JPS60176580A - 凍結乾燥微生物の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の技術分野 本発明は広義に、凍結乾燥微生物を培養する新規な方法
、及び微生物とその微生物の生産物を凍結乾燥する新規
な方法に関する。特に本発明は無菌蒸留水で復元したと
き容器中で直接実質的な対数又は指数増殖をする生育可
能な微生物を含有する凍結乾燥調製物ができるように、
栄養分を含有す、る容器中で微生物を凍結乾燥する方法
に関する。

本発明は研究や臨床検査室における診断の応用に、そし
て教育用手段としても使用できる。

先行技術の説明 凍結乾燥は長い間、将来の央砿、対照又は比較のために
培養昭を保存しておく簡便で経済的な方法であると考え
られてきた。凍結乾燥は、生物活性を維持しながら長期
間の保存が可能である乾燥調製物を生成すると一般に考
えられている。このＡ、Ｔ、０．０．　（，１９８０年
）に、特に異なる微生物に適した方法に言及しながら、
広く記載されている。この説明書には、広範囲の微生物
を凍結乾燥するのに適した従来の方法と、その方法を実
施するのに適した器具が記載しである。

凍結乾燥の操作中に培養液の水分が除去されると、分子
はその場所に事実上固定されてしまい、生成物の物理学
的又は化学的性質が変化する機会はほとんど又は全くな
くなる。このような生成物を調製する場合は当然培養萌
の生育可能性が維持され℃いることが最も重要である。

微生物を保護するために、凍結乾燥中の細胞の傷害を最
小限にし微生物の生存期間を伸ばすことを目的とした種
種の凍結保護剤の存在下で、凍結乾燥を実施するのがふ
つうである。先行技術中において使用されてきた凍結保
護剤にはブドウ糖、ショ糖、乳糖、マンニトール、クリ
セロール、テキストラン、果糖、及びその他の物質〔た
とえばグルタミンｔａ　−ナトリウム、ポリビニルピロ
リドン（ｐｖｐ　）　、粉末せ性ホエイ、乾燥スキムミ
ルク、乾燥全乳、そして牛血清アルブミン〕がある。

また凍結乾燥前に濃縮した微生物の培養液に少量の新鮮
な栄養培地（例：ブイヨン）を加えるのがふつうである
。この栄養培地は生物学的に適合する浮遊剤として用い
る。この栄養培地はまた凍結保護剤としても働き、再発
育させたときの直後の栄養源となる。しかしながら先行
技術は、凍結乾燥調製物を無菌蒸留水で正しく復元した
ときその場で活性のある増殖菌が得られるように、凍結
乾燥すべき浮遊液中の微生物と栄養培地の比率が調節さ
れているような、容器中の微生物の凍結乾燥については
開示していない。

先行技術はいつも、凍結乾燥調製物の無菌蒸留水による
標値的な復元法により実質的には発育静止期の非休眠性
の培養菌が得られるように、浮遊用液体と共に添加され
る栄養分の量に対する生物の幾度を使用してきた。ふつ
う復元は凍結乾燥調製物に適当なブイヨン、蒸留水など
を混合することでできる。それから復元した調製物の一
部又は全てを新鮮な増殖培地に植菌することにより培養
菌を増殖させるーすなわち微生物の凍結乾燥調製物は、
その単一の培養菌をその保存容器中で直接増殖させるた
めではなく、新しく調製し外から加えた栄養培地を用い
て無数の新鮮な培養菌を増殖させるのに用いられてきた
。

本発明の目的は、微生物の凍結乾燥調製物から、たとえ
ば小バイアルのような容器中で増殖中の培養菌を樹立す
る簡便な方法を供することである。

本発明のもう一つの目的は、微生物の凍結乾燥調製物か
ら活発に増殖し繁殖している培養石を得るために新鮮な
栄養培地を調製して凍結乾燥調製物に供給する必要のな
い、微生物の凍結乾燥調製物を復元する方法を供するこ
とである。

本発明のさらに別の目的は、凍結乾燥調製物を無菌蒸留
水で復元するだけで直接その場で活発な増殖菌が得られ
るように、容器中で微生物と栄養分を凍結乾燥する方法
を供することである。

本発明のさらにもう一つの目的は、容器に正しい量の無
菌蒸留水を加えるだけでその中で活発な増殖菌が得られ
るように、微生物、栄養分、そして随時に凍結保護剤の
特定の凍結乾燥組成物を有する容器を与えることである
。

これらの目的及び以下の記載より明らかな他の目的を本
発明は与える。

発明の要約 最初の態様において本発明は、ｆａｔ凍結乾燥調製物中
の生育可能な微生物の数と栄養分の量が、その栄養分が
生育可能な微生物の実質的な対数増殖を維持するのに充
分な量であるような、微生物と栄養分の凍結乾燥調製物
を含有する密封した容器を与え、（１））この容器を開
封して水を加えこの生育可能な微生物の対数増殖を開始
させることより成る、容器中で増殖中の培養菌を樹立す
る方法より成る。

また別の態様においては本発明は、故生物と栄養分の凍
結乾燥調製物中の生育可能な微生物の数と栄養分の量が
、この凍結乾燥調製物を含有する容器に水を添加１〜だ
とき、栄養分が容器中の生育可能な微生物の実質的な対
数増殖を維持するのに充分子［蛍である、微生物と栄養
分の凍結乾燥調製物を含有する密封容器より成る。

さらに別の態様においては本発明は、 ａ、栄養培地中で微生物を培養し、 ｂ、この培養液から細胞の濃縮液を作り、Ｃ０この細胞
濃縮液に新鮮な栄養培地を加えて細胞浮遊液を作り、 ｄ、容器中でこの細胞浮遊液を凍結乾燥して容器中の凍
結乾燥調製物を作り、そして θ、新鮮な栄養培地中の一定量の栄養分を与えて、この
栄養分が凍結乾燥調製物中の生育可能な微生物の実質的
な対数増殖を維持するのに充分な量であるようにするこ
とより成る、容器中の凍結乾燥調製物を得るための容器
中の微生物と栄養分を凍結乾燥する方法。

さらに別の態様において本発明は、 ａ、微生物を栄養培地中で培養し、 ｂ、この培養液から細胞の濃縮液を作り、Ｃ１この細胞
濃縮液に新鮮な栄養培地を加え細胞浮遊液を作り、 ｄ：　容器中でこの細胞浮遊液を凍結乾燥して容器中の
凍結乾燥調製物を作り、 ｅ、新鮮な栄養培地中の一定量の栄養分を与えて、この
栄養分が凍結乾燥調製物中の生育可能な微生物の実質的
な対数増殖を維持するのに充分な量であるようにし、そ
して ｆ、容器中の凍結乾燥浮遊液を水で復元して、この凍結
乾燥浮遊液中の生育可能な微生物を正しくインキュベー
トすると実質的な対数増殖をするようにすることより成
る、 容器中で増殖中の培養菌を樹立する方法を与える。

詳細な説明 本発明は、水で復元したとき直接容器中で実質的な対数
増殖をするような凍結乾燥調製物が得られるように、容
器中の微生物と栄養分を凍結乾燥する方法に関する。凍
結乾燥調製物に他の生物や毒性を与える可能性のある物
質が混入するのを避けるため、調製物は無菌蒸留水を用
いて復元するのが好ましい。従って本明細書中の以後の
部分では無菌蒸留水の使用を強調している。

本明細書において「実質的な対数増殖」とは、増殖の止
まる時期の細胞の数（すなわち静止期の細胞の数）が、
最初に復元したときの細胞の故より少なくとも約１０倍
多いことを意味する。凍結乾燥調製物中の栄養分の量と
生育できる微生物の数は、復元した浮遊液では少なくと
も１００倍以上の細胞数の増加が起きるように調節しで
あることが好ましい。「微生物の静止期における濃度よ
りも実質的に低い生育可能な微生物の濃度」という言葉
は、復元した浮遊液中の最初の細胞数は増殖の止まる時
期の細胞の数（すなわち静止期の細胞の教）より少なく
とも約１０倍少ないことを意味する表現に関連している
。

「培養菌」という言葉は栄養培地中で培養Ｉ、た又は増
殖した一群の１故生物を意味する。

またここで使用されている「新鮮な栄養培地」又は「適
当な栄養培地」などの言葉は、凍結乾燥されている微生
物の増殖を維持するのに必要でありかつ充分な栄養分の
水溶液又は浮遊液を意味する。

凍結乾燥はふつう微生物を保存する有効な方法でアルド
考えられている。この方法では微生物は凍結中に急速に
乾燥される。本発明を実施するには微生物はまず適当な
栄養培地、好ましくは凍結乾燥すべき属や種の微生物に
とって最適の栄養培地中で増殖させる。適当な栄養培地
又は増殖培地は一般に炭素源の他に通常の必要な栄養分
（たとえば窒素源、イオウ源やリン源、微量金属などの
無機物質、増殖因子、酸素そして二酸化炭素）を含有す
る。栄養培地はふつう凍結乾燥される微生物に適した市
販の栄養物質〔たとえばＢａｃｔＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂ
ｒｏｔｈ　（Ｄｉｆｃｏ　Ｏｏ、、　Ｄｅｔｒｏｉｔ　
、　Ｍｉ、）］より調製する。

ある特定の微生物株を培養するのに適した水性栄養培地
又は基礎培地の組成は当業者は容易に理解できる。さら
に１吸生物を所期の様式で増殖させるために栄養培地中
の特定の栄養分の濃度を選ぶことが、具体的に考えられ
る。たとえば正しい成分（栄養分）を蒸留水に溶解又は
浮遊させた後、必要があれば、滅菌し培養液に無菌的に
移すことにより培地は調製できる、微生物は好ましくは
その最適温度範囲内で最大静止期に達するまでインキュ
ベートする。本発明の実施にあたっては、培地、温度、
微生物の増殖特性により、インキュベーション時間は微
生物ごとに異なる。たとえば栄養細胞はふつう対数増殖
中期又は後期に採取する。

本発明の方法は藻類、カビ（酵母を含む）、細菌そして
原生動物などの多種類の微生物に適用できる。前記した
様に特定の微生物株に適用できる適切な栄養培地や増殖
条件は当業者には明白である。たとえば細菌は一般的に
広範囲の物理的条件下で増殖が可能であるし、多くの異
なる栄養分を利用できるが、よく知られているようにあ
る特定の種の微生物の最適な増殖にはある特定の条件が
必要であろう数種類の微生物に対し適当な市販の栄養培
地は後述の実施例に記載しである。

培養した菌を集めた後、ここから細胞の濃縮液を調製す
る。たとえばあらかじめ培養した菌を遠心分離して上澄
液を除くことにより濃縮液が得られる。この操作により
、凍結乾燥中に微生物の生存を妨害する可能性のある代
謝物である副産物、及び／又はその後で復元したときに
増殖を阻害する可能性のある物質が除かれる。細胞濃縮
液を調！！するその他の方法は当業者には明らかである
。

それから細胞濃縮液は新鮮な無菌栄養培地に浮遊する。

細胞濃縮液を所定量の既知の濃度の新鮮な栄養培地で稀
釈して細胞浮遊液を作る。一般に細胞浮遊液の調製に用
いる栄養培地は、培養閑を増殖させるために最初如月い
たものと同じ栄養成分を有しているが、濃度は高い一徹
生物を増殖させるために用いる栄養培地に関する説明が
、同様に細り１８浮遊液を作るために用いる新鮮な栄養
培地に関しても同様に適用できる。

本発明は、正しい量の無菌蒸留水をそこに加えた場合そ
の場所で活発に増殖する培養菌が得られるように、容器
中で微生物と栄養培地の凍結乾燥ＮＷ４製物を作るとい
う目的を有している。ある場合に必要な栄養培地の容量
と（ａ度を決めるために、まず細胞濃縮液中の細胞の濃
度を固定（確定）してこれらの細胞のうち何係が凍結乾
燥中に生存し続けるか、すなわち凍結乾燥調製物中生き
ているａ生物の割合をめておく必要がある。この値はふ
つうの実験（たとえば直接又は間接的細胞計数法）によ
り容易にめられ、また正確に再現性のある方法により培
養し、集菌しくすなわち細胞濃縮液の調製）凍結乾燥さ
れた微生物の株についてはこの値はふつうかなり一定で
ある。次にこの細胞浮遊液から得られた凍結乾燥調製物
がある数の生育可能な微生物を含有しているように、新
鮮な栄養培地の量と濃度を選択する。このある数の微生
物とは、ある量の栄養物との混液として凍結乾燥中に死
滅せずその結果凍結乾燥調製物を適当な量の無菌蒸留水
で復元したとき復元した浮遊液中の生首可能な微生物の
濃度がその微生物の実質的な対数増殖を維持するのに充
分な濃度の栄養物中での静止期での濃度よりも実質的に
低くなるような数である。

復元した培養囚は、凍結乾燥調製物を無菌水で復元した
後もその菌の実質的な対数増殖を維持するのに適当な”
濃度の栄養分を含有していなければならない。ふつう復
元した浮遊液中の生育可能な微生物の濃度は約１０１細
胞／　ｍｌ以下である。細胞濃縮液、細胞浮遊液を調製
するのに用いる新鮮な栄養培地の量と濃度、そして凍結
乾燥調製物を復元するのに用いる無菌蒸留水の適当な量
との関係は、下記の仮説の例によって最もうまく説明で
きる。具体的な微生物の例は後に詳細に示す。

（１１Ｖｆｎ　＝　（ＫｆｌＯｃｖ（＋　）　／　（Ｃ
ｅｐｆ＋　１　そして（２１ＶＨ２０＝　（Ｋｆｌｏｏ
Ｖｏ）　／　０８ｐ（３）　ｆ２＝　（ＶＨ２０／ｖｆ
ｎ　）　＝　（Ｃｆｎ／”ｒｓ　）式中　ｖｆｎ　”所
定量の新鮮な栄養培地ｖＨ２ｏ＝凍結乾燥浮遊液を復元
するのに用いる無菌蒸留水の適切な量 ｆ１＝凍結乾繰中に生き残る細胞濃縮液中の細胞の割合
、すなわち凍結乾 燥調製物中の生育可能な細胞の割 合 ａ０＝細胞濃縮液中の微生物の濃度 ｖｏ＝細胞濃縮液の容量 ０ｓｐ＝復元した浮遊液の微生物の静止期の濃度 ｆ２　−新鮮な栄養培地中の栄養物の濃度（Ｃｆｎ）と
復元した浮遊液中の好 ましい栄養分の濃度（Ｏｒ８）の比 Ｋ　＝復元した浮遊液中の好ましい増殖の種度を示す１
０以上の定数 イ設生物Ａ株は最適の栄養培地でインキュベートした時
、約１０７細胞／　ｍｌの静止期細胞数に達する。この
培養液から標準的遠心分離法により調製した細胞濃縮液
の容量は約ｏ、ｉ　ｒｎｔ　（Ｖｏ）であり約５Ｘ１０
７細胞／ｍ１（Ｏｃ）の細胞を含有する、このｍ縮液を
標準的な凍結乾燥法で凍結乾燥したとき、適当な条件下
（ｆｌ＝　ｏ、ｓ　）で約８０係の細胞はある一定期間
生き残っている。その結果この特定の条件下ではこの細
胞濃縮液中の生育可能な細胞（￥なわち凍結乾燥の操作
中に生き残る細胞）の数は約４’Ｘ１０’細胞／ｍ７！
である。

復元したときにこの改生物が実質的な対数増殖をするた
めには、復元した浮遊液（栄養培地の濃縮液を含む）の
インキュベーション条件が初めに培養菌を増殖（仮定の
静止期の細胞数は約１０７細胞／　ｍｅであることに注
意）させるのに用いた条件とほぼ同じならば、復元した
浮遊液の濃度は１　Ｄ’細胞／ゴ以下である（菌数の少
なくとも１０倍の上昇；　Ｋ＝　１０　）ことが必要で
ある。すなわちこの場合　Ｃ５ｐ−１０７である。細胞
数が１０６細胞／ｍｅ以下の復元した浮遊液を得るため
には、凍結乾燥浮遊液は約４　ｍｌの無菌蒸留水で復元
しく式（２））、凍結乾燥調製物用に適当な容量の復元
水を固足しなければならない。もちろん復元水の量には
多少の変効があり菌のｌｉｊ力学的性質にも若干の影響
を与える。しかし復元水の畦が多すぎる場合は栄養分の
濃度が低すぎて菌の増殖を維持できなくなる。一方復元
水の着が少なすぎる場合は栄養分の良度が高くなりすぎ
て閑に対して毒性を与えるであろう。この開示に基づけ
ば、微生物の実質的な対数増殖を開始させるために加え
るべき復元水の量の許容範囲は当業者には容易に理解で
きる。

細胞濃縮液に加えるべき新鮮な栄養培地中の栄養分の嫡
度は、凍結乾燥中に除去すべき水の量を最小にするため
、復元した浮遊液中の菌を増殖させるのにふつう使用す
る濃度よりも高いことが好ましい、すなわち　ｆ２〉１
゜たとえば標準よりも少なくとも２倍量の栄養分（ｆ２
−２）が好ましい。こうして新鮮な栄養培地の必要量（
容量）が式（１）より計算できる。

上記の如く、凍結乾燥される特定の属や種について復元
したときに巌適の組成が得られるように新鮮な栄養培地
を調製することが好ましい。ｆ２−２であるこの仮説の
例においては細胞濃縮液を、２倍濃度の新鮮な栄養培地
２ｄで稀釈して細胞浮遊液を得る。

Ｅ記の式は必ずしも厳密に守る必要はなく、そこから計
算される数値は単なる指標として用いることが好ブしい
。これらの式を本明細書に加えたのは本発明をより完全
に例示し説明するためである。便宜上、正しい（大体の
）細胞濃度を有する細胞浮遊液調製物であることを確認
するため、ネフエゝロメーターや分光光度計を用いるこ
とができる。

微生物の保存のための従来の凍結乾燥法では、浮遊用液
体と共に加える栄養分の量に比較してはるかに高濃度の
微生物が使用され、そうすることにより、凍結乾燥中に
生き残る細胞の数を考慮に入れたあとも、従来の復元し
た浮遊液は静止期と同じか又はそれに近い濃度の微生物
を含有するようになっている。

本発明の細胞浮遊液はふつう保護溶剤すなわち凍結保護
剤を含有している。この凍結保護剤は栄養培地に加える
のが便利である。この凍結保護剤は凍結乾燥中の微生物
の生存率を上昇させる。本発明の広義の実施において先
行技術に開示された広範囲の凍結保睦剤のうち任意のも
のを用いることができ、本技術に関し当業者は、特定の
株の微生物にはある種の凍結保護剤がより有効であるこ
とは容易に理解できる。ある種の凍結保護剤（たとえば
乾燥スキムミルク）は復元すると濁った培養液を生成す
るため、光学的方法（たとえば分光光度法、ネフエロメ
トリー、又は濁度法）を用いて、復元した浮遊液の増殖
を追跡したい場合はこのような凍結保護剤は好ましくな
い。このような場合は一般的に、復元した培養菌の光学
的特性にほとんど影響を与えないショ糖や牛血清アルブ
ミンが好寸しい。

ふつう凍結保護剤も含有する細胞浮遊液の調製後この浮
遊液を適当な容器中で凍結乾燥する。細胞浮遊液は調製
後できるだけ早く凍結乾燥することが好ましい。ふつう
広範囲のがラスやある場合にはプラスチックのアンプル
やバイアルが概して使用される。透明の容器は、増殖し
ている復元した浮遊液が肉眼で見えるし光学的分析も可
能なため特に好ましい、この容器の容量は大体１１以下
であり、ふつう１００ｍ１以下の容量の容器が用いられ
る。この容器は使用前に洗浄し、滅菌し、正しく明示す
る。

細胞浮遊液の凍結乾燥法を完全に記述するのは本発明の
範囲外であり、先行技術に容易に見出される方法が適当
である。一つの方法は以下の例において詳細に記載する
。一般的に前記の浮遊液は、まず培養菌を一４０℃で約
１時間凍結しくたとえば市販の凍結乾燥機中）、次に空
気を抜いて絶対圧を下げることにより凍結乾燥する。こ
の長時間にわたる脱気中に調製物の温度を徐々に周囲温
度まで上げる。標準的な凍結乾燥装置の任意のものを本
発明の実施に使用できる。本発明の広義の実施における
微生物の凍結乾燥に適した正しい方法や装置の詳細につ
いては、前記の文献のｔＭ　ＡＴ○０Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｎ　Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
　：　Ｆｒｅｅｚｉｎｇａｎｄ　ＦｒθｅＺθ−Ｄｒｙ
ｉｎｇを参照。その開示をそのまま本明細書に記載しで
ある。

最後の目的殴の水分を除去した後、微生物と栄養分の凍
結乾燥Ａ製物を含有する容器はきちんと密封し保存の準
備ができる。この容器は一定量の凍結乾燥微生物と凍結
乾燥栄養分を含有し、正しく復元しインキュベートする
ことにより活性のある微生物培養液がその場で得られ、
この培養菌は最初の細胞数から終わりの細胞数まで実質
的な対数増殖をする。

凍結乾燥調製物を含有する容器は周囲ユ度で保存するこ
ともできるが、５°Ｃ以下の一定温度で保存する方が凍
結乾燥微生物の生育可能期間を長くする。特定の微生物
株が特別の保存条件が必要か、又は標準的保存方法でよ
いのかは当業者は容易に理解できる。

本発明の方法においては、凍結乾燥微生物の増殖培養菌
は、保存容器中で直接凍結乾燥調製物を適量の無菌蒸留
水で復元するだけで樹立できる。

容器を開封し、復元した浮遊液中の栄養分の濃度を凍結
乾燥調製物中の生育可能な微生物の実′直的な対数増殖
に適した濃度に調製するのに必要な量の水を容器に加え
る。こうして栄養培地の正しい濃度がその場で達成され
る。復元した浮遊液を含有する容器を次に、その微生物
の種に適した条件（たとえば光、酸素、温度など）でイ
ンキュベートする。しばらく遅れてから細胞集団は指数
又は対数増殖の急速な上昇にはいる。この細胞集団は最
初の細胞数から最後の細胞数（静止期に存在する一定の
細胞数に対応する）まで実質的な対数増殖をする。増殖
が停止に向かうのはある栄養が不足してくるのが原因で
ある。ある場合には増殖による毒性のある副産物の生成
が原因のこともある。

一般に、靜止勘に達してからは細胞数は一定期間不変で
ある。

微生物培養液（細胞浮遊液）を透明な容器中で凍結乾燥
し、復元した浮遊液の光学特性に有害でない凍結保護剤
を用いることにより、細胞数の変化は光学的方法（たと
えば分光光度法、ネフエロメ）ＩＪ−１そして濁度法）
で容易に追跡できる。

こうして本発明の製品は、たとえば細胞の動力学、生殖
、増殖などについて教える教育用に使うことができる。

教育用補助品として本発明の製品はキットとして供給さ
れるーこのキットは微生物と栄養分の凍結乾燥調製物を
含有する透明の容器と、凍結乾燥調製物を復元するため
の適当な量の無菌蒸留水を含有する２番目の容器を含有
するパッケージより成る。本発明の製品は研究や化学実
験室などで使用することもできる（たとえば診断的応用
や、凍結乾燥調製物から活発に増殖している培養菌が調
製される任意の分野）。

診断方法をチェックするものとして、臨床倹査室は一般
的に、その方法の正確さや試薬の適切さを証明するため
に検査している又は検出している特定の細菌の既知の培
養菌を必要とする。従って生育可能な標準的に反応をす
る微生物の容易に入手できる経済的な入手源に対する要
求がある。本発明はその要求を満たすのみでなくそれを
簡便で便利でかつ経済的な方法で実施する。

本発明は、活発に増殖する培養菌を微生物の凍結乾燥調
製物から調製するたびにいつも新鮮で無菌の栄養培地を
調製又は供給する必要性を除去している。従って凍結乾
燥試料から活発な培養菌を調製する時間と手間が大幅に
減少できる。

以下の例は説明用であり失して本発明の範囲を限定する
ものではない。

実施例１ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　０ｕｌｔｕｒｅ　Ｏｏｌ
’１ｅｃｔｉｏｎ　６Ｑ　５１番から入手できる枯草菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）の特定の株
の純粋培養菌をＢａｃｔｏ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａ
ｒＤ工ＦＯＯＯ７１１で試験管培養をした。細胞集団が
後期対数期に達したとき、細胞を集め培養菌を遠心分離
して細胞濃縮液を調製した。次に細胞を、１２　％　（
ｖ／ｖ　）　シヨ糖ト５４　（Ｖ／′Ｖ）　牛血清アル
プミンを含有する２倍濃度のＢａｃｔｏ　ＩＪｕｔｒｉ
ｅｎｔＢｒｏｔｈ　Ｄ工Ｆ０００７１１に再浮遊し１０
７細胞／−の細胞浮遊液を得た。細胞濃度は分光光度計
を用いて確認した。

その後１．０ｒｎｌの細胞浮遊液を４．Ｑｍｌの透明の
がラスバイアルに入れた。この容器にブチルゴム製の栓
をして、あらかじめ冷却したＶｉｒｔｉθ２５ＳＲＯ−
ＭＳ　昇華器の棚にこのバイアルをのせ−４０”Ｃ（温
度は追跡した）まで冷却して凍結乾燥した。昇華器槽内
は５０マイクロ（Ｈｇ、）まで脱気し、コンデンサーは
−５５−０；棚は一６０℃まで暖め、約６８時間昇華さ
せた。棚温塵を６０゛Ｃまで上げ生成物の温度が２０゛
Ｃになるまで乾燥を続けた。バイアルに無菌のＮ２を充
填し栓をした。

次に加速保存試験の一環として凍結乾燥試料の一部を約
′５７℃で８０日間保存した。６７℃での８０日間蘭の
保存は２５”Ｃで１２００−１６００日間保存するのに
等しい。

次に保存しておいた凍結乾燥調製物を取出し、容器を開
封して、３ｍＪの無菌水を加えて凍結乾燥調製物を復元
した。正しくインキュベーションすることにより、復元
した培養菌は初期細胞数２．４Ｘ１０’細胞／、ｒｔｌ
から実質的な対数増殖を示した。

実施例２ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ　ｌ　１７７５番から入手できる大腸菌
（Ｆ！５ｃｈｅｒｉａｈｉａ　ｃａｄｉ　）の特定の株
の純粋培養菌をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ　ＤＩＦ
’０Ｏ０７１１で試・験培養をした、細胞集団が後期対
数期に達したとき遠心分離して細胞を集め、１２係（Ｖ
／Ｖ　）ショ糖と５４　（ｖ／ｖ　）牛血清アルブミン
を含有する２倍濃度のＢａｃｔｏ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　
Ｂｒｏｔｈ０７１１に再浮遊させ約１０７細胞／プの細
胞濃度を得た。細胞濃度は分光光度計を用いて確認した
。

次に１．０Ｍの細胞濃縮液を４．Ｏｄの透明のがラスバ
イアルに入れ、この容器にブチルゴム製の栓をして実施
例１と同様の方法で凍結乾燥した。

実施例１と同様の加速保存期間の後に凍結乾燥調製物を
取出し、容器を開封して７．、、Ｑｍｌの無菌水を加え
て培養菌を復元した。正しくインギュペーションするこ
とにより、復元した培養菌は初期細胞数２．９　Ｘ　１
０５細胞／ｒｒｔｌから実質的な対数増殖を示した。

実施例ろ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ　８１９５番から入手できるセラチアマ
ルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｅｎｓ　）
の特定の株の純粋培養菌をＢａ０ｔＯＮｕｔｒｉｅｎｔ
　Ｂｒｏｔｈ　Ｄ工ｐａｏ０７１１で試験管培養をした
。細胞集団が後期対数期に達したとき遠心分離して細胞
を集め、１２％（Ｖ／Ｖ）ショ糖と５憾（Ｖ／Ｖ　）牛
血清アルブミンを含有する２倍濃度のＢａｃｔｏ　Ｎｕ
ｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ　Ｄ工ＦＯＯＱ　７　ｌ　ｌ
に再浮遊させ約１０７細胞／　ｍｌの細胞濃縮液を得た
。細胞濃度は分光光度計を用いて確認した。

次に１．０ｒＬｌの細胞濃縮液を４．０ｄの透明のがラ
スバイアルに入れ、この容器にブチルゴム製の栓をして
実施例１と同様の方法で凍結乾燥した。

実施例１と同様の加速保存期間の後に凍結乾燥調製物を
取出し、容器を開封して５．Ｑｍｌの無菌水を加えて培
養菌を復元した。正しくインキュベーションすることに
より、復元した培養菌は初期細胞数６．６×１０３細胞
／ｒＩＬｔから実質的な対数増殖を示した。

実施例４ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ　９４４９番から入手できるロートドル
ーラルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒ＋ｒｌａ　ｒｕｂｒａ　
）　ノ％定の株の純粋培養菌をＢａｃｔｏ　ＹＭ　Ｂｒ
’ｏｔｈ　Ｄ工Ｉ’ＯＯ０００３−Ｏｊ−６で試験管培
養をした。細胞集団が後期対数期に達したとき遠心分離
して細胞を集め、１２　％　（ｖ／ｖ）ショ糖と５４　
（ｖ／ｖ　）牛血清アルブミンを含有する２倍濃度のＢ
ａｃｔｏ　ＹＭ　Ｂｒｏｔｈ　Ｄ工ＦＯＯＤＯＯ３−０
１−６に再浮遊させ１．７Ｘ１１］７細胞／ｄの細胞濃
縮液を得た。

次に１．０ｄの細胞濃縮液を４．Ｏｍｌの透明のがラス
バイアルに入れ、この容器にブチルゴム製の栓をして実
施例１と同様の方法で凍結乾燥した。

凍結乾燥後容器を開封して３．Ｄコの無菌水を加えて培
養菌を復元した。正しくインキュベーションすることに
より、復元した培養菌は初期細胞数９Ｘ１０’細胞／ｄ
から実質的な対数増殖を示した。

本発明の具体的な態様をここに記載したが、本発明の精
神と範囲を逸脱することなく変更は可能であり、本発明
は特許請求の範囲のみによってのみ限定されることは当
業者眞は明らかなはずである。

代理人　浅　村　皓 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第２３２２６３号 ２、発明の名称 凍結乾燥微生物の培養方法 ３、補正をする者 事１１゛との関係　特ｎ出碩人 ４、代理人 ５、補正命令の日イ」 昭和６０年　２月２６［Ｊ ６、補正により増加する発明の数 〕 ７、補正の対象 ８、補正の内容　別紙のとおり 規な方法、及び微生物とその微生物の生産物を凍結乾燥
する新規な方法に関する。特に本発明は無菌蒸留水で復
元したとき容器中で直接実質的な対数又は指数増殖をす
る生育可能な微生物を含有する凍結乾燥調製物ができる
ように、栄養分を含有する容器中で微生物を凍結乾燥す
る方法に関する。

本発明は研究や臨床検査室における診断の応用にそして
教育用手段としても使用できる。

先行技術の説明 凍結乾燥は長い間、将来の実験、対照又は比較のために
培養菌を保存しておく簡便で経済的な方法であると考え
られてきた。凍結乾燥は、生物活性を維持しながら長期
間の保存が可能である乾燥調整物を生成すると一般に考
えられている。この方法はアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション拳メソツズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ
ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　）　１Ｌ保存に関する研究所の手引き：凍結
と凍結乾燥、ハツト・エイチ（Ｈａｔｔ　、　Ｈ，）　
、エイ・ティー・シイ・シイ（Ａ。

Ｔ、Ｃ，Ｃ，）　（１９８０年）に、特に異なる微生物
に適した方法に言及しながら、広く記載されている。こ
の説明書忙は、広範囲の微生物を凍結乾燥乾燥すべき属
や種の微生物にとって最適の栄養培地中で増殖させる。

適当な栄養培地又は増殖培地は一般に炭素源の他に通常
の必要な栄養分（たとえば窒素源、イオウ源やリン源、
微量金属などの無機物質、増殖因子、酸素そして二酸化
炭素）を含有する。栄養培地はふつう凍結乾燥される微
生物に適した市販の栄養物質〔たとえばバクト栄養ブロ
ス（ディフコ社）〕より調製する。

ある特定の微生物株を培養するのに適した水性栄養培地
又は基礎培地の組成は当業者は容易に理解できる。さら
に微生物を所期の様式で増殖させるために栄養培地中の
特定の栄養分の濃度を選ぶことが、具体的に考えられる
。たとえば正しい成分（栄養分）を蒸留水に答辞又は浮
遊させた後、必要があれば、滅菌し培養液に無菌的に移
すことにより培地は調製できる。微生物は好ましくはそ
の最適温度範囲内で最大静止期に達するまでインキュベ
ートする。本発明の実施にあたっては、培地、温度、微
生物の増殖特性により、インキュペにわたる脱気中に調
製物の温度を徐々に周囲温度まで上げる。標準的な凍結
乾燥装置の任意のものを本発明の実施に使用できる。本
発明の広義の実施における微生物の凍結乾燥に適した正
しい方法や装置の詳細については、前記の文献の「保存
に関するＡＴＣＣ研究所の手引き：凍結および凍結乾燥
」を参照。その開示をそのまま本明細書に記載しである
。

最後の目的量の水分を除去した後、微生物と栄養分の凍
結乾燥調製物を含有する容器はきちんと密封し保存の準
備ができる。この容器は一定量の凍結乾燥微生物と凍結
乾燥栄養分を含有し、正しく復元しインキュベートする
ことにより活性のある微生物培養液がその場で得られ、
この培養−は最初の細胞数から終わりの細胞数まで実質
的な対数増殖をする。

凍結乾燥調製物を含有する容器は周囲温度で保存するこ
ともできるが、５°Ｃ以下の一定温度で保存する方が凍
結乾燥微生物の生育可能期間を長くする。特定の微生物
株が特別の保存条件が必要か、特定の細菌の既知の培養
菌を必要とする。従って生育可能な標準的に反応をする
微生物の容易に入手できる経済的な入手源に対する要求
がある。本発明はその要求を満たすのみでなくそれを簡
便で便利でかつ経済的な方法で実施する。

本発明は、活性に増殖する培養菌を微生物の凍結乾燥調
製物から調製するたびに℃・つも新鮮で無菌の栄養培地
を調製又は供給する必要性を除去している。従って凍結
乾燥試料から活発な培養菌を調製する時間と手間が大幅
に減少できる。

以下の例は説明用であり決して本発明の範囲を限定する
ものではない。

実施例１ アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション６０５
１番から入手できる枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｉｘｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ　）の特定の株の純粋培養菌をｔ−、’１ク
ト栄養寒天ディフコ０７１１で試験管培養した。細胞集
団が後期対数期に達したとき、細胞を集め培養菌を遠心
分離して細胞濃縮液を調製した。次に細胞を、１２％（
ヅＶ）ショ糖と５チ（Ｖ／Ｖ　）牛血清アルブミンを含
有する２倍濃度のバクト栄養プロスディフコ０７１１に
再浮遊し１０７細胞／ｍｌの細胞浮遊液を得た。細胞濃
度は分光光度計を用いて確認した。

その後１．０ｍｌの細胞浮遊液を４．０Ｍの透明のガラ
スバイアルに入れた。この容器にブチルイム製の栓をし
て、あらかじめ冷却したＶｉｒｔｉｓ　２５８ＲＣ−Ｍ
Ｂ昇華器の棚にこのバイアルをのせ−４０００（温度は
追跡した）まで冷却して凍結乾燥した。

昇華器槽内は５０マイクロ（Ｈｇ　）まで脱気し、コン
デンサーは一５５°Ｃ；棚は一６０°Ｇまで暖め、約６
８時間昇華させた。棚温度を６０℃まで上げ生成物の′
温度が２０℃になるまで乾燥を続けた。

バイアルに無菌のＮ２を充填し栓をした。次に加速保存
試験の一環として凍結乾燥試料の一部を約６７°Ｇで８
０日間保存した。６７°Ｃでの８０日間の保存は２５℃
で１２００−１６００日間保存するのに等しい。

次に保存しておいた凍結乾燥調製物を取出し、容器を開
封して、３ｍｌの無菌水を加えて凍結乾燥調製物を復元
した。正しくインキュベーションすることにより、復元
した培養菌は初期細胞数２．４×１０４細胞／ＩｒＬｌ
から実質的な対数増殖を示した。

実施例２ アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション１１７
７５番から入手できる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ　）の特定の株の純粋培養菌を栄養プロスディ
フコ０７１１で試験培養した。細胞集団が後期対数期に
達したとき遠心分離して細胞を集め、１２　ｆ＝　（ｖ
／ｖ　）ショ糖と５％（Ｖ／ｖ）牛血清アルブミンを含
有する２倍濃度のバクト栄養プロス０７１１に再浮遊さ
せ約１０７細胞／　ｍｌの細胞濃度を得た。細胞濃度は
分光光度計を用いて確認した。

次に１．０ＩｒＬｌの細胞濃縮液を４．０Ｍの透明のが
ラスバイアルに入れ、この容器にブチルゴム製の栓をし
て実施例１と同様の方法で凍結乾燥した。

実施例１と同様の加速保存期間の後に凍結乾燥調製物を
取出し、容器を開封して６．Ｏｍｌの無菌水を加えて培
養菌を復元した。正しくインキュペー胞数２．９　Ｘ　
１０５細胞／　ｍｌから実質的な対数増殖を示した。

実施例６ アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション８１９
５番から入手できるセラチアマルセサンス（５ｅｒｒａ
ｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｅｎｓ　）の特定の株の純粋培養
菌なバクト栄養プロスディフコ０７１１で試験管培養を
した。細胞集団が後期対数期に達したとき遠心分離して
細胞を集め、１２％（ｖ／ｖ　）ショ糖と５％（Ｖ／Ｖ
　）牛血清アルブミンを含有する２倍濃度のバクト栄養
プロスディフコ０７１１に再浮遊させ約１０７細胞／　
ｍｌの細胞濃縮液を得た。

細胞濃度は分光光度計を用いて確認した。

次に０．１ｍｌの細胞濃縮液を４．Ｏｍｌの透明のガラ
スバイアルに入れ、この容器にブチルゴム製の栓をして
実施例１と同様の方法で凍結乾燥した。

実施例１と同様の加速保存期間の後に凍結乾燥調製物を
取出し、容器を開封して３．ＱｍＡ！の無菌水を加えて
培養菌を復元した。正しくインキュベーションすること
により、復元した培養菌＆ま初期細胞数６．３８１０”
細胞／　ｍｌから実質的な対数増殖を示した。

実施例４ アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション９４４
９番から入手できるロートドルーラルブラ（Ｒｈｏｄｏ
ｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ　）の特定の株の純粋培養菌
バクト靭ブロスディフコ０００３−０１−６で試験管培
養をした。細胞集団が後期対数期に達したとき遠心分離
して細胞を集め、１２％（ｖ／ｖ）ショ糖と５％（ｖ／
ｖ）牛血清アルブミンを含有する２倍濃度のバクトｍプ
ロスディフコ０００３−０１−６に再浮遊させ１．７　
Ｘ　１０’細胞／　ｍｌの細胞濃縮液を得た。

次に１．０４の細胞濃縮液を４．Ｏｍｌの透明のガラス
バイアルに入れ、この容器にブチルゴム製の栓をして実
施例１と同様の方法で凍結乾燥した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１容器中で増殖中の培養菌を樹立する方法において
   、（ａ）凍結乾燥調製物中の生育可能な微生物の故と栄
   養分の量がその栄養分が生育可能な微生物の実直的な対
   数増殖を維持するのに充分であるような、改生物と栄養
   分の凍結乾燥調製物を含有する密封容器を洪し、（ｂ）
   この容器を開封して水を加え、この生育可能な微生物の
   対数増殖を開始させることを特徴とする、上記方法。 （２）微生物と栄養分の凍結乾燥調製物中の生育可能な
   微生物の数と栄養分の量が、この凍結乾燥調製物を含有
   する容器に水を添加したとき、栄養分が容器中の生育可
   能な微生物の実質的な対数増殖を維持するのに充分な量
   である、１散生物と栄養分の凍結乾燥調製物を含有する
   密封した容器。 （３）増殖中の微生物の培養液の調製用キットにおいて
   、微生物と栄養分の凍結乾燥調製物中の生育可能な微生
   物の数と栄養分の計が、容器に水を添加したとき栄養分
   が容器中の生育５丁能な１故生物の実質的な対数増殖を
   維持するのに充分な敗であるような、微生物と栄養分の
   凍結乾燥調製物を含有する第１の密封した透明な容器と
   、この凍結乾燥調製物を復元するのに適した一定量の無
   菌の蒸留水を含有する第２の密封した容器から成る、上
   記キット。 （４）容器中の凍結乾燥調製物を得るための容器中の微
   生物と栄養分を凍結乾燥する方法において、ａ、栄養培
   地中で微生物を培養し、 ｂ、培養液から細胞の濃縮液を作り、 Ｃ１細胞濃縮液に新鮮な栄養培地を加えて細胞浮遊液を
   作り、 ｄ、容器中で細胞浮遊液を凍結乾燥して容器中の凍結乾
   燥調製物を作り、そして ｅ、新鮮な栄養培地中に一定量の栄養分を供し、栄養分
   が凍結乾燥調製物中の生育可能な微生物の実質的な対数
   増殖を維持するのに充分な量であるようにすることより
   成る、上記凍結乾燥方法。 （５）容器中で増殖中の培養菌を樹立する方法において
   、 ａ、微生物を栄養培地中で培養し、 ｂ、培養液から細胞の濃縮液を作り、 Ｃ８細胞濃縮液に新鮮な栄養培地を加えて細胞浮遊液を
   作り、 ｄ、容器中で細胞浮遊液を凍結乾燥して容器中の凍結乾
   燥調製物を作り、 ｅ、ｆｒ鮮な栄養培地中に一定量の栄養分を共し、栄養
   分が凍結乾燥調製物中の生育可能な微生物の実質的な対
   数増殖を維持するのに充分な量であるようにし、そして ｆ、容器中の凍結乾燥浮遊液を水で復元して、凍結乾燥
   浮遊液中の生育可能な微生物を正しくインキュベートす
   ると実質的な対数増殖をするようにすることより成る、
   上記樹立方法。 （６）　容器が透明である、特許請求の範囲第１項、第
   ２項、第４項又は第５項記載の発明。 （７）凍結乾燥調製物が凍結保護剤も含有する、特許請
   求の範囲第１項、第２項、第６項、第４項、又は第５項
   記載の発明。 （８）凍結保護剤がショ糖、牛血清アルブミン、及び乾
   燥スキムミルクより成る群から選ばれる、特許請求の範
   囲第７項記載の発明。 （９）凍結乾燥調製物が凍結保護剤としてショ糖と牛血
   岳アルブミンのうちのいずれかひとつ、又はその両者を
   特徴する特許請求の範囲第６項記載の発明。 ００）凍結乾燥調製物が凍結保護剤としてショ糖と牛血
   清アルブミンのうちのいずれかひとつ、又はその両者を
   特徴する特許請求の範囲第６項記載のキット。 （１１）微生物が細面のある株と酵母のある株より成る
   群から選ばれる、特許請求の範囲第１項、第２項、第３
   項、第４項、又は第５項記載の発明。