KR19990022412A - 다양한 식물 세포의 동결보존 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물 세포를 동결보존시키는 방법 및 장기간 또는 단기간 동결보존으로부터의 생존 가능한 식물 세포를 회수하는 방법에 관한 것이다. 동결보존하고자 하는 식물 세포를 배양액내에서 성장시키고, 동결보존제 및, 임의로 안정화제를 포함하는 용액으로 예비처리할 수 있다. 안정화제는 에틸렌 억제제, 산소 라디칼 스캐빈저 및 2가 양이온과 같은 막 안정화제인 것이 바람직하다. 또한, 세포는 배양물에 열 충격을 가해 살균할 수 있다. 예비처리된 세포는 감압으로 순양되고, DMSO, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 동결보존제가 장입된다. 장입된 세포는 예를들면, 고농도의 동결보존제를 갖는 용액을 포함하는 투화 용액으로 배양된다. 투화된 세포는 약 20% 미만의 수분 함량을 보유하고 있으며, 세포의 유전자형 또는 표현형 특성이 크게 변형되지 않은채 장기간동안 동결보존 온도에서 냉동될 수 있다. 또한, 식물 세포는 세포를 동결건조시켜 동결보존시킨 후, 투화 용액에 노출시킬 수 있다. 동결건조 및 투화 단계의 조합으로 식물 세포에서 약 80%∼약 95%의 수분을 제거한다. 장기간동안 세포를 성공적으로 동결보존시킬 수 있으며, 이는 생존가능하게 회수될 수 있다. 또한, 본 발명은 동결보존으로부터의 생존 가능한 식물 세포를 회수하는 방법에 관한 것이다. 세포는 약 실온으로 해동되고, 동결보존제 및 안정화제를 포함하는 배지내에서 배양한다. 동결보존제를 제거하고, 세포를 성공적으로 배양시키고, 액체 또는 반고형 성장 배지내에서 세포를 회수한다. 또한, 본 발명은 동결보존된 세포 및 장시간 또는 단시간동안의 동결보존으로부터 회수되는 생존 가능한 식물 세포에 관한 것이다.
Description
관련출원 참조
본 출원은 1995년 6월 7일자로 출원된 미국 특허 출원 일련번호 제 08/486,204 호의 일부 계속 출원이다.
1. 발명의 기술분야
본 발명은 식물 세포의 동결보존 방법 및 동결보존된 식물세포의 회수 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식물, 생존 가능한 식물 세포 및 동결보존으로부터 성공적으로 회수된 식물 세포 배양물에 관한 것이다.
2. 배경 설명
동결보존은 초저온에 보관된 생물학적 물질의 대사성 작용을 감소시키고 이어서 정지시키는 것을 기초로 한다. 장시간동안 유전적 변화없이 식물 및 식물 세포를 극저온 보존시키고, 이어서 변형되지 않은 특성 및 생합성 활성을 갖는 보통의 식물 세포를 회수하는 것은 식물 번식, 생물의학적 연구 및 유전공학에 있어서 매우 중요한 의미를 함축한다. 액체 질소(-196℃)의 온도에서, 세포의 거의 모든 대사 활성은 중단되고, 세포는 이러한 정지된 상태로 유지되나, 장기간동안 생존가능하게 된다.
식물 세포를 동결보존하여 오염으로 인한 손실을 배제시키고, 연속 세포주에서의 유전적 변화를 최소화하고, 최종 세포주에서의 숙성 및 형질전환을 배제시킨다. 바람직한 식물 특성의 보존에 대한 통상적인 방법은 노지에서의 식물 콜로니의 형성을 포함하는데, 이는 많은 식물이 종자로부터 번식되지 않기 때문이다. 이러한 노지 식물의 수탁은 많은 노동력 투입 및 토지를 요구하고 있으며, 기후, 질병 또는 기타의 해로 인한 위험을 초래한다. 노지 콜로니에 대한 대안으로서는 정상 또는 제한된 성장 조건하에서 식물 조직의 생체내 수집을 달성하는 것이다. 장기간동안의 저장의 경우, 통상적인 계대배양의 배제가 바람직한데, 이는 돌연변이, 오염, 노동 비용 및 조직 배양과 관련된 사람의 실수에 대한 위험이 관여될 수 있기 때문이다.
식물을 비롯한 대부분의 생물학적 물질은 동결보존제 및 절차 없이 냉동 및 극저온로부터의 해동을 견딜 수 없다. 수많은 동결보존제는 극저온 냉동의 손상 효과로부터 세포를 보호할 수 있는 특성을 지닌다. 동결보존의 요점은 조절된 최소한의 손상 방법으로 사이토졸의 세포 탈수 및 농축을 실시하여 사이토졸내의 얼음 결정화를 예를 들면 액체 질소 내에서의 급냉동안 배제시키거나 또는 최소화하도록 한다.
통상의 동결보존 절차에서, 세포 탈수는 현탁 배지의 냉동 유도 농축에 의해 실시된다. 탈수에 의한 해로운 효과는 동결보존제의 존재에 의해 완화된다. 세포 또는 기관과 같은 시험체는 디메틸설폭시드(DMSO) 또는 에틸렌 글리콜과 같은 동결보존제를 포함하는 용액내에서 평형화된다. 현탁액을 냉각시키고, 빙점보다 약간 낮은 온도에서 얼음 결정으로 시드 처리했다. 현탁액을 약 -30℃∼약 -40℃의 중간 영하 이하의 온도로 최적의 속도로 다시 냉각시키고, 최종적으로 액체 질소내에서 급냉시켰다.
통상의 미생물, 접합자 및 접합자로부터 유도된 동물의 극저온 보존이 가능한 반면, 식물 세포의 동결보존은 통상의 것과는 크게 다르며, 흔히 식물의 각 종에 대한 여러가지 프로토콜이 필요하게 된다.
타수스 나무는 탁솔을 생성하며, 이는 퍼시픽 주목, 타수스 브레비폴리아의 수피로부터 초기 분리한 디테르페노이드 알칼로이드이다. [참고문헌 : 엠.씨. 와니 일동, J. Am. Chem. Soc. 93:2325-27, 1971]. 실험으로 이 화합물은 과도한 독성을 지니지 않으면서 포유동물 세포의 미세소관의 중합을 억제하며, 이는 효과적인 항종양형성제라는 것을 예시하고 있다. 임상학적 트레일은 탁솔이 난치성 난소, 유방 및 기타 암에 대해 매우 효과적이라는 것을 확인했다. 마찬가지로, 탁솔은 다소 독특하지만 작용의 기본 메카니즘이 통상의 화학요법제와는 근본적으로 구별되기 때문에 화학요법에서의 돌파구가 된다. 참고 문헌[엘.에이. 로빈스키 일동, J. Natl. Cancer Instit. 82:1247-59, 1990].
지금까지 탁솔 방정식에서의 가장 위압적인 변수는 공급원이다. 탁솔의 평균 수득율이 낮기 때문에 한명의 환자를 치료하기 위해서는 100년생 퍼시픽 주목이 3∼6그루 필요하게 된다. 참고 문헌[위더럽 일동, 1990]. 치료 및 테스트에 필요한 함량의 탁솔의 제조는 수만그루의 주목 파괴를 자초하게 된다. 주목 개체군은 벌목에 의해 거의 소멸되어 가고 있으며, 퍼시픽 주목의 수가 점차로 감소하고 있기 때문에 의학적 연구는 탁솔에 대한 다른 형태의 공급원을 찾아야만 한다. 탁솔 뿐 아니라, 식물 세포내에서 번식하거나 또는 수확될 수 있는 많은 기타 화합물의 유용도는 타수스 및 기타 식물 세포를 배양하는데 있어서 그 중요성이 커지고 있다.
이들의 생체 합성 능력에 대한 식물 세포의 배양은 통용되고 있는 기술에 대해 특별한 문제점을 지니고 있다. 식물 세포의 번식된 배양은 흔히 초기 분리물내에 존재해온 생합성 능력의 손실을 초래한다[참고 문헌 : 후트 일동, Ann. Bot. 41:943-49, 1977; 바즈 일동, Ber. Dtsch. Bot. Ges. 94:1-26, 1981]. 표현형 변형은 세포 배양을 추가로 복잡하게 하는 문제점을 초래한다. 식물 세포, 특히 타수스 세포를 냉동시키기 위한 프로토콜은 탁솔과 같은 유용한 식물 알칼로이드의 제조에 대한 생합성 방법의 개발에 있어서 중요한 단계가 되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 통용되고 있는 전략 및 계획과 관련된 문제점 및 단점을 극복하며, 동결보존 방법 및 생존가능한 동결보존 식물 세포의 회수에 대한 신규한 방법을 제공한다.
본 발명의 제 1 실시태양은 식물 세포의 동결보존 방법에 관한 것이다. 겉씨 식물 또는 속씨 식물이 될 수 있는 식물 세포를 동결보존제 및 안정화제로 예비처리하고, 이를 감압으로 순양시킨다. 예를 들면 2가 양이온과 같은 안정화제는 부분적으로는 세포성 막을 파열로부터 보호한다. 예비 처리는 에틸렌 억제제, 예를 들면, 에틸렌 양이온 억제제 또는 에틸렌 생합성 억제제가 있다. 예비처리된 식물 세포는 투화되고 동결보존 온도에서 냉동된다. 2가 양이온은 투화 단계 또는 장입 단계에 포함될 수 있다. 순양된 세포는 장입제와 함께 장입되며, 상기 장입제는 투화제 및 투화 용액으로 투화된 장입 세포와 동일할 수 있다. 투화된 식물 세포는 동결보존 온도, 예를 들면, 약 -70℃∼약 -200℃ 또는 미만에서 냉동된다.
본 발명의 제 2 실시태양은 식물 세포를 동결보존시키는 방법에 관한 것이다. 동결보존시키고자 하는 식물 세포를 동결보존제, 에틸렌 억제제, 2가 양이온 또는 열 충격 단백질로 예비처리하고, 감압으로 순양시켰다. 에틸렌 억제제는 에틸렌 양이온 억제제 또는 에틸렌 생합성 억제제가 될 수 있다. 순양된 식물 세포는 투화되고 동결보존 온도에서 냉동된다.
본 발명의 제 3 실시태양은 식물 세포를 동결보존시키는 방법에 관한 것이다. 동결보존시키고자 하는 식물 세포를 투화제 및 안정화제를 포함하는 배지내에서 갑압하에 제 1 기간동안 배양시킨다. 배양된 식물 세포는 증가된 농도의 투화제를 포함하는 배지내에서 제 2 시간동안 추가로 배양시킨다. 고 농도의 투화제에서 투화된 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉동시킨다.
본 발명의 제 4 실시태양은 식물 세포를 동결보존시키는 방법에 관한 것이다. 동결보존시키고자 하는 식물 세포를 진공 증발에 의해 동결건조시키고, 투화 용액내에서 투화시킨다. 동결건조로 세포로부터 약 60%의 수분을 제거하며, 투화와 조합하면 약 95% 이하의 수분을 제거할 수 있다. 투화되고 동결건조된 식물 세포는 동결보존 온도에서 세포를 질소 액체로 급냉시킴으로써 동결 및 저장된다.
본 발명의 제 5 실시태양은 식물 세포를 동결보존시키는 방법에 관한 것이다. 동결보존시키고자 하는 식물 세포를 열 충격으로 예비처리한다. 열 충격은 부분적으로 세포성 막을 파열로부터 안정화시켜 단백질 형질발현을 유도한다. 또한, 예비처리는 에틸렌 억제제, 예컨대, 에틸렌 작용 억제제 또는 에틸렌 생합성 억제제를 포함할 수 있다. 예비처리된 식물 세포를 투화시키고, 동결보존 온도에서 냉동시킨다. 2가 양이온은 예비처리 또는 투화 단계 또는 장입 단계에서 포함될 수 있다.
본 발명의 제 6 실시태양은 식물 세포를 동결보존으로부터 회수하는 방법에 관한 것이다. 식물 세포를 본 발명의 방법에 의해 동결보존시킨다. 해동된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도로 가온시키고, 동결보존제 및 안정화제를 포함하는 배지내에서 배양시킨다. 삼투제를 제거하고, 생존 가능한 식물 세포를 회수한다.
본 발명의 제 7 실시태양은 동결보존으로부터 식물 세포를 회수하는 방법에 관한 것이다. 식물 세포를 본 발명의 방법에 의해 동결보존시킨다. 해동된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도로 가온시키고, 에틸렌 억제제, 산소 라디칼 스캐빈저, 2가 양이온, 동결보존제 또는 이들 물질의 조합물을 포함하는 배지내에서 배양시킨다. 생존 가능한 식물 세포를 회수하고, 이는 격렬한 회수 재성장을 보이며, 재빠르게 세포 현탁 처리될 수 있다.
본 발명의 제 8 실시태양은 동결보존으로부터 동결보존된 식물 세포를 회수하는 방법에 관한 것이다. 동결보존된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도로 해동시키고, 동결보존제 및 안정화제를 포함하는 배지내에서 배양시킨다. 동결보존제를 혼합물의 희석 또는 회수된 세포 및 생존 가능한 식물 세포의 펠릿화에 의해 제거한다.
본 발명의 제 9 실시태양은 본 발명의 방법에 의해 동결보존된 생존 가능한 식물 세포에 관한 것이다. 동결보존된 식물 세포는 동결보존에 의해 유전자형 또는 표현형이 크게 변형되지 않는다.
본 발명의 제 10 실시태양은 현탁액내에서 동결보존된 식물 세포를 회수하는 방법에 관한 것이다. 동결보존된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도로 해동시킨다. 해동된 식물 세포를 액체 현탁액내에서 배양시키고, 고형 또는 반고형 배양을 사용하지 않고 생존가능한 세포를 액체 배지내에서 회수한다.
본 발명의 제 11 실시태양은 동결보존된 생존 가능한 식물 및 식물 세포 및 본 발명의 방법에 의해 회수된 생존 가능한 식물 및 식물 세포에 관한 것이다. 세포는 동결보존 방법에 의해 유전자형 및 표현형으로 변형되지 않았으며, 생존 비율도 높다.
본 발명의 다른 실시태양 및 잇점은 부분적으로는 하기의 설명에 의해 기재되며, 부분적으로는 본 발명의 실시로부터 알 수 있다.
도 1 (A, B 및 C)
다양한 동결보존 및 회수 프로토콜의 개략도
도 2
에틸렌 생성의 생합성 경로 및 억제점
도 3
타수스 세포의 동결보존 절차
도 4
타수스 치넨시스 현탁 배양 주 K-1 에서의 생물량 증가
도 5
6개월동안 동결보존된 세포 (A) 와 비-동결보존된 세포의 비교 크로마토그램
도 6
6개월동안 동결보존된 세포 (A) 와 비-동결보존된 세포의 비교 크로마토그램
도 7
동결보존된 세포의 유전적 안정도에 대한 서던 블롯 분석
도 8
동결보존된 세포의 유전적 안정도에 대한 PCR 분석
발명의 설명
본 명세서에서 구체화되고 광범위하게 기재된 바와같이, 본 발명은 식물 세포의 동결보존 방법, 동결보존된 식물 세포의 회수 방법 및 동결보존으로부터 성공적으로 회수된 생존 가능한 식물 세포에 관한 것이다.
식물 세포는 식물 또는, 식물 세포의 효소적 경로에 대해 특이성을 갖는 화학적 제제, 재조합 단백질 또는 독특한 생성물의 제조에서의 유용성이 증가해 가고 있다. 캘러스 배양 조직과 같은 식물 세포는 반복된 계대 배양을 통한 연속적인 상태로 유지될 수 있다. 그러나, 계대배양은 흔히 배수성이 증가되고, 오염에 대한 위험성이 증가되고, 자발적 돌연변이의 축적, 형태발생 가능성의 감소 및 손실, 생성물 형성에 대한 생합성 능력의 감소, 야생형에 대한 선택된 주의 전환, 속성 및 전환 유한 세포주 및 바람직하지 못한 표현형의 무의식중의 선택을 초래한다. 이러한 각각의 요인은 가치있는 화합물의 통상의 제조에 대해 세포 배양계의 개발을 크게 촉진할 수 있다.
동물 조직 배양 세포가 수년동안 통상적으로 동결보존될지라도, 식물 세포에 대한 유사한 동결보존 기술은 훨씬 더 어려운 것으로 증명되었다. 식물 세포 및, 특히 배양물 내에서의 식물 세포는 성장 속도, 배가 시간, 유사분열 지수, 세포 동조성, 핵 대 세포질 비 및 공포형성도에 대해 일련의 불균질성을 나타낸다. 임의의 소정의 배양액내에 존재하는 세포는 다양한 생리적 및 형태적 다양성을 나타낸다. 부가로, 식물 세포 현탁액 및 착색 세포 배양액은 동결보존에 대한 여러가지 프로토콜을 필요로 한다. 게다가, 동결보존을 부적절하게 실시하는 경우, 공정의 방지를 시도하는 바로 그 돌연변이를 유도할 수 있다.
놀랍게도, 일련의 단계 및 특이성 제제를 사용함으로써 대부분의 임의의 속 및 종의 식물 세포는 동결보존되고 성공적으로 회수된다. 이러한 방법은 성공적인 식물 세포 동결보존이 세포로부터 수분을 상당량 제거하고, 적절한 조건하에서 세포의 생육성에 크게 영향을 미치지 않으면서 상당량의 수분을 제거할 수 있다는 관찰을 기초로 한 것이다. 개발된 동결보존 프로토콜은 통상의 재현가능한 방법으로 생존가능한 세포를 저장, 유지 및 회수에 대해 매우 성공적이다. 이러한 프로토콜은 생식질 저장 및 세포 뱅크 처리 시스템을 생성하는 통상의 유니트 조작으로 이루어질 수 있다. 또한, 세포는 식물 배양으로 전에는 불가능하다고 생각되었던 방법인 액체 현탁으로 완전 회수될 수 있다. 동결보존된 세포로부터 수확한 생성물은 표현형 또는 유전자형 부동, 특히 성장 및 생존 가능성에 대해서 생성물의 형성 및 세포 생물량의 증식이 이 거의 없기 때문에, 원 세포 또는 모 세포로부터 크게 변형되지 않는다. 측정가능하거나 또는 정량가능한 표현형 또는 형태학적 변형으로부터 변화를 측정한다. 이러한 변형은 이들이 작은 정도 이상으로 표현형 변수를 감소시키는 경우 중요하게 된다.
본 발명의 제 12 실시태양은 식물 세포의 동결보존 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 놀랍게도 많은 유형의 식물 세포에 대해 재현가능하고 응용가능하다. 이와 마찬가지로, 이들은 정부 당국 또는 행정청의 재현성에 대한 기준을 요하는 물질의 제조에 대해 매우 유용하게 된다.
기본적인 방법은 예비처리(예, 2가 양이온, 라디칼 스캐빈저와 같은 안정화제 또는 동결보존제를 사용한 예비배양, 또는 열 충격), 저온 순양, 단계적 또는 단일 투여 장입, 투화, 동결건조, 냉동 및 해동 단계의 조합에 의해 세포로부터 수분을 상당량 제거하는 것을 포함한다. 이러한 단계의 폭넓은 조합이 가능하며, 모든 단계는 생존 가능한 식물 세포가 바람직하도록 하는 특징 및 성장 특성을 보유하는 생존 가능한 식물 세포의 성공적인 동결보존 및 회수에 대해 반드시 필요하지는 않다. 이러한 단계의 다양한 실시태양의 가능한 조합은 이러한 변형이 단지 예로서 이해될 지라도, 도 1A, 1B 및 1C 에 도시되어 있다. 각 유형의 식물(예, 강, 목, 과, 속, 종, 아종 또는 변종)은 동결보존으로부터의 회수를 최대로 하는 일련의 바람직한 조건을 갖는다. 본 명세서에서 개시된 소정의 변형예로부터 동결보존에 대한 최적의 변수를 용이하게 측정할 수 있다.
대부분의 임의의 식물 세포는 겉씨 식물 및 속씨 식물을 비롯한 상기 방법을 이용하여 성공적으로 동결보존되고 회수될 수 있다. 동결보존될 수 있는 겉씨 식물의 특정 유형으로는 속 아비에스(전나무), 시프레수스(사이프레스), 징코(공작고사리), 쥬니페루스(곱향나무), 피세아(가문비), 피누스(소나무), 슈도추가(미송), 세쿠오이아, 타수스(주목), 추가(헴록) 또는 자미아(소철) 의 종이 있다. 매우 유용한 타수스 종은 티. 바카타, 티. 브레비폴리아, 티. 카나덴시스, 티. 치넨시스, 티. 쿠스피다타, 티. 플로리다나, 티. 글로보사, 티. 메디아, 티. 누시페라 및 티. 월리키아나가 있다. 보존될 수 있는 속씨 식물은 외떡잎 식물 세포 및 쌍떡잎 식물 세포가 있다. 외떡잎 식물 세포의 예로는 속 아베나(귀리), 코코스(코코넛), 디오스코레아(참마), 호르데움(보리), 무사(바나나), 오리자(쌀), 사카룸(사탕수수), 소르굼(사탕수수), 트리티쿰(밀) 및 제아(옥수수)가 있다. 쌍떡잎 식물에는 속 아키로클린, 아트로파, 브라시카(겨자), 베르베리스, 소포라, 레굼, 루피누스, 캅시쿰, 카타란투스, 코노스페르뭄, 다투라, 다우쿠스(당근), 디지탈리스, 에키나세아, 에쉬콜리치아, 글리신(대두), 고시피움(면), 히오스키아무스, 리코페르시쿰(토마토), 말루스(사과), 메디카고(자주개자리), 니코티아나, 파낙스, 피숨(완두), 라우볼피아, 루타, 솔라눔(감자) 및 트리코산테스가 있다.
식물 세포는 신생 성장 침엽, 잎, 뿌리, 수피, 줄기, 근경, 캘러스 세포, 원형질체, 세포 현탁액, 기관 또는 기관계, 꼭대기 분열 조직과 같은 분열 조직, 종자 또는 배와 같은 노지로부터의 시험체를 새롭게 수확될 수 있다. 일반적으로, 저 통과 세포 및 1차 배양액은 배양 내에서 또는 동결보존으로부터의 회수시의 최종 생존 가능성이 커진다. 또한, 샘플 세포는 수득된 생체내 배양물로부터 수득될 수 있다. 배양물은 특정 온도, 특정 광 강도 또는 특정 성장 또는 유지 배지의 생체내 조건에 대해 오래동안 이루어져왔거나 또는 단지 최근에 순응되어 왔다. 이러한 세포는 현탁 세포로서 또는 반고형 영양 배지상에서의 성장에 의해 유지될 수 있다.
현탁 배양은 타수스 종의 캘러스 배양 또는 타수스 종의 동결보존된 세포의 해동으로부터 유도될 수 있다. 저 통과 1차 세포주는 이들의 배양물이 배양물내에서 장시간동안 손실되는 독특한 특성을 지닐 수 있기 때문에 보존될 가치가 있다. 이러한 세포주 대부분은 디테르페노이드 알칼로이드 탁산, 에스테르 측쇄 변형된 탁산, 탁솔(분자량 853) 및 탁산의 다양한 기타 변형예(바카틴 또는 10-데악틸바카틴)과 같은 디테르페노이드를 형질발현시킨다.
배양물로부터의 타수스 세포는 임의의 식물 세포로부터 수득될 수 있다. 수집물은 북아메리카 뿐 아니라 기타 대륙에 걸쳐서 얻을 수 있다. 수피, 부름켜, 침엽, 줄기, 구근, 구과 및 뿌리를 비롯한 식물의 임의의 부분으로부터의 조직은 세포 배양에 대해 선택되고 변형될 수 있다. 식물의 침엽 및 분열조직 부위, 특히 1∼3월령의 신생 성장 침엽은 세포 배양을 개시하기에 바람직하다. 예를 들면, 선택된 식물 조직은 10방울의 트윈 20 이 첨가된 4ℓ의 10% 표백 용액내에서 20분동안 침지시켜 표면 살균시킨다. 절단 조직은 매우 작은 크기로 외식하고 배양한다.
타수스 배양물은 특히 성장 형태학, 생산성, 제품 프로파일 및 기타 특성에서의 다양성을 보인다. 각각의 세포주는 성장 배지 성분에 대한 선호도가 변화되기 때문에, 많은 여러가지 성장 배지를 세포 배양의 유도 및 증식에 대해 사용될 수 있다. 살균, 캘러스 성장의 개시 및 현탁 성장의 방법 뿐 아니라, 적절한 영양 배지는 당업자에게 잘 공지되어 있다.
타수스 현탁 배양은 빠른 성장 속도 및 고 세포 밀도를 가능케 한다. 다양한 타수스 종의 초기 배양은 예를 들면 거대 또는 미세 영양, 유기 염 및 성장 호르몬을 포함하는 적절한 배지로의 전달에 의해 계대배양된다. 액체 배양물을 공기중에 노출시키고, 바람직하게는 교반시켜 배지에 산소를 공급하거나 또는 공기를 배지내에서 버블링시킨다. 약 20℃의 온도에서, 약 3∼약 7, 바람직하게는 약 4 내지 약 6 의 pH 에서 배양을 유지시킨다. 이러한 배양은 성장 배지의 제거, 예를 들면, 여과 또는 원심 분리에 의해 수확될 수 있다. 가장 높은 생존 가능성을 갖는 세포는 초기 지연기 또는 초기 세포 분열 성장기 또는 세포 분열 또는 유사분열을 막 통과한 것이다. 일반적으로, 성장 배지내의 타수스 종의 4∼10일된 세포 현탁액, 바람직하게는 성장 배지내의 5∼8일된 세포 현탁액, 더욱 바람직하게는 성장 배지내의 타수스 종의 6∼7일된 세포 현탁액이 사용하기에 적절하다.
동결보존의 기본적인 단계 각각은 하기와 같다.
예비처리
냉동보존시키고자 하는 식물 세포를, 배양 배지로부터의 성장 또는 세포 사멸 동안 세포에 의해 분비되는 해로운 물질을 제거하여 세포성 생존 가능성을 증가시키는 제제로 예비처리할 수 있다. 본 명세서에서 안정화제로 칭하는 이러한 제제는 천연 또는 인공 합성될 수 있으며, 배양 배지에 직접 투입될 수 있다. 안정화제의 예로는 활성 산소 종 및 기타 자유 라디칼의 존재에 기인한 매우 해로운 효과를 중화시키는 산화방지제 또는 라디칼 스캐빈저 제제가 있다. 이러한 물질은 내부 및 외부 막 모두의 세포성 막에 손상을 끼칠 수 있어서 동결 보존 및 회수가 심각하게 된다. 이러한 물질이 제거되지 않거나 또는 효과가 없는 경우, 생존 가능성에 대한 이러한 효과는 크게 제한된 실질적인 저장 수명에 대해 누적된다. 게다가, 세포가 사멸되거나 또는 궁핍하게 되는 경우, 부가의 해로운 물질이 방출되어 이웃하는 세포의 손상 및 사멸을 증가시키게 된다.
유용한 안정화제의 예로는 산소 라디칼과 같은 반응성이 크고 손상이 큰 분자를 분리시키는 화합물이 있다. 라디칼 스캐빈저 및 산화방지제의 특정예로서는 환원 글루타티온, 1,1,3,3-테트라메틸우레아, 1,1,3,3-테트라메틸-2-티오우레아, 티오황산나트륨, 티오황산은, 베타인, N,N-디메틸포름아미드, N-(2-머캅토프로피오닐) 글리신, β-머캅토에틸아민, 셀레노메티오닌, 티오우레아, 프로필갈레이트, 디머캅토프로판올, 아스코르브산, 시스테인, 나트륨 디에틸 디티오카르보네이트, 스퍼민, 스퍼미딘, 페룰산, 세사몰, 레소르시놀, 프로필갈레이트, MDL-71,897, 카다베린, 푸트레신, 1,3-디아미노프로판, 1,2-디아미노프로판, 데옥시글루코스, 요산, 살리실산, 3-아미노-1,2,4-트리아졸, 4-아미노-1,2,4-트리아졸, 벤조산, 히드록실아민 및 이의 조합물 및 유도체가 있다.
안정화제의 다른 군으로는 에틸렌 생합성 및/또는 에틸렌 작용을 방해하거나 또는 실질적으로 억제하는 제제가 있다. 또한, 이들 화합물중 몇몇은 마찬가지로 스캐빈저 특성을 갖는다. 에틸렌 억제제의 효과는 에틸렌의 형질발현 또는 작용이 충분하게 실시되어 동결보존 공정에서 세포 회수를 증가시키게 된다. 많은 식물 세포들은 스트레스를 받을 때 에틸렌을 방출하는 것으로 알려져 있다. 에틸렌은 세포를 손상시키고, 세포 사멸을 초래하게 된다. 에틸렌의 생성 또는 에틸렌의 작용을 방지하는 것은 세포 생존가능성 및 동결보존 공정으로부터의 세포 회수를 부가로 향상시키게 된다.
도 2 에 예시된 바와같이, 에틸렌 생합성 및 이와 동등한 다수의 억제제의 수많은 경로가 있다. 예를 들면, 생합성 경로는 S-아데노실메티오닌(SAM)(ACC 신타제+SAM →ACC), 아미노시클로프로판 카르복실산(ACC)(ACC+ACC 옥시다제→에틸렌) 및 에틸렌(에틸렌+에틸렌 옥시다제→CO2)의 전환시에 억제될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 수많은 생합성 억제제는 하기 표 1 에 제시되어 있다.
| 에틸렌 생합성 억제제 | ||
| 리조비톡신 | 메톡실아민 HCl | 히드록실아미노 유사물 |
| α-카날린 | DNP(2,4-디니트로페닐) | SDS(라우릴황산나트륨) |
| 트리톤 X-100 | 트윈 20 | 스퍼민 |
| 스퍼미딘 | ACC 유사물 | α-아미노이소부티르산 |
| n-프로필 갈레이트 | 벤조산 | 벤조산 유도체 |
| 페룰산 | 살리실산 | 살리실산 유도체 |
| 세사몰 | 카다바린 | 히드로퀴논 |
| 알라 | AMO-1618 | BHA(부틸화 히드록시아니솔) |
| 페닐에틸아민 | 브라시노스테로이드 | p-클로로머큐리벤조에이트 |
| N-에틸말레이미드 | 요오드아세테이트 | 염화코발트 및 기타 염 |
| 비피리딜 | 아미노(옥시아세트)산 | 염화수은 및 기타 염 |
| 살리실 알콜 | 살리신 | 염화니켈 및 기타 염 |
| 카테콜 | 플로로글루시놀 | 1,2-디아미노프로판 |
| 데스페리옥사민 | 인도메타신 | 1,3-디아미노프로판 |
또한, 에틸렌 작용의 수많은 억제제가 있다. 이들 화합물의 몇몇은 하기 표 2 에 제시되어 있다.
| 에틸렌 작용 억제제 | |
| 은 염 | 벤질이소티오시아네이트 |
| 8-히드록시퀴놀린 황산염 | 8-히드록시퀴놀린 시트레이트 |
| 2,5-노르보르나디엔 | N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린 |
| 트랜스-시클로옥텐 | 7-브로모-5-클로로-8-히드록시퀴놀린 |
| 시스-프로페닐포스폰산 | 디아조시클로펜타디엔 |
| 메틸시클로프로판 | 2-메틸시클로프로판 카르복실산 |
| 메틸시클로프로판 카르복실레이트 | 시클로옥타디엔 |
| 시클로옥토딘 | (클로로메틸)시클로프로판 |
1976년 이래로, 은 이온은 식물 조직 및 세포 배양의 수명을 개선시키고, 다양한 식물에서의 강력한 항에틸렌제제로서 작용하는 것으로 공지되어 왔다. 예를 들면, 컷 카네이션의 수명은 은 염으로 예비처리하여 증가될 수 있다. 은 이온의 상대적인 부동성으로 인해서, 줄기의 기부 처리는 꽃의 직접 분무 처리보다 덜 효과적인 것으로 나타났다. 은 이온의 낮은 이동성은 금속을 티오황산 은과 같은 음이온성 착물로 속임으로써 증가되는 것으로 알려져 있다. 티오황산염 단독으로는 에틸렌 생합성 뿐 아니라 에틸렌 작용을 억제할 수 없다.
은 이온 매개된 에틸렌 억제는 동일한 수용체 부위상에서 은이 구리로 치환되는 것을 기초로 하여 설명될 수 있다. 또한, 구리는 에틸렌 생합성 또는 작용과 관련된 효소 반응과 관련된 금속이다. 은 및 구리의 크기면에서의 유사성, 동일한 산화 상태 및 두 금속의 에틸렌과의 착물 형성 가능성은 이러한 착상에 신빙성을 제공한다.
티오황산은을 비롯한 은 염은 이들이 합성에 대해 커다란 자극적인 효과를 갖는다할지라도, 식물 및 식물 세포 배양에서의 에틸렌 작용을 억제한다. 이러한 은 이온(티오황산은의 활성 성분)의 ACC 및 에틸렌 생합성에 대한 자극 효과는 ACC 옥시다제의 증가된 활성으로 인한 ACC 의 에틸렌으로의 전환이 증가되는 것을 암시한다. 에틸렌 작용을 억제하는 은 염의 몇몇의 예가 하기 표 3 에 제시되어 있다.
| 선택된 은 염 | ||
| 티오황산은 | 질산은 | 염화은 |
| 아세트산은 | 인산은 | 시트르산 삼은 염 |
| 벤조산은 | 황산은 | 산화은 |
| 아질산은 | 시안산은 | 락트산 은 염 |
| 펜타플루오로프로피온산은 | 헥사플루오로인산은 | |
| 톨루엔설폰산의 은 염 |
냉동 공정, 회수, 해동 및 재성장동안 안정화제가 존재하는 것이 바람직하다고 할지라도, 안정화제는 냉동 전에 식물 세포와 함께 배양되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 에틸렌 생합성 엑제제 및 에틸렌 작용 억제제는 해동 및 재성장동안 배양 배지내에 포함되는 것이 훨씬 바람직할 것이다. 배양은 제제 자체가 세포에 대해 일반적으로 해롭지 않고 생존 가능성을 증가시킬 수 있기 때문에 수시간 또는 수일동안 실시할 수 있다. 몇몇의 더 민감한 식물 세포주는 다른 것들에 비해 훨씬 더 긴 처리를 요하게 된다. 정확한 배양 기간은 용이하게 실험에 의해 측정될 수 있다. 식물 세포는 안정화제 또는 안정화제 조합물과 함께 바람직하게는 약 1 ∼약 10일동안, 더욱 바람직하게는 약 1∼7일동안, 훨씬 더 바람직하게는 약 3일동안 성장 배지내에서 배양시킨다. 이러한 정도의 시간은 배지내에서 제거하고자 하거나 또는 세포에 대해 더 이상 해롭지 않은 정도로 적어도 감소시키고자하는 물질을 파괴시키는데 특히 충분하다.
배양은 대사 및 세포 증식 또는 보존 배지, 반드시 세포 성장을 촉진하지는 않는 염 및 영양원의 균형을 제공하는 배지와 같은 액체 또는 반-고형 배지내에서 실시할 수 있다. 세포는 동결보존용으로 준비되기 때문에, 때때로, 세포의 대사 공정을 감소하도록 보존 배지(최적 이하 또는 느린 성장 배양 배지; 예, 보통의 성장 배지의 염 농도의 1/4)내에서 배양하는 것이 바람직하다.
실온에서 또는 식물 세포가 대개 배양되는 온도에서 세포를 예비배양하여 예비처리를 실시할 수 있다. 예비배양은 취급 용이성을 위해 그리고 대부분의 식물 세포는 실온에서 안정하기 때문에 약 실온(20℃)에서 실시하는 것이 바람직하다. 안정화제는 배지에 직접 첨가될 수 있으며, 예비처리 공정동안 반드시 보충해야 된다. 안정화제의 농도는 특정 안정화제에 대해서 특정되어 있지만, 다소간 하나이상의 안정화제가 드물지 않을 경우, 대개는 약 1μM∼약 1mM, 또는 바람직하게는 약 10μM∼약 100μM으로 사용된다.
또한, 예비처리는 하나이상의 삼투제의 존재하에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 유용한 삼투제의 예로는 당 및 당 유도체, 아미노산 및 이미노산, 예를 들면, 프롤린 및 프롤린 유도체 또는 이들의 조합물이 있다. 더 유용한 당 및 당 유도체의 예로는 과당, 포도당, 맥아당, 만니톨, 소르비톨, 자당 및 트레할로즈 가 있다. 삼투제는 차후의 장입, 동결건조 및/또는 투화용 세포를 준비하는 농도로 이용된다. 농도는 여러가지 제제에 따라 크게 달라질 수 있으나, 대개는 약 50mM∼약 2M 이 된다. 이러한 농도는 원하는 만큼 이루어질 때까지 연속적으로 또는 증분량으로 시간에 걸쳐 (단계적으로) 소량의 제제를 첨가하여 얻을 수 있다. 배지내의 삼투제 농도는 바람직하게는 약 0.1M∼약 0.8M, 더욱 바람직하게는 약 0.2M∼약 0.6M이 된다. 또한, 삼투제는 약 1중량%∼약 10중량%의 농도의 수용액으로서 사용된다.
또한, 예비처리는 지질 이중충(예, 스테롤, 포스포지질, 글리코지질, 글리코단백질)에 삽입되는 화합물 또는 세포 배양물에 첨가된 2가 양이온과 같은 막 안정화제의 첨가를 단순히 포함할 수 있다. 2가 양이온은 열 충격 및 막 단백질을 안정화시키고, 또한 세포성 및 기타 막 사이의 정전기적 반발을 감소시킨다. 마그네슘, 망간 및 칼슘은 저렴하고, 예를 들면, CaCl2, MnCl2및 MgCl2와 같은 형태로 용이하게 시판되는 2가 양이온의 바람직한 예이다. 나트륨은 임의의 미량이상의 농도에서의 독성으로 인해서 덜 바람직하다. 바람직한 농도 범위는 약 1mM∼약 30mM, 더욱 바람직하게는 약 5mM∼약 20mM, 훨씬 더 바람직하게는 약 10mM∼약 15mM이다. 또한, 배지내의 2가 양이온의 존재는 냉동 온도를 감소시키고, 세포가 빙점을 빠르게 통과할 수 있도록 한다. 세포간 및 세포내 얼음 결정 형성 모두의 온도는 냉동시 및 해동시에 감소된다. 이러한 제제가 해동 및 후-해동 배양시에 존재하는 것은 중요할 수 있다.
저온 순양
예비처리동안 또는 예비처리후의 일정시간에, 동결보존시키고자 하는 세포는 냉동 온도 이상이지만 배양 온도보다 감소한 온도로 순양될 수 있다. 이로서 세포 대사를 크게 지연시키고, 일종의 임계성이 큰 온도 변화를 통해 급속한 온도 전이의 충격을 감소시켜 동결보존 공정에 대해 세포를 준비한다. 임계 온도 범위는 예를 들면 얼음 결정 형성의 임계 온도 주위에서 세포 손상의 위험이 가장 큰 범위를 말한다. 당업자에게 공지된 바와같이, 이러한 온도는 용액의 조성에 다소 영향을 미친다. 대부분의 세포 배양 배지의 주성분인 물의 경우, 얼음 결정 형성 및 재형성은 약 0℃∼약 -50℃에서 발생한다.
순양으로 인해서 임의의 삼투 전위에서 세포 탈수도를 감소시키는 내인성 용질의 축적이 초래되며, 과도한 탈수동안 단백질 및 막의 안정화에 기인하게 된다. 또한, 저온 순응은 투화제와 상승적으로 상호 작용하며, 세포성 막의 액체 입체배좌에서의 변형을 초래하여 삼투 배제 및 탈수 모두에 대한 내성을 증가시킨다.
순양은 단계적 방식으로 또는 점진적으로 실시될 수 있다. 단계는 세포 손상을 일으키지 않으면서 저온에 순양되기에 충분한 시간동안 약 0.5℃∼약 10℃ 증븐으로 감소하게 될 수 있다. 점진적이거나 또는 단계적이건간에 온도 구배는 세포가 가능한한 빠르게 빙점을 통과하도록 단계적으로 되어 있다. 세포는 단계적 또는 연속 방식에 의해 점진적으로 또는 급속하게 감온에 순양될 수 있다. 순양에 대한 기술은 통상의 업자에게 공지된 것이며, 순양제가 시판되고 있다. 점진적인 순양은 목표로 하는 온도가 달성될 때까지 1시간당 1℃ 로 배양 온도를 감소시키는 것을 포함한다. 점진적인 순양은 동결보존시키기가 가장 민감하며 어렵다고 간주되는 세포들에 대해 가장 유용하다. 단계적인 순양은 세포를 소정의 시간동안 감온하에 둔 후, 또다른 시간동안 부가로 감온하에 두는 것을 포함한다. 이러한 단계는 원하는 만큼 반복한다.
현탁 세포는 냉동 및 해동에 대해 가장 큰 생존 비율을 얻도록 가장 늦은 지체 또는 빠른 세포 분열 기가 될 수 있다. 이러한 기를 통과한 세포는 공포도 및 분화도가 높아서 냉동 손상의 위험을 증가시키고, 냉동 및 해동에 대한 생존율이 감소하게 된다.
장입
장입은 하나이상의 동결보존제의 용액내에서 세포를 평형화시키는 것을 포함한다. 장입동안 사용된 제제는 장입제로 칭할 수 있다. 유용한 장입제는 하나이상의 탈수제, 투과제, 비투과제 및 삼투제가 될 수 있다. 장입을 위한 적절한 제제는 세포 현탁을 유도하는 세포 탈수를 유도하는 제제가 있다. DMSO 및 에틸렌 글리콜과 같은 투과제 및, 과당, 자당 또는 포도당, 소르비톨, 만니톨 또는 글리세롤과 같은 투과성 및 비투과성 삼투제의 조합물을 사용할 수 있다. 이 단계는 적당한 농도의 동결보존제를 사이토졸에 약 0.5M∼약 2M 또는 약 5중량%∼약 20중량%로 투입하여 사이토졸의 용질 농도를 증가시킨다. 평형화에 필요한 시간을 최소로 하기 위해, 장입에 대한 최적의 온도 및 기타 조건을 배지, 광 강도 및 생존 가능한 세포 배양을 유지하는 산소 농도와 같은 조건과 맞추는 것이 바람직할지라도 장입은 약 실온에서 대개 실시한다.
장입 단계에서, 단일 동결보존제 또는 여러가지 동결보존제의 조합물을 배양 배지에 연속적으로 또는 단계적으로 직접 첨가할 수 있다. 단계적 장입은 단일 투여 장입보다 더 약하기 때문에 때때로 장입제가 세포에 전달되는 것을 용이하게 한다. 단계적 장입에 대한 첨가사이의 시간 증분 또는 간격은 수분 내지 수시간 범위가 될 수 있지만, 바람직하게는 약 1∼약 10분, 더욱 바람직하게는 약 1∼약 5분, 훨씬 더 바람직하게는 약 1∼약 2분 간격이 될 수 있다. 단계적 장입에서의 첨가의 수는 대개 실질적으로 어떻든지 간에 소수 내지 다수가 될 수 있다. 바람직하게는 약 20회 미만, 더욱 바람직하게는 약 10회 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 5 회정도가 된다. 간격 기간 및 간격 횟수는 특정 유형의 세포 및 장입제의 경우 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 세포는 세포내 및/또는 세포외 제제의 농도를 평형화시키도록 장입제(들)(장입제의 함량을 연속적 또는 단계적으로 증가시키면서)를 포함하는 용액내에서 배양시킨다. 배양 시간은 실질적으로 수분 내지 수 시간이 된다. 장입의 보존 효과는 부분적으로는 소량의 제거에 있지만 세포로부터 상당량의 수분을 제거하는 것을 포함한다. 이는 갑작스런 세포내 수분 손실의 충격을 최소로하여 차후의 투화 및/또는 동결건조에 대해서 세포를 대비하는 것이다.
장입후, 동결보존제를 포함하는 성장 배지를 제거하거나 또는 사용하고자 하는 제제(투화제)가 동일하거나 또는 유사한 제제인 경우, 장입제는 유지될 수 있거나 또는 농도를 단순히 투화에 대해 증가시킨다.
투화
동결보존시키고자 하는 세포를 투화시킨 후, 예비처리, 장입 및/또는 동결건조시킨다. 이러한 절차는 여러가지 잇점을 갖는다. 시스템내의 얼음 결정의 형성을 방해함으로써, 얼음 형성을 초래하는 복잡한 변수들을 최적화시킬 필요성을 배제시킨다. 추가로, 시험체는 액체 질소에 직접 넣을 수 있으며, 절차는 조절된 냉각에 필요한 대량의 장비를 필요로 하지 않는다. 투화 절차는 여러가지 유형의 세포로 구성된 복합 조직 및 기관에 대한 동결보존 절차를 개발하고자 하는 최대의 가능성을 제공한다.
투화 절차는 액체 질소 내에서의 급냉 이전에 세포 또는 시험체의 점진적 또는 단계적 삼투 탈수를 포함한다. 투화 절차에 있어서, 세포 탈수는 액체 질소 내에서의 냉각 이전에 농축 용액에 직접 노출시켜 실시한다. 노출은 세포에 첨가된 투화 양을 연속적으로 증가시켜 점진적으로 또는, 증가량을 일련의 시간동안 첨가하여 단계적이 될 수 있다. 단계적 투화에 대한 첨가 사이의 시간 증분 또는 간격은 수분 내지 수시간 이상, 바람직하게는 약 1 내지 약 10분, 더욱 바람직하게는 약 1분 내지 약 5분, 가장 바람직하게는 약 1 또는 약 2 분 범위내이다. 단계적 투화 절차에서의 첨가 횟수는 대개 실질적으로 수회 내지 다수 회가 될 수 있다. 바람직하게는 약 20회 미만, 더욱 바람직하게는 약 10회 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 5회이다. 간격 기간 및 간격 횟수는 세포 및 투화제의 특정 유형에 대해 당분야의 통상의 것에 의해 용이하게 측정된다. 세포는 소정 제제의 세포내 및/또는 세포외 농도를 평형화시키는 투화제(들)를 포함하는 용액내에서 (연속적 또는 단계적 증가 함량으로) 배양된다. 배양 시간은 수분 내지 수시간이 된다. 이상적인 조건하에서, 세포 또는 기관을 세포간 또는 세포내 얼음을 형성시키지 않고 매우 빠른 속도로 냉각시킬 수 있다. 그 결과로서, 얼음 형성에 영향을 미치는 모든 요인은 배제되며, 통상의 동결보존 절차에 비해서 투화 절차의 실질적인 잇점을 여러개 갖는다. 투화는 복합 조직 및 기관에 대한 동결보존 절차를 개발하는데 있어서 훨씬 더 큰 가능성을 제공한다. 시스템 내에서의 커다란 얼음 형성을 배제시킴으로써, 투화 절차는 통상의 동결보존 절차에 비해 작동면에서 훨씬 더 복잡해진다. 추가로, 투화는 몇몇의 시험체의 감도를 냉동시키는 문제점을 회피하도록 초급속 냉각 속도의 사용을 가능케 한다. 조절된 냉각 속도에 대해서는 아무런 특별한 또는 고가의 장비가 필요하지 않게 된다.
투화는 고 농축된 사이토졸을 과냉각시켜 고형의 준안정 유리를 커다란 결정화 없이 형성한다. 임의의 세포의 동결보존에서의 주된 문제점은 냉동 및 해동동안 세포내 얼음 결정의 형성이다. 과도한 얼음 결정 형성은 세포 막 및 세포 기관의 파열로 인해 세포 사멸을 초래한다. 얼음 결정 형성을 방지하는 한 방법은 세포를 급속히 냉동시켜 형성된 얼음 결정이 커다란 손상을 일으키기에 충분할 정도로 크지 않아야 한다. 수분 함량이 낮은 세포를 급속하게 냉동시키는 경우, 투화된다. 급속 냉동에 의한 투화는 수분 함량이 높은 식물 세포와 같은 세포에서는 가능하지 않다. 수분 함량이 높은 세포를 투화시키기 위해서는, 투화를 위한 급속 냉동 이외에 빙점 강하제 및 얼음 형성 억제제를 필요로 하게 된다. 적절하게 투화된 세포는 너무 작아서 광을 회절시키지 못하는 얼음 결정으로 구성된 투명 냉동 무정형 고체를 형성한다. 투화된 세포가 약 -40℃로 가온되는 경우, 실투될 수 있다. 실투시에, 얼음 결정은 확장되고, 세포 생존에 대개 치명적인 공정이 강화된다. 투화 용액은 냉동시에 세포 투화를 촉진시키고, 해동시에 실투를 지연시킨다.
대부분의 동결보존 용액은 문제의 물질을 유리 또는 유리상 물질로 변형시킬 수 있으며, 단 냉각 속도는 얼음 결정의 핵화 및 성장을 방해하기에 충분하게 빠르며, 임계 냉각 속도는 용질 농도에 따라 다르다. 유사하게, 세포의 투화는 사이토졸이 충분하게 농축되는 경우, 실시될 수 있다. 동결보존 절차에 있어서, 액체 질소 내에서의 급냉이전에 과도하게 농축된 용액내에서 세포를 탈수시켜 이루어질 수 있다. 동결보존 공정에서, 사이토졸은 시험체를 투화제와 같은 농축된 동결보존제 용액내에 넣음으로서 투화에 필요한 정도로 농축시킨다. 약 4M∼약 10M 또는 약 25중량%∼약 60중량%의 농도가 바람직하다. 이는 샘플 세포의 과도한 탈수를 생성한다. 과도한 7M 용액은 대개 90% 이상의 삼투 활성수를 세포로부터 제거하지만; 각 제제에 대한 정확한 농도는 실험적으로 측정될 수 있다. 사용될 수 있는 투화제는 DMSO, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 부탄디올, 포름아미드, 프로판디올 및 이러한 물질들의 혼합물이 있다.
적절한 투화 용액은 DMSO(1∼50%), 프로필렌 글리콜(약 5∼25%), 글리세롤(약 0∼50%), PEG-8000(약 5∼20%), 에틸렌 글리콜(약 10∼75%), 에틸렌 글리콜/소르비톨(약 60/20중량%∼약 10/60중량%) 및 에틸렌 글리콜/소르비톨(약 40/30중량%)를 갖는 배양 배지를 포함한다. 에틸렌 글리콜/소르비톨이 바람직하며, 50/30%, 45/35%, 40/40%, 40/30%, 30/50%의 농도로 사용되는 것이 바람직하며, 30/40% 가 바람직하다. 이러한 투화 용액은 약 1℃∼약 8℃, 바람직하게는 2℃∼6℃, 더욱 바람직하게는 약 4℃의 온도에서 사용할 수 있다.
투화 용액으로의 노출의 해로운 결과를 최소로 하기 위해, 탈수는 약 0℃∼약 4℃에서 노출 시간은 가능한한 짧게 하여 실시할 수 있다. 이러한 조건하에서, 물 및 용질에 대한 투과 계수차 때문에 시험체로의 부가의 상당량의 동결보존 유입은 없다. 그 결과, 시험체는 수축된 상태로 유지되며, 투화에 필요한 세포성 농축에서의 증가는 탈수에 의해 달성된다. 그러나, 동결보존제를 사용한 세포의 평형 (장입)은 식물 세포 또는 기관의 성공적은 투화에 대해 항상 필요한 것은 아니다. 예를 들면, 몇몇의 경우에 있어서, 장입제를 사용한 예비배양은 장입 단계와 동일한 목적을 달성한다.
장입을 필요로 하는 경우에 있어서, 이는 주로 세포성 막 및 가능한한 단백질의 탈수 유도된 탈안정화를 방해하도록 작용한다. 그러나, 장입 단계의 부재시에, 세포 생존이 감소될 수 있으며, 이후에 탈수 및 냉각/가온 단계가 실시된다. 그래서, 장입 단계동안 세포내 에틸렌 글리콜 또는 다른 동결보존제는 냉각동안의 세포의 투화를 촉진할 뿐 아니라, 탈수 단계동안의 손상으로부터 세포를 보호하게 된다.
동결건조
동결건조는 진공 증발에 의한 동결보존 전에 세포의 수분 함량을 감소시키는 것에 관한 것이다. 진공 증발은 감소된 공기압의 대기내에서 세포를 두는 것을 포함한다. 원하는 수분 제거 속도에 따라서, 약 -30℃∼-50℃의 온도에서 작동하는 감소된 상압은 100torr, 1torr, 0.01torr 또는 그 미만이 될 수 있다. 감압 조건하에서, 수분 증발 속도는 증가되어 세포내 수분의 65% 이하가 밤새 제거될 수 있게 된다. 최적의 조건하에서, 수분 제거는 수시간 또는 미만에서 실시될 수 있다. 증발동안의 열 손실은 냉각 상태로 세포를 유지하는 것이다. 진공도를 주의하여 조절함으로써 세포는 진공 증발 공정동안 저온 순양 온도에서 유지될 수 있다. 수분을 급속하게 제거하는 강 진공은 세포를 냉동시킬 위험이 있다. 냉동은 세포에 열을 직접 가하거나 또는 진동도를 조절함으로써 조절될 수 있다. 세포를 초기에 진공 챔버에 넣어 두는 경우, 세포내의 잔류 열이 냉동을 방해하기 때문에 고 진공을 가할 수 있다. 탈수가 진행되고 세포 온도가 강하되기 때문에, 진공은 감소될 수 있거나 또는 열을 가하여 냉동을 방지할 수 있다. 반건조 세포는 증발 챔버내에서 산란되는 경향을 지닐 수 있다. 이러한 경향은 기류가 다시 챔버로 유입되는 경우 처리 종반에서 매우 커지게 된다. 기류가 반건조 세포에 근접할 경우, 세포는 공기로 운반되어 샘플을 교차 오염시키게 된다. 이러한 파열을 방지하게 위해, 세포를 건조시키면서 원심력에 의해 시험관내에 가두어 증발 냉각을 진공 원심분리로 실시할 수 있다. 이러한 방법에서 제거된 물의 양은 세포의 무수 중량 측정에 의해 주기적으로 모니터할 수 있다. 소정량의 물이 제거되면, 투화 용액을 일정시간동안 액체 질소내에서 직접 냉동시키기 전에 반건조 세포에 직접 가할 수 있다.
냉동
예비처리, 장입, 투화 및/또는 동결건조시킨 식물 세포를 동결보존 온도로 냉동시켜 보존한다. 냉동 단계는 세포의 생존에 치명적인 커다란 얼음 결정의 형성을 방지하기에 충분하도록 빨라야 한다. 세포는 직접적으로 냉동될 수 있으며, 즉 이는 동결보존 온도에서 이미 제제와 직접 접촉하게 되는 것이다. 직접적인 방법은 액체 질소 또는 액체 헬륨과 같은 극저온 유체에 직접 세포를 침지, 분무, 주사 또는 붓는 것을 포함한다. 세포는 또한 냉동 고체, 예를 들면 액체 질소 냉동 강철 블록과 직접 접촉될 수 있다. 극저온 유체를 세포 용기에 직접 부을 수 있다. 직접적인 방법은 또한 공기를 비롯한 기체를 극저온에서 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 질소 또는 헬륨의 극저온 기류를 직접 세포 현탁액에 송풍시키고나 또는 버블링시킬 수 있다. 간접적인 방법은 용기내에 세포를 넣고, 용기를 고체, 액체 또는 기체와 극저온에서 접촉시키는 것이다. 적절한 용기의 예로는 극저온 온도를 견디도록 고안된 플라스틱 바이알, 유리 바이알 또는 앰플이 있다. 간접적인 냉동 방법에 대한 용기는 공기 또는 액체에 대해 불투과성을 갖지 않도록 해야 한다. 예를 들면, 플라스틱 백 또는 알루미늄 호일이 적당하다. 게다가, 용기가 반드시 극저온을 견딜 필요는 없다. 극저온하에서 균열하지만 실질적으로 손상이 없는 플라스틱 바이알을 사용할 수 있다. 또한 세포는 셀의 샘플을 금속 호일의 한면상에 두면서 호일의 다른 면을 극저온에서 기체, 고체 또는 액체와 접촉시켜 냉동시킬 수 있다. 냉동은 얼음 결정 형성을 방지하기에 충분히 빨라야 한다. 냉동 시간은 약 5분 또는 4분, 3분, 2분 또는 1분 미만이 되어야 한다. 임계 냉동 시간은 단일 세포 기준 프레임으로부터 측정되어야 한다. 예를 들면, 대량의 세포 샘플을 액체 질소에 붓는데에는 10분이 소요되지만, 각각의 세포를 이러한 방법으로 급속하게 냉동된다.
해동
본 발명의 제 13 실시태양은 동결보존된 세포를 해동시키는 방법에 관한 것이다. 적절한 해동 및 회수는 세포의 생존에 필수적이며, 이들이 본래 냉동된 조건과 거의 동일한 조건으로 세포를 회수하는 것이 필수적이다. 동결보존된 세포의 온도가 해동동안 증가되기 때문에, 소량의 얼음 결정은 강화되고, 실투라고 불리우는 단계에 의해 크기가 증가된다. 커다란 세포내 얼음 결정은 대개 세포 생존에 치명적이다. 실투를 방지하기 위해서 동결보존된 세포는 가능한한 빠르게 해동되어야만 한다. 가열 속도는 분당 약 30℃ 이상 내지 분당 60℃ 가 될 수 있다. 분당 90℃, 분당 140℃ 내지 분당 200℃ 이상의 더 빠른 가열 속도가 사용될 수 있다. 빠른 가열을 원하는 동시에, 식물 세포는 실온 이상에서 배양 온도를 견디는 능력이 감소된다. 과열을 방지하기 위해, 세포 온도를 주위깊게 모니터해야만 한다. 사용할 수 있는 임의의 가열 방법의 예로는 전도, 대류, 복사, 전자기 복사 또는 이들의 조합이 있다. 전도법은 수조내에 침지시키고, 가열 블록에 넣거나 개방 플레임내에 직접 넣는 것을 포함한다. 대류법은 가열 총 또는 오븐을 사용하는 것을 포함한다. 복사법은 예를 들면 가열 램프 또는 오븐, 예컨대, 대류 또는 복사 오븐을 사용하는 것을 포함한다. 전자기 복사는 전자레인지 및 유사한 장치를 사용하는 것을 포함한다. 몇몇의 장치는 이들 방법을 조합하여 가열할 수 있다. 예를 들면, 오븐은 대류 및 복사에 의해 가열된다. 가열은 세포 및 주위의 용액이 0℃ 이상이 되어야 하는 액체 형태로 되자마자 중단시켜야 한다. 동결보존된 세포는 하나이상의 빙점강하제의 존재하에 냉동된다. 이러한 제제가 존재하는 경우, 냉동된 세포는 0℃ 이하의 온도에서, 예를 들면 약 -10℃, -20℃, -30℃ 또는 -40℃ 에서 액화될 수 있다. 동결보존된 세포는 이러한 임의의 온도에서 또는 0℃ 이상의 온도에서 중단될 수 있다.
후-해동
투화 용액의 희석 및, 역장입으로 일컬어지는 세포로부터의 동결보존제의 제거는 가능한한 빠르게 실시되어야만 하며, 가능한한 빨리 동결보존된 세포 샘플의 해동을 실시해야한다. 세포내 고 농도 동결보존제로 인해서 삼투 팽창을 최소로 하면서 현탁 배지를 희석시키는 것이 바람직하다. 그러므로, 현탁 배지의 희석 및 샘플 시험체내의 동결보존제의 유입은 대개 고장 배지 내에서의 희석 또는 단계적 희석에 의해 실시된다.
해동된 세포는 생존을 최대로 하는 성장 조건으로 점진적으로 순양될 수 있다. 투화제는 세포독성, 세포 증식 억제 또는 돌연변이 유발성을 지닐 수 있으며, 해동된 세포로부터 세포에 유해하지 않은 속도로 제거되어야만 한다. 재현탁 및 원심분리, 투석, 일련의 세척, 생치료, 화학제를 사용한 중화 또는 전자기 복사와 같은 수많은 제거법을 사용할 수 있다. 몇몇의 투화 용액 및 삼투제의 급속 제거는 세포 스트레스 및 사멸을 증가시킬 수 있으며, 그리하여 제거 단계는 점진적이 될 수 있다. 제거 속도는 삼투 또는 투화가 적은 제제를 포함하는 용액을 사용한 일련의 세척으로 조절할 수 있다. 제거 속도를 감소시키는 다른 방법의 예로는 덜 투과성인 막을 사용한 투석, 낮은 농도의 투화제를 포함하는 반고형 또는 액체 배지상에서의 일련의 성장을 포함한다. 기타의 방법으로는 극저온 제제의 점진적인 희석, 투석, 생치료, 중화 및 촉매 분해가 있다.
해동 및 후-해동 처리는 안정화제의 존재하에 실시하여 생존을 확인하고, 유전적 및 세포성 손상을 최소로 한다. 예를 들면, 2가 양이온 또는 에틸렌 억제제와 같은 안정화제는 동결보존으로부터 생성된 손상 제제를 감소, 제거 또는 중화시킨다. 이러한 손상 제제의 예로는 자유 라디칼, 산화제 및 에틸렌이 있다. 이러한 몇몇의 제제는 다중 특성을 지니며, 이러한 점에서 매우 유용하다. 생존율 및 재성장율은 놀랍게도 해동 및 후-해동 단계동안 안정화제를 첨가하여 향상된다.
세포는 허용가능한 정도로 삼투제 및 투화제의 농도가 감소된 후 적절한 매체내에서 재성장될 수 있다. 재성장에 대한 한 방법은 반고형 성장 배지, 예컨대, 한천 배지내에서 캘러스가 형성될 때까지 상기 해동된 세포를 놓는 것을 포함한다. 세포를 캘러스로부터 회수하고, 액체 배양물내에서 성장시킬 수 있다. 또한, 캘러스 세포를 적절한 호르몬을 포함하는 반고형 배지내에 두어 어린싹 및 뿌리를 성장시키도록 유도할 수 있다. 어린 싹 및 뿌리를 포함하는 캘러스 세포는 점진적으로 순양되어 식물이 성장할때까지 온실내의 살균 토양상에서 성장할 수 있다. 온실 식물은 순양되어 천연 환경내의 온실 외부에서 성장될 수 있다. 또한, 세포는 반고형 배지를 사용하지 않고 해동되고 재성장될 수 있다. 즉, 삼투제 및 투화제를 제거한 후, 세포를 재성장용 액체 배지에 직접 둘 수 있다.
본 명세서에 개시된 하나이상의 변형예들은 다양한 세포 유형에 대해 동결보존된 후 세포 회수를 실질적으로 증가시킬 수 있다. 이러한 방법은 동결보존제, 에틸렌의 축적, 막 관련 수용체와 관련된 특정 목표에 대한 에틸렌의 작용, 막의 불안정성 및 막 누출에 기인한 독성과 관련된 문제점을 방지한다. 본 명세서에서 개시된 방법으로부터, 단계의 특정 조합은 특정 세포 유형에 대해 최적인 것으로 인식되었다. 예를 들면, 토마토, 감자 및 담배 세포는 2가 양이온을 사용한 단계적 장입 및/또는 투화를 사용한 동결보존에 잘 반응한다(프로토콜 10, 12, 13, 14).
탁솔을 생성하는 타수스 세포와 같은 식물 세포의 동결보존을 실시하는 한 방법이 도 3 에 개략적으로 제시되어 있다. 간략하게, 1차 분리물로부터 또는 세포 배양물로부터의 캘러스 세포 성장은 액체 성장 배지 내에서의 배양에 적절하다. 세포를 액체 배양으로 조절한 후, 이들을 삼투제 및 안정화제를 포함하는 예비처리 성장 배지에 24∼72시간동안 옮긴다. 예비배양된 세포를 4℃에서 1∼4시간동안 예비처리 배양에 의해 저온 순양시킨다. 저온 순양후, 세포를 원심분리 바이알로 옮기고, 약하게 원심분리하고, 세포가 손상되지 않은채 펠릿으로 만들었다. 삼투제 및 안정화제를 포함하는 예비처리 배지를 포함하는 상청액을 세포 펠릿으로부터 빨아들이고, 이를 버렸다. 안정화제 및 투화제를 포함하는 예비냉각된 용액을 세포 펠릿에 첨가하고, 세포를 약하게 재현탁시킨다. 투화 용액으로 처리한 3분 후, 세포를 포함하는 바이알을 액체 질소에 침지시킴으로써 문서용 극저온 보관에 세포를 둔다. 극저온 보존된 세포를 액체 질소내에서 약 30분 내지 수년동안 보관했다. 세포를 회생시키기 위해, 동결보존된 세포를 포함하는 바이알을 액체 질소로부터 40℃ 수조에 빠르게 옮겼다. 내용물을 액화시킬 경우, 바이알을 40℃ 수조로부터 꺼낸다. 해동된 세포 분액을 육안 배제 분석에 의해 즉석 생존가능성에 대해 조사했다. 안정화제 및 점진적으로 낮은 농도를 갖는 삼투제를 포함하는 일련의 저온 성장 배지로 세척했다. 충분량의 삼투제 및 투화제를 일련의 세척에 의해 세포로부터 제거한 후, 세포를 액체 배양물로 직접 옮겼다. 또한, 세포를 평판지에 놓고, 안정화제 및 감소량의 삼투 및 투화제를 포함하는 일련의 반고형 배지에 옮겼다. 이러한 일련의 평판은 세포가 삼투 및 투화 용액의 부재하에 반고형 배지상에서 재성장하도록 조절될 때까지 지속시켰다.
세포 동결보존의 다른 방법은 도 1A, 1B 및 1C 에 개시되어 있다. 개략적인 도시에서 알 수 있는 바와같이, 수많은 변형예가 바람직하다. 예를 들면, 단계 1 에서, 삼투제(0.06M∼0.80M 농도의 자당, 소르비톨 또는 만니톨)를 포함하는 액체 배지내에서 세포 생물량을 1∼6일동안 액체 배지내에서 예비배양시켰다. 단계 2 에서, 장입은 단계적으로 실시한다. 예비배양된 세포 생물량에 동결보존제(영양 배양 배지내에 40/30중량%의 농도로 에틸렌 글리콜/소르비톨을 포함하는 20% 투화 용액(V2N), 또는 영양 배양 배지내에 30%(w/v) 글리세롤, 15%(w/v) 에틸렌 글리콜 및 15%(w/v) 디메틸설폭시드를 포함하는 20% 투화 용액(VS3) 또는 0.4M 자당 용액(pH 5.6∼5.8))를 장입한다. 액체내의 세포 생물량을 약하게 혼합하고, 얼음상에서 또는 0℃∼4℃의 냉장고내에서 5분동안 배양시킨다. 이 단계 직후, 투화 용액의 최종 농도가 65% 에 이를 때까지 1분 간격으로 냉각된 100% 투화 (V2N 또는 VS3) 용액을 5회 단계적으로 첨가하여 액체내의 동결보존제의 농도를 증가시킨다. 장입 단계 및 0℃∼4℃의 배양에 사용된 총 시간은 10분이다. 혼합물(세포 생물량+투화)을 5분 이하(1∼5분)동안 100×g 으로 원심분리하고 상청액을 버린다.
또한, 단계 2 에서, 단일 단계로 장입을 실시할 수 있다. 예비배양된 세포 생물량에 동결보존제(영양 배양 배지내에 40/30중량%의 농도로 에틸렌 글리콜/소르비톨을 포함하는 65% 투화 용액(V2N); 또는 영양 배양 배지내에 30%(w/v) 글리세롤, 15%(w/v) 에틸렌 글리콜 및 15%(w/v) DMSO를 포함하는 65% 투화 용액(VN3); 또는 0.4M 자당 용액(pH 5.6∼5.8))를 장입한다. 동결보존제를 포함하는 액체내의 세포 생물량을 약하게 혼합하고, 얼음상에서 배양시키거나 또는 0℃∼4℃의 냉장고내에서 10분동안 냉장시킨다.
또한, 장입은 하나이상의 막 안정화제를 포함하는 동결보존제를 사용하는 다단계 또는 단일 단계로 실시할 수 있다. 모든 생물학적 막은 통상의 총체적 구조를 갖는다. 이는 비공유 상호작용에 의해 함께 유지되는 지질 및 단백질의 집합체이다. 지질은 이중층으로서 배열되며, 이는 막의 기본적인 구조물을 제공하며, 대부분의 수용성 분자의 흐름에 대해 상대적으로 불투과성인 차단물로서 작용한다. 단백질 분자는 지질 이중층내에 포함되며, 막의 다양한 작용을 조절한다. 단백질 분자는 세포, 예를 들면, 채널 단백질, 예컨대, 수동적 채널 단백질, 운반체 단백질 및 활성 수송과 관련된 단백질의 내부 또는 외부에 특이성 분자를 전달하는 작용을 한다. 다른 단백질은 막 관련 반응을 촉매화하는 효소이며, 기타의 단백질은 세포의 세포골격 및 세포외 매트릭스사이의 구조적 결합물로서 및/또는 세포 환경으로부터 도입된 화학적 신호를 수용하기 위한 수용체로서 작용한다.
특정 식물 종 및 세포 주는 부분적으로는 동결보존제의 유형 및 농도에 민감하기 때문에 동결보존 프로토콜을 미리 설정하는데 있어서 저항을 갖는다. 이에는 막의 불안정화, 장입 및 탈수 단계에 사용된 동결보존제의 화학적 독성 및 농축된 용액으로의 노출로부터 생성된 과도한 탈수(예, 투화)의 둘이상의 잠재적인 원인이 있다. 냉각 또는 가온동안의 얼음의 형성 및 유리의 파쇄로 인한 세포의 기계적 파손과 같은 다른 요인은 막의 불안정화에 기인할 수 있다.
동결보존제 농축액으로의 노출에 의해 형성된 과도한 탈수는 지질, 단백질 및 핵산을 비롯한 생물학적 분자의 다양한 배열에서의 구조적 변이를 일으킬 수 있다. 이러한 조건하에서, 혈장 막 및 기타 세포성 막의 초구조에는 여러가지 변형이 있을 수 있다. 이러한 변화는 막의 단백질 및 지질 성분의 친수성 부분과 관련된 물의 제거를 초래하는 혈장 막내의 특정 도메인의 형성을 포함한다. 또한, 불안정화는 식물 세포 막을 투과성 동결보존제 화합물(예, 식물 세포 막내의 채널 단백질을 유동화시키는 화합물)과 접촉하여 발생할 수 있다. 단계적 장입 및/또는 투화는 과도한 탈수로부터 형성된 막 불안정화를 최소로 할 수 있다. 세포 부피, 혈장 막의 투과성 등의 실질적인 변화와 관련된 다른 특징은 또한 단계적 장입에 의해 최소화될 수 있다.
열 충격 처리는 막 및 단백질을 안정화시킨다. 세포 생물량을 삼투제로 예비배양시킨 후의 열 충격 처리는 동결보존제를 세포에 장입하기 전에 반드시 필요하지는 않다. 그러나, 세포 생물량이 삼투제와 함께 예비배양되지 않는 경우에는 열 충격 처리가 필요하다. 게다가, 2가 양이온을 포함하는 투화 용액(동결보존제)(CaCl2, MnCl2또는 MgCl2, 5mM∼20mM)을 세포에 장입하는 것이 중요하다(예, 프로토콜 11 및 12). 열 충격 처리는 대개 세포 생물량의 예비배양후 실시한다. 동결보존후 세포의 생존율이 약 20%∼약 40% 정도되는 것이 중요하다. 이 절차는 약 37℃에서 약 4시간 이하동안 수조 교반기내에서 세포 또는 세포 생물량(예비배양되거나 또는 예비배양되지 않음)의 배양을 포함한다. 이러한 처리후, 액체 배지(삼투제의 포함 또는 포함하지 않음)내의 세포를 동결보존(장입 단계)에 사용하기 전에 4시간 이하동안 실온(23℃∼25℃)으로 만든다.
열 충격 처리는 스트레스에 적응하는데 포함되는 것으로 간주되는 특정 단백질(열 충격 단백질)의 새로운 합성을 유도하는 것을 알려졌다. 삼투제로 예비배양되지 않은 열 충격 세포는 냉동을 견디지 못한다. 열 충격은 단백질 및 막을 안정화시키는 열 충격 단백질의 형성에 의해 냉동으로부터 생성된 세포내의 삼투제의 농도를 갑작스럽게 증가시킴으로써 노출에 대한 내성을 유도한다. 열 충격은 약약 31℃∼약 45℃, 바람직하게는 약 33℃∼약 40℃, 더욱 바람직하게는 약 37℃의 수조내에서 세포를 배양시킴으로써 실시된다. 배양은 수분 내지 수 시간, 바람직하게는 약 1 시간 내지 약 6 시간, 더욱 바람직하게는 약 2 시간 내지 약 4 시간에 실시된다.
CaCl2, MnCl2또는 MgCl2와 같은 2가 양이온은 세포를 LN2온도에 노출시키기 전에 투화 용액내에 포함될 수 있다. 투화 용액내에 포함되는 2가 양이온은 식물 세포 막 및 열 충격 단백질을 안정화시키는 것으로 나타났다. 2가 양이온은 막상의 이온 중심사이의 정전기적 반발력을 감소시켜 세포 막을 안정화시킨다. 또한, 2가 양이온은 냉동 및 해동동안 얼음 핵화를 방지할 수 있다. 막의 지질 이중층사이에 삽입되어 있는 스테롤, 포스포지질, 글리코지질 또는 글리코단백질은 또한 식물 세포 막을 효과적으로 안정화시킬 수 있다. 이러한 화합물은 식물 세포 막 및/또는 열 충격 단백질의 안정화에서 2가 양이온을 대체할 수 있다.
동결보존제로 예비배양되거나 또는 예비배양되지 않은 세포 생물량(37℃ 이에서 4시간이하동안 열 충격 처리하거나 또는 처리하지 않음)을 단계적으로 장입하는 절차는 투화 용액(V2N 또는 VS3)이 5mM∼20mM 범위내의 농도에서 막 안정화제 2가 양이온(예, CaCl2, MnCl2또는 MgCl2)을 포함하는 것을 제외하고 동일하다.
단계 3 에서, 투화 단계는 단계적으로 실시될 수 있다. 그리하여 장입 및 원심분리후에 수득된 세포 또는 세포 생물량은 단계적 방법으로 투화 용액(V2N 또는 VS3)으로 부가로 처리된다. 이 단계는 대개 냉각된 극저온 바이알로 원심분리후 세포 생물량을 전달하고, 0℃에서의 3분의 배양 기간동안 1분 간격으로 농축된(100%) 투화 용액을 첨가한다. 배양 기간의 말기에, 극저온 바이알내의 내용물(세포+투화 용액)을 약하게 혼합한 후, LN2에 플런지시킨다. 또한, 투화를 단일 단계로 실시할 수 있다. 그리하여 장입 및 원심분리후에 수득된 세포 또는 세포 생물량은 투화 용액(100%)으로 부가로 처리된다. 이 단계는 대개 냉각된 극저온 바이알로 원심분리후 세포 생물량으로 전달하고, 농축된 (100%) 투화 용액을 첨가한다. 극저온 바이알내의 내용물을 약하게 혼합하고, 3분동안 0℃에서 배양한 후, LN2에 플런지시킨다. 또한, 투화는 CaCl2또는 MgCl2와 같은 2가 양이온 함유 동결보존제를 사용하여 단계적으로 또는 단일 단계가 될 수 있다.
장입된 세포 생물량을 동결보존제로 투화시키는 절차는 농축된 투화 용액(V2N 또는 VS3)이 약 5mM∼약 20mM 범위내의 농도에서 막 안정화제 2가 양이온(예, CaCl2또는 MgCl2)을 포함하는 것을 제외하고 동일하다.
세포를 냉동시키는 것은 대개 LN2내에서의 극저온 바이알내에서 대개 급속으로 이루어지거나 또는 액체 질소(LN2)를 포함하는 저장 용기내의 투화 용액내에 세포를 포함하는 극저온 바이알을 신속 전달하는 것이다.
해동은 40℃ 또는 60℃로 조절된 수조내에서 냉동된 세포 생물량 또는 세포를 포함하는 극저온 바이알의 신속 가온(예, 약 20초∼약 45초)을 포함한다. 후-해동은 삼투제(자당, 소르비톨 또는 만니톨; 농도 1M∼2M) 및 에틸렌 억제제 또는 에틸렌 작용 억제제(티오황산은; 농도 약 5μM∼약 20μM)와 함께 액체 영양 배지를 포함하는 살균 원심분리 시험관에 극저온 바이알내의 액화 세포 생물량을 즉시 전달하는 것을 포함한다. 내용물을 약하게 혼합하고, 교반기(120rpm)상에서 30분동안 실온에서 배양한다. 이후, 원심분리하고, 펠릿내의 세포를 블롯팅지상에 있는 무균 여과지의 두 개의 층으로 전달한다(세포 또는 세포 생물량으로부터 과량의 수분을 제거하기 위해). 세포 또는 세포 생물량을 2분동안 배양한다. 이러한 배양 기간후, 상부 여과지와 세포를 0.8M 에서 0.1M 로 자당의 농도가 감소하도록 삼투제를 포함하는 고형 영양 배지에 순차적으로 전달하여 세포를 삼투 조절시킨다. 각각의 단계에서, 여과지상의 세포는 30분 내지 1시간동안 배양시키고, 최종적으로 임의의 부가의 삼투제의 부재하에 보통의 고형 영양 배지로 전달한다. 이러한 배양 단계(보통의 영양 배지내의 임의의 부가 삼투제를 사용하지 않음)를 24시간 배양후 암실에서 25℃에서 반복한다.
또한, 해동직후 후-해동된 펠릿내의 세포를 삼투제(자당, 소르비톨 또는 만니톨; 농도 범위 1M∼2M)를 포함하는 액체 배지로 신속하게 세척한다. 이는 대개 삼투제를 포함하고, 100×g으로 1∼3분동안 원심분리하여 액체 영양 배지내에서 2∼5분동안 세포 생물량의 배양을 실시한다. 이 단계를 한 번더 반복한 후, 세포 생물량의 배양을 30분동안 삼투제 및 에틸렌 억제제 또는 에틸렌 작용 억제제(티오황산은, 5μM∼20μM)를 포함하는 액체 영양 배지내에서 배양시킨다.
새로운 캘러스 재성장은 1주일 후에 대개 눈에 보인다. 새로운 세포 생물량 성장이 증가하면, 캘러스 세포는 여과지로부터 제거되고, 보통의 고형 영양 배지상에서 직접 전달된다. 충분한 성장(대개 2∼3주)이 발생한 후, 액체 배지내의 세포 현탁액은 형성된 캘러스로부터 개시된다.
본 발명의 제 14 실시태양은 상기 기재된 방법에 의해 동결보존된 식물 세포에 관한 것이다. 세포는 상기 개시되거나 또는 동결보존법이 사용될 수 있는 임의의 속 또는 종이 될 수 있다. 동결보존된 세포는 극저온 보관에 대해 적절한 온도에서 유지될 수 있다. 세포는 액체 질소(약 -196℃), 액체 아르곤, 액체 헬륨 또는 액체 수소내에서 유지되는 것이 바람직하다. 이러한 온도는 세포의 장기간 저장, 부가로 온도 변화를 최소로 하는 것에 가장 적절하다. 장기간의 저장은 수개월일 수 있으며, 회수시에 세포 생존가능성을 크게 상실하지 않은채 수년인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 동결보존된 세포의 회수에 대한 효율적인 방법에 관한 것이기 때문에, 비교적 많은 양의 세포 샘플은 전체 샘플의 손실없이 손실될 수 있다. 세포 또는 식물은 잔류하는 세포로부터 증식될 수 있다. 단기간의 저장, 수개월 미만의 저장은 -150℃, -100℃ 또는 -50℃의 저장 온도를 사용할 수 있어서 바람직할 수 있다. 드라이 아이스(이산화탄소) 및 통상의 냉각제를 사용하여 상기 온도를 유지한다.
본 발명의 제 15 실시태양은 상기 기재된 동결보존 회수 방법에 의해 회생된 식물 및 식물 세포에 관한 것이다. 세포는 본 명세서에 개시된 임의의 속 또는 종 또는 극저온 회수법이 사용된 속 또는 종이 될 수 있다. 세포는 동결보존된 원 세포 또는 상기 세포로부터 증식된 세포가 될 수 있다. 동질성 세포 배양과는 구별되는 식물은 상호 관련된 작용을 갖는 관련 세포의 다양한 집합이다.
본 발명의 제 16 실시태양은 동결보존된 세포의 수송 및 해동을 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 이러한 방법에 의해 동결보존된 세포는 차후의 복구를 위한 중앙 저장소에 보관할 수 있다. 불의의 손실로부터의 안전성을 증가시키기 위해, 각각의 냉동된 세포주를 수많은 장소에 저장할 수 있다. 복구동안 동결보존된 세포를 포함하는 극저온 바이알을 적절한 용기에 넣어 수령인에게 선적할 수 있다. 적절한 용기는 선적동안 동결보존 온도를 유지할 수 있는 것이다. 모든 세포는 액체 질소와 같은 휴대용 동결보존제를 사용하여 장기간동안 비교적 낮은 온도에서 선적할 수 있다. 즉시 해동시키고자 하는 세포는 드라이 아이스내에 선적하여 비용을 절감시킬 수 있다. 저장소로부터 세포를 복구하기 위한 키트는 일련의 세척물에 대한 적절한 농도의 삼투제, 투화 용액 및 안정화제를 포함하는 충분한 배지인 동결보존된 세포 바이알을 포함할 수 있다. 또한, 세척 용액 대신에, 또는 이외에 안정화제를 포함하며, 삼투 및 투화 용액의 함량이 감소되는 다수의 반고형 성장 배지와 함께 세포를 선적할 수 있다. 해동후, 세포를 세척하고, 즉시 사용하거나 또는 투화 및 삼투제를 점진적으로 제거하도록 반고형 배지상에 놓을 수 있다. 수송 키트는 후-해동 생존 가능성 분석을 위한 제제 및 유전적 안정도를 측정하도록 해동된 세포로부터의 DNA 와 비교하기 위한 표준 DNA 샘플을 부가로 포함할 수 있다.
하기의 실험은 본 발명의 실시태양을 예시하고자 제공하는 것으로 본 발명의 범주를 제한해서는 안된다.
실시예 1
캘러스 개시 및 증식
타수스 침엽을 야생형 및 배양된 식물로부터 수집했다. 식물 재료를 희석된 비누 용액으로 세척하고, 증류수로 강력 세척하고, 10분동안 염소 함유 용액(1% 차아염소산염, pH 7)내에서 표면을 살균시켰다. 살균 조건하에서, 재료를 살균 증류수로 3회 세척했다. 침엽을 100㎎/ℓ 아스코르브산을 포함하는 1% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 용액내에서 절단했다. 반고형 배지 E 내의 절단 말단과 함께 침엽을 놓고, 암실에서 24℃±1℃로 배양했다. 배양을 매일 모니터하고, 미생물 오염이 의심되는 것은 버린다. 상당한 캘러스가 형성된 것이 관찰되었으며, 캘러스를 20일동안에 외식편으로부터 분리하고, 하기 표 4 에 제시되어 있는 다양한 캘러스 증식 배지상에 놓는다. 타수스 치넨시스의 캘러스를 배지 D 로 옮긴다(표 4). 이 절차로 외식편 90% 에서 캘러스를 유도했다. 동일한 절차를 사용하여 티. 브레비폴리아, 티. 카나덴시스, 티. 쿠스피다타, 티. 바카타, 티. 글로보사, 티. 플로리다나, 티. 월리키아나, 티. 메디아, 티. 치넨시스의 배양을 개시했다. 외식편으로부터 제거한 캘러스를 24℃ 암실에서 배양했다. 건강한 캘러스 부분을 신선한 배지에 10일마다 옮겼다. 본 발명에 바람직한 성장 및 세포 유지 배지는 하기 표 4a 및 4b 에 제시한다.
| 다양한 성장 배지의 화학적 조성 | ||||||||
| 화학 성분 | A | B | C | D | E | F | G | H |
| 질산암모늄 | - | - | - | - | - | 400 | 500 | 400 |
| 황산암모늄 | 134 | - | 33.5 | 134 | 67 | - | 134 | |
| 붕산 | 3 | 1.5 | 0.75 | 3 | 1.5 | 0.75 | 6.2 | 1.5 |
| 염화칼슘(무수물) | 113.2 | - | 28.31 | 113.24 | 56.62 | 72.5 | 113.24 | 72.5 |
| 염화칼슘 2H2O | - | 0 | 50 | - | - | - | - | - |
| 질산칼슘 4H2O | - | 208.4 | - | - | - | 386 | - | 386 |
| 염화코발트 6H2O | 0.03 | - | 0.006 | 0.025 | 0.0125 | - | 0.025 | - |
| 황산구리 5H2O | 0.03 | 0.01 | 0.006 | 0.025 | 0.0125 | 0.25 | 0.025 | 0.25 |
| Na2EDTA 2H2O | 37.3 | - | 9.32 | 37.3 | 18.65 | 37.3 | 37.3 | 37.3 |
| 황산제이철 | - | 2.5 | - | - | - | - | - | - |
| 황산제일철 7H2O | 27.8 | - | 6.95 | 27.8 | 13.9 | 27.8 | 27.8 | 27.8 |
| 황산마그네슘(무수) | 122.1 | 366.2 | 30.5 | 122.09 | 61.04 | 180.7 | 122.09 | 180.7 |
| 황산망간 H2O | 10 | 23.788 | 22.5 | 10 | 5 | 22.3 | 10 | 22.3 |
| 삼산화몰리브데늄 | - | 0.001 | - | - | - | - | - | - |
| 몰리브산(나트륨 염) 2H2O | 0.25 | - | 0.062 | 0.25 | 0.125 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| 염화칼륨 | - | 65 | - | - | - | - | - | - |
| 요오드화 칼륨 | 0.75 | 0.75 | 0.175 | 0.75 | 0.375 | - | 0.75 | - |
| 질산칼륨 | 2500 | 80 | 625 | 2500 | 1250 | - | 2500 | - |
| 인산나트륨(1염기성) | - | - | 10 | - | - | 170 | - | 170 |
| 황산칼륨 | - | - | - | - | - | 990 | - | 990 |
| 인산나트륨(1염기성,무수) | 130.5 | 16.5 | 32.62 | 130.5 | 65.25 | - | 130.5 | - |
| 황산나트륨 | - | 200 | - | - | - | - | - | - |
| 황산아연 7H2O | 2 | 3 | 0.5 | 2 | 1 | 8.6 | 2 | 8.6 |
| 마이오-이노시톨 | 100 | 100 | 125 | 100 | 50 | 100 | 100 | 100 |
| 니코틴산 | 1 | - | 0.75 | 1 | 0.5 | 1 | 1 | 1 |
| 피리독신-HCl | 1 | - | 0.25 | 1 | 0.5 | 1 | 1 | 1 |
| 티아민-HCl | 10 | 5 | 3.5 | 10 | 5 | 10 | 10 | 10 |
| 글루타민 | 292.6 | 146.4 | - | 292.8 | 292.8 | 1756.8 | - | 292.8 |
| 화학 성분 | A | B | C | D | E | F | G | H |
| 트립토판 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 페닐알라닌 | - | 30 | - | - | - | - | - | - |
| 리신 | - | 20 | - | - | - | - | - | - |
| 메티오닌 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 아세트산나트륨 | - | 10 | 10 | - | - | - | - | - |
| 자당 | 10000 | 50000 | 40000 | 10000 | 10000 | 10000 | 20000 | 10000 |
| N6-벤질아데닌 | 2 | 2 | 2 | 0.002 | 0.002 | - | - | |
| 아스코르브산 | 50 | 100 | 50 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 피클로람 | - | - | 1.2 | 2.4 | 1.2 | - | 1.2 | |
| 카제인 가수분해물 | - | - | 500 | - | - | - | 1000 | - |
| 6-디메틸탈릴아미노푸린 | - | - | - | - | - | 0.02 | - | - |
| 키네틴 | - | - | - | - | - | - | - | 0.02 |
| pH | 5.6 | 5.6 | 5.6 | 5.6 | 5.6 | 5.6 | 5.6 | 5.6 |
| β-나프탈렌아세트산 | 0.931 | 10 | - | - | - | - | 1.862 | - |
실시예 2
현탁된 세포의 현탁 개시 및 성장
25㎖의 액체 배지(표 4a 및 4b)를 포함하는 125㎖의 삼각 플라스크에 1g의 캘러스 물질을 무균 접종했다. 플라스크를 실리콘 발포물 캡으로 도포하고, 24℃ 암실에서 120rpm 으로 선회 교반기상에 두었다. 현탁 배양물이 약 3∼10일동안 형성되었다. 교환된 배지는 미라클로쓰 여과지를 포함하는 뷰흐너 깔때기를 통해 플라스크 내용물을 흡입 여과하고 신선한 배지내의 모든 생물량을 재현탁시켜 배지 교환을 개시했다. 25㎖의 신선한 배지를 포함하는 125㎖의 플라스크에 매주 1∼2g의 세포를 옮겼다. 대표적인 종의 현탁 배양물에서 수득된 대표적인 성장 속도 및 세포 밀도를 하기 표 5 에 제시한다.
| 타수스 세포 성장 프로파일 | ||||
| 종 | 건조 중량 배가 시간 | 신선 중량 배가 시간 | 건조 중량 밀도 | 신선 중량 밀도 |
| 티. 브레비폴리아 | 2.0일 | 3.5일 | 20g/ℓ | 400g/ℓ |
| 티. 비카타 | 2.0일 | 6.0일 | 15g/ℓ | 220g/ℓ |
| 티. 치넨시스 | 2.5일 | 4.5일 | 20g/ℓ | 285g/ℓ |
| 티. 카나덴시스 | 8.5일 | 13g/ℓ | 260g/ℓ |
티. 치넨시스 주 K-1 에 대한 시간에 따른 생물량(신선 및 건조 중량)의 증가를 도 4 에 도시한다. 가장 빠른 생물량 증가를 나타내는 점에서의 기울기를 측정하여 최대 성장 속도를 측정했다. 2.5일의 최대 배가 시간을 갖는 티. 치넨시스의 세포 배양은 타수스 종 현탁 배양에 대해 이미 보고된 것보다 훨씬 높은 성장 속도를 나타낸다. 대표적인 타수스 배양은 배가 시간이 약 7∼12일이 된다.
고밀도에서의 배양 세포는 세포 배양 방법의 생산율을 최대로 한다. 이전의 티. 브레비폴리아가 1ℓ당 건조 중량 1g 미만의 세포 밀도를 갖는 반면, 현탁 배양물 티. 치넨시스는 18일의 성장후 1ℓ당 건조 중량 8∼20g 이하의 밀도를 가질 수 있다. 세포 생존 가능성은 아세톤내의 0.05% 형광 디아세테이트(FDA)로 염색하여 측정되며[참고 문헌 : 제이. 엠. 위드홀, Stain Technol 47:189-94, 1972], 형광 현미경내의 청색광으로 여기시에 녹색 형광 세포의 수를 계수한다. 세포 생존 가능성은 성장기동안 90% 이상이 되었다.
실시예 3
만니톨을 사용한 예비배양후 타수스 세포의 생존 가능성
타수스 세포의 6 내지 7 일된 현탁 배양물을 수확하고, 0.16M의 만니톨, 0.22M의 만니톨, 0.33M의 만니톨 및 0.44M의 만니톨을 포함하는 신선한 성장 배지에 재현탁했다.
만니톨을 포함하는 성장 배지내에서 3일동안 배양한 후, 세포를 4℃에서 3시간동안 저온 순양시켰다. 순양된 세포를 수확하고, 배지내에 40/30중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨의 저온 투화 용액을 포함하는 4㎖의 극저온 바이알에 옮겼다. 바이알을 4℃에서 3분동안 배양하고, 액체 질소에 침지시켜 냉동시켰다. 바이알을 해동 실험에 사용하기 적어도 10분 이상동안 액체 질소내에서 유지시켰다.
냉동된 세포의 바이알을 액체 질소 저장소에서 꺼내고, 내용물이 액화될 때까지(1∼2분) 40℃에서 교반했다. 액화된 세포를 1M 소르비톨을 포함하는 무균 배지로 5∼6회, 0.5M 소르비톨 배지로 3회, 0.1M 소르비톨 배지로 3회, 무소르비톨 배지로 3 회 세척했다. 세척 배지내에서 세포를 재현탁시켜 세척을 실시하고, 50×g 에서 2분동안 원심분리하고, 세포 펠릿으로부터 세척 배지를 흡기시켰다. 해동 직후의 세포 생존 가능성을 측정했다. 다수의 실험 개요를 하기 표 6 에 제시한다.
| 만니톨로 예비처리된 세포의 후-냉동 생존 가능성 | ||
| 농도 | 생존 가능성 | 재성장 |
| 0.16M | 60% | 활발 |
| 0.22M | 30% | 약간 |
| 0.33M | 30% | 약간 |
| 0.44M | 20% | 약간 |
실시예 4
소르비톨을 사용하여 예비배양시킨 후의 타수스 세포의 생존 가능성
냉동된 타수스 세포를 해동시키고, 0.15M, 0.22M, 0.33M, 0.44M 및 0.80M 의 소르비톨로 소르비톨 함유 신선한 성장 배지에 현탁시켰다. 해동 직후의 세포 생존 가능성을 측정했다. 다수의 실험 개요를 하기 표 7 에 제시한다.
| 소르비톨로 예비처리된 세포의 후-해동 생존 가능성 | ||
| 농도 | 생존 가능성 | 재성장 |
| 0.15M | 20% | 없음 |
| 0.22M | 40% | 활발 |
| 0.33M | 30% | 활발 |
| 0.44M | 20% | 활발 |
| 0.80M | 20% | 약간 |
실시예 5
자당을 사용하여 예비배양시킨 후의 타수스 세포의 생존 가능성
성장 배지내의 6 내지 7 일된 현탁 배양물을 수확하고, 세포 생물량을 0.06M, 0.12M, 0.15M, 0.29M 및 0.58M 의 자당을 포함하는 신선한 성장 배지에 재현탁시켰다. 세포를 동결보존, 냉동, 해동 및 삼투 조절했다. 해동 직후의 세포 생존 가능성을 측정했다. 다수의 실험 개요를 하기 표 8 에 제시한다.
| 자당으로 예비처리된 세포의 후-해동 생존 가능성 | ||
| 농도 | 생존 가능성 | 재성장 |
| 0.06M | 40% | 약간 |
| 0.12M | 40% | 약간 |
| 0.15M | 40% | 약간 |
| 0.29M | 30% | 약간 |
| 0.58M | 15% | 약간 |
실시예 6
타수스 세포의 생존에 대한 삼투제의 효과
예비배양 기간 이후 및 동결보존되고 냉동된 타수스 세포 현탁액의 해동 이후 상기 제제로 예비배양된 타수스 종 세포의 생존에 대한 성장 배지내의 다양한 삼투제의 효과를 측정하여 평가했다. 동결보존 이전에 다양한 삼투제를 포함하는 성장 배지내에서 3일된 세포 배양 현탁액의 세포를 예비배양했다. 동결보존된 세포를 냉동시키고, 최소 1시간동안 액체 질소내에 보관했다. 예비배양 기간의 말기에(대조용) 및 동결보존되고 냉동된 세포를 해동시킨 직후 생존 가능성 테스트를 실시했다.
성장 배지내에서 만니톨을 사용하여 예비처리한 세포 배양물은 기타 삼투제를 사용하여 관찰된 생존 가능성과 비교하여 동결보존 및 냉동후의 해동시의 생존 가능성이 가장 높은 것으로 나타났다.
| 후-해동 생존 가능성에 대한 삼투제의 효과 | ||
| 생존 농도(생존 가능성) | ||
| 삼투제 | 대조용 | 냉동 |
| 프롤린 | 50% | 15% |
| 트레할로즈 | 50-95% | 15% |
| 자당 | 50-95% | 20-50% |
| 소르비톨 | 50-95% | 30-70% |
| 만니톨 | 50-95% | 40-80% |
실시예 7
타수스 생존 가능성에 대한 삼투제 및 동결보존제의 효과
타수스 현탁 배양물(KS1A)의 세포를 수집하고, 배지내의 다양한 삼투제로 예비배양시켰다. 테스트한 삼투제는 트레할로즈, 프롤린, 소르비톨(0.15M∼0.8M), 자당(2∼20%) 및 만니톨(0.16M)이다. 예비배양 기간의 종반에 및 해동 직후에 각각의 세포 현탁액에 대해 생존 가능성을 평가했다. 후-해동 삼투 조절 이후 재성장을 평가했다. 투화 용액은 에틸렌 글리콜/소르비톨/펙틴 및 에틸렌 글리콜/소르비톨을 배양 배지내에서 40/30중량%로 사용했다. 결과를 하기 표 10에 제시한다. 예비배양에 만니톨을 사용하고 투화 용액에 동결보존제로서 에틸렌 글리콜/소르비톨을 사용한 경우에 가장 높은 생존 가능성 및 가장 활발한 재성장이 관찰되었다.
| 후-해동 생존 가능성에 대한 삼투제 및 동결보존제의 효과 | ||||
| 삼투제 | 생존 가능성 | 후-해동 동결보존제 | 후-해동 회수율 | |
| 생존 가능성 | 재성장 | |||
| 트레할로즈 및 프롤린 | 50-95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨/펙틴 | 15% | 없음 |
| 소르비톨0.15M-0.8M | 50-95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨 | 30-70% | 약간 내지 활발 |
| 자당2%-20% | 50-95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨 | 10-40% | 없음 내지 활발 |
| 만니톨 | 75-95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨 | 40-80% | 약간 내지 활발 |
실시예 8
생존에 대한 예비배양 길이의 효과
타수스 세포를 세포 배양액으로부터 수확하고, 생물량을 3%의 농도로 1 또는 3일동안 실온에서 만니톨을 포함하는 성장 배지내에서 재현탁시켰다. 장입된 세포를 4℃에서 3시간동안 배양하고, 배양 배지내의 40/30중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨을 포함하는 저온 투화 용액을 포함하는 4㎖ 극저온 바이알에 옮겼다. 바이알을 4℃에서 3분동안 배양하고, 액체 질소 침지로 냉동시켰다. 바이알에 포함된 세포를 10분 이상동안 액체 질소내에서 유지시켰다.
동결보존된 세포를 해동시키고, 이의 생존 가능성을 FDA 및 트립판 블루 염색 절차로 측정했다. 3일동안 만니톨로 예비배양시킨 세포는 만니톨을 포함하는 배지내에서 예비배양시키지 않은 세포보다 더 높은 후-해동 이용가능성을 갖는 것으로 나타났다.
| 생존 가능성에 대한 예비배양 시간의 효과 | ||
| 예비배양 일수 | 생존(대조용) | 3% 만니톨 |
| 1 | 5-10% | 50% |
| 3 | 5-15% | 40-80% |
실시예 9
해동된 타수스 세포 생존 가능성에 대한 에틸렌 글리콜/소르비톨의 효과
타수스 종 세포주 KS1A 의 6 내지 7일간의 세포 현탁액을 3% 만니톨로 3일동안 실온에서 예비처리했다. 4℃ 에서 3시간동안 플라스크를 배양시켜 장입된 세포를 저온 순양시켰다. 저온 순양된 세포를 4㎖ 극저온 바이알에 옮기고, 저온 투화 용액을 각각에 첨가하고, 혼합했다. 4℃에서 3분동안 투화시킨 후, 세포를 액체 질소 침지로 냉동시켰다. 바이알을 적어도 10분동안 액체 질소내에 유지시켰다.
바이알을 액체 질소로부터 옮기고, 40℃ 수조에서 1∼2분동안 진탕시켜 동결보존된 세포를 해동시켰다. 후-해동 생존 가능성을 FDA 염색 분석으로 측정했다.
타수스 종 세포주 KS1A 의 세포 현탁액을 평가하는 10회의 시험을 서로 다른 농도의 에틸렌 글리콜/소르비톨로 실시했다. 결과를 하기 표 12에 제시한다. 40/30중량% 농도의 에틸렌 글리콜/소르비톨 함유 투화 용액내에서 냉동시킨 세포 현탁액은 다른 농도의 에틸렌 글리콜/소르비톨을 사용하여 투화시킨 세포에 비해서 후-해동 생존 가능성(%)이 높을 뿐 아니라, 재성장이 활발한 것으로 나타났다.
| 회수율에 대한 투화 용액의 효과 | ||
| 에틸렌 글리콜/소르비톨 | 후-해동생존 가능성 | 재성장 |
| 50%/30% | 20% | 약간 |
| 45%/35% | 25% | 약간 |
| 40%/40% | 25% | 약간 |
| 40%/30% | 60% | 활발 |
| 38%/32% | 40% | 활발 |
| 36%/34% | 35% | 적당 |
| 35%/35% | 35% | 적당 |
| 30%/40% | 40% | 약간 |
| 30%/40% | 40% | 약간 |
| 20%/50% | 25% | 없음 |
실시예 10
196℃에서의 보관후 타수스 세포 생존에 대한 동결보존제의 효과
배양된 타수스 세포를 수확하고, 3% 만니톨을 포함하는 신선한 성장 배지를 3 일동안 재현탁했다. 세포를 3 시간동안 저온 순양시키고, 투화 용액을 포함하는 극저온 바이알에 옮겼다. 세포 현탁액을 액체 질소 침지로 냉동시켰다. 극저온 바이알을 40℃의 수조에서 1∼2분동안 진탕시켜 액체 질소 냉동된 세포를 해동시켰다. 동결보존제로서 에틸렌 글리콜로 냉동시킨 세포는 생존 가능성이 가장 높았다.
| 생존 가능성에 대한 동결보존제의 효과 | ||
| 동결보존제 | 농도 | 생존 가능성 |
| DMSO | 5%-30% | ≤15% |
| 프로필렌 글리콜 | 15% | 0 |
| 글리세롤 | 20%-30% | 0 |
| PEG-8000 | 10% | 0 |
| 에틸렌 글리콜 | 20%-50% | 25%-80% |
실시예 11
투화 용액에 대한 생물량 함수로서의 타수스 세포의 생존 가능성
타수스 종 세포주 KS1A 의 6 내지 7일간의 세포 현탁액을 수확하고, 3% 만니톨을 포함하는 신선한 배지내에서 재현탁시키고, 3일동안 실온에서 배양시켰다. 4℃에서 3시간동안 저온 순양시킨 후, 배양 배지내의 40/30중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨을 포함하는 4㎖의 극저온 바이알에 세포를 옮겼다. 바이알을 4℃에서 3분동안 배양시키고, 액체 질소 침지로 냉동시켰다. 바이알을 액체 질소내에서 적어도 10분동안 유지한 후 해동시켰다.
세포 생물량/투화 용액 함량이 167㎎/㎖인 경우 가장 높은 생존 가능성(%)을 나타냈다. 또한, 세포 생물량/투화 용액 비가 143,200 및 250㎎/㎖인 경우 생존 가능성은 허용가능했다.
| 생존 가능성에 대한 세포 생물량의 효과 | |
| 세포 생물량/투화 용액 | 생존 가능성 |
| 143㎎/㎖ | 60% |
| 167㎎/㎖ | 80% |
| 200㎎/㎖ | 45% |
| 250㎎/㎖ | 45% |
| 300㎎/㎖ | ≤10% |
| 400㎎/㎖ | ≤10% |
| 500㎎/㎖ | ≤5% |
| 1,000㎎/㎖ | ≤5% |
실시예 12
타수스 세포 생존 가능성에 대한 여러가지 방법 단계의 효과
가장 높은 후-해동 생존 가능성(%)을 갖는 단계를 측정하기 위해 여러가지 방법의 단계를 평가했다. 세포를 동결보존제의 존재 및 부재하에, 삼투 예비처리의 존재 및 부재하에 및 투화의 존재 및 부재하에 동결보존시켰다.
제 1 시험에서, 6 내지 7일된 타수스 세포 배양물을 동결보존제의 존재 또는 부재하에 냉동시켰다. 제 2 시험에서, 세포를 40/30중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨 투화 용액 처리로 냉동시켰다. 제 3 시험에서, 세포를 투화시키고, 3% 만니톨 성장 배지내에서 3일동안의 배양을 포함하는 예비처리의 존재 및 부재하에 냉동시켰다. 제 4 시험에서, 저온 순양의 존재 또는 부재하에 세포를 예비처리, 투화 및 냉동시켰다.
각각의 시험에서, 해동 직후 생존 가능성 테스트를 실시했다. 3%의 만니톨을 포함하는 성장 배지내에서 3일동안 실온에서 세포를 예비배양시킨 후, 동결보존 전에 2∼4시간동안 저온 처리하여 생존 가능성(%)이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한, 3%의 만니톨을 포함하는 배지내에서 3일동안 예비 배양시키고, 이를 사전의 저온 처리 없이 3일동안 성장 배지내에서 세포 예비배양으로 동결보존시키고, 24시간동안 만니톨을 포함하는 배지내에서 예비배양시킨 후, 동결보존 이전에 2∼4시간동안 저온 처리한 세포에서 생존 가능성이 적절한 것으로 관찰됐다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 실시된 지시된 단계를 이용하여 생존 가능성 테스트에 대해 세포를 다시 테스트했다.
실시예 13
동결보존 전후의 세포 생존 가능성 및 성장
타수스 종 세포주 KS1A, KEIR, 647, 1224, 12-6, 12-14 및 12-20 을 동결보존후 세포 생존 가능성 및 재성장을 측정하여 평가했다.
각 세포주의 6 내지 7일된 세포 현탁액을 수확하고, 3% 만니톨 함유 신선한 성장 배지내에서 생물량을 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 3일동안 배양시킨 후, 장입된 세포 현탁액을 4℃에서 3시간동안 배양시켰다. 저온 순양된 세포를 40/30중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨의 저온 투화 용액을 포함하는 4㎖의 극저온 바이알에 옮겼다. 투화 용액 및 세포를 약하게 혼합하고, 바이알을 40℃에서 3분동안 배양했다. 그후, 세포 현탁액을 10분 이상동안 액체 질소 침지에 의해 냉동시켰다.
냉동후, 액체 질소로부터의 냉동된 바이알을 40℃ 수조에 1∼2분동안 옮겨 세포를 해동시켰다. 후-해동 세포 생존 가능성을 FDA 염색 분석에 의해 측정했다. 세포를 저온 무균 1M 소르비톨 배지로 5∼6회 세척하고, 배지내의 신선한 1M로 재현탁시켰다.
독성 동결보존제를 포함하지 않는 세포 현탁액을 무균 상태에서 뷰흐너 깔때기 및 왓맨 541 여과지를 사용하여 각각 별도로 여과했다. 각각의 세포 현탁액에 대해, 세포를 포함하는 여과물을 0.5M 소르비톨을 포함하는 반고형 성장 배지상에 적층시키고, 30분동안 실온에서 평형화시켰다. 세포를 포함하는 여과지를 0.1M 소르비톨을 포함하는 고형 성장 배지에 옮기고, 24시간동안 배양했다. 세포를 포함한 여과지를 소르비톨을 포함하지 않는 반고형 성장 배지에 옮기고, 실온에서 24시간 동안 배양시켰다. 세포를 포함하는 여과지를 다시 소르비톨을 포함하지 않는 신선한 반고형 성장 배지에 옮기고, 실온에서 부가의 24 시간동안 배양했다. 반고형 영양 배지상에서의 캘러스 세포 성장은 약 2∼3주에서 뚜렷했다. 그후, 액체 성장 배지내의 세포 현탁액을 캘러스로부터 개시시켰다.
하기에 제시되어 있는 표 17에서 알 수 있는 바와같이, 모든 세포 주는 허용가능한 후-해동 생존 가능성 및 회수 성장을 나타냈다.
| 생존 가능성에 대한 예비배양 조건의 효과 | |||||
| 세포주 | 예비배양조건 | 생존가능성 | 동결보존제 | 후-해동 생존 가능성 | 회수재성장 |
| KS1A | 3% 만니톨3일 | ≥95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨 40/30중량% | 40-80% | 활발 |
| KEIR | 3% 만니톨3일 | ≥95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨 40/30중량% | 30-60% | 약간 |
| 647 | 3% 만니톨3일 | ≥95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨 40/30중량% | 30-60% | 약간 |
| 1224 | 3% 만니톨3일 | ≥95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨 40/30중량% | 40-60% | 활발 |
| 12-6 | 3% 만니톨3일 | ≥95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨 40/30중량% | 40% | 활발 |
| 12-14 | 3% 만니톨3일 | ≥95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨 40/30중량% | 30% | 활발 |
| 1220 | 3% 만니톨3일 | ≥95% | 에틸렌 글리콜/소르비톨 40/30중량% | 35% | 활발 |
실시예 14
동결보존시의 타수스 세포의 성장 및 생성물 형성
타수스 세포주 KS1A 의 6 내지 7일된 세포 현탁액을 동결보존시키고, 해동시켰다. 세포를 성장 배지내의 3% 만니톨로 3일동안 예비배양시키고, 동결보존제로서 40/30중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨을 사용했다. 성장 배가 시간 및 생성물 형성을 냉동 및 해동 전후에 평가했다. 수득율은 현탁액 내에서의 5일의 성장후 모니터했다. 세포내의 핵 DNA 함량을 유동 세포계수로 모니터하고, 동결보존전에 약 22.7pg/핵 및 동결보존후에 22.9pg/핵인 것으로 나타났다. 동결보존은 생성물의 생성에 영향을 미치지 않는다.
| LN2전후의 타수스 성장 및 생성물 형성 | |||||
| 예비배양 처리 | 동결보존제 | 배가 시간 | 생성물 형성(㎎/ℓ) | ||
| 탁솔 | 바카틴 | 10-DAB | |||
| 3% 만니톨 | 에틸렌 글리콜/소르비톨(40/30중량%) | 7(5-7) | 0.2 | 1.1 | 0.4 |
| - | - | 7(5-7) | 0.2 | 1.1 | 0.4 |
실시예 15
동결보존후의 타수스 세포의 성장 및 생성물 형성
타수스 세포주를 동결보존시킨 후, 해동시키고, 후-해동 삼투 조절시켰다. 성장 및 생성물 형성을 액체 배양물내의 세포 현탁후 측정했다. 성장은 이들이 성장 배지내에서 형성된 후 수일동안 세포 현탁액의 평균 배가 시간을 반영한다. 생성물의 형성은 현탁액 내에서의 14일의 성장후 측정했다. 결과를 하기 표 19에 제시한다.
| 동결보존으로부터 회수된 세포의 탁솔 생성 | ||||
| 세포주 | 평균 배가 시간(일수) | 생성량(㎎/ℓ--14일) | ||
| 탁솔 | 바카틴 | 10-DAB | ||
| KEIR | 4 | 10.5 | 10.6 | 3.4 |
| KS1A | 5.5 | 22.6 | 7.4 | 2.3 |
| 1224 | 5.5 | 10.8 | 73 | 13 |
| SS3-184 | 7 | - | - | - |
| SS12-6 | 5.8 | 25 | 51 | 6.7 |
| SS12-19 | 6 | 9.2 | 31 | 4.7 |
| SS12-20 | 5.5 | 10 | 24 | 4.4 |
| SS12-79 | 5 | 2.4 | 9.6 | 1.9 |
| SS12-99 | 8.5 | - | - | - |
| SS12-103 | 6 | 19.3 | 68.5 | 14.3 |
| 647 | 5.5 | - | - | - |
도 5 는 타수스 종 세포주 1224로부터 20일에 세포외 분획의 크로마토그래피를 예시하는 것으로서, (A) 는 동결보존되지 않은 대조용 세포 현탁액을 나타내며, (B) 는 동결보존, 냉동, 6개월간의 저장, 해동 및 후-해동 삼투 조절후 재생된 세포 현탁액을 나타낸다. 피이크 1 은 10-데아세틸바카틴이며, 피이크 2 는 9-디히드로바카틴 III 이고, 피이크 3 은 바카틴 III이며, 피이크 4 는 9-디히드로-13-아세틸바카틴 III 이며, 피이크 5 는 탁솔이며; 피이크 6 은 2-벤조일-2-데아세틸바카틴이며, 피이크 7 은 2-벤조일-2-데아세틸-1-히드록시바카틴 I 이다.
도 6 은 타수스 종 세포주 203 으로부터 20일째의 세포외 분획의 크로마토그래피를 예시하는 것으로서, (A) 는 동결보존되지 않은 대조용 세포 현탁액을 나타내며, (B) 는 동결보존, 냉동, 3개월간의 저장, 해동 및 후-해동 삼투 조절후 재생된 세포 현탁액을 나타낸다. 피이크 1 은 10-데아세틸바카틴이며, 피이크 2 는 9-디히드로바카틴 III 이고, 피이크 3 은 바카틴 III이며, 피이크 4 는 9-디히드로-13-아세틸히드로바카틴 III 이며, 피이크 5 는 탁솔이며; 피이크 6 은 2-벤조일-2-데아세틸바카틴이다. 도 5 및 도 6 에서 알 수 있는 바와같이, 생성물 형성 프로파일은 대조용 세포 현탁액 및 재생된 세포 현탁액과 거의 동일하다.
실시예 16
동결보존 및 동결보존되지 않은 세포의 유전적 안정성
단일 타수스 치넨시스 바. 마이러 나무로부터 세포주를 얻었다. 수득된 세포주 중 하나를 배양, 1년동안 동결보존 및 해동시켰다. 원 나무로부터의 세포 및 동결보존된 세포에 유전적 분석을 실시하여 동결보존이 세포의 유전적 안정성에 영향을 미치는지에 대해 결정했다. 간략하게, 각 세포주로부터의 10㎍의 총 DNA를 제한 엔도뉴클레아제의 소화에 대해 4배로 처리하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 크기 분별화시켰다. 크기 분별화된 DNA 를 니트로셀룰로스 고형 지지체에 옮기고, 방사 표지된 핵산 탐침, 제프리 33.6 미니 위성 탐침으로 하이브리드 처리했다. 과변수 영역의 탐침은 도 7 의 레인 1∼4에서의 4개의 별도의 트리의 DNA 로부터의 여러가지 밴드 패턴이 나타났다. 반대로, 초기 분리물(레인 A), 1년동안 배양된 세포(레인 B) 및 1년동안 동결보존시킨 세포(레인 C)는 1년후 동일한 트리로부터 분리된 세포(레인 D 및 E)와 유전적으로 동일하다. 동결보존은 이러한 분석에 의해 검출되는 임의의 돌연변이를 형성하지 않았다.
실시예 17
동결보존된 타수스 세포의 안정성
동결보존의 길이가 유전적 안정성에 어떠한 영향을 미치는지를 측정하기 위해, 타수스 세포주 1224 를 1시간 내지 6개월동안 냉동시키고, 이의 유전적 안정성에 대해 분석했다. DNA 를 동결보존시킨 세포로부터 성장, 해동 및 재형성된 생존 가능한 배양물로부터 추출했다. 핵 리보좀 암호화 및 비-암호화 DNA를 포함하는 게놈의 3.1Kb 다형성 영역을 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭시키고, 엔도뉴클레아제 DpnII으로 소화시켰다. 소화된 DNA 를 겔 전기영동으로 크기별로 분류하고, 에티디움 브로마이드 염색후 가시화시켰다. 분석 결과를 도 8 에 제시한다. 원 세포주 및 동결보존되지 않은 세포주를 각각 레인 C 및 D 에서 분석했다. 무관련 나무로부터 형성된 두 개의 무관련 세포주는 여러가지 소화 패턴을 나타낸다. 반대로, 유전적 돌연 변이는 1시간(레인 E), 1일(레인 F), 1주일(레인 G), 1개월(레인 H) 또는 6개월(레인 I 및 J)에 대해 동결보존된 세포내에서 검출되지 않았다. 이러한 동결보존된 세포 및 동결보존되지 않은 세포의 밴드 유형은 모두 동일했다(레인 C 내지 J).
실시예 18
토마토 세포주의 동결보존
토마토 세포주의 성공적인 동결보존을 위해, 장입 및 투화 용액을 단계적 방식으로 점진적으로 첨가하여 삼투 충격을 감소시켰다. 장입 및 투화 용액은 30%(w/v) 글리세롤, 15%(w/v) 에틸렌 글리콜 및 15%(w/v) 디메틸설폭시드를 포함한다. 점진적으로 첨가하지 않으면 세포는 후-해동 회수 기간후 빠르게 성장하지 않는다. 후-해동 생존 가능성 및 회수 재성장의 효과를 시험하고, 그 결과를 하기 표 20에 제시한다.
| 토마토 세포주의 생존 가능성 및 회수 성장에 대한 예비배양 조건의 효과 | ||||
| 삼투제 농도 | 예비배양 기간(생존 가능성(%)) | |||
| 1일째 | 2일째 | 3일째 | 6일째 | |
| 자당 0.06M | 5(-) | 10(-) | 15(+) | 15(+) |
| 0.1M | 20(+) | 30(++) | 35(++) | 40(++) |
| 0.3M | 35(++) | 35(++) | 50(+++) | 60(+++) |
| 0.5M | 45(+++) | 60(+++) | 65(+++) | 30(++) |
| 0.8M | 50(+++) | 30(+++) | 10(-) | 10(-) |
| 소르비톨 0.06M | 10(-) | 15(+) | 20(+) | 30(+) |
| 0.1M | 15(+) | 20(++) | 40(++) | 60(+++) |
| 0.3M | 30(++) | 40(++) | 70(+++) | 50(+++) |
| 0.5M | 20(++) | 40(++) | 35(++) | 10(+) |
| 0.8M | 10(-) | 30(+++) | 20(+) | 5(-) |
| 만니톨 0.06M | 5(-) | 5(-) | 10(-) | 10(-) |
| 0.1M | 15(+) | 30(++) | 35(++) | 40(++) |
| 0.3M | 40(++) | 45(++) | 50(+++) | 20(+) |
| 0.5M | 30(++) | 40(++) | 35(++) | 15(+) |
| 0.8M | 20(+) | 35(++) | 15(+) | 5(-) |
| (-)=캘러스 회수 재성장 없음 | ||||
| (+)=캘러스 회수 재성장 약간 있음 | ||||
| (++)=캘러스 회수 재성장 적당히 있음 | ||||
| (+++)=캘러스 회수 재성장 활발함 |
세포를 3일동안 0.5M 자당 또는 0.3M 소르비톨, 65% 및 70% 각각을 포함하는 액체 영양 배지내에서 예비배양한 경우 생존 가능성(세포의 생존일수)이 가장 높았다. 이러한 예비 배양 조건은 세포 현탁액의 후-해동시 세포의 활발한 성장을 돕는다. 성공적인 동결보존은 예비배양 기간 및 삼투제의 농도에 따라 다르다. 예비배양 기간을 10일로 연장시키고, 삼투제의 농도를 0.8M 이상으로 증가시키면 세포의 생존 가능성은 증가되지 않는다. 예비배양시키지 않으면, 세포는 단일 단계로 또는 단계적 장입 및 투화 용액 첨가 방법으로 LN2온도를 견디지 못한다.
예비배양된 세포를 열 충격 처리에 4 시간 이하동안 노출시키고, 2가 양이온(CaCl2, MgCl2)을 첨가하여 생존 가능성 및 재성장 회수를 추가로 개선시켰다. 이러한 접근은 루피누스, 소포라, 코노스페르뭄, 니코티아나 및 솔라눔 종으로부터 유도된 세포주 뿐 아니라, 타수스 종, 예컨대, 타수스 치넨시스로부터 유도된 저항 세포주의 동결보존에 성공적으로 이용되어 왔다. 많은 경우에 있어서, 이러한 식물 종의 세포주 재성장은 장입 및 투화 방법의 단일 단계로 6∼10일에 비해 평판후 3∼4일에 육안으로 확인된다. 에틸렌 작용 억제제 또는 에틸렌 생합성 억제제를 포함하는 액체 배지를 사용하여 세포 생물량의 후-해동 세척은 회수된 세포주의 질을 추가로 개선시킨다. 90% 의 생존 가능율이 달성되었으며, 세포 현탁액을 이러한 세포주로부터 형성한 후에 더 빠른 성장 속도가 관찰되었다.
실시예 19
에틸렌 억제제를 사용한 후-해동 처리의 영향
극저온 바이알내의 세포 생물량을 20초∼45초 동안 40℃∼60℃로 조정된 수조내에서 급속 가온에 의해 해동시켰다. 이 단계 직후, 극저온 바이알내의 액화 세포 생물량을 1∼2mM 농도 범위의 삼투제(자당, 소르비톨 또는 만니톨) 및 2μM∼20μM 농도 범위의 에틸렌 억제제를 갖는 액체 영양 배지를 포함하는 무균 원심분리물에 옮겼다. 내용물을 약하게 혼합하고, 30분동안 실온에서 교반기(120rpm 으로 조절된 속도)상에서 배양시켰다. 이를 원심분리하고, 펠릿내의 세포를 블롯팅지(세포 또는 세포 생물량으로부터 과량의 수분을 제거하기 위해)상에 배치된 무균 여과지의 이중층으로 옮겼다. 세포 및 세포 생물량을 약 2 분동안 배양했다. 배양후, 농도가 0.8M∼0.1M 의 자당(세포의 삼투 조절을 위해)으로 감소되는 삼투제를 포함하는 고형 영양 배지로 상기 세포를 포함하는 상부 여과지를 옮겼다. 각각의 단계에서, 여과지상의 세포를 30분∼1시간동안 배양하고, 최종적으로 임의의 부가의 삼투제의 부재하에 보통의 고형 영양 배지로 옮겼다. 이 단계를 24시간동안 2회 반복했다. 암실에서 25℃에서 2∼3주동안 세포 생물량을 배양하고 1주일에 1회씩 옮겼다. 신생 세포 생물량의 성장이 증가되는 경우, 캘러스 세포를 여과지로부터 제거하고, 보통의 고형 영양 배지상에 직접 옮겼다. 충분한 성장이 발생한 후, 액체 배지내의 세포 현탁은 형성된 캘러스로부터 개시된다. 해동후 여러시간동안 세포의 생존 가능성을 관찰했으나, 가장 중요한 관찰을 기록했다. 여과지상의 세포를 임의의 부가의 삼투제의 부재하에 보통의 고형 배지에 옮겼다. 세포 성장 회수율을 25℃ 암실내의 여과지상에서의 모든 생물량을 배양한 처음 3주동안 관찰했다.
세포 또는 세포 생물량의 후-해동과 관련된 다른 방법이 유용하다. 이 절차는 에틸렌 억제제의 부재하에 1∼2M 농도 범위의 삼투제(자당, 소르비톨 또는 만니톨)을 포함하는 액체 배지로 세포를 신속하게 세척하는 것을 포함한다. 이는 2∼5분동안 삼투제를 포함하는 액체 영양 배지내에서 세포 생물량을 배양시키고, 100×g으로 1∼3분동안 원심분리했다. 이 단계를 2회 반복하여 투화 용액으로부터 독성 동결보존제를 제거한 후, 삼투제 및 에틸렌 억제제(농도 범위 2∼30μM)를 포함하는 액체 영양 배지내에서 30분동안 세포 생물량을 배양시킨다.
에틸렌 억제제는 에틸렌 생성, 대사 또는 에틸렌 작용을 방해하는 물질이다. 이들은 부가로 에틸렌 생합성 길항제 및 에틸렌 작용 길항제로서 부가로 분류될 수 있다. 에틸렌 생합성 작용제는 에틸렌의 생합성 경로를 방해하는 화합물이다. 억제된 생합성 경로와 함께 효소의 예로는 ACC 신타제, ACC 옥시다제 및 에틸렌 옥시다제이다. 에틸렌 생합성 길항제의 예로는 α-아미노이소부티르산, 아세틸살리실산, 메티옥시비닐글리신, 아미노옥시아세트산 등이 있다. 에틸렌 작용 길항제의 예로는 은 함유 화합물, 은 착물 또는 은 이온, 이산화탄소, 1-메틸시클로프로펜, 2,5-노르보르나디엔, 트랜스-시클로옥텐, 시스부텐, 디아조-시클로펜타디엔 등이 있다. 적절한 은 염의 예로는 질산은, 티오황산은, 인산은, 벤조산은, 황산은, 톨루엔설폰산의 은 염, 염화은, 산화은, 아세트산은, 펜타플루오로프로피온산은, 시안산은, 락트산의 은 염, 헥사플로오로인산은, 아질산은 및 시트르산의 삼은 염이 있다. 다양한 은 염에 의해 탁산 생합성을 증진시키는 예시적인 예는 표 1 및 2 에 제시되어 있다.
실험 조건은 1.25M 의 삼투제 및 적절한 농도의 SLTS 를 포함하는 영양 액체 배지로 구성된다. 삼투제는 자당, 소르비톨 또는 만니톨이다. 대조용 조건은 1.25M 의 삼투제는 포함하지만 SLTS 는 포함하지 않는 영양 액체 배지로 구성된다. 결과를 하기 표 21에 제시하며, 이는 캘러스 세포 성장율 및 회수율(%)을 나타낸다.
| 세포의 생존 가능성 및 회수 재성장에 대한 에틸렌 억제제-티오황산은(SLTS)을 이용한 후-해동 처리의 효과 | ||||||
| 식물 종 | 대조용 | 생존 가능성(%) 및 세포 성장 강도 | ||||
| 실험상 SLTS 의 농도(μM) | ||||||
| SLTS 없음 | 2일째 | 4일째 | 8일째 | 10일째 | 20일째 | |
| 타수스 종 | 35(+) | 40(+) | 50(++) | 80(+++) | 60(+++) | 30(+) |
| 리코페르시쿰 종 | 40(+) | 45(++) | 60(++) | 90(+++) | 80(+++) | 40(+) |
| (+)=2주동안의 가시적인 세포 성장을 포함한 적당한 회수 재성장 | ||||||
| (++)=6∼10일동안의 가시적인 세포 성장을 포함한 활발한 회수 재성장 | ||||||
| (+++)=3∼4일동안의 가시적인 세포 성장을 포함한 활발한 회수 재성장 |
에틸렌 억제제를 포함하는 액체 배지를 이용한 세포의 후-해동 처리는 회수된 세포주의 생존 가능성 및 성장율을 일관되게 개선시켰다. 4μM∼10μM 농도 범위의 티오황산은이 회수된 세포주의 성장을 증진시키기 위한 2μM 및 20μM 보다 더 효과적이다. 사용된 세포주에 따라서, 생존 가능성은 90% 에 달했다. 8μM 및 10μM 의 SLTS 를 포함하는 후-해동 액체 배지는 훨씬 더 활발하게 세포 성장을 촉진하였으며, 세포 성장은 삼투제 및 에틸렌 억제제를 포함하지 않는 영양 배지상에서의 세포를 평판시킨 후 3∼4일 후에 육안으로 확인된다.
본 발명의 기타 실시태양 및 용도는 본 명세서에 개시된 본 발명의 명세서 및 실시를 참고로 하여 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에서 인용된 미국 특허는 참고로 인용한다. 명세서 및 실시예는 예시용으로 간주하며, 본 발명의 범위 및 범주는 특허 청구의 범위에 기재되어 있다.
Claims (92)
- a) 동결보존제 및 안정화제로 식물 세포를 예비처리하는 단계,b) 상기 예비처리된 식물 세포를 감온으로 순양시키는 단계,c) 상기 식물 세포에 장입제를 장입하는 단계,d) 상기 식물 세포를 투화 용액으로 투화시키는 단계, 및e) 상기 투화된 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉각시키는 단계를 포함하는, 식물 세포를 동결보존시키는 방법.
- a) 동결보존제 및 안정화제로 식물 세포를 예비처리하는 단계,b) 상기 식물 세포를 투화시키는 단계, 및c) 상기 투화된 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉각시키는 단계를 포함하는, 식물 세포를 동결보존시키는 방법.
- a) 식물 세포를 동결건조시키는 단계,b) 상기 동결건조된 식물 세포를 투화 용액내에서 투화시키는 단계, 및c) 상기 투화된 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉각시키는 단계를 포함하는, 식물 세포를 동결보존시키는 방법.
- a) 삼투제 및 에틸렌 억제제로 식물 세포를 예비처리하는 단계,b) 상기 식물 세포에 동결보존제를 장입하는 단계,c) 상기 식물 세포를 동결보존 용액으로 투화시키는 단계, 및d) 상기 투화된 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉각시키는 단계를 포함하는, 식물 세포를 동결보존시키는 방법.
- a) 삼투제 및 약 5mM 이상의 2가 양이온으로 식물 세포를 예비처리하는 단계,b) 상기 식물 세포에 동결보존제를 장입하는 단계,c) 상기 식물 세포에 동결보존 용액으로 투화시키는 단계,d) 상기 투화된 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉각시키는 단계를 포함하는, 식물 세포를 동결보존시키는 방법.
- a) 열 충격으로 식물 세포를 예비처리하는 단계,b) 상기 순양된 식물 세포를 투화 용액으로 투화시키는 단계, 및c) 상기 배양된 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉각시키는 단계를 포함하는, 식물 세포를 동결보존시키는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포가 겉씨 식물 또는 속씨 식물인 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 겉씨 식물은 아비에스, 시프레수스, 징코, 쥬니페루스, 피세아, 피누스, 슈도추가, 세쿠오이아, 타수스, 추가 또는 자미아 종인 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 타수스 종은 티. 바카타, 티. 브레비폴리아, 티. 카나덴시스, 티. 치넨시스, 티. 쿠스피다타, 티. 플로리다나, 티. 글로보사, 티. 메디아, 티. 누시페라 또는 티. 월리키아나인 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 속씨 식물은 외떡잎 식물 세포 또는 쌍떡잎 식물 세포인 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 외떡잎 식물 세포는 속 아베나, 코코스, 디오스코레아, 호르데움, 무사, 오리자, 사카룸, 소르굼, 트리티쿰 및 제아의 종으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 쌍떡잎 식물 세포는 속 아키로클린, 아트로파, 브라시카, 베르베리스, 캅시쿰, 카타란투스, 코노스페르뭄, 다투라, 다우쿠스, 디지탈리스, 에키나세아, 에쉬콜리치아, 글리신, 고시피움, 히오스키아무스, 리코페르시쿰, 말루스, 메디카고, 니코티아나, 파낙스, 피숨, 라우볼피아, 루타, 솔라눔 및 트리코산테스의 종으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포는 신생 성장 침엽, 수피, 잎, 줄기, 뿌리, 근경, 캘러스 세포, 원형질체, 세포 현탁액, 분열 조직, 종자 또는 배로부터 수득되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 예비처리는 상기 식물 세포를 상기 장입제제 및 상기 안정화제를 포함하는 배지내에서 약 1시간 내지 약 7 일동안 약 실온에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 장입제는 당, 아미노산 또는 이의 조합물인 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 당은 과당, 포도당, 맥아당, 만니톨, 소르비톨, 자당, 트레할로즈 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택되는 하나이상의 당을 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 장입제는 약 0.05M∼약 0.8M 또는 약 1중량%∼약 10중량% 농도의 수용액으로서 사용되는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 안정화제는 산화방지제, 산소 라디칼 스캐빈저, 2가 양이온, 에틸렌 억제제 또는 이의 조합물인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기안정화제는 환원 글루타티온, 테트라메틸우레아, 테트라메틸티오우레아, 디메틸포름아미드, 머캅토프로피오닐 글리신, 머캅토에틸아민, 셀레노메티오닌, 티오우레아, 디머캅토프로판올, 아스코르브산, 시스테인, 나트륨 디에틸디티오카르보네이트, 티오황산나트륨, 티오황산은, 프로필갈레이트, 스퍼민, 스퍼미딘 및 이의 조합물 및 유도체로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 안정화제는 약 1μM∼약 1mM 농도의 수용액으로서 사용되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 감압은 약 1℃∼약 15℃ 인 방법.
- 제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 장입은 약 0.5중량%∼약 10중량%의 투화제를 포함하는 투화 용액내에서 상기 식물 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
- 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존제는 DMSO, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 부탄디올, 포름아미드, 프로판디올, 소르비톨, 만니톨 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존제 또는 투화 용액은 DMSO, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 부탄디올, 포름아미드, 프로판디올, 소르비톨, 만니톨 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 물질을 포함하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존제 또는 투화 용액은 약 20중량%∼약 60중량%의 동결보존제를 포함하는 방법.
- 제 1 항, 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존제 또는 투화 용액을 상기 식물 세포에 첨가하여 약 250㎎/㎖ 이하 용액 비의 생물량을 얻는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 장입제 및 투화제가 동일한 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 삼투제 및 동결보존제가 동일한 방법.
- 제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장입 및 투화를 거의 동시에 실시하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장입 또는 투화를 단일 단계 또는 다 단계 절차로 실시하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 동결건조 단계가 식물 세포에서 약 40중량%∼약 60중량%의 수분을 제거하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 동결건조 및 투화 단계가 식물 세포에서 약 75중량%∼약 95중량%의 수분을 제거하는 방법.
- 제 2 항 내지 제 4 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포에 장입제를 장입시킨 후 투화시키는 방법,
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포를 약 0℃∼약 4℃의 온도에서, DMSO, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 소르비톨, 만니톨 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 투화제를 포함하는 투화 용액으로 배양시켜 식물 세포를 투화시키는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 냉동이 액체 질소로 급냉시키는 것을 포함하는 방법.
- 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포를 동결보존제를 포함하는 배지내에서 배양시킨 후 냉동시키는 단계를 부가로 포함하는 방법.
- 제 36 항에 있어서, 상기 동결보존제는 과당, 포도당, 맥아당, 만니톨, 소르비톨, 자당, 트레할로즈 및 이의 혼합물 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 36 항에 있어서, 상기 배지는 안정화제를 부가로 포함하는 방법.
- 제 38 항에 있어서, 상기 안정화제는 산화방지제, 산소 라디칼 스캐빈저, 에틸렌 억제제, 2가 양이온 또는 이의 조합물인 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 온도는 약 -70℃ 미만인 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존된 세포를 상기 동결보존 온도에서 1개월 이상이 기간동안 저장하는 단계를 부가로 포함하는 방법.
- 제 40 항에 있어서, 상기 기간은 1년 이상인 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 동결보존된 생존 가능한 식물 세포.
- 제 42 항에 있어서, 상기 세포는 동결보존에 의해 유전자적으로 또는 표현형적으로 크게 변형되지 않은 생존 가능한 식물 세포.
- 제 42 항에 있어서, 타수스 종의 것인 생존 가능한 식물 세포.
- 제 45 항에 있어서, 상기 타수스 세포가 디테르페노이드를 형질발현시킨 생존 가능한 식물 세포.
- 제 46 항에 있어서, 상기 디테르페노이드가 탁솔인 생존 가능한 식물 세포.
- 제 46 항에 있어서, 상기 디테르페노이드의 형질발현은 동결보존에 의해 크게 변형되지 않는 생존 가능한 식물 세포.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 의한 방법에 의해 동결보존된 생존 가능한 식물 세포의 배아 세포 뱅크.
- a) 식물 세포를 투화제 및 안정화제를 포함하는 배지내에서 감온하에 제 1 기간동안 배양하는 단계;b) 식물 세포를 증가된 농도의 투화제를 포함하는 배지내에서 제 2 기간동안 배양하는 단계; 및c) 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉동시키는 것을 포함하는, 식물 세포를 동결보존시키는 방법.
- 제 50 항에 있어서, 상기 제 1 시간이 약 1시간∼약 7 일인 방법.
- 제 50 항에 있어서, 상기 제 2 시간이 약 30분∼약 2 시간인 방법.
- 제 50 항에 있어서, 상기 투화제의 증가된 농도는 약 20중량%∼약 60중량%인 방법.
- 제 50 항의 방법에 의해 동결보존된 생존 가능한 식물 세포.
- a) 식물 세포를 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 50 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 동결보존시키는 단계;b) 상기 동결보존된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도에서 해동시키는 단계;c) 상기 해동된 식물 세포를 동결보존제 및 안정화제를 포함하는 성장 배지내에서 배양시키는 단계;d) 상기 동결보존제를 제거하는 단계; 및e) 생존 가능한 식물 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 동결보존된 식물 세포를 회수하는 방법.
- a) 동결보존된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도에서 해동시키는 단계;b) 에틸렌 억제제를 포함하는 성장 배지내에서 상기 해동된 식물 세포를 배양시키는 단계; 및c) 생존 가능한 식물 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 동결보존된 식물 세포를 회수하는 방법.
- a) 동결보존된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도에서 해동시키는 단계;b) 동결보존제 및 안정화제를 포함하는 성장 배지내에서 상기 해동된 식물 세포를 배양시키는 단계;c) 동결보존제를 제거하는 단계; 및d) 생존 가능한 식물 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 동결보존된 식물 세포를 회수하는 방법,
- a) 동결보존된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도에서 해동시키는 단계;b) 2가 양이온을 포함하는 성장 배지내에서 상기 해동된 식물 세포를 배양시키는 단계; 및c) 생존 가능한 식물 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 동결보존된 식물 세포를 회수하는 방법.
- a) 동결보존된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도에서 해동시키는 단계;b) 현탁액내에서 상기 해동된 식물 세포를 배양시키는 단계; 및c) 생존 가능한 식물 세포를 회수하는 단계를 포함하는 현탁액내에서 동결보존된 식물 세포를 회수하는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존된 식물 세포는 약 실온에서 해동되는 방법.
- 제 55 항 또는 제 57 항에 있어서, 상기 동결보존제는 당, 아미노산 또는 이의 혼합물인 방법.
- 제 55 항 또는 제 57 항에 있어서, 상기 동결보존제는 소르비톨, 만니톨, 자당, 트레할로즈, 프롤린 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 57 항에 있어서, 상기 안정화제는 산화방지제, 산소 라디칼 스캐빈저, 에틸렌 억제제, 2가 양이온, 또는 이의 조합물인 방법.
- 제 57 항에 있어서, 상기 안정화제는 환원 글루타티온, 테트라메틸우레아, 테트라메틸티오우레아, 디메틸포름아미드, 머캅토프로피오닐 글리신, 머캅토에틸아민, 셀레노메티오닌, 티오우레아, 디머캅토프로판올, 티오황산나트륨, 티오황산은, 아스코르브산, 시스테인, 나트륨 디에틸디티오카르보네이트, 스퍼민, 스퍼미딘, 프로필갈레이트 및 이의 조합물 및 유도체로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 및 회수는 액체 배지내에서 실시하는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존제를 상기 액체 배지의 단계적 또는 연속 희석에 의해 제거하는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양을 반고형 배지상에서 실시하는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제거 단계는 감소되는 농도의 상기 동결보존제를 포함하는 성장 배지를 사용하여 삼투 조절된 세포를 다단계 세척하는 것을 포함하는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 회수된 생존 가능한 식물 세포는 디테르페노이드를 형질발현시키고, 디테르페노이드 형질발현은 동결보존에 의해 크게 변형되지 않는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50% 이상의 회수된 식물 세포가 생존 가능한 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 70% 이상의 회수된 식물 세포가 생존 가능한 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 80% 이상의 회수된 식물 세포가 생존 가능한 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 해동된 식물 세포는 약 0℃∼약 10℃의 성장 배지 내에서 배양되는 방법.
- 제 73 항에 있어서, 상기 성장 배지는 동결보존제를 포함하는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존제는 일정시간후에 제거되며, 식물 세포의 배양은 배양 배지 및 현탁액내에서 지속되는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성장 배지는 안정화제를 포함하는 방법.
- 제 76 항에 있어서, 상기 안정화제는 산화방지제, 산소 라디칼 스캐빈저, 에틸렌 억제제, 2가 양이온 또는 이의 혼합물인 방법.
- 제 77 항에 있어서, 상기 에틸렌 억제제는 에틸렌 생합성 억제제 또는 에틸렌 작용 억제제인 방법.
- 제 78 항에 있어서, 상기 에틸렌 작용 억제제는 은 염인 방법.
- 제 79 항에 있어서, 상기 은 염은 티오황산은, 질산은, 염화은, 아세트산은, 인산은, 황산은, 아질산은 및 이의 조합물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 78 항에 있어서, 상기 에틸렌 생합성 억제제는 스퍼미딘, 스퍼민, 카테콜, n-프로필 갈레이트, 히드로퀴논, 페룰산, 알라, 페닐에틸아민, 실시실 알콜, 인도메타신 및 이의 조합물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 79 항에 있어서, 상기 2가 양이온은 칼슘, 마그네슘 또는 망간인 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포는 반고형 배지로 전달되는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 및 회수는 액체 배지내에서 실시하는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 반고형 배지상에서 실시하는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 회수된 생존 가능한 식물 세포는 활발하게 재성장되는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장입 또는 투화는 단일 단계 또는 다 단계 절차로 실시하는 방법.
- 제 87 항에 있어서, 상기 다단계는 동결보존제를 식물 세포에 1분의 간격으로 5회 첨가하는 것을 포함하는 방법.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 회수된 생존 가능한 식물 세포.
- 제 89 항의 생존 가능한 식물 세포로부터 증식된 식물.
- 제 90 항에 있어서, 타수스 종인 식물.
- 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 회수된 생존 가능한 식물 세포의 현탁액.
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