CN108102982B - 麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂及其保藏方法 - Google Patents

麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂及其保藏方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂及其保藏方法，保护剂，其特征在于，组成成分为：海藻酸钠、谷氨酸钠，丙酮酸钠，脱脂乳粉，氯化钠和无菌蒸馏水。麦氏弧菌冻干粉的制备方法，包括以下步骤：（1）麦氏弧菌悬液均匀分散于冻干保护剂中形成麦氏弧菌悬浮液，分装于西林瓶中。4℃预冷30min‑60min；‑70℃预冻8‑10h。（2）将上述预冻的麦氏弧菌悬浮液转移至冻干机中，真空冷冻干燥，得到麦氏弧菌冻干粉。本发明采用先预冷后预冻的方式对麦氏弧菌进行适应性快速预冻，使预冻过程中菌体损失降低，优化真空干燥参数，能有效减轻冷冻损伤和干燥应力损伤，大大提高麦氏弧菌冻干粉的复壮存活率，得到麦氏弧菌冻干粉性质稳定，便于室温下长期储存和科研研究。

Description

麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂及其保藏方法
技术领域
本发明涉及一种制备麦氏弧菌的冻干保护剂和冻干方法，属于微生物学检测方面的菌种保藏领域。
背景技术
致病性弧菌广泛发分布于海水、海产品中，尤以近海口、河口多见，人类摄入或接触污染的水源和食物而引起感染。其中麦氏弧菌(Vibriometschnikovii)是国际公认的11种致病性弧菌之一，也是引起感染性腹泻的致病菌，主要能引起人类的创伤性感染和败血症。麦氏弧菌因与霍乱弧菌培养特征相同，在pH10及40℃能生长，且在检测霍乱弧菌的血清学实验中呈现阳性，容易误诊为霍乱弧菌。此外，麦氏弧菌氧化酶阴性，在常规检验中易误认为肠杆菌科细菌而漏检。目前发展的VITEK等多种商品化的生化鉴定系统针对麦氏弧菌的鉴定也存在偏差。因此，为了避免血清分型和生化实验等不确切和矛盾的结果，快速有效的准确鉴定方法多有报道，但是未有报道麦氏弧菌的长期保存技术研究。菌种的长期有效地保存，是研究该菌的流行病学、病原学、病理学和检测技术的基础。
在微生物实验室中,常需保存一些微生物实验室进行室内质控常用的标准菌种及临床分离菌株，菌种在科学实验、教育、传染病的致病机理及遗传变异的研究中起着重要的作用。菌种保存应选择最适宜的保存方法,避免在保存期间中死亡、变异及衰退,以保持菌种原有的各种生物学特征,从而达到保证科研、实验的目的。菌种在保存过程中,必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态,这样才能在一定的时间内不发生变异而又保持生物活性。保存菌种的原理,不外乎是设法尽量减低微生物代谢作用的速度,使其限于暂时性的“假死”，力求尽量隔艳外界环境的影响，其遵循三个原则,即(l)降低环境的温度；(2)隔绝空气中的氧气；(3)干燥脱水。目前，保存菌种的方法很多，其中能完全符合这三个原理的，且在实际应用中被国内外学者证实为最佳方法的，应该是冷冻真空干燥法。
目前，冷冻干燥用于生物制品的长期保存方面的技术还不成熟。比如在冷冻真空干燥过程中，因剧烈的环境而产生的冻结和干燥应力，会对细胞造成不同程度的损伤导致其死亡或失去活性。冷冻损伤主要是由冰晶形成所导致的，冷冻速率过快会导致机械损伤，过慢会导致溶质损伤。升华干燥也会引起细胞的损伤，过分干燥会导致细胞因脱水而死亡，提前结束干燥又会导致过多的水分，从而加速细胞代谢，使细胞活性下降。本发明引入了胁迫预处理的思路，胁迫预处理迫使菌体细胞及早启动防御机制，能有效减轻冷冻损伤和干燥应力损伤，大大提高麦氏弧菌冻干粉的复壮存活率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于冷冻真空干燥保存麦氏弧菌菌株的冻干保护剂和具体冻干方法，能够提高菌体抗冻能力的麦氏弧菌冻干粉的制备方法，为深入研究麦氏弧菌的相关研究提供技术支撑。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂，组成成分为：海藻酸钠、谷氨酸钠，丙酮酸钠，脱脂乳粉，氯化钠和无菌蒸馏水。
优选的，本发明的保护剂中还包括丙酮酸钠。通常情况下，细菌的冷冻损伤转变是可逆的，受损细胞的修复在生长繁殖之前，在修复过程中，磷脂和核酸可再合成，细胞内物质恢复到正常状态。麦氏弧菌在低温处理后，细胞中涉及糖酵解的酶表达下降，细胞内生命活动降低，例如丙酮酸激酶表达量下降，增加培养基中丙酮酸钠含量会修复受损细胞。
所述的各种成份的质量浓度为：2-10％海藻酸钠，1-9％谷氨酸钠，0.5-2％丙酮酸钠，0.5-2％脱脂乳粉，0.5-2％氯化钠，溶剂为无菌蒸馏水。
优选的，各种成份的质量浓度为：5.5％海藻酸钠，5.0％谷氨酸钠，1.2％丙酮酸钠，1.2％脱脂乳粉，0.5％氯化钠，溶剂为无菌蒸馏水。
该保护剂的配制方法为：将海藻酸钠、谷氨酸钠，丙酮酸钠，氯化钠溶解于蒸馏水中，在115℃条件下灭菌15min，自然冷却后配制成溶液A。将脱脂乳粉溶解于无菌蒸馏水中，并经0.22μm混合纤维素滤膜过滤后配制成溶液B。将溶液A和溶液B在无菌条件下混合，振荡均匀后配制成麦氏弧菌的冻干保护剂溶液。
本发明还提供一种麦氏弧菌的真空冷冻干燥保藏的方法，步骤如下：
经纯化培养的麦氏弧菌接种无菌的碱性蛋白胨水，在36±1℃条件下培养16-20小时，经过富集培养至稳定期，获得108-109CFU/mL的活菌悬液，并将活菌悬液与上述的麦氏弧菌的冻干保护剂溶液按体积比1:4的比例充分混合均匀后，取1mL分装至西林瓶中；
将分装好混悬液的西林瓶先置于4℃预冷，预冷时间为30min-60min；-70℃条件下预冻8-10h，再开盖放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中；冷冻干燥设置条件为：主干燥真空度0.11～0.16mbar、搁板温度-45℃～-35℃，冻干时间30h，二次干燥真空度0.01mbar，搁板温度-30～-10℃，时间10h；冻干结束后，立即手动进行压盖，密封西林瓶。
进一步的，本发明还提供一种麦氏弧菌冻干粉的制备方法，包括以下步骤：(1)麦氏弧菌悬液均匀分散于冻干保护剂中形成麦氏弧菌悬浮液，分装于西林瓶中。4℃预冷30min-60min；-70℃预冻8-10h。(2)将上述预冻的麦氏弧菌悬浮液转移至冻干机中，真空冷冻干燥，得到麦氏弧菌冻干粉。
本发明与现有技术对比的有益效果：
本发明采用先预冷后预冻的方式对麦氏弧菌进行适应性快速预冻，使预冻过程中菌体损失降低，优化真空干燥参数，能有效减轻冷冻损伤和干燥应力损伤，大大提高麦氏弧菌冻干粉的复壮存活率，得到麦氏弧菌冻干粉性质稳定，便于室温下长期储存，适用于科研研究。
优化了冻干保护剂的配方，并在其中添加了丙酮酸钠和适合弧菌生长的盐分，促进受损细菌的修复，改进菌种保藏方法。
本发明的保藏方法也进行了改进，在真空冷冻之前，先置于4℃预冷30min-60min；-70℃条件下预冻8-10h，提前启动细胞的防御机制，有利于细菌的保藏。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行详细说明：
实施例1
(1)菌株F5-1分离自进口美国的美国龙虾(Homarus americanus)腹部。无菌操作取美国龙虾腹部25g，置于装有225mL碱性蛋白胨水的无菌均质杯中，36±1℃恒温培养18h，划线接种于TCBS琼脂平板，36±1℃培养24h，观察菌落形态，获得菌落形态基本一致的优势细菌一株，挑取这株菌的单个菌落，再次转接至一个新的TCBS琼脂培养基上进行划线培养。重复以上步骤2-3次，直至获得该菌的纯培养物。使用全自动微生物鉴定仪和革兰氏阴性菌鉴定卡进行鉴定，确定这株菌为麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)。
(2)经纯化培养的麦氏弧菌接种无菌的碱性蛋白胨水，在36±1℃条件下培养16-20小时，经过富集培养至稳定期，获得108-109CFU/mL的活菌悬液，并将活菌悬液与上述麦氏弧菌的冻干保护剂溶液按体积比1:4的比例充分混合均匀后，取1mL分装至西林瓶中。
(3)冻干
将分装好混悬液的西林瓶先置于4℃预冷，预冷时间为30min-60min；-70℃条件下预冻8-10h，再开盖放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中。冷冻干燥设置条件为：主干燥真空度0.11mbar、搁板温度-45℃～-35℃，冻干时间36h，二次干燥真空度0.01mbar，搁板温度-30～-10℃，时间12h。冻干结束后，立即手动进行压盖，密封西林瓶。整个冻干时间为48h。
(4)冻干存活率
将菌悬液与冻干保护剂按照体积比1:4混合均匀后，采用平板菌落计数法计算冻干前的活菌数；取冻干后的菌粉于超净工作台上，加入1mL无菌生理盐水，静置20min，使其复水，然后采用平板菌落计数法测定冻干后的活菌数，存活率按式以下计算：
存活率＝冷冻干燥前的活菌数/冷冻干燥后的活菌数
在冻干完成后的当天，分别取6个西林瓶，在无菌条件下打开密封盖加入1mL的灭菌碱性蛋白冻水进行复水，待冻干粉完全溶解后用碱性蛋白冻水进行稀释，并用硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖(TCBS)琼脂涂布，36±1℃培养24h，进行活菌计数，以测定冻干菌株的存活率，每个梯度进行3次平行试验，取平均值，结果见表1.
表1冷冻干燥后的存活率
Figure GDA0002987708560000041
分别将添加保护剂得到的冻干粉放在低温(4℃)和常温(25℃)下储藏，7天，1个月、2个月、3个月分别取出6瓶，测一次活菌数，连续测3个月，每个处理3个平行，试验重复2次，最后计算存活率。见表2、表3
表2 4℃保存的存活率
Figure GDA0002987708560000051
表3 25℃保存的存活率
Figure GDA0002987708560000052
(5)冻干菌粉生理特征
在冻干完成后的当天、4℃保存7天，1个月、2个月、3个月，分别取6个西林瓶，在无菌条件下打开密封盖加入1mL的灭菌碱性蛋白冻水进行复水，36±1℃培养24h，划线于TCBS平板上，对复苏的菌株进行VITEK鉴定，生理生化特征符合麦氏弧菌。
(6)低温胁迫处理前后的冻干效率比较
表4冷激处理效果
Figure GDA0002987708560000053
(7)保护剂加丙酮酸钠的冻干效率比较
表5添加丙酮酸钠保护剂的冻干效果
Figure GDA0002987708560000061
实施例2
(1)菌株F14-11分离自进口爱沙尼亚的冻北极甜虾。无菌操作取冻北极甜虾25g，置于装有225mL碱性蛋白胨水的无菌均质杯中，36±1℃恒温培养18h，划线接种于TCBS琼脂平板，36±1℃培养24h，观察菌落形态，获得菌落形态基本一致的优势细菌一株，挑取这株菌的单个菌落，再次转接至一个新的TCBS琼脂培养基上进行划线培养。重复以上步骤2-3次，直至获得该菌的纯培养物。使用全自动微生物鉴定仪和革兰氏阴性菌鉴定卡进行鉴定，确定这株菌为麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)。
(2)经纯化培养的麦氏弧菌接种无菌的碱性蛋白胨水，在36±1℃条件下培养16-20小时，经过富集培养至稳定期，获得108-109CFU/mL的活菌悬液，并将活菌悬液与上述麦氏弧菌的冻干保护剂溶液按体积比1:4的比例充分混合均匀后，取1mL分装至西林瓶中。
(3)冻干
将分装好混悬液的西林瓶先置于4℃预冷，预冷时间为30min-60min；-70℃条件下预冻8-10h，再开盖放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中。冷冻干燥设置条件为：主干燥真空度0.11mbar、搁板温度-45℃～-35℃，冻干时间36h，二次干燥真空度0.01mbar，搁板温度-30～-10℃，时间12h。冻干结束后，立即手动进行压盖，密封西林瓶。整个冻干时间为48h。
(4)冻干存活率
将菌悬液与冻干保护剂按照体积比1:4混合均匀后，采用平板菌落计数法计算冻干前的活菌数；取冻干后的菌粉于超净工作台上，加入1mL无菌生理盐水，静置20min，使其复水，然后采用平板菌落计数法测定冻干后的活菌数，存活率按式以下计算：
存活率＝冷冻干燥前的活菌数/冷冻干燥后的活菌数
在冻干完成后的当天，分别取6个西林瓶，在无菌条件下打开密封盖加入1mL的灭菌碱性蛋白冻水进行复水，待冻干粉完全溶解后用碱性蛋白冻水进行稀释，并用硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖(TCBS)琼脂涂布，36±1℃培养24h，进行活菌计数，以测定冻干菌株的存活率，每个梯度进行3次平行试验，取平均值，结果见表6.
表6冷冻干燥后的存活率
Figure GDA0002987708560000071
分别将添加保护剂得到的冻干粉放在低温(4℃)和常温(25℃)下储藏，7天，1个月、2个月、3个月分别取出6瓶，测一次活菌数，连续测3个月，每个处理3个平行，试验重复2次，最后计算存活率。见表7、表8
表7 4℃保存的存活率
Figure GDA0002987708560000072
表8 25℃保存的存活率
Figure GDA0002987708560000073
(5)冻干菌粉生理特征
在冻干完成后的当天、4℃保存7天，1个月、2个月、3个月，分别取6个西林瓶，在无菌条件下打开密封盖加入1mL的灭菌碱性蛋白冻水进行复水，36±1℃培养24h，划线于TCBS平板上，对复苏的菌株进行VITEK鉴定，生理生化特征符合麦氏弧菌。
(6)低温胁迫处理前后的冻干效率比较
表9冷激处理效果
Figure GDA0002987708560000081
(6)保护剂加丙酮酸钠的冻干效率比较
表10添加丙酮酸钠保护剂的冻干效果
Figure GDA0002987708560000082
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂，其特征在于，各种成份的质量浓度为：2-10%海藻酸钠，1-9%谷氨酸钠，0.5-2%丙酮酸钠，0.5-2%脱脂乳粉，0.5-2%氯化钠，溶剂为无菌蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂，其特征在于，各种成份的质量浓度为：5.5%海藻酸钠，5.0%谷氨酸钠，1.2%丙酮酸钠，1.2%脱脂乳粉，0.5%氯化钠，溶剂为无菌蒸馏水。
3.麦氏弧菌的真空冷冻干燥保藏的方法，其特征在于，步骤如下：
经纯化培养的麦氏弧菌接种无菌的碱性蛋白胨水，在36±1℃条件下培养16-20小时，经过富集培养至稳定期，获得108-109CFU/mL的活菌悬液，并将活菌悬液与权利要求1或2所述的保护剂溶液按体积比1:4的比例充分混合均匀后，取1mL分装至西林瓶中；
将分装好混悬液的西林瓶先置于4℃预冷，预冷时间为30min-60min；-70℃条件下预冻8-10h，再开盖放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中；冷冻干燥设置条件为：主干燥真空度0.11~0.16mbar、搁板温度-45℃~-35℃，冻干时间30h，二次干燥真空度0.01mbar，搁板温度-30~-10℃，时间10h；冻干结束后，立即手动进行压盖，密封西林瓶。
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