KR101082380B1 - 살모넬라 엔테리카 ＴＡ1535/ｐＳＫ1002 균주의 동결건조방법 - Google Patents

살모넬라 엔테리카 ＴＡ1535/ｐＳＫ1002 균주의 동결건조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전독성검출에 이용되는 SOS/umu-test 균주의 동결건조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)TA1535/pSK1002 균주를 배양하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 균주에 글루코오스, 트레할로오스 및 슈크로오스로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 동결 보존제를 첨가하는 단계; (c) 상기 단계 (b)에서 동결 보존제 첨가된 균주를 동결건조하는 단계. 본 발명의 유전독성 검출 균주의 동결건조방법에 의하면, 장기간 보관 가능하고, 발색성능이 보존되며, 향상된 생존율을 갖는 동결건조 균주를 제공함으로써, 신속성과 편이성이 개선된 유전독성 검출용 키트(kit) 제작에 매우 유용하게 활용할 수 있다.
유전독성검출방법, SOS/umu-test, 동결건조, 동결건조 보존제, 당류, 글루코오스

Description

살모넬라 엔테리카 ＴＡ1535/ｐＳＫ1002 균주의 동결건조방법{Freeze-Drying Method of Salmonella enterica subsp. enterica TA1535/pSK1002}
본 발명은 유전독성 검출방법에 이용되는 SOS/umu-test 균주의 동결건조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 유전독성을 발색으로 측정하는 SOS/umu-test의 자동화 및 키트(kit)제조에 사용될 수 있는 균주인 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica subsp. enterica)TA1535/pSK1002 균주의 동결건조방법 및 이 방법에 의해 제조된 동결건조균체에 관한 것이다.
유전독성시험이란 특정 시료가 유전자 또는 염색체에 미치는 상해작용을 검사하는 시험으로 OECD 유전독성시험기준에는 박테리아를 이용한 복귀돌연변이 시험(Ames test), 포유류 배양세포를 이용한 체외 염색체이상 시험 또는 마우스 림포마 tk 시험, 설치류 조혈세포를 이용한 체내 소핵시험법이 있다. 이러한 시험법은 방법이 복잡하고 까다로우며 많은 시간이 요구되는 단점이 있다. 따라서 시료가 함유하고 있는 유해 화학물질의 독성, 특히 유전독성을 빠른 시간 안에 측정할 수 있 는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 1985년 Oda 등(Oda et al., 1985, Mutat. Res. 147, 219-229)에 의해 개발된 SOS/umu-test(ISO 13829, 2000, International standard, Water quality)는 OECD 가이드라인(guideline)에 등재되어 있지 않지만 간편하고 신속하며, Ames test와 유사한 민감도를 나타내어 널리 사용되는 유전독성 검출법이다. SOS/umu-test에 사용되는 균주는, 락토오스 오페론(lactose operon)을 가지고 있지 않고, 변이원에 대한 감수성을 높이기 위하여 DNA의 복구(repair) 기능을 제거하고(△uvrB - ), 화학물질이 세포내에 쉽게 들어가도록 세포 표면의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 결실(rfa - )한 OECD 가이드라인의 Ames test 시험 균주 중 하나인 S. enterica (typhimurium) TA1535 균주에, 15kb의 멀티카피(multicopy)형 플라스미드 pSK1002를 도입한 균주 Salmonella enterica subsp. enterica TA1535/pSK1002 이다. 플라스미드 pSK1002는 암피실린 내성 유전자를 가진 플라스미드 벡터 pMC1403에 전사 및 번역 개시 신호가 결핍된 lacZ 유전자와 umu 오페론을 연결하여 구축(promotor-operator-umuD-umuC-lacZ)한 플라스미드이다. 상기 균주를 사용하여 umuC-lacZ 유전자의 융합발현을 확인함으로써 유전독성 물질에 대한 β-갈락토시다아제(galactosidase) 분석이 가능하다.
본 발명과 관련된 SOS/umu-test에 대해서는 간편화 방법, 또는 키트(kit) 제작에 대한 연구가 계속 진행되고 있으나, 테스트에 사용되는 Salmonella enterica subsp. enterica TA1535/pSK1002 균주의 동결건조방법 및 발색 최적화에 대한 연구 는 보고되지 않았다. 동결건조 방법은 미생물을 장기 보존하는 일반적인 기술로 알려져 있으나, 미생물의 활성이 급격히 감소하는 등의 부작용을 초래하므로 보존제를 첨가하여 보완하여야 한다. 일반적인 동결건조 방법은 보존제로 스킴밀크(skim milk), 당류 등의 성분 또는 이들의 혼합물을 균체와 혼합 후 급속히 냉각시키고, 이를 동결건조장치에서 건조하는 과정으로 이루어진다. 따라서 유전독성 검출방법에 S. enterica TA1535/pSK1002를 동결건조하여 사용하더라도 동결건조 전 상태와 유사한 활성도를 유지시키고 동결건조후의 생존율을 향상시킬 수 있는 방안이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 SOS/umu-test의 자동화 또는 유전독성 검출용 키트(kit) 제조에 사용될 수 있는 균주를 동결건조할 수 있는 방법에 대해 연구 노력한 결과, SOS/umu-test 균주를 정체기(stationary phase)까지 배양하고 여기에 글루코오스, 트레할로오스 및 슈크로오스 중 어느 하나의 동결보존제를 첨가한 후 이를 동결건 조시키면, 동결건조 균주의 활성화시에 생존율을 현저히 향상시킬 수 있고, 동결건조전 상태와 동등한 수준의 발색 활성도를 유지할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 SOS/umu-test에 사용되는 균주를 동결건조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 동결건조 방법에 의해 제조된 SOS/umu-test 균주의 동결건조균체를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 SOS/umu-test 균주의 동결건조 방법을 제공한다: (a) 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)TA1535/pSK1002 균주를 배양하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 균주에 글루코오스, 트레할로오스 및 슈크로오스로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 동결 보존제를 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 동결 보존제 첨가된 균주를 동결건조하는 단계.
본 발명자들은 SOS/umu-test의 자동화 또는 유전독성 검출용 키트(kit) 제조에 사용될 수 있는 균주를 동결건조할 수 있는 방법에 대해 연구 노력한 결과, SOS/umu-test 균주를 정체기(stationary phase)까지 배양하고 여기에 글루코오스, 트레할로오스 및 슈크로오스 중 어느 하나의 동결보존제를 첨가한 후 이를 동결건조시키면, 동결건조 균주의 활성화시에 생존율을 현저히 향상시킬 수 있고, 동결건조전 상태와 동등한 수준의 발색 활성도를 유지할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하에서 본 발명의 방법을 각 단계별로 나누어 상세히 설명한다.
(a) SOS/ umu -test 균주를 배양하는 단계
본 발명에서의 "SOS/umu-test"는 Oda 등(Oda et al., 1985, Mutat. Res. 147, 219-229)에 의해 개발된 유전독성물질의 테스트 방법(ISO 13829, 2000, International standard, Water quality)으로서, 특정의 시료가 유전자에 미치는 유전독성 수준을 살모넬라(Salmonella) 균주를 이용한 β-갈락토시다아제(galactosidase)에 의한 발색량으로 측정하는 방법이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, SOS/umu-test 균주는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)TA1535/pSK1002 균주이다.
본 발명에서 SOS/umu-test에 사용된 "살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) TA1535/pSK1002 균주"는 락토오스 오페론을 가지고 있지 않고, 변이원에 대한 감수성을 높이기 위하여 DNA의 복구 기능이 제거되어 있으며(△uvrB - ), 화학물질이 세포내에 쉽게 들어가도록 세포 표면의 리포폴리사카라이드가 결실(rfa - )된 S. enterica TA1535 균주에, 플라스미드 pSK1002가 형질전환된 균주이다. 상기 플라스 미드 pSK1002는 암피실린 내성 유전자를 가진 플라스미드 벡터 pMC1403에 전사 및 번역 개시 신호가 결핍된 lacZ 유전자와 umu 오페론을 연결하여 구축(promotor-operator-umuD-umuC-lacZ)한 플라스미드이다. 따라서, Salmonella enterica TA1535/pSK1002를 이용하면 umuC-lacZ 융합유전자의 발현을 β-갈락토시다아제의 발색으로 확인함으로써 특정 시료의 유전독성여부를 신속하게 검색할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 S. enterica TA1535/pSK1002 균주는 정체기(stationary phase)까지 배양된 균주를 사용한다. 본 발명에서 S. enterica TA1535/pSK1002 균주를 대수기(exponential phase)에 있는 균주 보다는 정체기까지 배양한 균주를 동결건조에 사용하면, 균주의 생존율을 극적으로 향상시킬 수 있다.
(b) 상기 단계 (a)에서 배양된 균주에 글루코오스, 슈크로오스 및 트레할로오스로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 동결 보존제를 첨가하는 단계;
본 발명의 방법에서는 배양된 균주에 동결건조 보존제로서 글루코오스(glucose), 슈크로오스(sucrose) 및 트레할로오스(trehalose)로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 첨가한다.
보존제로 사용되는 글루코오스, 슈크로오스 및 트레할로오스는 영양분의 고갈, 삼투압 등의 다양한 물리 화학적 외부충격으로부터 세포를 보호하고, 특히 동결하는 동안 형성된 얼음결정으로부터 세포를 보호하는 작용을 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 배양된 균주에 첨가되는 동결건조 보존제의 농도는 2.5-10％(W/V)의 범위이고, 동결 보존제가 첨가된 혼합액의 균 주의 흡광도(OD, optical density)는 1.2-1.5이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 동결 보존제를 첨가한 후 균주를 추가 배양한다. 추가 배양시간은 바람직하게는 1-30분, 더욱 바람직하게는 5-25분, 가장 바람직하게는 10-15분이다. 이러한 추가 배양에 의해 동결건조 균주의 생존율이 더욱 향상될 수 있다. 그러나, 상기 당류의 동결 보존제하에서 30분을 초과하여 배양하게 되면 삼투압으로 인해 세포의 성장이 저해되므로, 동결건조후의 생존율이 저하되어 바람직하지 않다. 상기 추가 배양은 바람직하게는 진탕배양에 의해 행한다.
(c) 상기 단계 (b)에서 동결 보존제 첨가된 균주를 동결건조하는 단계
본 발명의 방법에 의하면, 동결 보존제를 첨가한 균주를 동결건조한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 방법에서 동결건조 단계는 예비 동결단계를 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 예비 동결단계는 -70℃의 에탄올조(ethanol bath)에서 동결하는 단계이다. 동결건조시에 예비 동결과정을 행하면, 동결건조된 균주의 생존율을 현저히 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 일양태에 따르면, 상기 설명된 방법에 의해 제조된 것으로서, 글루코오스, 트레할로오스 및 슈크로오스로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 동결 보존제가 포함되어 동결건조된 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리카 TA1535/pSK1002 동결건조균체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 살모넬라 엔테리카 TA1535/pSK1002 동 결건조균체에 첨가되어 있는 동결 보존제의 농도는 2.5-10％(W/V)의 범위이다.
본 발명의 유전독성 검출 균주의 동결건조방법에 의하면, 장기간 보관 가능하고, 발색성능이 보존되며, 향상된 생존율을 갖는 동결건조 균주를 제공함으로써, 신속성과 편이성이 개선된 유전독성 검출용 키트(kit) 제작에 매우 유용하게 활용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : SOS/ umu -test의 발색에 영향을 주지 않는 동결건조 보존제의 선정
Oda 등의 SOS/umu-test에서는 S. enterica TA1535/pSK1002 균주를 이용하여 유전독성 물질의 검출에 적용한 실험이었으나, 시험 균주에 동결건조 방법을 적용하지는 않았다. 본 발명의 동결건조 방법에서 동결건조 보존제의 SOS/umu-test 발색에 대한 영향을 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
TGA (tryptone 10 g/L, NaCl 5 g/L, D-glucose 2 g/L, ampicillin 20 ㎍/㎖) 배지에서 12 시간 배양한 S. enterica TA1535/pSK1002 균체를 TGA배지에 희석하고, 6％(W/V) 트레할로오스(trehalose), 5％(W/V) 글루코오스(glucose), 9％(W/V) 슈크로오스(sucrose), 10％(W/V) DMSO, 20％(W/V) 글리세롤(glycerol), 12％(W/V) 스킴밀크(skim milk) 등 각 동결보존제와 흡광도(OD, optical density)가 600 nm에서 0.4-0.5가 되도록 혼합된 테스트 균주를 유전독성 물질이 50 ㎕씩 들어있는 시료 96-웰(well) 플레이트에 웰당 50 ㎕씩 분주하여, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이때, 유전독성 물질로는 4-니트로-퀴놀린-옥사이드(4-Nitro-Quinoline-Oxide)(4-NQO, 최종 농도 1 ㎍/㎖)를 첨가하였으며, 유전독성 물질을 넣지 않은 백그라운드(Background) 대조군으로는 4-NQO의 용매인 D.W를 사용하였다.
배양 후 새로운 96-웰 플레이트에 20 ㎕의 균주 배양액과 90 ㎕의 Z-완충액(0.06 M Na2HPO4ㆍ7H2O, 0.04 M NaH2PO4ㆍH2O, 0.01 M KCl, 0.01 M MgSO4ㆍ7H2O, 0.05 M β-mercaptoethanol), 50 ㎕의 0.1％ 소디엄도데실설페이트(sodiumdodecyl sulfate, SDS), 10 ㎕의 CPRG(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside 4 ㎎/㎖ in Z-완충액)를 첨가하여 37℃에서 20분간 발색시키고, 100 ㎕의 반응정지액(1M Na2CO3)을 첨가하여 반응을 종료하였다. 육안으로 붉은색 계열의 색상 차이를 관찰하거나, 570 nm와 595 nm에서 흡광도를 측정하여 RGA (relative β-galactosidase activity; RGA = A570/A595)를 산출하여 결과를 확인하였다. 백그라운드 대조군과 확연한 색상의 차이 또는 2배 이상의 RGA로 양성결과를 판독할 수 있는 동결건조 보 존제를 선정하였다. 실험으로 얻은 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에는 동결건조 보존제의 SOS/umu-test 발색에 대한 영향을 그래프로 나타내었다. 도 1에 나타난 결과에 의하면, 트레할로오스, 글루코오스, 슈크로오스를 동결 보존제로 사용한 경우 백그라운드 대조군과 유전독성물질 4-NQO과의 발색차이가 뚜렷하였다. 따라서, S. enterica TA1535/pSK1002균주의 동결건조 보존제로 트레할로오스, 글루코오스, 슈크로오스가 사용 가능함을 알 수 있었다. 그러나, 글리세롤의 경우 SOS/umu-test에 사용이 가능하지만 동결건조 과정의 어려움이 있었고, 동결건조 보존제로 가장 널리 알려진 스킴밀크의 경우 발색이 되지 않았는데, 이는 유전독성물질을 흡착하는 작용에 의한 결과로 생각된다.
실시예 2: 선정된 보존제와 동결건조된 미생물의 생존율 측정
본 발명에 따른 동결건조 방법에서 동결건조 균체의 최적 생존율을 보이는 동결건조 보존제를 선별하기 위해 다음의 실험을 수행하였다. TGA 배지에서 12 시간 배양한 S. enterica TA1535/pSK1002 50 ㎖을 0.85％ NaCl에 세척한 후 농축하고, 여기에 6％(W/V) 트레할로오스, 5％(W/V) 글루코오스, 9％(W/V) 슈크로오스의 동결보존제를 넣어 각각 600 nm에서의 흡광도(optical density)가 1.2 - 1.3이 되도록 만들었다. 이를 -70℃ 냉동고(deep freezer)에서 2시간 이상 예비동결 시킨 후에, 7 시간 동안 동결건조하였다. 생존율은 동결건조 전후의 균주를 각각 TGA배지에 도말하고 37℃에서 배양하였으며, 균수(colony)를 계수하여 계산하였다. 도 2에 동결건조 보존제의 종류와 동결건조 후 SOS/umu-test 균주의 생존율에 대한 그 래프를 나타내었다. 도 2의 결과에 의하면, S. enterica TA1535/pSK1002 균주의 동결건조 보존제로 글루코오스가 가장 우수한 생존율을 보였고, 그 다음으로 슈크로오스와 트레할로오스의 순으로 생존율이 좋은 것으로 확인되었다.
실시예 3: SOS/ umu -test 균주의 생장 단계에 따른 동결건조 균체의 생존율 측정
상기 실험에서 생존율이 우수한 것으로 확인된 글루코오스와 슈크로오스를 동결 보존제로 하여, 동결건조 균체의 최적 생존율을 보이는 균주의 생장 단계를 확인하기 위해 다음 실험을 수행하였다.
S. enterica TA1535/pSK1002를 TGA 배지, 37℃에서 배양하면서 생장곡선을 측정하였다. 이때, 대수기(exponential phase)와 정체기(stationary phase)의 균체 50 ㎖을 각각 취하여 0.85％ NaCl로 세척 후 농축하고, 여기에 5％(W/V) 글루코오스, 9％(W/V) 슈크로오스의 동결보존제를 첨가하여, 흡광도(OD, optical density)가 600 nm에서 1.2-1.4가 되도록 각각 혼합하고, 이 혼합물을 -70℃ 냉동고(deep freezer)에서 2시간 이상 예비동결 시킨 후 7시간 동안 동결건조 하였다. 생존율은 동결건조 전후의 균주를 각각 TGA배지에 도말하고 37℃에서 배양하한 후, 균수(colony)를 계수하여 계산하였다.
도 3에 SOS/umu-test 균주의 생장 단계와 동결건조 후 생존율의 관계를 보여주는 그래프를 나타내었다. 도 3의 결과에 의하면 S. enterica TA1535/pSK1002 균주의 동결건조 보존제로 글루코오스와 슈크로오스을 사용한 경우, 미생물 생장 단 계에서 정체기(stationary phase)까지 배양한 한 후 이를 동결건조시켰을 때 높은 생존율을 얻었음을 알 수 있었다.
실시예 4: 글루코오스 처리 시간과 생존율과의 관계
동결건조 균체가 최적 생존율을 보이는 보존제의 처리 시간을 동결 보존제로 가장 우수한 것으로 확인된 글루코오스를 보존제로 사용하여 다음의 실험을 통해 확인하였다.
우선, TGA 배지, 37℃에서 정체기까지 배양한 S. enterica TA1535/pSK1002 균체 50 ㎖을 취하여 0.85％ NaCl로 세척 후 농축하고, 5％(W/V) 글루코오스를 첨가하여 흡광도(OD, optical density) 600 nm에서 1.2-1.4가 되도록 혼합한 후, 이를 0-5분, 5-10분, 10-15분, 15-20분, 20-25분, 25-30분의 범위에서 진탕배양하였다. 이후에 배양물을 각각 -70℃ 냉동고(deep freezer)에서 2 시간 이상 예비동결시킨 후, 7 시간 동안 동결건조하였다. 생존율은 동결건조 전후의 균주를 각각 TGA 배지에 도말하고 37℃에서 배양한 후, 균수(colony)를 계수하여 측정하였다.
도 4에 동결보존제로서 글루코오스 처리 시간과 동결건조 후 SOS/umu-test 균주의 생존율의 관계를 그래프로 표시하여 나타내었다. 도 4에 나타낸 결과에 의하면, S. enterica TA1535/pSK1002 균주의 경우 보존제로서 5％(W/V) 글루코오스를 첨가한 후 10-15 분간의 진탕배양으로 처리하는 경우에 가장 높은 생존율을 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 글루코오스 첨가 후 25분 이상 배양하는 경우에는 생존율이 좋지 않음도 알 수 있다. 보존제로 사용된 글루코오스는 배지의 영양성분 중에 하나인데, 세포내로 들어가 동결건조 보존제의 역할을 하기 위해서는 세포내로 이동할 충분한 시간이 필요하다. 그러나 글루코오스를 첨가한 후 25분 이상 배양하게 되면 삼투압으로 인해 세포증식을 억제시켜 오히려 생존율을 저하시키는 결과를 가져온다.
실시예 5 : 동결 방법과 생존율의 관계 측정
동결방법에 따른 동결건조 균체의 생존율에 대해 알아보기 위해 다양한 동결방법으로 다음 실험을 수행하였다. 동결방법의 종류는 하기 표 1와 같다.
[표 1] 동결방법
동결 방법 처리조건
-70℃ -70℃ deep freezer 3 hr
-70℃ in ethanol -70℃ ethanol bath 0.5 hr, -70℃ deep freezer 2.5 hr
-20℃ -20℃ 0.5 hr, -70℃ deep freezer 2.5 hr
4℃ 4℃ 0.5 hr, -20℃ 0.5hr, -70℃ deep freezer 2 hr
도 5에 동결 방법과 동결건조 후 SOS/umu-test균주의 생존율과의 관계에 대한 실험결과를 그래프로 나타내었다. 도 5에 나타낸 실험결과에서 알 수 있는 바와 같이, -70℃의 에탄올조(ethanol bath)에서 동결하는 방법이 가장 높은 생존율을 나타내었다. 96-웰 플레이트(well plate)를 이용한 동결방법의 적합성도 고려하면, -70℃의 에탄올조(ethanol bath)를 이용한 동결방법이 최적의 방법임을 확인하였다.
실시예 6 : 동결보존제의 농도에 따른 생존율 측정
동결 보존제의 농도에 따른 동결건조 균체의 생존율에 대해 조사하였다. 동 결 보존제로서 글루코오스를 사용하였고, 사용한 글루코오스의 농도는 각각 2.5, 5.0, 7.5, 10.0％(W/V) 이었다. 도 6에 동결건조 보존제로 사용한 글루코오스의 농도와 동결건조 후의 SOS/umu-test 균주의 생존율을 그래프로 나타내었다. 도 6의 결과에 의하면, 5％(W/V)의 글루코오스를 사용할 때 가장 높은 생존율을 나타냄을 알 수 있었다.
SOS/umu-test 균주의 동결건조의 최적의 조건은 균체에 5％(W/V)의 글루코오스를 첨가하여 10-15분 배양하고, -70℃의 에탄올조를 이용하여 예비 동결한 후 동결건조하면, 약 45％ 이상의 생존율을 나타내어 발색율을 최대한 보존할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 여러 가지 동결건조 보존제의 SOS/umu-test 발색에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 2는 동결건조 보존제의 종류와 동결건조 후 SOS/umu-test 균주의 생존율과의 관계를 보여주는 그래프이다.
도 3은 SOS/umu-test 균주의 생장 단계와 동결건조 후 생존율과의 관계를 보여주는 그래프이다.
도 4는 동결보존제로서 글루코오스 처리 시간과 동결건조 후 SOS/umu-test 균주의 생존율의 관계를 보여주는 그래프이다. 도 4에 나타낸 결과에 의하면, S. enterica TA1535/pSK1002 균주의 경우 보존제로서 5％(W/V) 글루코오스를 첨가한 후 10-15 분간의 진탕배양으로 처리하는 경우에 가장 높은 생존율을 나타냄을 알 수 있다.
도 5는 동결 방법과 동결건조 후 SOS/umu-test균주의 생존율과의 관계에 대한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5에 나타낸 실험결과에서로부터 -70℃의 에탄올조(ethanol bath)에서 동결하는 방법이 가장 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다.
도 6은 동결건조 보존제로서의 글루코오스의 농도와 동결건조 후의 SOS/umu-test 균주의 생존율의 관계를 보여주는 그래프이다. 도 6의 결과에 의하면, 5％(W/V)의 글루코오스를 사용할 때 가장 높은 생존율을 나타냄을 알 수 있었다.

Claims (6)

  1. 다음의 단계를 포함하는 SOS/umu-테스트(test) 균주의 동결건조 방법:
    (a) 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) TA1535/pSK1002 균주를 배양하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 균주에, 동결 보존제로서 5％(W/V)의 글루코오스를 첨가하여 10-15 분간 추가 진탕배양한 후, -70℃의 에탄올조(ethanol bath)에서 예비동결하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 예비 동결된 균주를 동결건조하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 균주는 정체기(stationary phase)까지 배양된 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 동결 보존제가 첨가된 혼합액의 균주의 흡광도(OD, optical density)는 1.2-1.5 인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
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