KR100390385B1 - 미생물의 동결건조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물의 동결건조방법에 관한 것으로, 트레할로스를 첨가하여 미생물을 동결건조함으로써 미생물의 생존율과 발광량을 보존할 수 있는 동결건조방법을 제공한다. 본 발명으로 발광미생물을 동결건조처리한 후에도 발광미생물의 생존율을 50 %이상 유지시킬 수 있을 뿐만 아니라 발광율 또한 45 %로 보존하여 미생물의 장기 보관방법으로 이용할 수 있다.

Description

미생물의 동결건조방법{Freeze-dried method of microorganism}

본 발명은 미생물의 동결건조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 트레할로오스를 첨가하여 미생물의 동결건조 균체 중 생균수를 향상시키고 생활성능을 보존하는 동결건조방법에 관한 것이다.

동결건조는 미생물을 장기 보존하거나, 효소 또는 기능성 단백질 등과 같이 수용액 상태에서 온도 등의 조건에 따라 상대적으로 불안정한 활성물질을 보존하거나, 식품의 향과 성상을 원형 그대로 보존하기 위하여 사용되어진 건조방법중의 하나로, 미생물을 장기 보존할 경우에도 동결건조방법으로 건조시켜 보관하는 것이 일반적인 기술로 알려져 있다.

그러나 동결건조는 미생물의 활성이 급격히 감소하는 등의 부작용을 초래하므로 이를 보완하기 위한 보존제를 첨가하여 동결건조하는 방법을 실시하였다. 사용되어지는 일반적인 동결건조 보존제는 스킴밀크, 당류 등의 성분 또는 이들의 혼합물로 이루어진 것으로 균체와 혼합 후 급속히 냉각시키고 이를 동결건조장치에서 건조하는 과정으로 행하였다. 또한 대한민국특허 제 92-8363호와 대한민국특허 제 95-35787호에서 탈지분유와 유청을 보존제로 공지하였지만 동결건조 후 일정시간이 지나면 생존율이 급격하게 감소하였다.

또한 미생물의 생존율과 함께 생활성도는 미생물의 이용분야에 따라 그 중요성이 강조되는데, 그 예로 발광미생물은 발광량으로 수질오염을 측정는 바이로센스가 개발되고 있다. 수질오염 측정을 동결건조된 발광미생물을 사용한다면 동결건조 전 상태와 유사한 생존율과 생활성도를 유지시켜줄 수 있는 방안이 필요하다.

따라서 미생물을 동결건조하여 사용하더라도 동결건조 전 상태와 유사한 생존율과 생활성도를 유지시켜줄 수 있는 방안이 필요하다.

따라서, 본 발명은 동결건조 이후 미생물의 생존율과 생활성도를 유지시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 발광미생물을 배양 후 트레할로오스를 첨가하여 동결건조한 발광미생물 UV2와 YH9의 생존율과 발광율을 도시한 것이고,

도 2는 본 발명의 트레할로오스를 첨가하여 7시간 배양한 후 동결건조한 발광미생물 UV2와 YH9의 생존율과 발광율을 도시한 것이고,

도 3은 본 발명의 발광미생물을 배양 후 트레할로오스를 첨가하여 15분 동안 다시 배양한 후 동결건조한 발광미생물 UV2와 YH9의 생존율과 발광율을 도시한 것이고,

도 4는 본 발명의 발광미생물을 배양 후 트레할로오스를 첨가하거나 첨가하지 않고 15분 동안 다시 배양한 후 동결건조한 발광미생물의 생존율과 발광율을 도시한 것이고,

도 5는 본 발명의 발광미생물을 배양 후 트레할로오스를 첨가하여 다시 배양하였을 때 동결건조한 발광미생물의 트레할로오스 첨가 후 배양시간에 따른 생존율과 발광율을 도시한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 미생물에 트레할로오스를 0.01 M이상 첨가하여 일정시간동안 진탕배양 후 미생물을 동결건조시키는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 동결건조 후 미생물의 생존율과 생활성도를 보존하기 위하여 보존제로 트레할로오스를 첨가하여 동결건조를 실시하였다.

본 발명의 상기 미생물은 발광미생물이 바람직하고 상기 생활성도는 발광미생물의 발광능이 바람직하다.

트레할로오스(Glucose-α(1 →1)-glucose)는 1861년 곤충의 자낭균에서 발견된 이후 세균, 곰팡이, 버섯, 효모, 그리고 일부 식물체 등에서 발견되는 비환원성 이당류로서, 주로 영양분의 고갈, 고온, 산소 결핍, 삼투압 등 다양한 종류의 물리 화학적 외부 충격에서 비롯되는 영향으로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 트레할로오스의 보존제로서의 반응기작은 트레할로오스가 세포의 단백질과 세포막 인지질과 수소결합을 하여 세포의 구조를 그대로 유지시켜 건조상태가 되어도 세포를 보호하거나 또는 트레할로오스가 글래스 메트릭스를 형성하여동결하는 동안 형성된 얼음결정으로부터 세포를 보호할 수 있는 것으로 여겨졌다. 동결건조시 발광미생물의 발광량과 생존율을 높이려면 트레할로오스가 반드시 세포질로 들어가야만 한다. 따라서 본 발명의 주요과제는 동결건조시 보존제로 첨가하는 트레할로오스 적정농도와 트레할로오스가 세포질로 들어갈 수 있는 방법을 개발하여 발광미생물의 발광량과 세포생존율을 높이는데 있다.

본 발명의 동결건조방법은 트레할로오스를 미생물에 0.01 M이상으로 첨가하여 1분 내지 30분 가량 진탕배양한 후 동결건조하는 방법이 바람직하다.

본 발명의 동결건조방법으로 발광미생물 UV2와 YH9 건조체를 제조한 다음 생존율과 발광율을 측정한 결과 UV2는 트레할로오스가 0.08 M이상에서 생존율 50 %, 발광율 45 %로 나타났고, YH9는 트레할로오스가 0.16 M일 때 생존율 45.1 %, 발광율 48.7 %로 트레할로오스를 첨가하지 않고 동결건조한 발광미생물에 비해 현저하게 높은 보존율을 나타내었다.

또한 본 발명의 동결건조방법으로 제조한 발광미생물은 수질오염측정시 바이오센스로 이용할 수 있다. 발광미생물은 산소의 존재하에서 세포내의 전자전달계가 일부 형성되어 플래빈 모노 뉴클레오타이드(FMN)가 NADH로 환원되면서 빛을 발산하는 과정이 이루어지는데 이러한 원리를 이용하여 발광미생물의 발광량을 정량적으로 측정하여 수질오염 정도를 측정할 수 있어 수질오염측정의 바이오센스로 본 발명의 동결건조방법으로 제조한 발광미생물을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예1]

발광미생물의 배양

천연미생물에luxAB가 형질전환된 재조합미생물 UV2와 YH9를 배양하였다. UV2는 LB배지에 배지 mL당 100 ug의 암피실린을 첨가하여 30℃, 200 rpm으로 대수성장기까지 진탕배양하였다. 상기 암피실린은luxAB유전자가 삽입된 미생물을 선별하기 위하여 첨가하였다. 상기 배양한 UV2를 다시 LB배지에 5 부피%로 접종하여 배양하였다.

YH9는 R2A배지에 배지 mL 당 7.5 ug/mL의 테트라사이클린을 첨가하여 30 ℃, 200 rpm에서 대수성장기까지 진탕배양한 후 다시 R2A배지에 5 부피%접종하여 대수성장기까지 배양하였다.

동결건조

상기에 대수성장기까지 배양한 균주 UV2에 0 내지 0.4 M로 트레할로오스를 다른 농도별로, YH9은 0 내지 0.4 M로 트레할로오스를 각기 다른 농도로 첨가하여 30 ul씩 386-웰 플레이트에 넣고 액체질소에 5분 동안 예비 동결시킨 후 3시간 30분 동안 동결건조하였다.

[실험예 1]

동결건조전의 미생물 균수와 발광량의 측정

상기 실시예 1의 발광미생물의 균수는 아가배지에 도말하여 형성된 콜로니를 이용하여 측정하였다. UV2는 암피실린이 100 ug/mL 포함된 LB 아가에 도말하고YH9는 테트라사이클린이 7.5 ug/mL이 포함된 R2A 아기배지에 도말한 후 30 ℃에서 2일간 배양하여 콜로니의 수를 계수하였다.

그리고 상기 실시예 1의 발광량은 루미노미터(luminometer)를 이용하여 측정하였다. 본 발명에 사용한 균주는luxAB 만을 삽입했기 때문에 기질(substrate)을 인위적으로 첨가해야 한다. 첨가한 기질로 데실알데하이드(n-decyl aldehyde)를 사용하였으며, UV2는 0.15%, YH9은 0.01%로 배지에 희석하여 사용하였다.

실시예 1의 동결건조 후 미생물 균수와 발광량의 측정

동결건조한 균주는 UV2는 LB배지로 YH9는 R2A배지로 30 ul로 현탁하여 상기 동결건조전의 측정법과 동일하게 실시하였다. 미생물의 생존율과 발광율은 하기 식 1로 계산하였고, 하기 표 1에 UV2균주는 트레할로로오스가 0.33 M일 때, YH9 균주는 트레할로오스가 0.16 M로 첨가되었을 때 생존율과 발광율을 나타내었다.

[식 1]

생존율(%) = 동결건조후 균수(CFU)/ 동결건조전 균수(CFU) X 100

발광율(%) = 동결건조후 발광량/ 동결건조전 발광량 X 100

[표 1]

균주	생존율	발광율
UV2	39	40.4
YH9	27.7	26.9

도 1은 트레할로오스의 농도에 따른 실시예 1의 발광미생물의 생존율과 발광율을 도시한 것으로, UV2균주는 트레할로로오스를 0.33 M 일 때 YH9 균주는 트레할로오스가 0.16 M일 때 생존율과 발광율이 가장 높았다.

[실시예 2]

발광미생물의 배양

천연미생물에luxAB가 형질전환된 재조합미생물 UV2와 YH9를 배양하였다. UV2는 LB배지에 배지 mL당 100 ug의 암피실린을 첨가하여 30℃, 200 rpm으로 대수성장기까지 진탕배양하였다. 상기 암피실린은luxAB유전자가 삽입된 미생물을 선별하기 위하여 첨가하는 것이다. 상기 배양한 UV2를 다시 트레할로오스가 첨가된 LB배지에 5 부피%로 접종하여 7시간 배양하였다.

YH9는 R2A배지에 배지 mL 당 7.5 ug/mL의 테트라사이클린을 첨가하여 30 ℃, 200 rpm에서 대수성장기까지 진탕배양한 후 다시 트레할로오스가 첨가된 R2A배지에 5 부피%로 접종하여 7시간 배양하였다.

동결건조

상기에 배양한 균주를 30 ul씩 386-웰 플레이트에 넣고 액체질소에 5분 동안 예비 동결시킨 후 3시간 30분 동안 동결건조하였다.

[실험예 2]

동결건조전의 미생물 균수와 발광량의 측정

상기 실험예 1과 동일하게 실시하였다.

실시예 2의 동결건조 후 미생물 균수와 발광량의 측정

동결건조한 균주는 UV2는 LB배지로 YH9는 R2A배지로 30 ul로 현탁하여 상기 동결건조전의 측정법과 동일하게 실시하였다. 하기 표 2에 UV2균주는 트레할로로오스가 0.1 M일 때, YH9 균주는 트레할로오스가 0.16 M일때 생존율과 발광율을 나타내었다.

[표 2]

균주	생존율	발광율
UV2	28.9	22
YH9	33.7	31.5

도 2는 트레할로오스의 농도에 따른 실시예 2의 발광미생물의 생존율과 발광율을 도시한 것으로, UV2균주는 트레할로로오스를 0.1 M 일 때 YH9 균주는 트레할로오스가 0.16 M일 때 생존율과 발광율이 가장 높았다.

[실시예 3]

발광미생물의 배양

실시예 1과 동일하게 실시하였다.

동결건조

상기에 대수성장기까지 배양한 균주 UV2에 0 내지 0.4 M로 트레할로오스를 다른 농도별로, YH9은 0 내지 0.4 M로 트레할로오스를 각기 다른 농도로 첨가하여 15분 동안 진탕배양한 후 30 ul씩 386-웰 플레이트에 넣고 액체질소에 5분 동안 예비 동결시킨 후 3시간 30분 동안 동결건조하였다.

[비교예]

천연미생물에 luxAB가 형질전환된 재조합미생물 UV2와 YH9를 배양하였다. UV2는 LB배지에 배지 mL당 100 ug의 암피실린을 첨가하여 30℃, 200 rpm으로 대수성장기까지 진탕배양하였다. 상기 배양한 UV2를 다시 LB배지에 5 부피%로 접종하여 배양하였다. YH9는 R2A배지에 배지 mL 당 7.5 ug/mL의 테트라사이클린을 첨가하여 30 ℃, 200 rpm에서 대수성장기까지 진탕배양한 후 다시 R2A 배지에 5 부피% 접종하여 대수성장기까지 배양하였다. 배양한 상기 균주를 30 ul씩 386-웰 플레이트에 넣고 액체질소에 5분 동안 예비 동결시킨 후 3시간 30분 동안 동결건조하였다.

[실험예 3]

동결건조전의 미생물 균수와 발광량의 측정

상기 실험예 1과 동일하게 실시하였다.

실시예 3의 동결건조 후 미생물 균수와 발광량의 측정

동결건조한 균주는 UV2는 LB배지로 YH9는 R2A배지로 30 ul로 현탁하여 상기 동결건조전의 측정법과 동일하게 실시하여 도 3에 도시하였다. 하기 표 3에 UV2균주는 트레할로로오스가 0.08 M이상일 때, YH9 균주는 트레할로오스가 0.16 M일때 생존율과 발광율을 나타내었다.

[표 3]

균주	실시예 3	비교예
	생존율	발광율	생존율	발광율
UV2	50	45	2.6	2.5
YH9	54.1	48.7	12	10

도 4는 트레할로오스를 첨가한 실시예 3과 트레할로오스를 첨가하지 않은 비교예의 발광미생물의 생존율과 발광율을 도시한 것으로, 트레할로오스를 첨가하여 15분간 진탕배양 후 동결건조함으로써 발광미생물의 생존율과 발광율을 비교예에 비해 20배 내지 4배 이상 향상시킬 수 있었다.

[실시예 4]

발광미생물의 배양

실시예 1과 동일하게 실시하였다.

동결건조

상기에 대수성장기까지 배양한 균주 UV2에 0 내지 0.4 M로 트레할로오스를 다른 농도별로, YH9은 0 내지 0.4 M로 트레할로오스를 각기 다른 농도로 첨가하여 1분 내지 30분 동안 진탕배양한 시간별 샘플을 30 ul씩 386-웰 플레이트에 넣고 액체질소에 5분 동안 예비 동결시킨 후 3시간 30분 동안 동결건조하였다.

[실험예 4]

동결건조전의 미생물 균수와 발광량의 측정

상기 실험예 1과 동일하게 실시하였다.

실시예 3의 동결건조 후 미생물 균수와 발광량의 측정

동결건조한 균주는 UV2는 LB배지로 YH9는 R2A배지로 30 ul로 현탁하여 상기 동결건조전의 측정법과 동일하게 실시하여 도 5에 도시하였다.

트레할로오스는 세포내 세포질로 들어가 동결건조시 보존제로 역할을 수행하기 위하여 충분히 세포내로 이동할 수 있는 시간이 요구되어지는데 실시예 2에서 나타난 결과처럼 트레할로오스를 첨가한 배지에서 발광미생물을 장시간 배양하게 되면 삼투압으로 인해 세포증식을 억제시키므로 적정 배양시간을 실험한 결과 도 5에서 나타난 바와 같이 균주에 0.16 M 트레할로오스를 첨가하여 5 분 이상 진탕배양하면 실시예 3의 15분 진탕배양한 결과와 유사하게 생존율과 발광율을 최대한 보존할 수 있었다.

상기에 언급한 바와 같이 본 발명의 트레할로오스를 이용한 미생물의 동결건조방법으로 미생물의 장기저장의 최적조건을 확립하였을 뿐 만 아니라 생존율과 생활성능이 보존된 동결건조된 균주를 제공할 수 있다.

Claims (3)

1. 대수성장기로 배양한 미생물에 0.1 내지 0.4 M의 트레할로즈를 첨가하여 1 내지 30 분 배양한 다음 동결건조하는 것을 특징으로 하는 미생물 동결건조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 발광미생물인 것을 특징으로 하는 미생물 동결건조방법.
3. (삭제)