KR100396374B1 - 보존성이 우수한 동결 건조 균체의 제조 방법 및 이를 위한 동결 건조 보호제 조성물 - Google Patents

Abstract

미생물을 장기간 보존하기 위해 동결 건조 균체를 제조하는 방법에 있어서, 균체 건조 중량 100중량부에 대하여 스킴밀크 20 ∼70중량부, 유당 50∼100중량부, 갈락토오스 30∼100중량부, 트레할로오스 20∼100중량부로 이루어진 조성물을 동결 건조 보호제로 농축 배양액에 첨가함으로써 동결 건조 균체 중 생균수를 향상시키고 동결 건조 균체의 보존 시 그 안정성을 증가시킬 수 있다.

Description

보존성이 우수한 동결 건조 균체의 제조 방법 및 이를 위한 동결 건조 보호제 조성물

[산업상 이용 분야]

본 발명은 보존성이 우수한 동결 건조 균체의 제조 방법 및 이를 위한 동결 건조 보호제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 동결 건조 균체 중 생균 수를 향상시키며 동결 건조 균체의 보존 시 안정성을 증가시키는 보존성이 우수한 동결 건조 균체의 제조 방법 및 이를 위한 동결 건조 보호제 조성물에 관한 것이다.

[종래기술]

동결 건조는 미생물을 장기 보존하거나, 효소 또는 기능성 단백질 등과 같이 수용액 상태에서 온도 등의 조건에 상대적으로 불안정한 활성 물질의 보존 및 식품의 향과 성상을 원형 그대로 보존하기 위하여 사용되어 온 건조 방법중의 하나이다. 특히 미생물의 장기 보존의 경우 동결 건조 방법으로 건조시켜 보관하는 것이 일반적인 기술로 알려져 있다.

종래의 미생물 균주의 동결 건조 방법과 동결 건조에 따르는 동해 방지를 위해 사용되는 동결 건조 보호제의 경우 미생물을 적절한 배지에서 배양, 농축한 후동결 건조 보호제를 농축 배양액과 혼합한 후 급속히 냉각시키고 이를 동결 건조 장치에서 건조하는 방법을 사용하여 왔다. 상기 동결 건조 보호제로는 스킴밀크, 당류, 글루코오스 등의 성분 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 알려져 있는 바 대한민국 특허 공고 92-8363에서는 스킴밀크 또는 펩톤이나 이들의 혼합물, 당, 구연산의 혼합물을 사용하는 동결 건조 보호제에 대하여 소개된 바 있다. 그러나 이러한 종래의 동결 건조 방법 및 동결 건조 보호제는 동결 건조 보호제의 동해 방지 효과가 미흡하였던 바 동결 건조 후 높은 생균수를 포함할 수 없고 균체의 보관 시 지속적으로 높은 생균수를 유지할 수 없다는 문제점을 가지고 있다.

본 발명은 상기한 문재점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 동결 건조 후 높은 생균수를 포함하며 균체의 보관 시 높은 생균수를 지속적으로 유지할 수 있는 동결 건조 균체의 제조 방법 및 이에 사용되는 동결 건조 보호제 조성물을 제공하는 것이다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 미생물을 배지에서 배양,농축하고 균체 건조 중량 100중량부에 대하여 스킴밀크 20∼70중량부, 유당 50∼100중량부, 갈락토오스 30∼100중량부, 트레할로오스 20∼100중량부를 포함하는 동결 건조 보호제 조성물을 농축 배양액에 첨가하여 동결 건조 장치의 동결 건조 상자에서 미생물을 배양한 후 동결 건조 상자의 온도를 -5℃∼15℃가 될 때까지 분당 5℃∼15℃의 속도로 강하(전동결)하고 -5℃∼-15℃에서 5분∼10분간 일정온도로 유지한 후 온도를 분당 5℃∼15℃의 속도로 강하시켜 -40℃∼-50℃가 되었을 때 10^-3∼10^-5mm Hg로 감압하여 동결 제조하는 동결 건조 균체의 제조 방법을 포함한다.

상기한 본 발명에 있어서 상기 전동결 과정에서 상기 동결 건조 보호제 조성물을 재차 첨가하는 것이 바람직하며 상기한 미생물은 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces. cerevisiae.)이고 상기한 미생물을 YPD액체 배지에 배양한 후 농축하여 동결 건조하는 것이 바람직하다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

사카로마이세스 세레비시아 균을 글루코스 2중량%, 펩톤 1중량%, 효모 엑기스 1중량%로 이루어진 YPD 액체 배지에서 배양하여 얻은 균체를 농축하고 균체 건조 중량 100중량부에 대하여 스킴밀크 20∼70중량부, 유당 50∼100중량부, 갈락토오스 30∼100중량부, 트레할로오스 20∼100중량부를 포함하는 조성물을 동결 건조 보호제로서 농축배양액에 첨가하여 유리 페트리 접시에 도말한다.

상기 동결 건조 보호제의 조성비를 상기한 바와 같이 제한하는 이유는 각각의 성분들의 최소량 미만에서는 동결 건조 보호제로서의 동해 방지 효과가 미흡하고 각각의 성분들의 최대량을 초과하여 첨가하는 경우에는 동결 건조 보호제로서의 동해 방지 효과의 증가는 미미한 반면 점성이 증가하여 동결 건조 전후 실험 조작이 곤란하게 되는 등 성상의 변화로 인한 불리한 점이 발생하기 때문이다.

상기한 동결 건조 보호제는 트레할로오스를 20∼100중량부 첨가함으로서 보다 바람직한 효과를 얻을 수 있다.

상기한 미생물은 동결 건조 장치의 동결 건조 상자에서 배양한 후 동결 건조 상자의 온도를 -5℃∼-15℃가 될 때까지 분당 5℃∼15℃의 속도로 강하시키고 (전동결) 시료의 온도가 -5℃∼-15℃가 되었을 때 5된∼10분간 일정 온도를 유지시킨다. 이 후 다시 온도를 분당 5℃∼15℃의 속도로 강하시켜 -40℃∼-50℃가 되게 한다. 시료의 온도가 -40℃∼-50℃가 되었을 때 감압하여 동결 건조한다. 동결 건조시의 압력은 10^-3∼10^-5mmHg로 유지한다.

이는 동결 건조 과정 중 급속한 냉각 과정을 거치면 균체가 동해를 입어 동결 건조 후 생균수가 급격히 감소하게 되므로 상기한 방법으로 냉각함으로써 동결 건조 후 높은 생균수를 얻을 수 있도록 한 것이다.

특히 동결 건조 과정 중 전동결 과정 시 상기의 동결 건조 보호제를 첨가하여 동결 건조하였을 때 동결 건조된 균체중의 생균수를 현저히 높일 수 있었으며 균체의 보존 시 높은 생균수를 지속적으로 유지할 수 있다.

[실시예]

이하 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

사카로마이세스 세레비시아 균을 글루코스 2%, 펩톤 1%, 효모 엑기스 1%로이루어진 YPD 액체 배지 60㎖에서 24시간 배양후 YPD 액체 배지 3ℓ가 들어있는 발효조에 접종하여 임펠러 회전 속도 400rpm, 분당 공기 송입량 3Nl, 배양 온도 30℃애서 24시간 배양하였다. 배양액을 7000rpm의 회전 속도로 20분간 원심 분리하여 얻은 균체를 최초 배지 부피의 1/10정도로 다시 현탁하여 농축하였다. 농축 배양액에 최종 균체 건조 중량 100중량부에 대하여 스킴밀크 50중량부, 유당 100중량부, 갈락토오스 100중량부, 트레할로오스 50중랑부가 되도록 상기 성분들의 혼합 농축액을 농축 배양액 부피의 100부피%로 조절하여 동결 건조 보호제로서 혼합한 후 유리 페트리접시에 도말하였다.

시료가 도말된 페트리접시를 동결 건조 장치의 동결 건조 상자에 배열한 후 동결 건조 상자의 온도를 -10℃가 될 때까지 분당 10℃의 속도로 강하시키고 시료의 온도가 -10℃가 되었을 때 10분간 일정 온도를 유지시켰다. 이후 다시 온도를 분당 10℃의 속도로 강하시켜 -40℃가 되게 하였다. 시료의 온도가 -40℃가 되었을 때 감압을 하여 동결 건조하였다. 동결 건조 시의 감압의 조건은 10^-3mmHg로 유지하도록 하였다.

비교예 1

상기한 실시예 1에서 동결 건조 보호제를 첨가하지 않고 실시한 것을 제외하고는 상기한 실시예 1과 실질적으로 동일하게 실시하였다.

비교예 2

상기한 실시예 1에서 동결 건조 보호제로서 균체 건조 중량 100중량부에 대하여 스킴밀크 50중량부, 유당 100중량부, 갈락토오스 100중량부의 조성물을 사용한 것을 제외하고는 상기한 실시예 1과 실질적으로 동일하게 실시하였다.

상기한 실시예 및 비교예에서 제조된 동결 건조 균체의 생균수 측정은 상기 온도와 감압 조건에서 24시간 동안 건조한 후의 시료를 사용하여 적정량을 멸균 생리식염수로 적정 희석배수로 희석한 후 YPD 한천 고체배지에 균의 콜로니가 고체배지 페트리 접시당 30∼300개 정도 나타나게 도말한 후 30℃ 항온기에서 약 48시간을 배양하여 균수를 측정하였고 또한 이 시료를 상온에서 30일간 밀봉하여 방치한 후 생균수를 측정하였다.

그 측정 결과를 표로 정리하여 나타내면 다음과 같다.

* 상온에서 30일간 밀봉하여 방치한 후의 생균수

상기 실시예 1의 동결 건조 보호제를 사용하여 동결 건조시킨 동결 건조 균체에서의 생균수는 동결 건조 균체 그람당 5.2 × 10¹¹생균으로 비교예 1에서의 생균수인 동결 건조 균체 그람당 8.2×10¹⁰생균에 비하여 6배 이상 높은 생균을 포함하였으며 비교예 2에서의 생균수는 동결 건조 균체 그람당 1.5×10¹¹생균에 비하여 3배 이상 높은 생균을 포함하였다.

또한 상기 실시예 1의 동결 건조 보호제를 사용하여 동결 건조시킨 동결 건조 균체를 상온에서 30일간 밀봉하여 방치한 후 생균수를 측정하여 본 결과 생균수는 동결 건조체 그람당 3.4×10¹¹생균으로 최초 측정시에 비하여 65%의 생존율을 나타내어, 같은 상온에서 30일간 밀봉하여 방치한 후 생균수를 측정하여 동결 건조 균체 그람당 7.9×10⁸생균수를 나타내어 최초 측정시에 비하여 1%의 생존율을 나타낸 비교예 1에 비하여 65배 이상 높은 생균의 안정성을 나타내였으며, 역시 같은 상온에서 30일간 밀봉하여 방치한 후 생균수를 측정하여 동결 건조 균체 그람당 4.3×10¹⁰생균수를 나타내어 최초 측정시에 비하여 29%의 생존율을 나타낸 비교예 2에 비하여 2배 이상 높은 생균의 안정성을 나타내였다.

상기한 바와 같이 본 발명의 동결 건조 보호제와 본 발명의 동결 건조 방법을 사용하여 동결 건조 균체를 제조하면 동결 건조 후 높은 생균수를 포함하며 보관시 지속적으로 높은 안정성을 가질수 있는 동결 건조 균체를 제조할 수 있으므로 종래의 동결 건조 방법이 가지는 생균수 감소와 보관 시의 안정성 문제를 해결할 수 있게 된다.

Claims (5)

1. 균체 건조 중량 100중량부에 대하여 스킴밀크 20∼70중량부 ;

   유당 50∼100중량부 ;

   갈락토오스 30∼100중량부 ;

   트레할로오스 20∼100중량부를;

   포함하는 동결 건조 보호제 조성물.
2. 미생물을 배지에서 배양,농축하고 ;

   균체 건조 중량 100중량부에 대하여 스킴밀크 20∼70중량부, 유당 50∼100중량부, 갈락토오스 30∼100중량부, 트레할로오스 20∼100중량부를 포함하는 동결 건조 보호제 조성물을 농축 배양액에 첨가하고 ;

   동결 건조 장치의 동결 건조 상자에서 미생물을 배양하고 ;

   동결 건조 상자의 온도를 -5℃∼-15℃가 될 때까지 분당 5℃∼15℃의 속도로 강하(전동결)하고 ;

   -5℃∼-15℃에서 5분∼10분간 일정 온도로 유지하고 ;

   온도를 분당 5℃∼15℃의 속도로 강하시켜 -40℃∼-50℃가 되었을 때 10^-3∼10^-5mmHg로 감압하여 동결 건조하는 ;

   공정을 포함하는 동결 건조 균체의 제조 방법.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 전동결 과정에서 상기 동결 건조 보호제 조성물을 재차 첨가하는 동결 건조 균체의 제조 방법.
4. 청구항 2에 있어서, 상기 미생물이 사카로마이세스 세레비시아인 동결 건조 균체의 제조 방법
5. 청구항 2에 있어서, 상기 배지가 YPD 액체 배지인 동결 건조 균체의 제조 방법.