ES2292127T3 - Uso de un medio de cultivo celular exento de suero para la produccion de il-18bp en celulas de mamiferos. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para el cultivo de células que producen IL-18BP, comprendiendo la etapa de crecimiento de las células en un medio de cultivo celular que está libre de componentes derivados de suero animal, en el que el medio de cultivo celular comprende: Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l; Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l; Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0, 005 y aproximadamente 0, 015 mg/l; Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2, 5 y aproximadamente 6 mg/l.
Description
Uso de un medio de cultivo celular exento de
suero para la producción de IL-18BP en células de
mamíferos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención está en el campo del
cultivo de células mamíferas bajo condiciones de cultivo sin suero.
En particular, se refiere al crecimiento de células mamíferas tales
como las células de Ovario de Hámster Chino (CHO, del Inglés
"Chinese Hamster Ovary"). Las células producen una proteína
recombinante llamada proteína de unión a interleuquina 18
(IL-18BP, del Inglés
"Interleukin-18 Binding Protein").
La presente invención se refiere a un proceso
que usa un medio sin suero para el crecimiento y mantenimiento de
células mamíferas en cultivo.
Actualmente, el cultivo celular se usa mucho
para la producción de diversos productos biológicamente activos,
tales como vacunas víricas, anticuerpos monoclonales,
inmunoreguladores no anticuerpo, factores de crecimiento
polipeptídicos, hormonas, enzimas, antígenos específicos de tumor,
etc. Estos productos se producen mediante células normales o
transformadas y modificadas por ingeniería genética.
Para cultivar células, antiguamente se
complementaba el medio de cultivo con suero, el cual servía como
nutriente universal para el crecimiento y mantenimiento de todas
las líneas celulares mamíferas que producen los productos
biológicamente activos. El suero contiene hormonas, factores de
crecimiento, proteínas vehículo, factores de unión y propagación,
nutrientes, elementos traza, etc. Los medios de cultivo normalmente
contenían hasta aproximadamente 10% de suero animal, tal como suero
bovino fetal (FBS, del Inglés "Fetal Bovine Serum"), también
llamado suero de ternera fetal (FCS, del Inglés "Fetal Calf
Serum").
Aunque se use mucho, el suero tiene muchas
limitaciones. Contiene alto niveles de numerosas proteínas que
interfieren con las cantidades limitadas de la proteína deseada de
interés producida por las células. Estas proteínas derivadas del
suero se deben separar del producto durante el proceso a corriente
tal como la purificación de la proteína de interés, lo cual
complica el proceso e incrementa el coste.
La llegada de la BSE (del Inglés "Bovine
Spongiform Encephalopathy"; Encefalopatía Espongiforme Bovina),
una enfermedad neurodegenerativa transmisible del ganado con un
largo periodo de latencia o incubación, ha planteado aspectos
reguladores sobre el uso de sueros derivados de animal en la
producción de productos biológicamente activos.
Por lo tanto, hay una gran demanda del
desarrollo de medios alternativos sin fuentes animales que sostengan
el crecimiento celular y mantenga las células durante la producción
de productos biológicamente activos.
Generalmente, los medios de cultivo celular
comprenden muchos componentes de diferentes categorías, tales como
aminoácidos, vitaminas, sales, ácidos grasos y compuestos
adicionales:
- -
- Aminoácidos: por ejemplo, el documento US 6.048.728 (Inlow et al.) revela que se pueden usar los siguientes aminoácidos en un medio de cultivo celular: Alanina, Arginina, Ácido Aspártico, Cisteína, Ácido Glutámico, Glutamina, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenialanina, Prolina, Serina, Triptófano, Tirosina, Treonina y Valina.
- -
- Vitaminas: el documento US 2003/0096414 (Ciccarone et al.) o el documento US 5.811.299 (Renner et al.), por ejemplo, describen que las siguientes vitaminas se pueden usar en un medio de cultivo celular: Biotina, Pantotenato, Cloruro de Colina, Ácido Fólico, Mioinositol, Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina, Putrescina.
- -
- Sales: por ejemplo, el documento US 6.399.381 (Blum et al.) revela un medio que comprende CaCl_{2}, KCl, MgCl_{2}, NaCl, Fosfato de Sodio Monobásico, Fosfato de Sodio Dibásico, Selenito de Sodio, CuSO_{4}, ZnCl_{2}. Otro ejemplo de un documento que revela las sales inorgánicas que se pueden usar en un medio de cultivo es el documento US 2003/0153042 (Arnold et al.), que describe un medio que comprende CaCl_{2}, KCl, MgCl_{2}, NaCl, Fosfato de Sodio Monobásico, Fosfato de Sodio Dibásico, CuCl_{2}.2H_{2}O, ZnCl_{2}.
- -
- Ácidos grasos: se sabe que los ácidos grasos que se usan en los medios son: Ácido Araquidónico, Ácido Linoleico, Ácido Oleico, Ácido Laurico, Ácido Mirístico, así como metil-beta-ciclodextrina, véase, por ejemplo, el documento US 5.045.468 (Darfler). Se debería indicar que la ciclodextrina no es un lípido per se, sino que tiene la capacidad de formar un complejo con lípidos y, por tanto, se usa para disolver los lípidos en el medio de cultivo celular.
- -
- Los componentes adicionales, usados en particular en el marco de los medios de cultivo celular sin suero, son compuestos tales como glucosa, glutamina, piruvato de Na, insulina o etanolamina (por ejemplo, el documento EP 274 445) o un agente protector tal como Pluronic F68. Pluronic® F68 (también conocido como Poloxamer 188) es un copolímero de bloqueo de óxido de etileno (OE) y óxido de propileno (OP).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los "medios básicos" estándar también son
conocidos por los expertos en la técnica. Estos medios ya contienen
varios de los componentes de medio anteriormente mencionados.
Ejemplos de tales medios que se aplican mucho son el Medio de Eagle
Modificado por Dulbecco (DMEM, del Inglés "Dulbecco's Modified
Eagle's Medium"), el Medio del "Rosswell Park Memorial
Institute" (RPMI) o el medio de Ham.
Para el desarrollo y suministro de productos
biológicamente activos, tales como proteínas terapéuticas o vacunas,
se deben producir grandes cantidades. Las células adecuadas que se
usan mucho para la producción de polipéptidos resultan ser las
células de Ovario de Hámster Chino (CHO).
Las células CHO fueron cultivadas primero por
Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) a partir de una biopsia
de un ovario de un hámster Chino hembra. A partir de estas células
originales se prepararon varias sublíneas con diversas
características. Una de estas líneas de células CHO,
CHO-K1, es requeriente de prolina y es diploide
para el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR). Otra línea
derivada de esta línea celular es una línea celular CHO deficiente
de DHFR (CHO DUK B11)(PNAS 77, 1980, 4.216-4.220),
la cual se caracteriza por la pérdida de la función de DHFR como
consecuencia de una mutación en un gen de DHFR y la posterior
pérdida del otro gen.
Células adicionales que se usan frecuentemente
para la producción de proteínas destinadas a la administración a
humanos son las líneas celulares humanas tales como la línea celular
de fibrosarcoma humano HT1080 o la línea celular de riñón de
embrión humano 293.
Una proteína terapéutica de interés es la
proteína de unión a interleuquina 18 (IL-18BP).
IL-18BP es una proteína soluble que tiene una alta
afinidad por la IL-18. Se aisló primero a partir de
orina humana y se clonaron los ADNcs humanos y de ratón así como el
gen humano (Novick et al., 1999; documento WO 99/09063). La
proteína se ha denominado proteína de unión a IL-18
(IL-18BP). El nombre no patentado internacional de
IL-18BP es tadekinig alfa.
IL-18BP no es el dominio
extracelular de uno de los receptores de IL-18
conocidos, sino una proteína de circulación natural secretada.
Pertenece a una familia nueva de proteínas secretadas, que incluye
además varias proteínas codificadas por Poxvirus (Novick et
al., 1999). La IL-18BP urinaria así como
recombinante se une específicamente a IL-18 con una
alta afinidad y modula la afinidad biológica de
IL-18.
Se localizó el gen de IL-18BP en
el cromosoma humano 11q13 y no se encontró exón codificador de un
dominio de transmembrana en una secuencia genómica de 8,3 kb. Hasta
ahora se han encontrado cuatro variantes de maduración por corte y
empalme o isoformas de IL-18BP generadas mediante
maduración por corte y empalme ("splicing") alternativa de
ARNm en humanos. Se denominaron IL-18BP a, b, c y d,
compartiendo todas el mismo terminal N y diferenciándose en el
terminal C (Novick et al., 1999). Estas isoformas varían en
su capacidad para unirse a IL-18. De las cuatro, se
sabe que las isoformas a y c de IL-18BP tienen una
capacidad de neutralización de IL-18. La isoforma
de IL-18BP humana se une a IL-18
murina.
Se ha sugerido la IL-18BP como
proteína terapéutica en varias enfermedades y trastornos, tales como
psoriasis, Enfermedad de Crohn, artritis reumatoidea, artritis
psoriásica, lesión de hígado, sepsis, ateroesclerosis, enfermedades
cardiacas isquémicas, alergias, etc., por ejemplo, revelados en los
documentos WO 9909063, WO 0107480, WO 0162285, WO 0185201, WO
02060479, WO 02096456, WO 03080104, WO 02092008, WO 02101049, WO
03013577.
Por tanto, hay una necesidad de un proceso de
fabricación eficaz para la producción de IL-18BP en
cultivo celular y, preferentemente, un proceso que se opere bajo
condiciones sin suero.
La presente invención se basa en el desarrollo
de un proceso para el cultivo de células en un medio de cultivo
celular que esté libre de componentes derivados de suero animal y a
la vez sea altamente eficaz para el crecimiento celular y
mantenimiento del cultivo celular mamífero. El cultivo de las
células se lleva a cabo para la producción de proteínas en las
células.
De acuerdo con la presente invención, las
células producen IL-18BP o se han modificado para
producir IL-18BP. La proteína se puede aislar y
purificar a partir del medio de cultivo celular (sobrenadante) y
formular en una composición farmacéutica destinada a la
administración en humanos o animales.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención
se refiere a un proceso para el cultivo de células que producen
IL-18BP, que comprende la etapa de crecimiento de
las células en un medio de cultivo celular sin componentes
derivados de suero animal, en el que el medio de cultivo celular
comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
un proceso para la producción de IL-18BP que
comprende la etapa de cultivo de células que expresan
IL-18BP en un medio de cultivo celular sin
componentes derivados de suero animal, en el que el medio de
cultivo celular comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l.
Un tercer aspecto de la invención se refiere al
uso de un medio de acuerdo con la invención para la producción de
una proteína de interés.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere al
uso del medio de la invención para el crecimiento de células en
cultivo.
Un quinto aspecto de la invención se refiere al
uso de un medio de acuerdo con la invención para el mantenimiento
de las células en cultivo durante la fase de producción de un
polipéptido de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1 Se cultivaron células CHO que expresan
IL-18BP en suspensión en medio sin suero de acuerdo
con la invención con diluciones repetidas con medio fresco durante
60 días (n=10). La Fig. 1 muestra la densidad celular viable;
Fig. 2, muestra las células viables
acumuladas;
Fig. 3, muestra el tiempo de duplicación; y
Fig. 4, muestra la concentración de glucosa y
lactato en el sobrenadante.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se basa en el desarrollo
de un proceso para el crecimiento y mantenimiento de células que
expresan IL-18BP, y para la producción de
IL-18BP, en un medio de cultivo celular que está
libre de componentes derivados de suero.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
un proceso para la producción de IL-18BP, que
comprende la etapa de cultivo de una célula que expresa
IL-18BP en un medio de cultivo celular sin
componentes derivados de suero animal, en el que el medio de
cultivo celular comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 700 y aproximadamente 1.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 5.000, preferentemente entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,003 y aproximadamente 0,02 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l.
Además, la invención se refiere a un proceso de
cultivo de células que expresan IL-18BP, que
comprende la etapa de crecimiento de la célula en un medio de
cultivo celular sin componentes derivados de suero animal, en el
que el medio de cultivo comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 700 y aproximadamente 1.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 5.000, preferentemente entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,003 y aproximadamente 0,02 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, el proceso comprende además la
etapa de recolección del medio que comprende la proteína de
interés.
En una realización preferida adicional, el
proceso comprende además el aislamiento de la proteína de
interés.
En una realización preferida adicional, el
proceso comprende además la formulación de la proteína aislada con
un vehículo farmacéuticamente aceptable para obtener una composición
farmacéutica.
\vskip1.000000\baselineskip
En un tercer aspecto, la invención se refiere al
uso del medio de cultivo celular que comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 700 y aproximadamente 1.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 5.000, preferentemente entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,003 y aproximadamente 0,02 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l
para la producción de un
polipéptido de
interés.
\vskip1.000000\baselineskip
En un cuarto aspecto, la invención se refiere al
uso de un medio de cultivo celular que comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 700 y aproximadamente 1.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 5.000, preferentemente entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,003 y aproximadamente 0,02 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l
para el crecimiento de células que
expresan IL-18BP en
cultivo.
\newpage
En un quinto aspecto, la invención se refiere al
uso de un medio de cultivo celular que comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 700 y aproximadamente 1.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 5.000, preferentemente entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,003 y aproximadamente 0,02 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l
para el mantenimiento de células
que expresan IL-18BP en cultivo, por ejemplo,
durante la fase de producción de un polipéptido de
interés.
De acuerdo con los procesos y usos de la
presente invención, el medio de cultivo celular comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 700 y aproximadamente 1.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 5.000, preferentemente entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,003 y aproximadamente 0,02 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l.
En el marco de la presente invención, la
Asparragina se puede usar en cualquier concentración que oscila
entre aproximadamente 700 y 1.000 mg/l, por ejemplo, a 705, 710,
715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775,
780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840,
845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905,
910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970,
975, 980, 985, 990, 995 mg/l.
En el marco de la presente invención, el Cloruro
de Sodio se puede usar a una concentración que oscila entre
aproximadamente 2.000 y aproximadamente 5.000 mg/l, por ejemplo, a
2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900,
3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, 3.600, 3.700, 3.800,
3.900, 4.000, 4.100, 4.200, 4.300, 4.400, 4.500, 4.600, 4.700,
4.800, 4.900 mg/l.
En el marco de la presente invención, el
Selenito se puede usar a una concentración que oscila entre
aproximadamente 0,003 y aproximadamente 0,02 mg/l, por ejemplo, a
0,0035, 0,004, 0,0045, 0,005, 0,0055, 0,006, 0,0065, 0,007, 0,0075,
0,008, 0,0085, 0,009, 0,0095, 0,01, 0,011, 0,012, 0,013, 0,014,
0,015, 0,016, 0,017, 0,018, 0,019, 0,02 mg/l.
En el marco de la presente invención, el
Hidrolizado de trigo se puede usar a una concentración que oscila
entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 mg/l, por
ejemplo, a 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000,
7.500, 8.000, 8.500, 9.000, 9.500, 9.600, 9.700, 9.800, 9.900,
10.000, 10.100, 10.200, 10.300, 10.400, 10.500, 10.600, 10.700,
10.800, 10.900, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500,
14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 18.000,
18.500, 19.000, 19.500 mg/ml.
En el marco de la presente invención, la
Insulina se puede usar a una concentración que oscila entre
aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, por ejemplo, a 1,25,
1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5,
4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8,
8,25, 8,5, 8,75 mg/l.
Tal como se muestra en los Ejemplos de a
continuación, en el proceso de la invención al usar un medio que
comprendía estos componentes dentro de los intervalos indicados se
sostuvo un excelente crecimiento celular y mantenimiento durante un
prolongado periodo de tiempo.
La etapa de cultivo del proceso de la invención
se puede llevar a cabo en cualquier ambiente adecuado, tal como
placas Petri, matraces T o frascos rotativos, pero preferentemente
en recipientes que tengan grandes volúmenes tal como, por ejemplo,
un bioreactor. Los matraces T y los frascos rotativos son
particularmente adecuados para el crecimiento de células, y para la
producción de proteína las células preferentemente se mantienen en
un bioreactor.
Las células a usar en el marco de los diversos
aspectos de la presente invención son preferentemente células
mamíferas. Pueden ser de origen humano o animal. Ejemplos de células
mamíferas que se pueden cultivar en el proceso de acuerdo con la
presente invención incluyen, por ejemplo: células 3T3, células COS,
células de osteosarcoma humano, células MRC-5,
células BHK, células VERO, células CHO, células
rCHO-tPA, células con antígeno de superficie
rCHO-Hep B, células HEK 293, células rHEK 293,
células con antígeno de superficie rC127-Hep B,
fibroblastos humanos normales, células de estroma, hepatocitos,
células PER.C6 y células amnióticas permanentes humanas. Ejemplos
de hibridomas que se pueden cultivar en el proceso de acuerdo con la
presente invención incluyen, por ejemplo: células DA4.4, células
123A, células 127A, células GAMMA y células
67-9-B.
Es muy preferido cultivar una célula de Ovario
de Hámster Chino (célula CHO) de acuerdo con la presente
invención.
Las células cultivadas de acuerdo con la
presente invención pueden crecer en suspensión o, para células
dependientes de anclaje, unidas a un soporte sólido. Se pueden usar
Microvehículos y discos de Fibra-Cel® en cultivo de
célula mamífera para el crecimiento de células dependientes de
anclaje y están entre las plataformas tecnológicas establecidas
para la producción industrial de proteínas (véase, por ejemplo,
Bohak et al., 1987; Petti et al.
1994).
1994).
En el marco de los procesos y usos de la
presente invención, la Asparragina está comprendida de manera
ventajosa como Asparragina. H_{2}O (TCL al 99%, siendo TCL (del
Inglés "Thin Layer Chromatography") la cromatografía de capa
fina).
El selenito, por ejemplo, puede está comprendido
en el medio como selenito de sodio.
El hidrolizado de trigo es un componente
derivado de planta, el cual es parte del medio de la invención en
base al hecho de que las células también pueden usar aminoácidos que
estén en forma de péptido. Los péptidos pueden oscilar en tamaño
entre dos aminoácidos y muchos aminoácidos. Los péptidos que se
derivan mediante la hidrólisis de proteínas proporcionan una fuente
suplementaria (indefinida) de aminoácidos de forma que sostiene el
crecimiento superior de varias líneas/tipos celulares.
La insulina a usar en el marco del medio de la
invención se puede derivar de cualquier fuente y especie, siempre
que sostenga el crecimiento y el mantenimiento de la línea celular o
tipo celular particular para el cual se usa el medio.
Preferentemente, la insulina puede ser recombinante. Además, se
prefiere que la insulina esté derivada de la especie que
corresponde a la especie de la cual se deriva la línea celular o el
tipo celular, o que sea insulina humana.
Los intervalos de concentración preferidos de
los compuestos del medio a usar en el proceso de la invención son
los siguientes:
- -
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 810 y aproximadamente 850 mg/l, lo más preferido aproximadamente 830.
- -
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.400 y aproximadamente 3.600 mg/l, lo más preferido aproximadamente 3.500 mg/l.
- -
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,012 mg/l, lo más preferido aproximadamente 0,0110 mg/l.
- -
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 8.000 y aproximadamente 12.000 mg/l, lo más preferido aproximadamente 10.000 mg/l.
- -
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5 mg/l, lo más preferido aproximadamente 4 mg/l.
En una realización preferida, el medio comprende
además glucosa a una concentración que oscila entre aproximadamente
500 y aproximadamente 5.500 mg/l, preferentemente aproximadamente
1.000 mg/l o aproximadamente 4.500 o aproximadamente 5.000
mg/l.
En una realización preferida adicional, el medio
comprende uno o más aminoácidos. Los aminoácidos se seleccionan
entre: Alanina, Arginina, Ácido Aspártico, Cisteína, Ácido
Glutámico, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina,
Metionina, Fenialanina, Prolina, Serina, Triptófano, Tirosina,
Treonina y Valina, pero no Glutamina.
En una realización alternativa, la Glutamina se
añade al medio. Preferentemente, la glutamina se puede añadir al
medio durante el cultivo celular (por ejemplo, modo de crecimiento,
mantenimiento, producción).
Preferentemente, el medio de acuerdo con la
invención comprende además vitaminas. Las vitaminas que se prefieren
en el medio de la invención se seleccionan entre: Biotina,
Pantotenato, Cloruro de Colina, Ácido Fólico,
Mio-inositol, Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina,
Vitamina B12, Tiamina y Putrescina.
Preferentemente, el medio de acuerdo con la
invención comprende además sales inorgánicas y elementos traza. Los
iones son preferentemente Ca^{2+}, K^{+}, Mg^{2+}, Na^{+},
Cl^{-}, Fosfato, Cu^{2+}, Zn^{2+}. Esas sales y elementos
traza preferentemente se seleccionan entre: CaCl_{2} anhidro, KCl,
MgCl_{2} anhidro, NaCl, Fosfato de Sodio Monobásico, Fosfato de
Sodio Dibásico, CuCl_{2}.2H_{2}O y ZnCl_{2}.
Preferentemente, el medio de la invención
comprende además un tampón. Se pueden usar muchos tampones en el
marco del medio de la invención, tal como el tampón bicarbonato de
sodio, Tris, BES (ácido
N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico),
tampón glicina o similares. Un tampón iónico anfótero es
particularmente útil para el medio de la invención. Un tampón
iónico anfótero preferido que se puede usar es HEPES (ácido
N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanosulfónico)
en forma ácida.
En otra realización preferida, el medio
comprende además ácidos grasos. Tales ácidos grasos preferentemente
se seleccionan entre: Ácido Araquidónico, Ácido Linoleico, Ácido
Oleico, Ácido Laurico, Ácido Mirístico y Ciclodextrina, la cual no
es un lípido per se sino simplemente sirve en la disolución
de lípidos en el medio. La ciclodextrina es preferentemente
metil-beta-ciclodextrina.
Se pueden usar hidrolizados adicionales en el
marco de la presente invención, siempre que no sean derivados de
fuentes animales. Preferentemente, el medio de la invención puede
comprender además un hidrolizado de soja.
También se prefiere que el medio de la invención
comprenda además esteroides tales como, por ejemplo, cortisona o
hidrocortisona y/o fuentes de energía adicionales tales como, por
ejemplo, piruvato, por ejemplo piruvato de Na, y/o un agente
protector tal como Pluronic F68.
En el marco de los procesos y usos de la
presente invención, se puede usar cualquier medio sin suero básico
conocido y adecuado, siempre que estén presentes los siguientes
compuestos:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 700 y aproximadamente 1.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 5.000, preferentemente entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,003 y aproximadamente 0,02 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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A continuación, se enumeran ejemplos de medios
sin suero básicos conocidos:
Los procesos y usos de la invención
preferentemente sirven para producir un polipéptido de interés.
El polipéptido de interés puede ser, por
ejemplo, una proteína naturalmente secretada, una proteína
normalmente citoplasmática, una proteína normalmente de
transmembrana o un anticuerpo humano o humanizado. Cuando la
proteína de interés es una proteína normalmente citoplasmática o
una normalmente de transmembrana, la proteína preferentemente se ha
modificado por ingeniería genética para convertirla en soluble.
El polipéptido de interés puede ser de cualquier
origen. Los polipéptidos preferidos de interés son de origen humano
y, más preferentemente, las proteínas de interés son proteínas
terapéuticas.
La proteína de interés puede ser una hormona,
una proteína de unión a citoquina, un interferón, un receptor
soluble o un anticuerpo.
Las proteínas terapéuticas que se pueden
producir de acuerdo con un método de la presente invención incluyen,
por ejemplo: gonadotropina coriónica, hormona estimuladora del
folículo, hormona coriogonadotrópica-lutropina,
hormona estimuladora del tiroides, hormona de crecimiento humana,
interferones (por ejemplo, interferón beta-1a,
interferón beta-1b), receptores de interferón (por
ejemplo, receptor de interferón gama), receptores TNF p55 y p75,
proteínas de fusión TACI-Fc, interleuquinas (por
ejemplo, interleuquina-2,
interleuquina-11), proteínas de unión a
interleuquina (por ejemplo, proteína de unión a
interleuquina-18), anticuerpos
anti-CD11a, eritropoyetina, factor estimulador de
colonia de granulocito, factor estimulador de colonia de
granulocito-macrófago, hormonas peptídicas de
pituitaria, gonadotropina menopáusica, factores de crecimiento
similares a insulina (por ejemplo, somatomedina-C),
factor de crecimiento de queratinocito, factor neurotrófico derivado
de la línea celular glial, trombomodulina, factor de crecimiento de
fibroblasto básico, insulina, Factor VIII, somatropina, proteína
morfogénica de hueso 2, factor de crecimiento derivado de plaqueta,
hirudina, epoyetina, proteína de fusión LFA-3/IgG1
recombinante, glucocerebrosidasa, y muteinas, fragmentos, formas
solubles, derivados funcionales, proteínas de fusión de las
mismas.
Particularmente, el polipéptido se puede
seleccionar entre el grupo que consiste en: gonadotropina coriónica
(CG, del Inglés "Chorionic Gonadotropin"), hormona estimuladora
del folículo (FSH, del Inglés
"Follicle-Stimulating Hormone"), hormona
coriogonadotrópica-lutropina (LH), hormona
estimuladora del tiroides (TSH, "Thyroid Stimulating
Hormone"), hormona de crecimiento humana (hGH, del Inglés
"human Growth Hormone"), interferones (por ejemplo, interferón
beta-1a, interferón beta 1b), receptores de
interferón (por ejemplo, receptor interferón gama), receptores TNF
p55 y p75, interleuquinas (por ejemplo,
interleuquina-2, interleuquina-11),
proteínas de unión a interleuquina (por ejemplo, proteína de unión
a interleuquina-18), anticuerpos
anti-CD11a, y muteínas, fragmentos, formas
solubles, derivados funcionales, proteínas de fusión de los
mismos.
Polipéptidos adicionales de interés incluyen,
por ejemplo: eritropoyetina, factor estimulador de colonia de
granulocito, factor estimulador de colonia de
granulocito-macrófago, hormonas peptídicas de
pituitaria, gonadotropina menopáusica, factores de crecimiento
similares a insulina (por ejemplo, somatomedina-C),
factor de crecimiento de queratinocito, factor neurotrófico
derivado de la línea celular glial, trombomodulina, factor de
crecimiento de fibroblasto básico, insulina, Factor VIII,
somatropina, proteína morfogénica de hueso 2, factor de crecimiento
derivado de plaqueta, hirudina, epoyetina, proteína de fusión
LFA-3/IgG1 recombinante, glucocerebrosidasa y
muteínas, fragmentos, formas solubles, derivados funcionales,
proteínas de fusión de los mismos.
La proteína de interés debería ser formulada con
un vehículo farmacéuticamente aceptable, el resultado del proceso
es una composición farmacéutica.
La definición de "farmacéuticamente
aceptable" quiere decir que abarca cualquier vehículo que no
interfiera con la eficacia de la actividad biológica del
ingrediente activo y que no sea tóxico al hospedante al cual se
administra. Por ejemplo, para la administración parenteral,
la(s) proteína(s) activa(s) se puede(n)
formular en una forma de dosificación unitaria para la inyección en
vehiculizantes tales como disolución salina, disolución de
dextrosa, albúmina de suero y disolución de Ringer.
A continuación, se puede administrar la
composición farmacéutica formulada de acuerdo con la invención a un
individuo de una diversidad de maneras. Las vías de administración
incluyen: vías intradérmicas, transdérmicas (por ejemplo, en
formulaciones de liberación lenta), intramusculares,
intraperitoneales, intravenosas, subcutáneas, orales,
intracraneales, epidurales, tópicas, rectales e intranasales. Se
puede usar cualquier otra vía de administración terapéuticamente
eficaz, por ejemplo, absorción a través de tejidos epiteliales o
endoteliales o mediante terapia genética en la que se administra al
paciente una molécula de ADN codificadora del agente activo (por
ejemplo, vía un vector), la cual hace que el agente activo se
exprese y secrete in vivo. Además, la(s)
proteína(s) de acuerdo con la invención se puede(n)
administrar junto con otros componentes de agentes biológicamente
activos tal como tensoactivos, excipientes, vehículos, diluyentes y
vehiculizantes farmacéuticamente aceptables.
Para la administración parenteral (por ejemplo,
intravenosa, subcutánea, intramuscular), la(s)
proteína(s) activa(s) se puede(n) formular
como una disolución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado
conjuntamente con un vehiculizante parenteral farmacéuticamente
aceptable (por ejemplo, agua, disolución salina, disolución de
dextrosa) y aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo,
manitol) o la estabilidad química (por ejemplo, conservantes y
tampones). La formulación se esteriliza mediante técnicas comúnmente
usadas.
Los procesos y usos de la presente invención van
dirigidos a la producción de la proteína de unión a
interleuquina-18 (IL-18BP).
La IL-18BP puede ser natural, es
decir, IL-18BP que se da de forma natural.
Preferentemente, la IL-18BP a producir es de origen
humano. Puesto que IL-18BP es una proteína
secretada, soluble, se libera en el sobrenadante del cultivo
celular, o bien por medio de su péptido señal natural o por medio de
un péptido señal heterólogo, es decir, un péptido señal derivado de
otra proteína secretada que puede ser más eficaz en el sistema de
expresión particular usado.
El término "proteína de unión a
IL-18" se usa en la presente memoria de manera
sinónima con "IL-18BP". Este término se
refiere a proteínas de unión a IL-18 tal como las
definidas en el documento WO 99/09063 o en Novick et al.,
1999. El término IL-18BP incluye variantes de
maduración por corte y empalme y/o isoformas de las proteínas de
unión a IL-18, tal como las definidas en Kim et
al., 2.000, en particular las isoformas a y c humanas de
IL-18BP. El término "IL-18BP",
tal como se usa en la presente memoria, incluye además muteínas,
derivados funcionales, fracciones activas, proteínas fusionadas,
proteínas permutadas de manera circular y sales de
IL-18BP tal como se define en el documento WO
99/09063.
La IL-18BP que se produce al
usar el medio de la presente invención preferentemente es
glicosilada.
Tal como se usa en la presente memoria, el
término "muteínas" se refiere a análogos de una
IL-18BP, o análogos de una IL-18BP
vírica, en los que uno o más de los residuos de aminoácidos de una
IL-18BP natural o IL-18BP vírica se
reemplazan por diferentes residuos de aminoácidos, o se someten a
deleción, o uno o más residuos de aminoácidos se añaden a la
secuencia natural de una IL-18BP, o una
IL-18BP vírica, sin cambiar considerablemente la
actividad de los productos resultantes en comparación con la
IL-18BP de tipo natural o la IL-18BP
vírica. Estas muteínas se preparan mediante síntesis conocida y/o
mediante técnicas de mutagénesis dirigidas a sitio o cualquier otra
técnica conocida adecuada para esto.
Las muteínas de acuerdo con la presente
invención incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal
como ADN o ARN, el cual híbrida con ADN o ARN, que codifica una
IL-18BP o codifica una IL-18BP
vírica (documento WO 99/09063) bajo condiciones estrictas. El
término "condiciones estrictas" se refiere a condiciones de
hibridación y posterior lavado, a las cuales aquellos con un
conocimiento normal en la técnica se refieren de manera convencional
como "estrictas". Véase Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y.
\NAK\NAK6.3 y 6.4 (1987, 1992). Sin ser limitantes, ejemplos de
condiciones estrictas incluyen: condiciones de lavado de 12 a 20ºC
por debajo de la Tm calculada del híbrido bajo estudio en, por
ejemplo, 2xSSC y SDS al 0,5% durante 5 minutos, 2xSSC y SDS al 0,1%
durante 15 minutos; 0,1xSSC y SDS al 0,5% a 37ºC durante 30 a 60
minutos y, a continuación, 0,1xSSC y SDS al 0,5% a 68ºC durante 30 a
60 minutos. Aquellos con un conocimiento normal en esta técnica
entienden que las condiciones de severidad también dependen de la
longitud de las secuencias de ADN, las sondas de oligonucleótidos
(tal como 10 a 40 bases) o sondas de oligonucleótidos mezcladas. Si
se usan las sondas mezcladas, es preferible usar cloruro de
tetrametil amonio (TMAC, del Inglés "Tetramethyl Ammonium
Chloride") en lugar de SSC. Véase Ausubel, supra.
La identidad refleja una relación entre dos o
más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de
polinucleótidos, determinada comparando las secuencias. En general,
la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido
a nucleótido o aminoácido a aminoácido de los dos polinucleótidos o
las dos secuencias de polipéptidos, respectivamente, sobre la
longitud de las secuencias a comparar.
Para secuencias en las que no hay una
correspondencia exacta, se puede determinar un "% de
identidad". En general, las dos secuencias a comparar se alinean
para dar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede
incluir la inserción de "gaps" en o bien una o dos secuencias,
para aumentar el grado de alineación. Se puede determinar un % de
identidad sobre la longitud completa de cada una de las secuencias a
comparar (la llamada alineación global), que es particularmente
adecuado para secuencias de la misma o muy similar longitud, o
sobre longitudes definidas más cortas (la llamada alineación local),
que es más adecuado para secuencias de longitud distinta.
En la técnica se conocen bien los métodos para
comparar la identidad y la homología de dos o más secuencias. Así,
por ejemplo, se pueden usar programas disponibles en el Paquete de
Análisis Secuencial de Wisconsin, versión 9.1 (Devereux, J. et
al., 1984), por ejemplo, los programas BESTFIT y GAP, para
determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de
identidad y el % de homología entre dos secuencias de polipéptidos.
BESTFIT usa el algoritmo "homología local" de Smith y Waterman
(1981) y encuentra la mejor región única de similitud entre dos
secuencias. En la técnica también se conocen otros programas para
determinar la identidad y/o la similitud entre secuencias, por
ejemplo, la familia de programas BLAST (Altschul, S. F. et
al., 1990, Altschul, S. F. et al., 1997, accesible a
través de la página principal de la NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y
FASTA (Pearson, W.R.,
1990).
1990).
Cualquier muteína preferentemente tiene una
secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la de una
IL-18BP, o suficientemente duplicativa de una
IL-18BP vírica, para tener una actividad
sustancialmente similar a IL-18BP. Una actividad de
IL-18BP es su capacidad de unirse a
IL-18. Siempre que la muteína tenga una sustancial
actividad de unión a IL-18, se puede considera que
tiene actividad sustancialmente similar a IL-18BP.
Por tanto, se puede determinar si cualquier muteína dada tiene
sustancialmente la misma actividad que IL-18BP por
medio de experimentación rutinaria que comprende someter dicha
muteína, por ejemplo, a un ensayo de competición tipo sándwich
simple para determinar si se une o no a una IL-18
apropiadamente marcada, tal como radioinmunoensayo o ensayo
ELISA.
En una realización preferida, cualquier muteína
tiene al menos una identidad u homología del 40% con la secuencia
de o bien una IL-18BP o una IL-18BP
homóloga víricamente codificada, tal como la definida en el
documento WO 99/09063. Más preferentemente, tiene una identidad u
homología a esto de al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al
menos 80% o, más preferentemente, de al menos 90% o 95%.
Los cambios preferidos para las muteínas de
acuerdo con la presente invención son los que se conocen como
sustituciones "conservadoras". Las sustituciones de aminoácidos
conservadoras de polipéptidos o proteínas de
IL-18BP o IL-18BPs víricas, pueden
incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo que tienen
propiedades fisicoquímicas suficientemente similares que la
sustitución entre miembros del grupo conservará la función
biológica de la molécula (Grantham, 1974). Está claro que las
inserciones y deleciones de los aminoácidos también se pueden
realizar en las secuencias anteriormente definidas sin alterar su
función, particularmente si las inserciones o deleciones solamente
implican unos pocos aminoácidos, por ejemplo, por debajo de treinta,
y preferentemente por debajo de diez, y no extraen o desplazan
aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por
ejemplo, residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas
por tales deleciones y/o inserciones están dentro del ámbito de la
presente invención.
El término "proteína fusionada" se refiere
a un polipéptido que comprende una IL-18BP, o una
IL-18BP vírica, o una muteína o fragmento de la
misma, fusionado con otra proteína, la cual, por ejemplo, tiene un
prolongado tiempo de resistencia en los fluidos corporales. Así,
una IL-18BP o una IL-18BP vírica, se
puede fusionar a otra proteína, polipéptido o similar, por ejemplo,
una inmunoglobulina o un fragmento de la misma.
Como "fracciones activas" de una
IL-18BP, o una IL-18BP vírica,
muteínas y proteínas fusionadas, la presente invención incluye
cualquier fragmento o precursores de la cadena polipeptídica de la
molécula proteica sola o junto con moléculas asociadas o residuos
unidos a estas, por ejemplo, residuos de azúcar o fosfato, o
agregados de la molécula proteica o sus propios residuos de azúcar,
dicha fracción proporcionada tiene actividad sustancialmente
similar a IL-18BP.
Se pueden tomar las secuencias de
IL-18BP y sus variantes/isoformas de maduración por
corte y empalme del documento WO 99/09063 o de Novick et
al., 1999, así como de Kim et al., 2000.
Se debería usar la IL-18BP de la
invención como composición farmacéutica, tal composición
farmacéutica se puede usar para el tratamiento y/o prevención de
varias enfermedades o trastornos. Tales enfermedades o trastornos
son preferentemente trastornos mediados por IL-18.
En particular, la IL-18BP purificada se puede usar
para el tratamiento y/o prevención de: psoriasis, artritis
psoriásica, Enfermedad de Crohn, artritis reumatoidea, lesión de
hígado tal como cirrosis de hígado alcohólico, sepsis,
ateroesclerosis, enfermedades cardiacas isquémicas, alergias, en
particular hipersensibilidad tipo retardada y herida de cabeza
cerrada, tal como se describe en los documentos WO 9909063, WO
0107480, WO 0162285, WO 0185201, WO 02060479, WO 02096456, WO
03080104, WO 02092008, WO 02101049, WO 03013577.
Ahora al tener completamente descrita esta
invención, los expertos en la técnica apreciarán que la misma se
puede realizar dentro de un amplio intervalo de parámetros,
concentraciones y condiciones equivalentes sin apartarse del
espíritu y alcance de la invención y sin la experimentación
indebida.
Aunque esta invención se ha descrito junto con
sus realizaciones específicas, se entenderá que es capaz de
modificaciones adicionales. Esta solicitud está destinada a incluir
cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención
siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo
tales desviaciones de la presente descripción ya que están dentro
de la práctica conocida o habitual en la técnica a la cual pertenece
la invención y ya que se puede aplicar a las características
esenciales explicadas anteriormente en la presente memoria tal como
sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
La referencia a etapas de métodos conocidos,
etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos
convencionales no es ninguna manera de admisión que cualquier
aspecto, descripción o realización de la presente invención está
descrito, enseñado o sugerido en la técnica relevante.
Ejemplo
1
El medio de cultivo celular que se usó para los
experimentos descritos a continuación en el punto 1.2. era un medio
adaptado para contener los siguiente componentes en las siguientes
concentraciones:
- -
- Asparragina a una concentración de 830 mg/l;
- -
- Cloruro de Sodio a una concentración de 3.500 mg/l;
- -
- Selenito a una concentración de 0,0110 mg/l;
- -
- Hidrolizado de trigo a una concentración de 10.000 mg/l; e
- -
- Insulina a una concentración de 4 mg/l.
Este medio también contenía 4,5 g/l de glucosa.
Si el medio se usa para el modo de producción, se puede disminuir
la concentración de glucosa a 1 g/l. El medio contenía además todos
los aminoácidos excepto Glutamina. También estaban presentes en
este medio vitaminas, sales, ácidos grasos, HEPES como tampón,
Pluronic F68, Hidrocortisona, Piruvato de Na e Hidrolizado de soja.
A continuación, el medio se identifica como
SM-005.
Se inocularon matraces T o frascos rotativos con
células de un clon de CHO que expresaba y secretaba
IL-18BP que previamente se había establecido. Estas
células crecieron en suspensión y primero se aumentaron. Durante el
proceso de aumento celular, las células se cultivaron en suspensión
y se diluyeron sistemáticamente con volúmenes definidos de medio
SM-005 fresco en días fijados. Con el propósito de
hacer un seguimiento, se midieron la densidad celular, la
concentración de glucosa y lactato en cada etapa de dilución (véase
las figuras).
En el día 0, se descongeló un vial del Banco
Celular Maestro previamente establecido. A continuación, las
células originadas a partir de este vial se inocularon en un Matraz
de Cultivo de Tejido de 75 cm^{2} (TCF 75 cm^{2}, del Inglés
"Tissue Culturing Flask") en un volumen total de 30 ml de medio
SM-005 fresco. La concentración celular resultante
en el TCF alcanzó aproximadamente 0,20 millones de células/ml. Por
último, se incubó el TCF bajo agitación a una temperatura de
37ºC.
En el día 4, se transfirió el cultivo a un TCF
175 cm^{2} y se diluyó hasta 120 ml añadiendo medio
SM-005 fresco y precalentado.
En el día 8, se transfirió el cultivo a un RB850
cm^{2} y se diluyó hasta 400 ml añadiendo medio
SM-005 fresco y precalentado.
En el día 12, se diluyó el cultivo hasta 1.200
ml (relación de dilución de 1/3) añadiendo medio
SM-005 fresco y precalentado y, a continuación, se
repartió en 3 frascos rotativos RB850 cm^{2}, conteniendo cada uno
400 ml.
En el día 16, se diluyó el cultivo hasta 4.800
ml (relación de dilución de 1/4) añadiendo medio fresco y
precalentado y, a continuación, se repartió en 6 RB1750 cm^{2},
conteniendo cada uno 800 ml.
A partir del día 20 (D20, D23, D26,...hasta
D62), se diluyeron los RB1750 cm^{2} de una manera repetitiva
cada 3 días, respetando una relación de dilución de 1/4. En cada día
de dilución, se generaba el número requerido de RB1750 cm^{2} (al
menos 4 RB1750 cm^{2}). Por tanto, cada RB1750 cm^{2} se diluyó
desde 800 ml hasta 3.200 ml añadiendo medio fresco y precalentado
y, a continuación, se repartía en 4 RB1750 cm^{2}, conteniendo
cada uno 800 ml.
Para inocular bioreactores, se recogió el número
requerido de frascos rotativos en un día de dilución (entre D20 y
D60), se juntaron en un frasco de cristal estéril y se transfirieron
a los bioreactores.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 1 a 4 muestran los datos medidos
durante el proceso de preparación del inóculo (n=10). La Figura 1
muestra la densidad celular viable, la Figura 2 las células viables
acumuladas, la Figura 3 el tiempo de duplicación y la Figura 4 la
concentración de glucosa y lactato en el sobrenadante.
Después de una fase de adaptación del día 20, el
crecimiento de las células es muy uniforme y reproducible en el
medio sin suero. Las condiciones de crecimiento estable permiten
subcultivar células fácilmente mediante dilución repetida con una
relación 1:4 durante el prolongado periodo de tiempo (ensayado hasta
el día 62, tal como se muestra en las Figuras 1, 2, 3, 4).
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Claims (21)
1. Un proceso para el cultivo de células que
producen IL-18BP, comprendiendo la etapa de
crecimiento de las células en un medio de cultivo celular que está
libre de componentes derivados de suero animal, en el que el medio
de cultivo celular comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l.
2. Un proceso para la producción de
IL-18BP, comprendiendo la etapa de cultivo de una
célula que expresa IL-18BP en un medio de cultivo
celular que está libre de componentes derivados de suero animal, en
el que el medio de cultivo celular comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l.
3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, comprendiendo además la etapa de recolección del medio que
comprende la proteína de interés.
4. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, comprendiendo además el aislamiento de
la proteína de interés.
5. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, comprendiendo además la formulación de
la proteína aislada con un vehículo farmacéuticamente aceptable
para obtener una composición farmacéutica.
6. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que las células son células de
Ovario de Hámster Chino (CHO, del Inglés "Chinese Hamster
Ovary").
7. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además
glucosa a una concentración que oscila entre aproximadamente 500 y
aproximadamente 5.500 mg/l.
8. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además
aminoácidos seleccionados entre: Alanina, Arginina, Ácido
Aspártico, Cisteína, Ácido Glutámico, Glicina, Histidina,
Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenialanina, Prolina,
Serina, Triptófano, Tirosina, Treonina y Valina, pero no
Glutamina.
9. El proceso de acuerdo con la reivindicación
8, en el que el medio comprende además Glutamina.
10. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además
vitaminas seleccionadas entre: Biotina, Pantotenato, Cloruro de
Colina, Ácido Fólico, Mioinositol, Niacinamida, Piridoxina,
Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina y Putrescina.
11. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además
sales seleccionadas entre: CaCl_{2}, KCl, MgCl_{2}, Fosfato de
sodio, CuCl_{2} y ZnCl_{2}.
12. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además un
tampón.
13. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además
ácidos grasos seleccionados entre: Ácido Araquidónico, Ácido
Linoleico, Ácido Oleico, Ácido Laurico, Ácido Mirístico.
14. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además
Ciclodextrina.
15. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además un
hidrolizado de soja.
16. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además
hidrocortisona.
17. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además un
agente protector, en particular Pluronic F68.
18. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además
piruvato.
19. El uso de un medio de cultivo celular que
comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l
para el crecimiento de células que
expresan IL-18BP en
cultivo.
20. El uso de un medio de cultivo celular que
comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l
para la producción de
IL-18BP en células que expresan
IL-18BP.
21. El uso de un medio de cultivo celular que
comprende:
- Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;
- Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;
- Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;
- Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e
- Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l
para el mantenimiento de las
células que expresan IL-18BP en
cultivo.
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