ES2292127T3

ES2292127T3 - Uso de un medio de cultivo celular exento de suero para la produccion de il-18bp en celulas de mamiferos.

Info

Publication number: ES2292127T3
Application number: ES05729822T
Authority: ES
Inventors: Yehoshua Aloni; Orit Aharonovitz; Thierry Ziegler
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2004-03-01
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2025-02-28
Also published as: HRP20070474T3; ATE375385T1; AU2005217154B2; CA2554238A1; AU2005217154A1; DE602005002829D1; DK1720979T3; EP1720979B1; JP2007525228A; DE602005002829T2; PT1720979E; RS50531B; US7553665B2; JP4713567B2; ME01218B; SI1720979T1; PL1720979T3; CY1107014T1; IL177493A; IL177493A0

Abstract

Un proceso para el cultivo de células que producen IL-18BP, comprendiendo la etapa de crecimiento de las células en un medio de cultivo celular que está libre de componentes derivados de suero animal, en el que el medio de cultivo celular comprende: Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l; Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l; Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0, 005 y aproximadamente 0, 015 mg/l; Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2, 5 y aproximadamente 6 mg/l.

Description

Uso de un medio de cultivo celular exento de suero para la producción de IL-18BP en células de mamíferos.

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Campo de la invención

La presente invención está en el campo del cultivo de células mamíferas bajo condiciones de cultivo sin suero. En particular, se refiere al crecimiento de células mamíferas tales como las células de Ovario de Hámster Chino (CHO, del Inglés "Chinese Hamster Ovary"). Las células producen una proteína recombinante llamada proteína de unión a interleuquina 18 (IL-18BP, del Inglés "Interleukin-18 Binding Protein").

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un proceso que usa un medio sin suero para el crecimiento y mantenimiento de células mamíferas en cultivo.

Actualmente, el cultivo celular se usa mucho para la producción de diversos productos biológicamente activos, tales como vacunas víricas, anticuerpos monoclonales, inmunoreguladores no anticuerpo, factores de crecimiento polipeptídicos, hormonas, enzimas, antígenos específicos de tumor, etc. Estos productos se producen mediante células normales o transformadas y modificadas por ingeniería genética.

Para cultivar células, antiguamente se complementaba el medio de cultivo con suero, el cual servía como nutriente universal para el crecimiento y mantenimiento de todas las líneas celulares mamíferas que producen los productos biológicamente activos. El suero contiene hormonas, factores de crecimiento, proteínas vehículo, factores de unión y propagación, nutrientes, elementos traza, etc. Los medios de cultivo normalmente contenían hasta aproximadamente 10% de suero animal, tal como suero bovino fetal (FBS, del Inglés "Fetal Bovine Serum"), también llamado suero de ternera fetal (FCS, del Inglés "Fetal Calf Serum").

Aunque se use mucho, el suero tiene muchas limitaciones. Contiene alto niveles de numerosas proteínas que interfieren con las cantidades limitadas de la proteína deseada de interés producida por las células. Estas proteínas derivadas del suero se deben separar del producto durante el proceso a corriente tal como la purificación de la proteína de interés, lo cual complica el proceso e incrementa el coste.

La llegada de la BSE (del Inglés "Bovine Spongiform Encephalopathy"; Encefalopatía Espongiforme Bovina), una enfermedad neurodegenerativa transmisible del ganado con un largo periodo de latencia o incubación, ha planteado aspectos reguladores sobre el uso de sueros derivados de animal en la producción de productos biológicamente activos.

Por lo tanto, hay una gran demanda del desarrollo de medios alternativos sin fuentes animales que sostengan el crecimiento celular y mantenga las células durante la producción de productos biológicamente activos.

Generalmente, los medios de cultivo celular comprenden muchos componentes de diferentes categorías, tales como aminoácidos, vitaminas, sales, ácidos grasos y compuestos adicionales:

-: Aminoácidos: por ejemplo, el documento US 6.048.728 (Inlow et al.) revela que se pueden usar los siguientes aminoácidos en un medio de cultivo celular: Alanina, Arginina, Ácido Aspártico, Cisteína, Ácido Glutámico, Glutamina, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenialanina, Prolina, Serina, Triptófano, Tirosina, Treonina y Valina.

-: Vitaminas: el documento US 2003/0096414 (Ciccarone et al.) o el documento US 5.811.299 (Renner et al.), por ejemplo, describen que las siguientes vitaminas se pueden usar en un medio de cultivo celular: Biotina, Pantotenato, Cloruro de Colina, Ácido Fólico, Mioinositol, Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina, Putrescina.

-: Sales: por ejemplo, el documento US 6.399.381 (Blum et al.) revela un medio que comprende CaCl_{2}, KCl, MgCl_{2}, NaCl, Fosfato de Sodio Monobásico, Fosfato de Sodio Dibásico, Selenito de Sodio, CuSO_{4}, ZnCl_{2}. Otro ejemplo de un documento que revela las sales inorgánicas que se pueden usar en un medio de cultivo es el documento US 2003/0153042 (Arnold et al.), que describe un medio que comprende CaCl_{2}, KCl, MgCl_{2}, NaCl, Fosfato de Sodio Monobásico, Fosfato de Sodio Dibásico, CuCl_{2}.2H_{2}O, ZnCl_{2}.

-: Ácidos grasos: se sabe que los ácidos grasos que se usan en los medios son: Ácido Araquidónico, Ácido Linoleico, Ácido Oleico, Ácido Laurico, Ácido Mirístico, así como metil-beta-ciclodextrina, véase, por ejemplo, el documento US 5.045.468 (Darfler). Se debería indicar que la ciclodextrina no es un lípido per se, sino que tiene la capacidad de formar un complejo con lípidos y, por tanto, se usa para disolver los lípidos en el medio de cultivo celular.

-: Los componentes adicionales, usados en particular en el marco de los medios de cultivo celular sin suero, son compuestos tales como glucosa, glutamina, piruvato de Na, insulina o etanolamina (por ejemplo, el documento EP 274 445) o un agente protector tal como Pluronic F68. Pluronic® F68 (también conocido como Poloxamer 188) es un copolímero de bloqueo de óxido de etileno (OE) y óxido de propileno (OP).

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Los "medios básicos" estándar también son conocidos por los expertos en la técnica. Estos medios ya contienen varios de los componentes de medio anteriormente mencionados. Ejemplos de tales medios que se aplican mucho son el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, del Inglés "Dulbecco's Modified Eagle's Medium"), el Medio del "Rosswell Park Memorial Institute" (RPMI) o el medio de Ham.

Para el desarrollo y suministro de productos biológicamente activos, tales como proteínas terapéuticas o vacunas, se deben producir grandes cantidades. Las células adecuadas que se usan mucho para la producción de polipéptidos resultan ser las células de Ovario de Hámster Chino (CHO).

Las células CHO fueron cultivadas primero por Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) a partir de una biopsia de un ovario de un hámster Chino hembra. A partir de estas células originales se prepararon varias sublíneas con diversas características. Una de estas líneas de células CHO, CHO-K1, es requeriente de prolina y es diploide para el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR). Otra línea derivada de esta línea celular es una línea celular CHO deficiente de DHFR (CHO DUK B11)(PNAS 77, 1980, 4.216-4.220), la cual se caracteriza por la pérdida de la función de DHFR como consecuencia de una mutación en un gen de DHFR y la posterior pérdida del otro gen.

Células adicionales que se usan frecuentemente para la producción de proteínas destinadas a la administración a humanos son las líneas celulares humanas tales como la línea celular de fibrosarcoma humano HT1080 o la línea celular de riñón de embrión humano 293.

Una proteína terapéutica de interés es la proteína de unión a interleuquina 18 (IL-18BP). IL-18BP es una proteína soluble que tiene una alta afinidad por la IL-18. Se aisló primero a partir de orina humana y se clonaron los ADNcs humanos y de ratón así como el gen humano (Novick et al., 1999; documento WO 99/09063). La proteína se ha denominado proteína de unión a IL-18 (IL-18BP). El nombre no patentado internacional de IL-18BP es tadekinig alfa.

IL-18BP no es el dominio extracelular de uno de los receptores de IL-18 conocidos, sino una proteína de circulación natural secretada. Pertenece a una familia nueva de proteínas secretadas, que incluye además varias proteínas codificadas por Poxvirus (Novick et al., 1999). La IL-18BP urinaria así como recombinante se une específicamente a IL-18 con una alta afinidad y modula la afinidad biológica de IL-18.

Se localizó el gen de IL-18BP en el cromosoma humano 11q13 y no se encontró exón codificador de un dominio de transmembrana en una secuencia genómica de 8,3 kb. Hasta ahora se han encontrado cuatro variantes de maduración por corte y empalme o isoformas de IL-18BP generadas mediante maduración por corte y empalme ("splicing") alternativa de ARNm en humanos. Se denominaron IL-18BP a, b, c y d, compartiendo todas el mismo terminal N y diferenciándose en el terminal C (Novick et al., 1999). Estas isoformas varían en su capacidad para unirse a IL-18. De las cuatro, se sabe que las isoformas a y c de IL-18BP tienen una capacidad de neutralización de IL-18. La isoforma de IL-18BP humana se une a IL-18 murina.

Se ha sugerido la IL-18BP como proteína terapéutica en varias enfermedades y trastornos, tales como psoriasis, Enfermedad de Crohn, artritis reumatoidea, artritis psoriásica, lesión de hígado, sepsis, ateroesclerosis, enfermedades cardiacas isquémicas, alergias, etc., por ejemplo, revelados en los documentos WO 9909063, WO 0107480, WO 0162285, WO 0185201, WO 02060479, WO 02096456, WO 03080104, WO 02092008, WO 02101049, WO 03013577.

Por tanto, hay una necesidad de un proceso de fabricación eficaz para la producción de IL-18BP en cultivo celular y, preferentemente, un proceso que se opere bajo condiciones sin suero.

Compendio de la invención

La presente invención se basa en el desarrollo de un proceso para el cultivo de células en un medio de cultivo celular que esté libre de componentes derivados de suero animal y a la vez sea altamente eficaz para el crecimiento celular y mantenimiento del cultivo celular mamífero. El cultivo de las células se lleva a cabo para la producción de proteínas en las células.

De acuerdo con la presente invención, las células producen IL-18BP o se han modificado para producir IL-18BP. La proteína se puede aislar y purificar a partir del medio de cultivo celular (sobrenadante) y formular en una composición farmacéutica destinada a la administración en humanos o animales.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un proceso para el cultivo de células que producen IL-18BP, que comprende la etapa de crecimiento de las células en un medio de cultivo celular sin componentes derivados de suero animal, en el que el medio de cultivo celular comprende:

: Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;

: Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;

: Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;

: Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e

: Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un proceso para la producción de IL-18BP que comprende la etapa de cultivo de células que expresan IL-18BP en un medio de cultivo celular sin componentes derivados de suero animal, en el que el medio de cultivo celular comprende:

Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso de un medio de acuerdo con la invención para la producción de una proteína de interés.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere al uso del medio de la invención para el crecimiento de células en cultivo.

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de un medio de acuerdo con la invención para el mantenimiento de las células en cultivo durante la fase de producción de un polipéptido de interés.

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Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 Se cultivaron células CHO que expresan IL-18BP en suspensión en medio sin suero de acuerdo con la invención con diluciones repetidas con medio fresco durante 60 días (n=10). La Fig. 1 muestra la densidad celular viable;

Fig. 2, muestra las células viables acumuladas;

Fig. 3, muestra el tiempo de duplicación; y

Fig. 4, muestra la concentración de glucosa y lactato en el sobrenadante.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el desarrollo de un proceso para el crecimiento y mantenimiento de células que expresan IL-18BP, y para la producción de IL-18BP, en un medio de cultivo celular que está libre de componentes derivados de suero.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un proceso para la producción de IL-18BP, que comprende la etapa de cultivo de una célula que expresa IL-18BP en un medio de cultivo celular sin componentes derivados de suero animal, en el que el medio de cultivo celular comprende:

: Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 700 y aproximadamente 1.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 mg/l;

: Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 5.000, preferentemente entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.500 mg/l;

: Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,003 y aproximadamente 0,02 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,015 mg/l;

: Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 15.000 mg/l; e

: Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l.

Además, la invención se refiere a un proceso de cultivo de células que expresan IL-18BP, que comprende la etapa de crecimiento de la célula en un medio de cultivo celular sin componentes derivados de suero animal, en el que el medio de cultivo comprende:

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Preferentemente, el proceso comprende además la etapa de recolección del medio que comprende la proteína de interés.

En una realización preferida adicional, el proceso comprende además el aislamiento de la proteína de interés.

En una realización preferida adicional, el proceso comprende además la formulación de la proteína aislada con un vehículo farmacéuticamente aceptable para obtener una composición farmacéutica.

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En un tercer aspecto, la invención se refiere al uso del medio de cultivo celular que comprende:

: Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, preferentemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l

para la producción de un polipéptido de interés.

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En un cuarto aspecto, la invención se refiere al uso de un medio de cultivo celular que comprende:

para el crecimiento de células que expresan IL-18BP en cultivo.

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En un quinto aspecto, la invención se refiere al uso de un medio de cultivo celular que comprende:

para el mantenimiento de células que expresan IL-18BP en cultivo, por ejemplo, durante la fase de producción de un polipéptido de interés.

De acuerdo con los procesos y usos de la presente invención, el medio de cultivo celular comprende:

En el marco de la presente invención, la Asparragina se puede usar en cualquier concentración que oscila entre aproximadamente 700 y 1.000 mg/l, por ejemplo, a 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 mg/l.

En el marco de la presente invención, el Cloruro de Sodio se puede usar a una concentración que oscila entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 5.000 mg/l, por ejemplo, a 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900, 3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, 3.600, 3.700, 3.800, 3.900, 4.000, 4.100, 4.200, 4.300, 4.400, 4.500, 4.600, 4.700, 4.800, 4.900 mg/l.

En el marco de la presente invención, el Selenito se puede usar a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,003 y aproximadamente 0,02 mg/l, por ejemplo, a 0,0035, 0,004, 0,0045, 0,005, 0,0055, 0,006, 0,0065, 0,007, 0,0075, 0,008, 0,0085, 0,009, 0,0095, 0,01, 0,011, 0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,016, 0,017, 0,018, 0,019, 0,02 mg/l.

En el marco de la presente invención, el Hidrolizado de trigo se puede usar a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 mg/l, por ejemplo, a 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 8.500, 9.000, 9.500, 9.600, 9.700, 9.800, 9.900, 10.000, 10.100, 10.200, 10.300, 10.400, 10.500, 10.600, 10.700, 10.800, 10.900, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500 mg/ml.

En el marco de la presente invención, la Insulina se puede usar a una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg/l, por ejemplo, a 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75 mg/l.

Tal como se muestra en los Ejemplos de a continuación, en el proceso de la invención al usar un medio que comprendía estos componentes dentro de los intervalos indicados se sostuvo un excelente crecimiento celular y mantenimiento durante un prolongado periodo de tiempo.

La etapa de cultivo del proceso de la invención se puede llevar a cabo en cualquier ambiente adecuado, tal como placas Petri, matraces T o frascos rotativos, pero preferentemente en recipientes que tengan grandes volúmenes tal como, por ejemplo, un bioreactor. Los matraces T y los frascos rotativos son particularmente adecuados para el crecimiento de células, y para la producción de proteína las células preferentemente se mantienen en un bioreactor.

Las células a usar en el marco de los diversos aspectos de la presente invención son preferentemente células mamíferas. Pueden ser de origen humano o animal. Ejemplos de células mamíferas que se pueden cultivar en el proceso de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo: células 3T3, células COS, células de osteosarcoma humano, células MRC-5, células BHK, células VERO, células CHO, células rCHO-tPA, células con antígeno de superficie rCHO-Hep B, células HEK 293, células rHEK 293, células con antígeno de superficie rC127-Hep B, fibroblastos humanos normales, células de estroma, hepatocitos, células PER.C6 y células amnióticas permanentes humanas. Ejemplos de hibridomas que se pueden cultivar en el proceso de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo: células DA4.4, células 123A, células 127A, células GAMMA y células 67-9-B.

Es muy preferido cultivar una célula de Ovario de Hámster Chino (célula CHO) de acuerdo con la presente invención.

Las células cultivadas de acuerdo con la presente invención pueden crecer en suspensión o, para células dependientes de anclaje, unidas a un soporte sólido. Se pueden usar Microvehículos y discos de Fibra-Cel® en cultivo de célula mamífera para el crecimiento de células dependientes de anclaje y están entre las plataformas tecnológicas establecidas para la producción industrial de proteínas (véase, por ejemplo, Bohak et al., 1987; Petti et al.
1994).

En el marco de los procesos y usos de la presente invención, la Asparragina está comprendida de manera ventajosa como Asparragina. H_{2}O (TCL al 99%, siendo TCL (del Inglés "Thin Layer Chromatography") la cromatografía de capa fina).

El selenito, por ejemplo, puede está comprendido en el medio como selenito de sodio.

El hidrolizado de trigo es un componente derivado de planta, el cual es parte del medio de la invención en base al hecho de que las células también pueden usar aminoácidos que estén en forma de péptido. Los péptidos pueden oscilar en tamaño entre dos aminoácidos y muchos aminoácidos. Los péptidos que se derivan mediante la hidrólisis de proteínas proporcionan una fuente suplementaria (indefinida) de aminoácidos de forma que sostiene el crecimiento superior de varias líneas/tipos celulares.

La insulina a usar en el marco del medio de la invención se puede derivar de cualquier fuente y especie, siempre que sostenga el crecimiento y el mantenimiento de la línea celular o tipo celular particular para el cual se usa el medio. Preferentemente, la insulina puede ser recombinante. Además, se prefiere que la insulina esté derivada de la especie que corresponde a la especie de la cual se deriva la línea celular o el tipo celular, o que sea insulina humana.

Los intervalos de concentración preferidos de los compuestos del medio a usar en el proceso de la invención son los siguientes:

-: Asparragina a una concentración que oscila entre aproximadamente 810 y aproximadamente 850 mg/l, lo más preferido aproximadamente 830.

-: Cloruro de Sodio a una concentración que oscila entre aproximadamente 3.400 y aproximadamente 3.600 mg/l, lo más preferido aproximadamente 3.500 mg/l.

-: Selenito a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,012 mg/l, lo más preferido aproximadamente 0,0110 mg/l.

-: Hidrolizado de trigo a una concentración que oscila entre aproximadamente 8.000 y aproximadamente 12.000 mg/l, lo más preferido aproximadamente 10.000 mg/l.

-: Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5 mg/l, lo más preferido aproximadamente 4 mg/l.

En una realización preferida, el medio comprende además glucosa a una concentración que oscila entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5.500 mg/l, preferentemente aproximadamente 1.000 mg/l o aproximadamente 4.500 o aproximadamente 5.000 mg/l.

En una realización preferida adicional, el medio comprende uno o más aminoácidos. Los aminoácidos se seleccionan entre: Alanina, Arginina, Ácido Aspártico, Cisteína, Ácido Glutámico, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenialanina, Prolina, Serina, Triptófano, Tirosina, Treonina y Valina, pero no Glutamina.

En una realización alternativa, la Glutamina se añade al medio. Preferentemente, la glutamina se puede añadir al medio durante el cultivo celular (por ejemplo, modo de crecimiento, mantenimiento, producción).

Preferentemente, el medio de acuerdo con la invención comprende además vitaminas. Las vitaminas que se prefieren en el medio de la invención se seleccionan entre: Biotina, Pantotenato, Cloruro de Colina, Ácido Fólico, Mio-inositol, Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina y Putrescina.

Preferentemente, el medio de acuerdo con la invención comprende además sales inorgánicas y elementos traza. Los iones son preferentemente Ca^{2+}, K^{+}, Mg^{2+}, Na^{+}, Cl^{-}, Fosfato, Cu^{2+}, Zn^{2+}. Esas sales y elementos traza preferentemente se seleccionan entre: CaCl_{2} anhidro, KCl, MgCl_{2} anhidro, NaCl, Fosfato de Sodio Monobásico, Fosfato de Sodio Dibásico, CuCl_{2}.2H_{2}O y ZnCl_{2}.

Preferentemente, el medio de la invención comprende además un tampón. Se pueden usar muchos tampones en el marco del medio de la invención, tal como el tampón bicarbonato de sodio, Tris, BES (ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico), tampón glicina o similares. Un tampón iónico anfótero es particularmente útil para el medio de la invención. Un tampón iónico anfótero preferido que se puede usar es HEPES (ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanosulfónico) en forma ácida.

En otra realización preferida, el medio comprende además ácidos grasos. Tales ácidos grasos preferentemente se seleccionan entre: Ácido Araquidónico, Ácido Linoleico, Ácido Oleico, Ácido Laurico, Ácido Mirístico y Ciclodextrina, la cual no es un lípido per se sino simplemente sirve en la disolución de lípidos en el medio. La ciclodextrina es preferentemente metil-beta-ciclodextrina.

Se pueden usar hidrolizados adicionales en el marco de la presente invención, siempre que no sean derivados de fuentes animales. Preferentemente, el medio de la invención puede comprender además un hidrolizado de soja.

También se prefiere que el medio de la invención comprenda además esteroides tales como, por ejemplo, cortisona o hidrocortisona y/o fuentes de energía adicionales tales como, por ejemplo, piruvato, por ejemplo piruvato de Na, y/o un agente protector tal como Pluronic F68.

En el marco de los procesos y usos de la presente invención, se puede usar cualquier medio sin suero básico conocido y adecuado, siempre que estén presentes los siguientes compuestos:

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(Tabla pasa a página siguiente)

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A continuación, se enumeran ejemplos de medios sin suero básicos conocidos:

1

Los procesos y usos de la invención preferentemente sirven para producir un polipéptido de interés.

El polipéptido de interés puede ser, por ejemplo, una proteína naturalmente secretada, una proteína normalmente citoplasmática, una proteína normalmente de transmembrana o un anticuerpo humano o humanizado. Cuando la proteína de interés es una proteína normalmente citoplasmática o una normalmente de transmembrana, la proteína preferentemente se ha modificado por ingeniería genética para convertirla en soluble.

El polipéptido de interés puede ser de cualquier origen. Los polipéptidos preferidos de interés son de origen humano y, más preferentemente, las proteínas de interés son proteínas terapéuticas.

La proteína de interés puede ser una hormona, una proteína de unión a citoquina, un interferón, un receptor soluble o un anticuerpo.

Las proteínas terapéuticas que se pueden producir de acuerdo con un método de la presente invención incluyen, por ejemplo: gonadotropina coriónica, hormona estimuladora del folículo, hormona coriogonadotrópica-lutropina, hormona estimuladora del tiroides, hormona de crecimiento humana, interferones (por ejemplo, interferón beta-1a, interferón beta-1b), receptores de interferón (por ejemplo, receptor de interferón gama), receptores TNF p55 y p75, proteínas de fusión TACI-Fc, interleuquinas (por ejemplo, interleuquina-2, interleuquina-11), proteínas de unión a interleuquina (por ejemplo, proteína de unión a interleuquina-18), anticuerpos anti-CD11a, eritropoyetina, factor estimulador de colonia de granulocito, factor estimulador de colonia de granulocito-macrófago, hormonas peptídicas de pituitaria, gonadotropina menopáusica, factores de crecimiento similares a insulina (por ejemplo, somatomedina-C), factor de crecimiento de queratinocito, factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, trombomodulina, factor de crecimiento de fibroblasto básico, insulina, Factor VIII, somatropina, proteína morfogénica de hueso 2, factor de crecimiento derivado de plaqueta, hirudina, epoyetina, proteína de fusión LFA-3/IgG1 recombinante, glucocerebrosidasa, y muteinas, fragmentos, formas solubles, derivados funcionales, proteínas de fusión de las mismas.

Particularmente, el polipéptido se puede seleccionar entre el grupo que consiste en: gonadotropina coriónica (CG, del Inglés "Chorionic Gonadotropin"), hormona estimuladora del folículo (FSH, del Inglés "Follicle-Stimulating Hormone"), hormona coriogonadotrópica-lutropina (LH), hormona estimuladora del tiroides (TSH, "Thyroid Stimulating Hormone"), hormona de crecimiento humana (hGH, del Inglés "human Growth Hormone"), interferones (por ejemplo, interferón beta-1a, interferón beta 1b), receptores de interferón (por ejemplo, receptor interferón gama), receptores TNF p55 y p75, interleuquinas (por ejemplo, interleuquina-2, interleuquina-11), proteínas de unión a interleuquina (por ejemplo, proteína de unión a interleuquina-18), anticuerpos anti-CD11a, y muteínas, fragmentos, formas solubles, derivados funcionales, proteínas de fusión de los mismos.

Polipéptidos adicionales de interés incluyen, por ejemplo: eritropoyetina, factor estimulador de colonia de granulocito, factor estimulador de colonia de granulocito-macrófago, hormonas peptídicas de pituitaria, gonadotropina menopáusica, factores de crecimiento similares a insulina (por ejemplo, somatomedina-C), factor de crecimiento de queratinocito, factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, trombomodulina, factor de crecimiento de fibroblasto básico, insulina, Factor VIII, somatropina, proteína morfogénica de hueso 2, factor de crecimiento derivado de plaqueta, hirudina, epoyetina, proteína de fusión LFA-3/IgG1 recombinante, glucocerebrosidasa y muteínas, fragmentos, formas solubles, derivados funcionales, proteínas de fusión de los mismos.

La proteína de interés debería ser formulada con un vehículo farmacéuticamente aceptable, el resultado del proceso es una composición farmacéutica.

La definición de "farmacéuticamente aceptable" quiere decir que abarca cualquier vehículo que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y que no sea tóxico al hospedante al cual se administra. Por ejemplo, para la administración parenteral, la(s) proteína(s) activa(s) se puede(n) formular en una forma de dosificación unitaria para la inyección en vehiculizantes tales como disolución salina, disolución de dextrosa, albúmina de suero y disolución de Ringer.

A continuación, se puede administrar la composición farmacéutica formulada de acuerdo con la invención a un individuo de una diversidad de maneras. Las vías de administración incluyen: vías intradérmicas, transdérmicas (por ejemplo, en formulaciones de liberación lenta), intramusculares, intraperitoneales, intravenosas, subcutáneas, orales, intracraneales, epidurales, tópicas, rectales e intranasales. Se puede usar cualquier otra vía de administración terapéuticamente eficaz, por ejemplo, absorción a través de tejidos epiteliales o endoteliales o mediante terapia genética en la que se administra al paciente una molécula de ADN codificadora del agente activo (por ejemplo, vía un vector), la cual hace que el agente activo se exprese y secrete in vivo. Además, la(s) proteína(s) de acuerdo con la invención se puede(n) administrar junto con otros componentes de agentes biológicamente activos tal como tensoactivos, excipientes, vehículos, diluyentes y vehiculizantes farmacéuticamente aceptables.

Para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), la(s) proteína(s) activa(s) se puede(n) formular como una disolución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado conjuntamente con un vehiculizante parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua, disolución salina, disolución de dextrosa) y aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o la estabilidad química (por ejemplo, conservantes y tampones). La formulación se esteriliza mediante técnicas comúnmente usadas.

Los procesos y usos de la presente invención van dirigidos a la producción de la proteína de unión a interleuquina-18 (IL-18BP).

La IL-18BP puede ser natural, es decir, IL-18BP que se da de forma natural. Preferentemente, la IL-18BP a producir es de origen humano. Puesto que IL-18BP es una proteína secretada, soluble, se libera en el sobrenadante del cultivo celular, o bien por medio de su péptido señal natural o por medio de un péptido señal heterólogo, es decir, un péptido señal derivado de otra proteína secretada que puede ser más eficaz en el sistema de expresión particular usado.

El término "proteína de unión a IL-18" se usa en la presente memoria de manera sinónima con "IL-18BP". Este término se refiere a proteínas de unión a IL-18 tal como las definidas en el documento WO 99/09063 o en Novick et al., 1999. El término IL-18BP incluye variantes de maduración por corte y empalme y/o isoformas de las proteínas de unión a IL-18, tal como las definidas en Kim et al., 2.000, en particular las isoformas a y c humanas de IL-18BP. El término "IL-18BP", tal como se usa en la presente memoria, incluye además muteínas, derivados funcionales, fracciones activas, proteínas fusionadas, proteínas permutadas de manera circular y sales de IL-18BP tal como se define en el documento WO 99/09063.

La IL-18BP que se produce al usar el medio de la presente invención preferentemente es glicosilada.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "muteínas" se refiere a análogos de una IL-18BP, o análogos de una IL-18BP vírica, en los que uno o más de los residuos de aminoácidos de una IL-18BP natural o IL-18BP vírica se reemplazan por diferentes residuos de aminoácidos, o se someten a deleción, o uno o más residuos de aminoácidos se añaden a la secuencia natural de una IL-18BP, o una IL-18BP vírica, sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes en comparación con la IL-18BP de tipo natural o la IL-18BP vírica. Estas muteínas se preparan mediante síntesis conocida y/o mediante técnicas de mutagénesis dirigidas a sitio o cualquier otra técnica conocida adecuada para esto.

Las muteínas de acuerdo con la presente invención incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, el cual híbrida con ADN o ARN, que codifica una IL-18BP o codifica una IL-18BP vírica (documento WO 99/09063) bajo condiciones estrictas. El término "condiciones estrictas" se refiere a condiciones de hibridación y posterior lavado, a las cuales aquellos con un conocimiento normal en la técnica se refieren de manera convencional como "estrictas". Véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y. \NAK\NAK6.3 y 6.4 (1987, 1992). Sin ser limitantes, ejemplos de condiciones estrictas incluyen: condiciones de lavado de 12 a 20ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido bajo estudio en, por ejemplo, 2xSSC y SDS al 0,5% durante 5 minutos, 2xSSC y SDS al 0,1% durante 15 minutos; 0,1xSSC y SDS al 0,5% a 37ºC durante 30 a 60 minutos y, a continuación, 0,1xSSC y SDS al 0,5% a 68ºC durante 30 a 60 minutos. Aquellos con un conocimiento normal en esta técnica entienden que las condiciones de severidad también dependen de la longitud de las secuencias de ADN, las sondas de oligonucleótidos (tal como 10 a 40 bases) o sondas de oligonucleótidos mezcladas. Si se usan las sondas mezcladas, es preferible usar cloruro de tetrametil amonio (TMAC, del Inglés "Tetramethyl Ammonium Chloride") en lugar de SSC. Véase Ausubel, supra.

La identidad refleja una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, determinada comparando las secuencias. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido de los dos polinucleótidos o las dos secuencias de polipéptidos, respectivamente, sobre la longitud de las secuencias a comparar.

Para secuencias en las que no hay una correspondencia exacta, se puede determinar un "% de identidad". En general, las dos secuencias a comparar se alinean para dar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir la inserción de "gaps" en o bien una o dos secuencias, para aumentar el grado de alineación. Se puede determinar un % de identidad sobre la longitud completa de cada una de las secuencias a comparar (la llamada alineación global), que es particularmente adecuado para secuencias de la misma o muy similar longitud, o sobre longitudes definidas más cortas (la llamada alineación local), que es más adecuado para secuencias de longitud distinta.

En la técnica se conocen bien los métodos para comparar la identidad y la homología de dos o más secuencias. Así, por ejemplo, se pueden usar programas disponibles en el Paquete de Análisis Secuencial de Wisconsin, versión 9.1 (Devereux, J. et al., 1984), por ejemplo, los programas BESTFIT y GAP, para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad y el % de homología entre dos secuencias de polipéptidos. BESTFIT usa el algoritmo "homología local" de Smith y Waterman (1981) y encuentra la mejor región única de similitud entre dos secuencias. En la técnica también se conocen otros programas para determinar la identidad y/o la similitud entre secuencias, por ejemplo, la familia de programas BLAST (Altschul, S. F. et al., 1990, Altschul, S. F. et al., 1997, accesible a través de la página principal de la NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson, W.R.,
1990).

Cualquier muteína preferentemente tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la de una IL-18BP, o suficientemente duplicativa de una IL-18BP vírica, para tener una actividad sustancialmente similar a IL-18BP. Una actividad de IL-18BP es su capacidad de unirse a IL-18. Siempre que la muteína tenga una sustancial actividad de unión a IL-18, se puede considera que tiene actividad sustancialmente similar a IL-18BP. Por tanto, se puede determinar si cualquier muteína dada tiene sustancialmente la misma actividad que IL-18BP por medio de experimentación rutinaria que comprende someter dicha muteína, por ejemplo, a un ensayo de competición tipo sándwich simple para determinar si se une o no a una IL-18 apropiadamente marcada, tal como radioinmunoensayo o ensayo ELISA.

En una realización preferida, cualquier muteína tiene al menos una identidad u homología del 40% con la secuencia de o bien una IL-18BP o una IL-18BP homóloga víricamente codificada, tal como la definida en el documento WO 99/09063. Más preferentemente, tiene una identidad u homología a esto de al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o, más preferentemente, de al menos 90% o 95%.

Los cambios preferidos para las muteínas de acuerdo con la presente invención son los que se conocen como sustituciones "conservadoras". Las sustituciones de aminoácidos conservadoras de polipéptidos o proteínas de IL-18BP o IL-18BPs víricas, pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo que tienen propiedades fisicoquímicas suficientemente similares que la sustitución entre miembros del grupo conservará la función biológica de la molécula (Grantham, 1974). Está claro que las inserciones y deleciones de los aminoácidos también se pueden realizar en las secuencias anteriormente definidas sin alterar su función, particularmente si las inserciones o deleciones solamente implican unos pocos aminoácidos, por ejemplo, por debajo de treinta, y preferentemente por debajo de diez, y no extraen o desplazan aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo, residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas por tales deleciones y/o inserciones están dentro del ámbito de la presente invención.

El término "proteína fusionada" se refiere a un polipéptido que comprende una IL-18BP, o una IL-18BP vírica, o una muteína o fragmento de la misma, fusionado con otra proteína, la cual, por ejemplo, tiene un prolongado tiempo de resistencia en los fluidos corporales. Así, una IL-18BP o una IL-18BP vírica, se puede fusionar a otra proteína, polipéptido o similar, por ejemplo, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma.

Como "fracciones activas" de una IL-18BP, o una IL-18BP vírica, muteínas y proteínas fusionadas, la presente invención incluye cualquier fragmento o precursores de la cadena polipeptídica de la molécula proteica sola o junto con moléculas asociadas o residuos unidos a estas, por ejemplo, residuos de azúcar o fosfato, o agregados de la molécula proteica o sus propios residuos de azúcar, dicha fracción proporcionada tiene actividad sustancialmente similar a IL-18BP.

Se pueden tomar las secuencias de IL-18BP y sus variantes/isoformas de maduración por corte y empalme del documento WO 99/09063 o de Novick et al., 1999, así como de Kim et al., 2000.

Se debería usar la IL-18BP de la invención como composición farmacéutica, tal composición farmacéutica se puede usar para el tratamiento y/o prevención de varias enfermedades o trastornos. Tales enfermedades o trastornos son preferentemente trastornos mediados por IL-18. En particular, la IL-18BP purificada se puede usar para el tratamiento y/o prevención de: psoriasis, artritis psoriásica, Enfermedad de Crohn, artritis reumatoidea, lesión de hígado tal como cirrosis de hígado alcohólico, sepsis, ateroesclerosis, enfermedades cardiacas isquémicas, alergias, en particular hipersensibilidad tipo retardada y herida de cabeza cerrada, tal como se describe en los documentos WO 9909063, WO 0107480, WO 0162285, WO 0185201, WO 02060479, WO 02096456, WO 03080104, WO 02092008, WO 02101049, WO 03013577.

Ahora al tener completamente descrita esta invención, los expertos en la técnica apreciarán que la misma se puede realizar dentro de un amplio intervalo de parámetros, concentraciones y condiciones equivalentes sin apartarse del espíritu y alcance de la invención y sin la experimentación indebida.

Aunque esta invención se ha descrito junto con sus realizaciones específicas, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales. Esta solicitud está destinada a incluir cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo tales desviaciones de la presente descripción ya que están dentro de la práctica conocida o habitual en la técnica a la cual pertenece la invención y ya que se puede aplicar a las características esenciales explicadas anteriormente en la presente memoria tal como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

La referencia a etapas de métodos conocidos, etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no es ninguna manera de admisión que cualquier aspecto, descripción o realización de la presente invención está descrito, enseñado o sugerido en la técnica relevante.

Ejemplo 1

Crecimiento de células CHO que expresan IL-18BP en medio sin suero 1.1 Preparación de medio sin suero (SFM) denominado "SM-005"

El medio de cultivo celular que se usó para los experimentos descritos a continuación en el punto 1.2. era un medio adaptado para contener los siguiente componentes en las siguientes concentraciones:

-: Asparragina a una concentración de 830 mg/l;

-: Cloruro de Sodio a una concentración de 3.500 mg/l;

-: Selenito a una concentración de 0,0110 mg/l;

-: Hidrolizado de trigo a una concentración de 10.000 mg/l; e

-: Insulina a una concentración de 4 mg/l.

Este medio también contenía 4,5 g/l de glucosa. Si el medio se usa para el modo de producción, se puede disminuir la concentración de glucosa a 1 g/l. El medio contenía además todos los aminoácidos excepto Glutamina. También estaban presentes en este medio vitaminas, sales, ácidos grasos, HEPES como tampón, Pluronic F68, Hidrocortisona, Piruvato de Na e Hidrolizado de soja. A continuación, el medio se identifica como SM-005.

1.2. Crecimiento de células en suspensión

Se inocularon matraces T o frascos rotativos con células de un clon de CHO que expresaba y secretaba IL-18BP que previamente se había establecido. Estas células crecieron en suspensión y primero se aumentaron. Durante el proceso de aumento celular, las células se cultivaron en suspensión y se diluyeron sistemáticamente con volúmenes definidos de medio SM-005 fresco en días fijados. Con el propósito de hacer un seguimiento, se midieron la densidad celular, la concentración de glucosa y lactato en cada etapa de dilución (véase las figuras).

En el día 0, se descongeló un vial del Banco Celular Maestro previamente establecido. A continuación, las células originadas a partir de este vial se inocularon en un Matraz de Cultivo de Tejido de 75 cm^{2} (TCF 75 cm^{2}, del Inglés "Tissue Culturing Flask") en un volumen total de 30 ml de medio SM-005 fresco. La concentración celular resultante en el TCF alcanzó aproximadamente 0,20 millones de células/ml. Por último, se incubó el TCF bajo agitación a una temperatura de 37ºC.

En el día 4, se transfirió el cultivo a un TCF 175 cm^{2} y se diluyó hasta 120 ml añadiendo medio SM-005 fresco y precalentado.

En el día 8, se transfirió el cultivo a un RB850 cm^{2} y se diluyó hasta 400 ml añadiendo medio SM-005 fresco y precalentado.

En el día 12, se diluyó el cultivo hasta 1.200 ml (relación de dilución de 1/3) añadiendo medio SM-005 fresco y precalentado y, a continuación, se repartió en 3 frascos rotativos RB850 cm^{2}, conteniendo cada uno 400 ml.

En el día 16, se diluyó el cultivo hasta 4.800 ml (relación de dilución de 1/4) añadiendo medio fresco y precalentado y, a continuación, se repartió en 6 RB1750 cm^{2}, conteniendo cada uno 800 ml.

A partir del día 20 (D20, D23, D26,...hasta D62), se diluyeron los RB1750 cm^{2} de una manera repetitiva cada 3 días, respetando una relación de dilución de 1/4. En cada día de dilución, se generaba el número requerido de RB1750 cm^{2} (al menos 4 RB1750 cm^{2}). Por tanto, cada RB1750 cm^{2} se diluyó desde 800 ml hasta 3.200 ml añadiendo medio fresco y precalentado y, a continuación, se repartía en 4 RB1750 cm^{2}, conteniendo cada uno 800 ml.

Para inocular bioreactores, se recogió el número requerido de frascos rotativos en un día de dilución (entre D20 y D60), se juntaron en un frasco de cristal estéril y se transfirieron a los bioreactores.

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TABLA 1 Descripción esquemática del proceso de preparación de inoculo. A partir del día 20, las células se diluían con una relación de dilución fijada de 1/4

4

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Las Figuras 1 a 4 muestran los datos medidos durante el proceso de preparación del inóculo (n=10). La Figura 1 muestra la densidad celular viable, la Figura 2 las células viables acumuladas, la Figura 3 el tiempo de duplicación y la Figura 4 la concentración de glucosa y lactato en el sobrenadante.

Después de una fase de adaptación del día 20, el crecimiento de las células es muy uniforme y reproducible en el medio sin suero. Las condiciones de crecimiento estable permiten subcultivar células fácilmente mediante dilución repetida con una relación 1:4 durante el prolongado periodo de tiempo (ensayado hasta el día 62, tal como se muestra en las Figuras 1, 2, 3, 4).

Referencias

1. Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990.

2. Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., \NAK\NAK6,3 y 6,4 (1987, 1992).

3. Altschul, S. F. et al., Nucleic Acids Res., 25:389-3.402, 1997.

4. Bohak et al., 1987, Bohak, Z., Kadouri, A. et al. (1987) "Novel anchorage matrices for suspension culture of mammalian cells" Biopolymers. 26 Suplemento: S205-213.

5. Devereux, J. et al., Nucleic Acids Res., 12, 387-395, 1984.

6. Grantham, et al., Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).

7. Kim, SH., Eisenstein, M., Reznikov, L., Fantuzzi, G., Novick, D., Rubinstein, M., Dinarello, CA. Structural requirements of six naturally ocurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2.000; 97:1.190-1.195.

8. Novick, D., Kim, SH, Fantuzzi, G., Reznikov, L., Dinarello, C. y Rubinstein, M. (1999). Immunity 10, 127-136.

9. Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183:63-98.

10. Petti, SA, Lages, AC et al. (1994) "Three-dimensional mammalian cell growth on nonwoven polyester fabric disks" Biotechnol Prog. 10(5):548-550.

11. Puck et al., J. Exp. Med. 108, 945, 1958.

Claims

1. Un proceso para el cultivo de células que producen IL-18BP, comprendiendo la etapa de crecimiento de las células en un medio de cultivo celular que está libre de componentes derivados de suero animal, en el que el medio de cultivo celular comprende:

2. Un proceso para la producción de IL-18BP, comprendiendo la etapa de cultivo de una célula que expresa IL-18BP en un medio de cultivo celular que está libre de componentes derivados de suero animal, en el que el medio de cultivo celular comprende:

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, comprendiendo además la etapa de recolección del medio que comprende la proteína de interés.

4. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, comprendiendo además el aislamiento de la proteína de interés.

5. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, comprendiendo además la formulación de la proteína aislada con un vehículo farmacéuticamente aceptable para obtener una composición farmacéutica.

6. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que las células son células de Ovario de Hámster Chino (CHO, del Inglés "Chinese Hamster Ovary").

7. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además glucosa a una concentración que oscila entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5.500 mg/l.

8. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además aminoácidos seleccionados entre: Alanina, Arginina, Ácido Aspártico, Cisteína, Ácido Glutámico, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenialanina, Prolina, Serina, Triptófano, Tirosina, Treonina y Valina, pero no Glutamina.

9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el medio comprende además Glutamina.

10. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además vitaminas seleccionadas entre: Biotina, Pantotenato, Cloruro de Colina, Ácido Fólico, Mioinositol, Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina y Putrescina.

11. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además sales seleccionadas entre: CaCl_{2}, KCl, MgCl_{2}, Fosfato de sodio, CuCl_{2} y ZnCl_{2}.

12. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además un tampón.

13. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además ácidos grasos seleccionados entre: Ácido Araquidónico, Ácido Linoleico, Ácido Oleico, Ácido Laurico, Ácido Mirístico.

14. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además Ciclodextrina.

15. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además un hidrolizado de soja.

16. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además hidrocortisona.

17. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además un agente protector, en particular Pluronic F68.

18. El proceso de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el medio comprende además piruvato.

19. El uso de un medio de cultivo celular que comprende:

: Insulina a una concentración que oscila entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 mg/l

para el crecimiento de células que expresan IL-18BP en cultivo.

20. El uso de un medio de cultivo celular que comprende:

para la producción de IL-18BP en células que expresan IL-18BP.

21. El uso de un medio de cultivo celular que comprende:

para el mantenimiento de las células que expresan IL-18BP en cultivo.