes de la aparici6n de esta.

La IL-18BP puede administrarse de modo profilactico o terapeutico a un individuo antes, de modo simultaneo o secuencial con otros agentes o regimenes terapeuticos (por ejemplo, regimenes de multiples farmacos) en cantidades terapeuticamente eficaces.

La IL-18BP producida segun la presente invenci6n puede utilizarse para la preparaci6n de un medicamento para el tratamiento y/o la prevenci6n de una serie de enfermedades o trastornos. Estas enfermedades o trastornos, por ejemplo, pueden ser trastornos mediados por la IL-18. Por ejemplo, la IL-18BP puede utilizarse para el tratamiento y/o la prevenci6n de la psoriasis, la artritis psoriatica, la enfermedad de Crohn, la enfermedad del intestino inflamatoria, la artritis reumatoide, las lesiones hepaticas, tales como la cirrosis hepatica alcoh6lica, la sepsis, la aterosclerosis, las enfermedades cardiacas isquemicas, las alergias, en particular la hipersensibilidad de tipo retrasado, y las lesiones de cabeza cerradas.

La referencia a etapas del metodo conocidas, a etapas del metodo convencionales, a metodos conocidos o a metodos convencionales no supone la admisi6n de que cualquier aspecto, descripci6n o realizaci6n de la presente invenci6n se describa, ensefe o sugiere en la tecnica pertinente. Debe entenderse que la fraseologia o la terminologia en la presente se utiliza de modo descriptivo y no como limitaci6n, de modo que la terminologia o la fraseologia de la presente descripci6n debe ser interpretada por los expertos en la tecnica a la luz de las ensefanzas y las guias presentadas en la presente, en combinaci6n con el conocimiento de los expertos en la tecnica.

Ejemplos (refereneia)

Ejemplo 1: Proeeso de perfusian para la produeeian de IL-18BP humana reeombinante a partir de una reeoleeeian de eelulas CHO sin suero en un biorreaetor de leeho eargado

Este ejemplo describe un proceso basado en el cultivo de alta densidad celular de celulas CHO recombinantes en un biorreactor de lecho cargado, en el que la velocidad de perfusi6n se ajusta segun las necesidades de crecimiento celular durante la fase de crecimiento, y despues se reduce de forma pronunciada durante la fase de producci6n sin comprometer la productividad del proceso o la calidad de la proteina.

El producto de proteina producido mediante este proceso, la IL-18BP, se caracteriza y resulta tener un perfil de Nglicanos ventajoso.

Un proceso de primera generaci6n habia sido disefado originariamente con el objetivo de producir con rapidez un material para ensayos preclinicos y clinicos tempranos.

Este proceso se disef6 con una velocidad de perfusi6n alta de 2,6 vvd para suministrar una alta densidad celular (aproximadamente 2,5.107 celulas.ml1 de lecho cargado) con medio fresco durante la fase de producci6n. En este proceso de primera generaci6n, la degradaci6n del producto no resultaba un problema, puesto que la alta velocidad de diluci6n impuesta al cultivo mantenia un tiempo de permanencia bajo del producto, la IL-18BP, en el entorno del biorreactor.

En una etapa posterior del desarrollo, se ensay6 una reducci6n en la velocidad de perfusi6n del medio en -25% y 50% para mejorar el proceso. Se emple6 un sistema a pequefa escala para realizar los ensayos, y las condiciones seleccionadas entonces se implementaron a escala piloto para producir mas material para ensayos clinicos con un proceso de segunda generaci6n mejorado.

Materiales y metodos

Cultivo celular - sistema experimental

Un biorreactor de lecho cargado (Ducommun et al., 2002a; Ducommun et al., 2002b) con vehiculo Fibra-Cel® (Bibby Sterilin, Reino Unido) se emple6 para cultivar celulas CHO (Laboratoires Serono S.A., Corsier-sur-Vevey, Suiza) que expresan y segregan la IL-18BP en un medio sin suero (Sigma C-9486). En el sistema a pequefa escala que se emple6 para investigar una reducci6n en la velocidad de perfusi6n, el biorreactor y el lecho cargado tenian un volumen de trabajo de 15 y 5 litros, respectivamente.

El biorreactor se perfusion6 con 2,6 vvd (segun se define en la tabla 1) durante la fase de crecimiento y producci6n. Esta velocidad de perfusi6n basica se elige como el 100% de referencia, indicada como ejecuci6n-100.

Tabla 1: Velocidades de perfusi6n ensayadas durante la fase de producci6n para la ejecuci6n-100, ejecuci6n-75 y ejecuci6n-50. Media de n replicaciones (± 2 desviaciones estandar para la ejecuci6n-100)

Velocidad de perfusi6n (l.kgFibra-Cel -1.dia-1)

Velocidad de diluci6n (vvd*) Replicaciones (n)

Ejecuci6n-100

100 ± 3,5 2,6 ± 0,1 8

Ejecuci6n-75

75 2,0 3

Ejecuci6n-50

50 1,3 2

* La velocidad de diluci6n D expresada en vvd se calcula como litro de medio por litro del volumen de trabajo del sistema total por dia (volumen total = lecho cargado + volumen del tanque de acondicionamiento).

Estas condiciones se aplicaron para todos los conjuntos de experimentos del biorreactor: el medio se perfusion6 a 100% durante la fase de crecimiento a 37 °C. La temperatura se regul6 a 37,0 °C durante la fase de crecimiento, y despues se redujo en dos etapas hasta 32,5 °C. El pH se regul6 a 7,00, y la concentraci6n de oxigeno disuelto (DO) se mantuvo al 70% de saturaci6n del aire a traves de todo el cultivo.

Debido al hecho de que el recuento de celulas y la determinaci6n del numero de celulas en un biorreactor de lecho cargado es un analisis complejo e impreciso, los inventores utilizaron la velocidad de consumo de glucosa (GCR) como un metodo indirecto para estimar el crecimiento y la densidad celular en el biorreactor de lecho cargado. En el sistema de los inventores se determin6, mediante recuentos de celulas directos en una serie de cultivos en el lecho cargado, que una GCR de 300 gramos de glucosa por kilogramo de discos Fibra-Cel® por dia se corresponde con aproximadamente 2,5.107 celulas por ml de volumen del biorreactor de lecho cargado (los datos no se muestran).

Esta etapa se ha definido como el final de la fase de propagaci6n celular a 37 °C, y cuando la GCR ha alcanzado un nivel de 300 gramos de glucosa por kilogramo de discos Fibra-Cel® por dia, los cultivos se cambiaron de 37,0 °C al modo de producci6n disminuyendo la temperatura hasta 33,5 °C. En esta etapa, en un conjunto de biorreactores, la perfusi6n se mantuvo al 100% (ejecuci6n-100) y en los otros dos conjuntos se utiliz6 una velocidad de perfusi6n del medio del 75% (ejecuci6n-75) y 50% (ejecuci6n-50) del nivel maximo, tal como se resume en la tabla 1. La temperatura disminuy6 aun mas hasta 32,5 °C en una etapa posterior de la fase de producci6n para evitar un mayor crecimiento celular y para estimular la producci6n.

En la secci6n de resultados, las barras que aparecen en las figuras representan un intervalo de 4 desviaciones estandar (± 2 desviaciones estandar) medido para las 8 replicaciones ensayadas con las condiciones de la ejecuci6n-100.

Ensayos

Las muestras se retiraron a diario durante el cultivo. Se cuantificaron las concentraciones de glucosa y lactato con un analizador EML 105 (Radiometer Medical A/S, Br0nsh0j, Dinamarca).

La IL-18BP recombinante producida se cuantific6 con un ensayo ELISA.

La calidad de la proteina recombinante se evalu6 con un metodo de RP-HPLC, en combinaci6n con metodos de SDS-PAGE (ExcelGel SDS Homogeneous 12,5% (n° de catalogo 80-1261-01, Pharmacia). Los geles se tiferon de modo especifico mediante una transferencia Western para detectar los variantes de IL-18BP de alto peso molecular (es decir, dimeros, agregados) o de bajo peso molecular. Tambien se utiliz6 una tinci6n no especifica mediante un tinte de plata para evaluar la intensidad relativa de la IL-18BP comparada con las impurezas despues del barrido (escaner ARCUS 2, Afga) de las bandas individuales para determinar su intensidad relativa.

La sialilaci6n de las proteinas, y en particular la abundancia de N-glicanos neutros, mono-, di-, tri-y tetrasialilados se analiz6 mediante la separaci6n de los N-glicanos segun su carga, segun se describe en Gervais et al., 2003. Los Nglicanos se escindieron de modo especifico de la IL-18BP mediante hidrazinolisis (N-glicanasa E-5006B o E-5006C, Glyko, Inc.), se marcaron con el tinte fluorescente 2-aminobenzamida (kit de marcaje de sefal 2-AB K404, Glyko Inc.), y se separaron mediante una columna de cromatografia antes de hacerlos pasar a traves de un detector fluorescentes. Las proporciones de las especies de N-glicanos entonces pudieron determinarse despues de la integraci6n de los picos de HPLC que se corresponden con las formas neutras, mono-, di-, tri-y tetrasialiladas.

Resultados

Reduccion de la velocidad de perfusion

El primer intento fue reducir la velocidad de perfusi6n desde 2,6 vvd a 2,0 vvd y 1,3 vvd durante la fase de producci6n (figura 1) y seguir su efecto sobre el metabolismo celular, la productividad volumetrica y la calidad del producto.

La concentraci6n de glucosa y lactato se midi6 para las tres velocidades de perfusi6n (figura 2A y 2B), y el nivel de glucosa residual se mantuvo por encima de 0,5 g/l.

Los resultados en la figura 3 muestran los niveles de velocidad de consumo de glucosa (GCR) para los tres conjuntos de velocidades de perfusi6n del medio ensayados. Estos resultados indican que una velocidad de perfusi6n reducida induce una menor GCR del cultivo. Sin embargo, este efecto es apenas significativo, y cuando la velocidad de perfusi6n del medio se redujo en -25% y -50%, la GCR media medida a lo largo de la fase de producci6n de 60 dias se redujo en -8% y -15%, respectivamente (figura 3).

En paralelo, la proporci6n molar aparente (figura 4) de la conversi6n de glucosa en lactato Ylac/glu disminuy6 ligeramente en respuesta a una menor velocidad de perfusi6n, pero permaneci6 en el intervalo de 1,55 a 1,65 mol de lactato producido por mol de glucosa consumida. La diferencia observada en la proporci6n de Ylac/glu no fue estadisticamente significativa, puesto que todos los puntos de datos medidos para las ejecuciones del ensayo a unas velocidades de perfusi6n reducidas estan comprendidas dentro de ± 2 desviaciones estandar de los valores obtenidos con las ejecuciones de referencia.

Productividad del proceso

Los resultados presentados en la figura 5A, B y C muestran una comparaci6n de la proteina recombinante producida (productividad volumetrica, producci6n total, y valoraci6n) en la ejecuci6n-100 de referencia y en las ejecuciones con una perfusi6n del medio reducida.

Cuando la velocidad de perfusi6n del medio se redujo en -25% y -50%, la productividad volumetrica media se redujo en -3% y -30%, respectivamente (figura 5A). El resultado de productividad menor obtenido en la ejecuci6n-50 era estadisticamente diferente de las condiciones de referencia.

Otra diferencia observada en la figura 5A es la disminuci6n de la productividad volumetrica a lo largo del tiempo a traves de la fase de producci6n. Se observ6 una productividad volumetrica estable para la ejecuci6n-100 y la ejecuci6n-75, pero en la ejecuci6n-50 la productividad disminuy6 a lo largo de la duraci6n de la fase de producci6n de 60 dias. De manera mas especifica, el nivel de productividad de la ejecuci6n-50 fue del 60% del valor de referencia al final de la fase de producci6n de 60 dias.

La menor productividad de la ejecuci6n-50 tambien se muestra en la figura 5B, que representa la cantidad acumulada de producto fabricado a lo largo de la fase de producci6n de 60 dias.

Las valoraciones correspondientes medidas para las diferentes velocidades de perfusi6n se presentan en la figura 5C, que demuestra que las valoraciones de proteinas recombinantes aumentaron en +25% y +50%, respectivamente, en oposici6n al control, en el que la perfusi6n disminuy6 en -25% y -50%.

Calidad del producto

Con la reducci6n en la velocidad de perfusi6n desde 2,6 vvd a 2,0 vvd y 1,3 vvd que se ensay6 en la ejecuci6n-100, la ejecuci6n-75 y la ejecuci6n-50, el tiempo de permanencia (t) de la proteina recombinante aument6 desde 0,4 a 0,5 y 0,8 dias, respectivamente (t = 1/D).

Puesto que una mayor exposici6n al entorno en el biorreactor puede conducir potencialmente a la degradaci6n de la proteina recombinante, se realiz6 un estudio de estabilidad antes de iniciar los ensayos en los biorreactores A. Una muestra de IL-18BP se sembr6 en el medio de cultivo celular, y se controlaron los atributos de calidad de la IL-18BP despues de 1, 2 y 5 dias de incubaci6n a 37 °C. Puesto que no se detectaron sefales de degradaci6n del producto mediante el metodo indicador de la estabilidad (los datos no se muestran), se decidi6 continuar con los experimentos en el biorreactor.

Durante los ensayos en los biorreactores, la proteina recombinante se purific6 hasta la homogeneidad en tres puntos de los ensayos en el biorreactor (dia 20, 40 y 60) para verificar que la calidad del producto se mantiene para cada velocidad de perfusi6n ensayada. Las condiciones de la ejecuci6n-50 se consideraron el peor caso para la degradaci6n de las proteinas, puesto que esta ejecuci6n tiene la velocidad de perfusi6n menor y el mayor tiempo de permanencia del producto en el biorreactor.

Para evaluar si la calidad del producto se ve afectada por la velocidad de perfusi6n reducida, se analizaron masas finales de la ejecuci6n-50 mediante una tinci6n con plata de SDS-PAGE y un analisis de la transferencia Western de SDS-PAGE, y se compar6 con el perfil obtenido en las condiciones de referencia de la ejecuci6n-100. Los correspondientes datos obtenidos para una masa producida con IL-18BP recolectada en los dias 47-48 de la fase de producci6n de la ejecuci6n-50 produjeron las bandas individuales esperadas a un peso molecular de aproximadamente 40 kDa (los datos no se muestran). No se detectaron modificaciones en los atributos de calidad de la IL-18BP en la ejecuci6n-50 comparado con la ejecuci6n-100. La pureza electroforetica medida mediante la tinci6n con plata de SDS-PAGE fue mayor que 99% de pureza para todos los carriles, y no pudo detectarse la presencia de agregados o de formas truncadas, tal como se muestra en el analisis de la transferencia Western de SDS-PAGE (no se muestra).

El nivel mayor de pureza (aproximadamente 100%) de la IL-18BP producida se confirm6 mediante RP-HPLC para la ejecuci6n-100, la ejecuci6n-75 y la ejecuci6n-50.

Por ultimo, la cantidad de impurezas derivadas de la celula CHO hospedante (HCP, "Host Cell Proteins", proteinas de la celula hospedante) en la proteina producida se cuantific6 mediante HCP-ELISA (los datos no se muestran) y se descubri6 que era coherente entre la ejecuci6n-50, la ejecuci6n-75 y la ejecuci6n-100.

Perfil de N-glicanos

Muestras de la IL-18BP recombinante producida se sometieron a un cartografiado de N-glicanos segun el metodo indicado anteriormente, para cuantificar la proporci6n de las diferentes formas sialiladas de la proteina de interes. Los resultados del cartografiado de los N-glicanos resumidos en la tabla 2 demuestran que se obtienen proporciones comparables de N-glicanos para todas las velocidades de perfusi6n ensayadas. Esto tambien se ve ilustrado por los correspondientes perfiles de HPLC indicados en la figura 6.

Tabla 2: Fracci6n de moleculas de N-glicano sialiladas de modo diferente (indicado como porcentaje de los grupos N-glicano) en muestras semiproducidas de sustancia farmaco para la ejecuci6n-100, la ejecuci6n-75 y la ejecuci6n50

Fraeeian de moleeulas de N-glieano sialiladas de modo diferente

Neutras (%)

Monosialiladas (%) Disialiladas (%) Trisialiladas (%) Tetrasialiladas (%)

Ejeeueian-100

19-21 21-29 39-44 7-11 2-4

Ejecuci6n-75

18-22 20-23 44-50 8-9 3-4

Ejecuci6n-50

19-21 20-25 45-48 8-10 2-4

Una comparaci6n de estos datos demuestra que la sialilaci6n del producto no se ve alterada por la velocidad de perfusi6n reducida, y los datos obtenidos para la ejecuci6n-75 y la ejecuci6n-50 estan claramente dentro del intervalo obtenido bajo las condiciones patr6n de la ejecuci6n-100.

Resumen y conclusiones

En el presente estudio, se determin6 la velocidad de perfusi6n del medio 6ptima que se va a utilizar para el cultivo continuo de una linea de celulas CHO recombinante en un biorreactor de lecho cargado fabricado con vehiculos de discos Fibra-Cel®.

Un proceso de primera generaci6n habia sido disefado originariamente con una alta velocidad de perfusi6n, y se habia hecho funcionar originariamente con una perfusi6n de 2,6 vvd durante la fase de producci6n para suministrar una alta densidad celular (aproximadamente 2,5.107 celulas.ml-1 del lecho cargado) con suficiente medio fresco.

Para mejorar el coste econ6mico de este proceso se investig6 a pequefa escala una reducci6n en la velocidad de perfusi6n del medio en -25% y -50%. La mejor opci6n entonces se aplic6 a escala piloto para producir mas material para ensayos clinicos con un proceso de segunda generaci6n mejorado.

Con una reducci6n de -25% de la velocidad de perfusi6n, la productividad volumetrica se mantuvo comparada con el

proceso de primera generaci6n, pero se obtuvo una perdida de productividad de -30% cuando se redujo aun mas la velocidad de perfusi6n del medio hasta -50% de su nivel original.

La calidad de la proteina bajo condiciones de velocidad de perfusi6n reducida se analiz6 para determinar la pureza, el nivel de sialilaci6n de los N-glicanos, la abundancia de dimeros o agregados, y se demostr6 que la calidad de la sustancia de farmaco final era comparable a la obtenida en condiciones de alta perfusi6n.

En este estudio se estableci6 que la calidad del producto se mantiene tras la reducci6n de la velocidad del medio de perfusi6n. El ensayo con la perfusi6n menor, la ejecuci6n-50, tenia el tiempo de permanencia mayor (t = 0,8 dias) y este es el peor caso para la estabilidad de las proteinas, puesto que deja al producto expuesto a todas las actividades potencialmente degradantes presentes en el entorno del biorreactor durante el tiempo mayor. Bajo estas condiciones, se puede considerar que 99% de la proteina tendra un tiempo de permanencia en el sistema del biorreactor menor que 4 dias (5t = 4 dias para la ejecuci6n-50).

Puesto que el estudio de estabilidad demuestra que la IL-18BP puede conservarse hasta 4 dias a 37 °C en la recolecci6n bruta sin alteraciones significativas, se anticipa que en el intervalo de velocidades de perfusi6n ensayado, el producto no se degradara. Esto se confirm6 mediante los resultados obtenidos en las ejecuciones en el biorreactor, puesto que todos los lotes de proteina producida generados en el dia de producci6n 20, 40 y 60 de cada una de las condiciones de perfusi6n ensayadas cumplia con las especificaciones establecidas con el material de referencia de la ejecuci6n-100. Por tanto, en el estudio indicado en la presente, no pudieron detectarse sefales de degradaci6n del producto.

La privaci6n de la glucosa es una causa tipica de la sialilaci6n incorrecta del producto (Goochee y Monica, 1990). Este efecto ha sido estudiado para la IFN-g producida a partir de celulas CHO, y se descubri6 que el producto de la glicosilaci6n se ve afectado con unos niveles residuales bajos de glucosa inferiores a 0,1 g/l (Hayter et al., 1993), (Hooker et al., 1995).

En las condiciones indicadas en la presente, la sialilaci6n de la IL-18BP no se vi6 afectada por las menores concentraciones de glucosa alcanzadas durante la fase de producci6n de la ejecuci6n-75 y la ejecuci6n-50. Sin desear limitarse a una explicaci6n especifica, esto puede explicarse por el hecho de que el intervalo de concentraciones residuales de glucosa (de 2,6 g/l a 0,5 g/l) indicadas en la presente todavia son mucho mayores que el valor menor que 0,1 g/l de nivel de glucosa (que puede inducir un pequefo efecto de privaci6n de glucosa) para el cual se ha observado una sialilaci6n incompleta de IFN-g.

Basandose en los resultados obtenidos a pequefa escala, se aplic6 una reducci6n de -25% de la perfusi6n del medio a escala piloto en un proceso de segunda generaci6n, lo cual permiti6 mantener la misma productividad y la misma calidad de la molecula mientras que se reduce el coste del medio, los materiales y la mano de obra del proceso de producci6n.

La reducci6n de -25% del medio se tradujo directamente en un ahorro de -25% en el medio en polvo y los ingredientes secundarios, los prefiltros y los filtros esterilizantes, las bolsas esteriles empleadas para almacenar el medio despues de la filtraci6n, y los costes de mano de obra asociados con la preparaci6n del medio, puesto que se necesitaron menos lotes de medio.

A medida que la valoraci6n de la IL-18BP aumenta en +25% en el proceso de segunda generaci6n, el procesamiento corriente abajo se beneficia de un ahorro similar: la necesidad de mano de obra se reduce debido a que hay que manipular volumenes menores, se reduce el tiempo del ciclo de producci6n, se optimiza el equipo, etc. (los datos no se muestran).

Conclusi6n

A partir de los resultados obtenidos a pequefa escala, es evidente que la reducci6n de -25% en la velocidad de perfusi6n combina ambos beneficios de maximizar la productividad con un ahorro de -25% en el consumo de medio.

Una mayor reducci6n de la velocidad de perfusi6n hasta -50% conduce a una menor productividad del proceso, que disminuye en -30% bajo estas condiciones. Con unas condiciones de velocidad de perfusi6n de -50%, la productividad volumetrica disminuy6 a lo largo de la duraci6n de la fase de producci6n de 60 dias, mientras que se mantuvo una productividad estable con las velocidades de perfusi6n mayores ensayadas. La estabilidad del producto se mantuvo en niveles comparables, independientemente de la velocidad de perfusi6n utilizada en el proceso.

Ejemplo 2: Proeeso semieontinuo para la produeeian de IL-18BP humana reeombinante a partir de un eultivo de eelulas CHO sin suero

Tambien se desarroll6 un proceso semicontinuo con celulas que expresan la IL-18BP humana recombinante en un cultivo en suspensi6n. Se realizaron tres ejecuciones en total, utilizando biorreactores con un volumen nominal de 5 l (n = 2) o 300 l (n = 1).

En resumen, los ajustes del cultivo fueron: una concentraci6n de oxigeno del 50% de saturaci6n del aire, pH 7,0 y 6,90, una temperatura de 37,0 °C durante la fase de crecimiento y que despues se reduce en dos etapas hasta 29,0 °C. Durante el desarrollo del cultivo semicontinuo, el medio basal sin suero (Sigma, S-9942) se suplement6 de modo gradual con una disoluci6n de alimentaci6n concentrada.

Los parametros del proceso semicontinuo se resumen en la tabla 3.

Tabla 3: Esquema del proceso de fabricaci6n semicontinuo

Tiempo/DT* [dia]

T [°C] pH [pHU] Alimentaeian Alimentaci6n-1 Comentarios

-3

Transferir el agrupamiento de inaeulos en bolsas de onda hasta el biorreaetor de siembra1) eon unas CV diana de: CV** = 0,20 ± 0,05 mioCs/ml

0

Transferir el agrupamiento de inaeulos del biorreaetor de siembra al biorreaetor de produeeian2) eon unas CV diana de: CV = 0,60 ± 0,10 mioCs/ml

0

37 6,90 +80 g/kgSobrenadante e(glueosa) < 1,0 g/l3)

↓

N/A N/A

4

→ 33 N/A

↓

N/A N/A +30 g/kgSobrenadante e(glueosa) < 5,5 g/l4)

6

→ 29 N/A

↓

N/A N/A

20

Clarifieaeian de la reeoleeeian bruta

1) Biorreactor de 5 l y 75 l para el funcionamiento a pequefa escala (5 l) y a escala piloto (300 l), respectivamente. 2) Biorreactor de 5 l y 300 l para el funcionamiento a pequefa escala (5 l) y a escala piloto (300 l), respectivamente. 3) La primera adici6n de la alimentaci6n-1 se produce cuando c(glucosa) < 1,0 g/l (+80 g/kg). 4) Las posteriores adiciones de la alimentaci6n-1 se producen cada vez cuando c(glucosa) < 5,5 g/l (+30 g/kg). * DT = dias de trabajo ** CV = celulas viables

Se analizaron importantes indicadores de la actuaci6n, a saber, la densidad celular total, la viabilidad, la concentraci6n de glucosa residual, y la valoraci6n de proteinas. Tal como se muestra en la figura 7(A) a (D), el 10 proceso semicontinuo final permite hacer crecer al clon hasta una densidad celular total maxima de aproximadamente 7,0 mioCs/ml y mantiene la viabilidad celular por encima del 80% hasta el dia de trabajo 19, cuando se recolecta el cultivo de 300 l, se clarifica y se captura. La figura 7(C) se corresponde con los perfiles de la concentraci6n de glucosa residual, basandose en mediciones diarias fuera de linea. Estos perfiles ilustran la estrategia de alimentaci6n aplicada. Por ejemplo, la primera adici6n en embolada de 80 g/kg de sobrenadante se

15 produjo en los tres lotes en el dia de trabajo 4 para aumentar la concentraci6n residual de glucosa hasta mas de 5,5 g/l. De una manera similar, cada posterior adici6n de 30 g/kg de sobrenadante puede identificarse con facilidad. Ademas, la productividad del proceso se muestra en la figura 7(D), con una valoraci6n de r-hIL-18BP final constante de 400 mg/l en el dia de trabajo 19. Se evalu6 la calidad de las proteinas en los tres lotes en el dia de trabajo 19.

Ejemplo 3: Perfil de sialilaeian de la rhIL-18BP produeida en el proeeso de perfusian y semieontinuo para un 20 eultivo de eelulas CHO

Se mont6 otro proceso de perfusi6n para la producci6n de IL-18BP. Las ejecuciones de la perfusi6n se realizaron con una velocidad de perfusi6n de 2,75 vvd en un biorreactor que contenia un volumen total de 160 l (incluyendo una columna externa de 40 l) cargado con 4,4 kg de discos Fibra-Cel®, a unas temperaturas de producci6n de 33,5 °C o 32,5 °C.

25 La IL-18BP producida en este proceso de perfus6n se compar6 con el material derivado del proceso semicontinuo descrito en el ejemplo 2.

Cada sobrenadante de perfusi6n o semicontinuo se someti6 a una etapa de captura utilizando una cromatografia de afinidad.

El material de IL-18BP tras la captura se analiz6 para la N-glicanaci6n, tal como se describi6 en el anterior ejemplo

30 1.

El numero de carga hipotetico, denominado numero Z, se calcul6 como se describe en Gervais et al. (2003). Brevemente, el numero Z se define como la suma de los productos de las areas respectivas (A) en la regi6n neutra, mono-, di-, tri-, tetra-y pentasialilada de las especies de N-glicanos, cada una multiplicada por la correspondiente carga:

Z = A(neutra) x 0 + A(mono) x 1 + A(di) x 2 + A(tri) x 3 + A(tetra) x 4 + A(penta) x 5

Los resultados se muestran en la figura 8, que demuestra que, a pesar de algunas diferencias cualitativas principalmente en los grupos disialilados, los datos del cartografiado de los N-glicanos indican que la sialilaci6n del producto es comparable para las condiciones del proceso de perfusi6n (Z = 149) y semicontinuo (Z = 154), en terminos de cantidad.

El material de IL-18BP ("material recolectado bruto"), derivado del proceso semicontinuo o derivado del proceso de perfusi6n, tambien se analiz6 mediante una electroforesis capilar de zonas (CZE) para las isoformas con diferente glicosilaci6n ("glicoformas"), segun el protocolo descrito en detalle a continuaci6n.

La distribuci6n de las isoformas despues se compar6 con la IL-18BP purificada, derivada del proceso semicontinuo o de perfusi6n.

El material recolectado bruto se someti6 a una etapa de microcaptura en un cartucho Sep-Pak® tC2 (Waters), seguido de una etapa de desalaci6n mediante ultrafiltraci6n Centricon® 10 (Millipore), antes de ser inyectado en el capilar. La IL-18BP purificada se obtuvo fundamentalmente como se describe en la solicitud de patente WO 2005/049649, pero con una etapa de captura diferente basada en una cromatografia de afinidad. Brevemente, las etapas de purificaci6n incluyen una cromatografia de afinidad de iones metalicos (sobre Chelating Sepharose FF), una cromatografia de inducci6n de carga hidr6foba (sobre Mep Hypercel), una cromatografia de intercambio i6nico (sobre CM-Sepharose FF, utilizando la corriente), una cromatografia de interacci6n hidr6foba (sobre Phenyl Sepharose Fast Flow HS), y una cromatografia en fase inversa (sobre Reverse Phase-Source 30 RPC). El material finalmente purificado se aplic6 directamente al capilar sin otra etapa de desalaci6n.

Metodo

Disolueiones para CZE

-

Tamp6n fosfato 5 mM de lavado/ensayo de CZE: se prepara mediante una diluci6n 1:10 de una disoluci6n madre de fosfato 50 mM, pH 7,0. Se filtra a traves de un filtro de 0,22 μm. Se prepara fresco.

-

NaOH 0,5 M (disoluci6n de lavado de CZE): se afaden 26,2 μl de NaOH al 50% a agua, volumen total de 1 ml. Se prepara fresco.

-

NaOH 1 M (disoluci6n de regeneraci6n de CZE): se afaden 52,4 μl de NaOH al 50% a agua, volumen total de 1 ml. Se prepara fresco.

-

Marcador neutro (diluci6n 1:10000): se afaden 10 μl de disoluci6n madre de marcador neutro a agua, volumen total de 1 ml. Se afaden 10 μl de esta diluci6n 1:100 de marcador neutro a agua, volumen total de 1 ml. Se conserva durante tres meses a 4 °C.

Analisis de CZE

Se trasladan ≥ 20 μl de muestra/referencia a viales de PCR que contienen 1/10 en volumen de marcador neutro, y se mezclan mediante pipeteado inverso, evitando la generaci6n de burbujas.

Parametros electroforeticos

Se afaden los siguientes reactivos en portadores de viales individuales, evitando la generaci6n de burbujas.

Tabla 4: Parametros electroforeticos para CZE Tabla 5: Programaci6n del analisis CZE

Reaetivos de entrada

Volumen del reaetivo Reaetivos de salida Volumen del reaetivo

Tamp6n de lavado

1,2 ml

Tamp6n de ensayo

1,2 ml Tamp6n de ensayo (3.3.1) 1,2 ml

Agua purificada

1,2 ml Agua purificada 1,2 ml

Disoluci6n de lavado de CZE

1,0 ml

Disoluci6n de regeneraci6n de CZE*

1,0 ml

Muestra

> 22 μl/vial de PCR

Residuo (agua purificada) 1

0,2 ml

Residuo (agua purificada) 2

0,2 ml

Aire*

Vial vacio

* se usa s6lo si es necesario

Aeonteeimiento

Valor Duraeian Vial de entrada Volumen del reaetivo Vial de salida

Presi6n de enjuagado

0,138 MPa 2,00 min Tamp6n de lavado 1,2 ml Residuo 1 (0,2 ml)

Presi6n de inyecci6n

0,003 MPa 5,0 seg Muestra ≥ 22 μl Tamp6n de ensayo (3.3.1)

Voltaje de separaci6n

25 KV 30,00 min Tamp6n de ensayo 1,2 ml Tamp6n de ensayo (3.3.1)

Presi6n de enjuagado

0,138 MPa 1,00 min Tamp6n de lavado 1,2 ml Residuo 1 (0,2 ml)

Presi6n de enjuagado

0,138 MPa 1,00 min Agua purificada 1,2 ml Residuo 1 (0,2 ml)

Presi6n de enjuagado

0,138 MPa 1,00 min Disoluci6n de lavado de CZE 1,0 ml Residuo 2 (0,2 ml)

Presi6n de enjuagado

0,276 MPa 2,00 min Agua purificada 1,2 ml Residuo 2 (0,2 ml)

Presi6n de enjuagado

0,276 MPa 2,00 min Tamp6n de lavado 1,2 ml Residuo 2 (0,2 ml)

Espera

Tamp6n de lavado 1,2 ml Tamp6n de ensayo (3.3.1)

Tabla 6: Programaci6n de la regeneraci6n del capilar de CZE

Aeonteeimiento

Valor Duraeian Vial de entrada Volumen del reaetivo Vial de salida

Presi6n de enjuagado

0,276 MPa 1,00 min Agua purificada 1,2 ml Residuo 2 (0,2 ml)

Presi6n de enjuagado

0,276 MPa 10,00 min Disoluci6n de regeneraci6n de CZE 1,0 ml Residuo 2 (0,2 ml)

Presi6n de enjuagado

0,276 MPa 4,00 min Agua purificada 1,2 ml Residuo 2 (0,2 ml)

Presi6n de enjuagado

0,276 MPa 1,00 min Tamp6n de lavado 1,2 ml Residuo 2 (0,2 ml)

Presi6n de enjuagado

0,003 MPa 30,00 min Tamp6n de lavado 1,2 ml Residuo 2 (0,2 ml)

Espera

Tamp6n de ensayo 1,2 ml Tamp6n de ensayo (3.3.1)

Longitud del capilar al detector/longitud total: 50/60 cm Polaridad: positiva a negativa (directa)

Temperatura del capilar = 25 ± 2 °C Temperatura de la bandeja de muestras = 10 ± 2 °C Detecci6n: 214 nm

Protocolos de inyeccion

Debe haber al menos tres inyecciones del material de referencia patr6n para acondicionar el capilar.

-

Referencia patr6n 1 (inicio)

-

Una inyecci6n de muestra 1

-

Una inyecci6n de muestra 2

-

Una inyecci6n de muestra 3

-

Una inyecci6n de muestra4

-

Referencia patr6n 2 (final)

Nota: para aumentar la reproducibilidad, puede analizarse un maximo de 4 muestras en una secuencia entre la referencia 1 y la referencia 2 utilizando el mismo tamp6n de ensayo de CZE. Como alternativa, pueden utilizarse para cada muestra dos referencias que forman un intervalo, como se describe a

continuaci6n. Deben realizarse al menos tres inyecciones del material de referencia patr6n para acondicionar el capilar. -Referencia patr6n (inicio 1)

-

Una inyecci6n de muestra 1 -Referencia patr6n (final 1/inicio 2)

-

Una inyecci6n de muestra 2

-Referencia patr6n replicada (final 2/inicio 3)

-Una inyecci6n de muestra 3 -Referencia patr6n replicada (final 3)

Analisis de los datos

El material de referencia patr6n se emplea para la comparaci6n de los datos de las muestras.

Los electroferogramas superpuestos y apilados de las muestras y ambas referencias patr6n que forman el intervalo (inicio/final) se imprimen y se archivan.

Determinacion de los tiempos de migracion MT2 y MT3

Se determinan los tiempos de migraci6n MT2 y MT3 en los valles izquierdo y derecho de los picos -3 y +3 de la referencia patr6n (inicio). El pico 0 es el pico principal de la referencia.

Clasificacion de las isoformas

Debido a la alta acidez del perfil de glicoproteinas de la IL-18BP, las isoformas entre MT2 y MT3 se denominan "isoformas acidas". Las isoformas con un tiempo de migraci6n mayor que MT3 se denominan "isoformas muy acidas". Las isoformas con un tiempo de migraci6n menor que MT2 se denominan "isoformas menos acidas".

En algunas circunstancias, puede ser necesario afadir la clase de "isoformas basicas", definida como isoformas con unos tiempos de migraci6n menores que MT1.

Estimacion de la abundancia de las isoformas

La referencia y cada muestra se analizan utilizando las funciones: pico manual entre MT1-M2, MT2-MT3 y MT3-MT4; la linea de base manual entre 5 y 28 minutos, y la integracion OFF entre 0 y MT1, y entre MT4 y 30 minutos. Se modifican las funciones Anchura y Umbral de forma manual para obtener una integraci6n de tres grupos de picos entre MT1-M2 (isoformas menos acidas), MT2-MT3 (isoformas acidas) y MT3-MT4 (isoformas muy acidas) similar al

mostrado anteriormente para el patr6n de referencia.

5 Cuando sea necesario, se afade el grupo de picos que se corresponden con las "isoformas basicas" definidas como las isoformas con unos tiempos de migraci6n menores que MT1, y la anterior f6rmula se corrige en consecuencia.

Resultados

Este metodo de CZE se aplic6 a muestras recolectadas brutas (figura 9) y a muestras purificadas para el proceso de perfusi6n y semicontinuo. A pesar de algunas diferencias observadas para las muestras recolectadas pretratadas

10 (por ejemplo, una mayor proporci6n de isoformas basicas con el proceso de perfusi6n), estas isoformas basicas fueron retiradas con exito mediante una cromatografia de intercambio i6nico durante el proceso de purificaci6n (los datos no se muestran). Por tanto, para el producto purificado, se obtuvo un perfil de isoformas comparable para ambos procesos (figura 10).

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Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un proceso para producir una proteina de uni6n a interleuquina-18 (IL-18BP) recombinante en celulas de ovario de hamster chino (CHO) en un biorreactor en condiciones de cultivo sin suero, en el que el proceso es un proceso discontinuo que comprende las etapas de:

   5 a) una fase de propagaci6n celular a 37 °C; b) opcionalmente, una fase intermedia a 33 °C; c) una fase de producci6n a 29 °C. 2.- El proceso segun la reivindicaci6n 1, en el que. 3.-El proceso segun la reivindicaci6n 2, en el que la densidad celular total en la fase de producci6n varia entre 4 a 8

   10 x 106 celulas por ml por dia a lo largo de al menos 10 dias de cultivo celular. 4.-El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la viabilidad varia entre 100% y 80%. 5.-El proceso segun la reivindicaci6n 4, en el que la viabilidad varia entre 100% y 80% a lo largo de al menos 10

   dias de cultivo celular. 6.-El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la productividad de proteinas es mayor 15 que aproximadamente 150 mg o aproximadamente 350 mg por l por dia.
2. 7.-El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas la etapa de recolectar el sobrenadante del cultivo celular. 8.-El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende ademas la etapa de purificar la IL

   18BP. 20 9.-El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende ademas la etapa de formular la IL18BP en una composici6n farmaceutica.