WO2016063806A1 - 細胞又は組織の凍結保存用治具および凍結保存方法 - Google Patents

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cell
tissue
jig
cells
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篤史 松澤
須崎　活光
徳永　幸雄
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三菱製紙株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation jig used when cryopreserving cells or tissues, and a cryopreservation method using the same.
  • Exceptional storage technology for cells or tissues is required in various industrial fields.
  • the embryo is cryopreserved, and the embryo is thawed and transferred in accordance with the estrous cycle of the recipient cow.
  • human infertility treatment after collecting an egg or ovary from a mother body, it is stored frozen in order to match the timing suitable for transplantation, and thawed at the time of transplantation.
  • a slow freezing method As a method for preserving cells or tissues, for example, a slow freezing method is known.
  • cells or tissues are first immersed in a preservation solution obtained by adding a freezing-resistant agent to a physiological solution such as phosphate buffered saline.
  • a freezing-resistant agent such as phosphate buffered saline.
  • compounds such as glycerol and ethylene glycol are used.
  • the cells or tissues are cooled to -30 to -35 ° C. at a relatively slow cooling rate (for example, 0.3 to 0.5 ° C./min), thereby allowing intracellular or extracellular or tissue
  • a relatively slow cooling rate for example, 0.3 to 0.5 ° C./min
  • the vitrified cell or tissue can be stored semipermanently by storing it in liquid nitrogen.
  • the slow freezing method since it is necessary to cool at a relatively slow cooling rate, the operation for cryopreservation takes time. In addition, there is a problem of requiring a device or jig for temperature control. In addition, in the slow freezing method, since ice crystals are formed in the preservation solution outside the cells or tissues, the cells or tissues may be physically damaged by the ice crystals.
  • a vitrification preservation method has been proposed as a method for solving the problems in the slow freezing method.
  • the vitrification preservation method is based on the principle that ice crystals are difficult to form even below freezing point due to the freezing point depression of an aqueous solution containing a large amount of antifreezing agents such as glycerol, ethylene glycol, and DMSO (dimethyl sulfoxide).
  • antifreezing agents such as glycerol, ethylene glycol, and DMSO (dimethyl sulfoxide).
  • vitrification method As a specific operation of the vitrification method, cells or tissues are immersed in a vitrification solution, and then cooled at a liquid nitrogen temperature ( ⁇ 196 ° C.). Since the vitrification method is such a simple and rapid process, it does not require a long time for the operation for cryopreservation, and also has the advantage of not requiring a device or jig for temperature control. is there.
  • vitrification preservation method When vitrification preservation method is used, ice crystals do not form inside or outside the cell, so physical damage (freezing damage) to cells during freezing and thawing can be avoided, but it is included in the vitrification solution. High concentrations of antifreeze are chemically toxic. For this reason, when the cells or tissues are cryopreserved, it is preferable that there is less vitrification solution around the cells or tissues, and the time for which the cells are exposed to the vitrification solution, that is, the time until freezing is short. preferable. Furthermore, it is necessary to dilute the vitrification solution immediately after thawing.
  • Patent Document 1 shows that application of the vitrification method to animal or human germ cells or somatic cells is extremely useful in terms of cryopreservation and survival after thawing.
  • the vitrification preservation method is a technique that has been developed mainly using human germ cells, but recently, its application to iPS cells and ES cells has been widely studied.
  • Non-Patent Document 1 shows that the vitrification preservation method was effective in preserving Drosophila embryos.
  • Patent Document 2 shows that the vitrification preservation method is effective in preservation of plant cultured cells and tissues.
  • the vitrification method is widely known to be useful for preserving various types of cells and tissues.
  • the so-called cryotop method used in the field of human infertility treatment is a method for cryopreserving eggs using a strip-like flexible, colorless and transparent film as a strip for holding eggs attached.
  • a method for cryopreserving eggs using a strip-like flexible, colorless and transparent film as a strip for holding eggs attached There has been proposed a method in which an egg or embryo is placed on the film together with a very small amount of vitrification solution under a microscope, and cryopreserved using a tool.
  • Patent Document 5 an ovum or embryo is placed on a vitrification preservative removal material together with a vitrification solution, and an extra vitrification solution adhering to the periphery of the ovum or embryo is removed by sucking from the lower part.
  • a method of cryopreserving the survival rate has been proposed.
  • a vitrification preservation liquid removal material what has a through-hole by the film-like thing which consists of natural products and synthetic resins, such as a wire net and paper, is described.
  • a cryopreservation jig that can remove excess vitrification liquid and improve workability when placing cells, for example, vitrification having a vitrification liquid absorber having a specific haze value A cryopreservation jig is described in Patent Document 6.
  • Patent Document 7 relates to a cell storage container used when storing cells together with a culture medium.
  • the container has an inner surface made of a material that is difficult to adhere to cells, specifically, the inner surface of the container is hydrophilic. It is described that a cell to which a material or a hydrophobic material or the like is bonded or coated can prevent adhesion of cells to the wall surface of the container during storage.
  • hydrophilic materials include acrylamide polymers and polyvinyl alcohol.
  • the material include a fluororesin and a silicone resin.
  • Patent Document 3 and Patent Document 4 propose a method for obtaining an excellent survival rate by cryopreserving an egg or embryo together with a small amount of vitrification solution by limiting the width of a film on which the egg or embryo is placed. ing.
  • this method has a problem that the degree of difficulty in operation is high when an egg or embryo is placed on a film together with a very small amount of vitrification solution by the operator's operation.
  • the cryotop method in order to cryopreserve an egg or embryo with a smaller amount of vitrification solution, once the egg or embryo is placed on a film together with the vitrification solution, an extra amount is added. A complicated operation of sucking the vitrification solution and removing it from the film may be performed.
  • the ovum or embryo is thawed after freezing, the ovum or embryo on the film is often fixed on the film, and there is also a problem that a high skill is required to collect these.
  • Patent Document 5 proposes a method of cryopreserving these germ cells with an excellent survival rate by removing excess vitrification solution adhering to the periphery of the ovum or embryo.
  • the method described in the above publication requires a suction operation from the bottom when removing the excess vitrification solution, which is a complicated operation and is not suitable for a vitrification cryopreservation operation in a short time. is there.
  • the suction from the lower part is insufficient, there is a problem that excess vitrification liquid remains.
  • Patent Document 3 and Patent Document 4 when thawing after freezing, the egg or embryo is fixed on the film, and there is a problem that a high skill is required for recovery.
  • the main object of the present invention is to provide a cell or tissue cryopreservation jig capable of easily and reliably performing a cell or tissue cryopreservation operation. More specifically, the cells or tissues are immersed in a preservation solution such as a vitrification solution, and the cells or tissues are placed on the cryopreservation jig together with the preservation solution and cryopreserved, and then the cells or tissues are thawed.
  • a first object to provide a cryopreservation jig that can easily peel and collect cells or tissues.
  • Another object is to provide a cryopreservation jig having excellent absorbability of a storage solution such as a vitrification solution in addition to the ability to easily collect the cells or tissues described above. It is another object of the present invention to provide a cryopreservation method that can easily detach and collect cells or tissues after cryopreservation.
  • cell or tissue cryopreservation jig having the following configuration (in this specification, “cell or tissue cryopreservation jig” It was found that the above-mentioned problem can be solved simply by “a jig for cryopreservation”).
  • a jig for cryopreservation of a cell or tissue comprising a layer containing a water-soluble polymer compound on the outermost surface of the placement portion on which the cell or tissue is placed.
  • the water-soluble polymer compound is at least one selected from polyvinyl alcohol having an ethanediol group and polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group.
  • Jig for cryopreservation of tissue is polyvinyl alcohol having a saponification degree of 94 mol% or less.
  • a cell or tissue immersed in a preservation solution is placed together with a preservation solution on the placement part of the cell or tissue cryopreservation jig according to any one of (1) to (5) above, Alternatively, a cell or tissue cryopreservation method comprising freezing a cell or tissue by immersing a cryopreservation jig in liquid nitrogen while the tissue is held on a mounting portion.
  • a cell or tissue cryopreservation method comprising freezing a cell or tissue by immersing a cryopreservation jig in liquid nitrogen while the tissue is held on a mounting portion.
  • the preservation solution is a vitrification solution containing 10% by mass or more of a freezing-resistant agent with respect to the total mass of the preservation solution. .
  • a cryopreservation jig capable of easily recovering the cell or tissue when thawing the frozen cell or tissue is provided. Can do.
  • an extra preservation solution attached to the outer periphery of the cell or tissue is preserved.
  • the liquid absorber absorbs, other operations for removing the extra storage solution (for example, suction removal operation from the lower part of the storage solution absorber, direct operation from the periphery of cells or tissues using a micropipette, etc. It is possible to provide a cell or tissue cryopreservation jig capable of easily and simply performing a cryopreservation operation of cells or tissues without particularly requiring a suction and removal operation. According to the inventions of the above (6) and (7), it is possible to provide a cryopreservation method that can easily detach and collect cells or tissues after cryopreservation.
  • FIG. 1 is an overall view showing an example of a jig for cryopreservation of cells or tissues of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional structure diagram of an example of the placement portion in FIG.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional structure diagram illustrating an example of the case where the placement unit illustrated in FIG. 1 includes a storage liquid absorber.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional structure diagram illustrating another example in the case where the placement unit illustrated in FIG. 1 includes a storage liquid absorber.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional structure diagram illustrating another example in the case where the placement unit illustrated in FIG. 1 includes a storage liquid absorber.
  • FIG. 6 is an example of a schematic cross-sectional structure when the surface layer of the mounting portion contains inorganic fine particles.
  • FIG. 7 is another example of a schematic cross-sectional structure when the surface layer of the mounting portion contains inorganic fine particles.
  • FIG. 8 is a schematic cross-sectional structure diagram showing an example of a case where the mounting portion has a storage liquid absorber and the surface layer contains inorganic fine particles.
  • FIG. 9 is a schematic cross-sectional structure diagram showing another example in the case where the mounting portion has a storage liquid absorber and the surface layer contains inorganic fine particles.
  • FIG. 10 is a scanning electron microscope observation image of the surface of the mounting portion of the cryopreservation jig of Example 24.
  • the jig for cryopreservation of the present invention is used when cryopreserving cells or tissues.
  • the cell includes not only a single cell but also a cell population of an organism composed of a plurality of cells.
  • the cell population composed of a plurality of cells may be a cell population composed of a single type of cell or a cell population composed of a plurality of types of cells.
  • the tissue may be a tissue composed of a single type of cell or a tissue composed of a plurality of types of cells, and includes non-cellular substances such as an extracellular matrix in addition to cells. Things can be used.
  • the cryopreservation jig of the present invention is used for a cryopreservation operation, and is preferably used for a vitrification cryopreservation operation. Therefore, the cryopreservation jig of the present invention is preferably used as a vitrification cryopreservation jig for cells or tissues. Specifically, the cryopreservation jig of the present invention is for immersing a cryopreservation jig on which cells or tissues are placed in a cooling solvent such as liquid nitrogen to freeze it.
  • the cells or tissues placed on the cryopreservation jig are thawed, the cells or tissues are taken out of the cooling medium together with the cryopreservation jig and immersed in a melting solution to be thawed.
  • the cryopreservation operation is performed using the jig for cryopreservation of the present invention, cells or tissues are usually placed on a layer containing a water-soluble polymer compound in a placement portion together with a preservation solution.
  • the jig for cryopreservation according to the present invention is used, the cell or tissue can be securely held when placed, and the cell or tissue can be easily recovered at the time of thawing. Can be easily and reliably performed.
  • the jig for cryopreservation of the present invention can be restated as a cell or tissue cryopreservation tool, a cell or tissue preservation tool, a cell or tissue cryopreservation instrument, or a cell or tissue preservation instrument.
  • the cryopreservation jig of the present invention has a layer containing a water-soluble polymer compound (hereinafter also referred to as a surface layer or simply a surface layer in the present invention) on the outermost surface of a placement part for placing cells or tissues.
  • a surface layer is preferably soluble in the melt.
  • soluble means that the solubility of the surface layer in the melt at 25 ° C. is 0.2% by mass or more.
  • the cryopreservation jig of the present invention is placed on a layer containing a water-soluble polymer compound of a cryopreservation jig together with a preservation solution during a freezing operation, and then a refrigerant (for example, a liquid Nitrogen), frozen, and when thawed, the frozen cells or tissues are taken out together with a cryopreservation jig and immersed in the melt to be melted, but when cells or tissues are thawed, they are soluble in water. All or part of the layer containing the polymer compound dissolves in the melt, allowing cells or tissues to be easily detached and recovered without sticking to the placement of the cryopreservation jig. It becomes.
  • a refrigerant for example, a liquid Nitrogen
  • the mounting portion has a preservation solution absorber, and it is preferable that the preservation solution absorber has a layer (surface layer) containing the water-soluble polymer compound on the preservation solution absorber.
  • the preservation solution absorber has a layer (surface layer) containing the water-soluble polymer compound on the preservation solution absorber.
  • the mounting portion has the preservation solution absorber. Since the vitrification solution around the placed cell or tissue becomes extremely small, the survival rate of the cell or tissue can be expected.
  • the mounting portion has the storage liquid absorber, it is preferable that no other layer be provided between the storage liquid absorber and the surface layer.
  • cryopreservation jig The configuration of the cryopreservation jig according to the present invention will be described below.
  • the cryopreservation jig of the present invention has a layer containing a water-soluble polymer compound on the outermost surface of a placement part for placing cells or tissues.
  • the outermost surface of the placement portion on which the cells or tissues are placed corresponds to the surface portion on which the cells or tissues are placed together with the preservation solution.
  • the mounting portion preferably has the surface layer in the present invention on a non-absorbent support such as various resin films, metals, glass, rubber, etc., or on a storage liquid absorber, and in particular, the storage liquid absorber. It is preferable to have the surface layer in this invention on it.
  • the surface layer does not need to form a uniform layer in the entire placement portion on which cells or tissues are placed, and may be, for example, a sea island shape or a stripe shape layer. That is, it is important that the surface layer in the present invention is present on the outermost surface of the place where the cell or tissue is placed together with the preservation solution, and the surface layer is present in a place where the cell or tissue is not placed. However, it does not have to exist.
  • the mounting portion may have the surface layer on the entire outermost surface or on a part of the outermost surface.
  • water-soluble polymer compound contained in the surface layer in the present invention examples include cellulose derivatives such as hydroxyethyl cellulose and carboxymethyl cellulose, starch and derivatives thereof, gelatin, casein, alginic acid and salts thereof, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, styrene Examples thereof include maleic acid copolymer salts and styrene / acrylic acid copolymer salts.
  • alginic acid and its salts and gelatin are preferable because they are soluble in a preservation solution and have an appropriate film forming action
  • polyvinyl alcohol is a non-biological material and has low toxicity to cells or tissues. Therefore, it is particularly preferable.
  • water-soluble polymer compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • the surface layer can contain a crosslinking agent as long as the solubility in the melt is not less than 10% by mass.
  • the water solubility of the water-soluble polymer compound of the present invention means that the amount dissolved in water at 25 ° C. is at least 0.5% by mass, more preferably 5% by mass or more.
  • the solid content of the water-soluble polymer compound contained in the surface layer is preferably 0.01 to 100 g / m 2 , more preferably 0.1 to 10 g / m 2 .
  • the solid content of the water-soluble polymer compound exceeds 100 g / m 2 , the elution / mixing of the water-soluble polymer compound in the melt increases, which is not preferable.
  • the solid content of the water-soluble polymer compound is less than 0.01 g / m 2 , the cells or tissues may not be easily detached when melted.
  • the surface layer preferably contains at least one selected from polyvinyl alcohol having an ethanediol group and polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group as a water-soluble polymer compound.
  • Polyvinyl alcohol having an ethanediol group and polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group have excellent hydrophilicity, moderate strength, and moderate solubility of the film, and the cell or tissue is placed on the mounting portion during the melting operation. In particular, it can be easily peeled off and collected without sticking to.
  • the polyvinyl alcohol having an ethanediol group and the polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group the polyvinyl alcohol having various saponification degrees can be used.
  • these polyvinyl alcohols can be used.
  • the saponification degree is preferably 94 mol% or less.
  • these polyvinyl alcohols may be used alone or in combination of two or more.
  • a product commercially available from Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. can be obtained and used.
  • the surface layer contains at least one kind of polyvinyl alcohol selected from polyvinyl alcohol having an ethanediol group and polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group
  • the surface layer contains one or two other water-soluble polymer compounds. More than one kind can be contained.
  • the water-soluble polymer compound include cellulose derivatives such as hydroxyethyl cellulose and carboxymethyl cellulose, starch and derivatives thereof, gelatin, casein, alginic acid and salts thereof, polyvinyl alcohol having no ethanediol group and ethylene oxide group, polyvinyl Examples include pyrrolidone, styrene / maleic acid copolymer salt, and styrene / acrylic acid copolymer salt.
  • the content of the other water-soluble polymer compound is 50% by mass or less based on the solid content of at least one polyvinyl alcohol selected from polyvinyl alcohol having an ethanediol group and polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group. It is preferable.
  • the surface layer preferably contains polyvinyl alcohol having a saponification degree of 94 mol% or less as a water-soluble polymer compound.
  • a polyvinyl alcohol film having a saponification degree of 94 mol% or less as a surface layer, excellent cell or tissue detachability can be obtained, so that the cell or tissue adheres to the mounting portion during the melting operation. It becomes possible to collect easily.
  • polyvinyl alcohol having a saponification degree of 81 mol% or less or by selecting polyvinyl alcohol having a saponification degree of 94 mol% or less and a polymerization degree of 400 or less, the detachment property of cells or tissues. In particular, an excellent cryopreservation jig can be obtained.
  • These polyvinyl alcohols may be used alone or in combination of two or more.
  • the surface layer can contain one or more other water-soluble polymer compounds.
  • the water-soluble polymer compound include cellulose derivatives such as hydroxyethyl cellulose and carboxymethyl cellulose, starch and derivatives thereof, gelatin, casein, alginic acid and salts thereof, polyvinyl alcohol having a saponification degree exceeding 94 mol%, polyvinyl pyrrolidone, and styrene. -Maleic acid copolymer salt, styrene / acrylic acid copolymer salt and the like.
  • the content of the other water-soluble polymer compound is preferably 50% by mass or less based on the solid content of polyvinyl alcohol having a saponification degree of 94 mol% or less.
  • the surface layer preferably further contains inorganic fine particles in addition to the water-soluble polymer compound described above.
  • Inorganic fine particles do not reduce the hydrophilicity of the surface layer, and it is possible to reduce the contact area between the placement part and the cell or tissue by forming fine irregularities on the surface layer. It is possible to peel and collect more easily without being fixed to the mounting portion of the jig.
  • Examples of such inorganic fine particles include light calcium carbonate, heavy calcium carbonate, magnesium carbonate, kaolin, titanium dioxide, zinc oxide, zinc hydroxide, calcium silicate, magnesium silicate, amorphous synthetic silica, alumina, alumina hydrate, Examples thereof include magnesium hydroxide.
  • the average particle size of such inorganic fine particles is 1 ⁇ m or less. Is more preferable, and 600 nm or less is more preferable.
  • the lower limit of the average particle size of the inorganic fine particles is not particularly limited, but is preferably 6 nm or more.
  • the average particle diameter is, for example, the number median using a laser scattering type particle size distribution meter (for example, LA910, manufactured by Horiba, Ltd.) if the fine particles are inorganic fine particles formed by aggregation of primary particles. It can be obtained as a diameter.
  • the average particle size of 100 particles existing within a certain area can be determined from an electron micrograph of the dispersed particles until the primary particle size can be determined.
  • the primary particles do not aggregate with each other, and the inorganic fine particles that do not form secondary particles (hereinafter referred to as single particle-dispersible inorganic fine particles) have a relatively small contact area with cells or tissues in the mounting portion. To preferred.
  • colloidal silica is preferable.
  • Colloidal silica is commercially available from, for example, Nissan Chemical Industries, Ltd. as Snowtex (registered trademark). Further, colloidal silica in which polyvinylpyrrolidone is coated on the particle surface, such as Percoll (trade name) commercially available from GE Healthcare Japan, Inc., can also be preferably used.
  • the water-soluble polymer compound is formed on the outermost surface of the mounting portion without clogging the pores of the storage liquid absorber with inorganic fine particles.
  • a layer containing inorganic fine particles is preferably provided.
  • the particle diameter of the inorganic fine particles can be made larger than the pore diameter of the preservation solution absorber, and if the absorbability of the preservation solution absorber is not significantly reduced, the inside of the pores of the preservation solution absorber.
  • inorganic fine particles may be present.
  • the solid content of the inorganic fine particles contained in the cryopreservation jig of the present invention is preferably 0.01 to 100 g / m 2 , more preferably 0.1 to 10 g / m 2 . If the solid content of the inorganic fine particles exceeds 100 g / m 2 , the elution / mixing of the inorganic fine particles in the melt increases, which is not preferable. On the other hand, when the solid content of the inorganic fine particles is less than 0.01 g / m 2 , the cells or tissues may not be easily detached when melting.
  • the content ratio of the inorganic fine particles to the water-soluble polymer compound (total mass of inorganic fine particles / total mass of the water-soluble polymer compound) Is preferably 1 to 100, and more preferably 1.67 to 50.
  • the inorganic fine particles can be prevented from falling off (powder falling) before using the cryopreservation jig, and the inorganic fine particles can be prevented from dropping unintentionally when the vitrification liquid is dropped during the freezing operation.
  • the placing part preferably has a support for the purpose of supporting cells or tissues when cryopreserved, and preferably has a surface layer on the support.
  • a support non-absorbable support
  • Such a support may be made of one kind of material or two or more kinds of materials.
  • the resin film is preferably used from the viewpoint of handling.
  • Specific examples of the resin film include polyester resins such as polyethylene terephthalate (PET) and polyethylene naphthalate (PEN), acrylic resins, epoxy resins, silicone resins, polycarbonate resins, diacetate resins, triacetate resins, polyacrylate resins, polychlorinated resins.
  • the resin film examples include vinyl resin, polysulfone resin, polyether sulfone resin, polyimide resin, polyamide resin, polyolefin resin, and cyclic polyolefin resin.
  • the total light transmittance of the support is 80% or more, because the cells or tissues placed on the placing portion can be easily confirmed using a transmission microscope.
  • a metal support can be suitably used from the viewpoint of excellent temperature conductivity and enabling rapid freezing.
  • the metal support include copper, copper alloy, aluminum, aluminum alloy, gold, gold alloy, silver, silver alloy, iron, and stainless steel.
  • the thickness of the above support is preferably 10 ⁇ m to 10 mm.
  • the surface of the support can be subjected to an easy adhesion treatment by an electrical method such as corona discharge treatment or a chemical method, and can also be roughened.
  • one or more other layers may be provided between the support and the surface layer, or the surface layer may be provided on the front side of the support, and one or more other layers may be provided on the back side. Also good.
  • a surface layer can also be provided in the front and back of a support body.
  • the support may be a storage liquid absorber described later.
  • cryopreservation jig of the present invention has a layer containing a water-soluble polymer compound on the preservation solution absorber will be described.
  • the preservation solution absorber can remove the preservation solution even if the amount of the preservation solution attached to the cells or tissues is large. This eliminates the need for removing the preservative solution, and improves the workability.
  • the cells or tissues thus manipulated are covered with a very small amount of a preservation solution, and can be quickly frozen even when freezing.
  • an aqueous solution containing a large amount of a freezing agent such as glycerol, ethylene glycol, DMSO (dimethyl sulfoxide) is used as a storage solution, and this storage solution has chemical toxicity due to a large amount of the freezing agent.
  • cryopreservation jig in which the placement part has a preservation solution absorber, the vitrification liquid around the placed cell or tissue becomes extremely small, and the viability of the cell or tissue is reduced. Improvement can be expected. Therefore, a cryopreservation jig in which the mounting part has a layer containing a water-soluble polymer compound on the preservation solution absorber is suitable as a vitrification cryopreservation jig.
  • the mounting part has a storage liquid absorber
  • a surface layer can be present inside the pores of the storage liquid absorber as long as the absorbency of the storage liquid absorber is not significantly reduced.
  • the mounting portion has a storage liquid absorber
  • the peelability of the cells or tissues during the melting operation is more advantageous as the solid content of the surface layer increases.
  • the solid content of the surface layer in the case where the mounting portion has the storage liquid absorber can be appropriately adjusted in consideration of the balance of the above performance, and preferably is set to a value of 0. 1-5 g / m 2 .
  • Examples of the preservation solution absorber included in the cryopreservation jig of the present invention include various sheets such as a fiber sheet, a porous resin sheet, a porous metal sheet, and a porous metal oxide sheet.
  • “Porosity” in the present invention means that the above-mentioned sheet is a structure having pores (pores) on the surface, and is more preferably a structure having continuous pores on the sheet surface and inside. preferable.
  • the thickness of the preservation solution absorber (the above-mentioned various sheets) is preferably 10 ⁇ m to 5 mm, more preferably 20 ⁇ m to 2.5 mm. When the preservation solution absorber is a thin sheet, the above-described non-absorbable support can be used as the reinforcing member.
  • the sheet made of fibers used as the preservation solution absorber is exemplified by paper or non-woven fabric, and the paper is preferably a paper whose ratio of the binder component such as a binder is 10% by mass or less, More preferably, it is 5% by mass or less, and more preferably 3% by mass or less.
  • the ratio of the papermaking chemicals contained in the paper to the whole paper is preferably 1% by mass or less.
  • fluorescent whitening agents, dyes, and cationic sizing agents may have a concern about the effect on cells.
  • the fiber sheet is paper
  • it is preferably paper having a density of 0.1 to 0.6 g / cm 3 and a basis weight of 10 to 130 g / m 2 .
  • a paper having a density of 0.12 to 0.3 g / cm 3 and a basis weight of 10 to 100 g / m 2 has excellent absorbability of the storage solution. It is preferable because it is possible to provide a cryopreservation jig having excellent cell or tissue visibility so that the cells or tissues placed thereon can be observed.
  • the fibers contained in the nonwoven fabric include cellulose fibers, rayon fibers and cupra fibers that are regenerated fibers made of cellulose fibers, and acetate fibers that are semi-synthetic fibers from cellulose fibers, Polyester fiber, nylon fiber, acrylic fiber, polypropylene fiber, polyethylene fiber, polyvinyl chloride fiber, vinylidene fiber, polyurethane fiber, vinylon fiber, glass fiber, silk fiber, etc. it can.
  • cellulose fiber, cellulose fiber-derived rayon fiber and cupra fiber that are cellulose regenerated fibers, and acetate fiber that is semi-synthetic fiber from cellulose fibers are preferable.
  • the nonwoven fabric is preferably a nonwoven fabric having a density of 0.1 to 0.4 g / cm 3 and a basis weight of 10 to 130 g / m 2 .
  • a non-woven fabric having a density of 0.12 to 0.3 g / cm 3 and a basis weight of 10 to 100 g / m 2 is excellent in storage solution absorbability and freezing with excellent cell or tissue visibility. This is preferable because a storage jig can be provided.
  • the non-woven fabric used as the storage liquid absorber is preferably 10% by mass or less, more preferably 5% by mass or less, as in the case of the paper described above, in the binder component such as the binder. Furthermore, the nonwoven fabric which is 3 mass% or less is preferable. In particular, a non-woven fabric containing no binder is preferable.
  • Non-woven fabrics have a variety of production methods, unlike paper.
  • non-woven fabrics with reduced binder components as described above are produced by spunbonding and melt-blowing methods, and fibers are arranged by wet or dry methods.
  • the nonwoven fabric manufactured by the hydroentanglement method or the needle punch method can be used suitably.
  • preferred fibers contained in the nonwoven fabric in the present invention include cellulose fibers, fibers derived from cellulose fibers, rayon fibers and cupra fibers that are cellulose regenerated fibers, and acetate fibers that are semi-synthetic fibers from cellulose fibers.
  • a hydroentanglement method or a needle punch method is suitable regardless of a wet method or a dry method.
  • the porous resin sheet used as the storage liquid absorber is, for example, described in Japanese Patent Publication No. 42-13560 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-283447, and is stretched at least in the uniaxial direction and exceeds the melting point of the resin.
  • melting the powder particle surface, and cooling are mentioned.
  • a porous resin sheet is used as a preservation solution absorber, it is preferable because it is possible to provide a cryopreservation jig having excellent preservation solution absorbability and excellent cell or tissue visibility.
  • Examples of the resin that forms the porous resin sheet described above include various polyethylenes such as low density polyethylene, high density polyethylene, and ultrahigh molecular weight polyethylene, polypropylene, polymethyl methacrylate, polystyrene, polytetrafluoroethylene, polyvinylidene difluoride, and the like. Fluorine resin, ethylene-vinyl acetate copolymer, polyamide, styrene-acrylonitrile copolymer, styrene-butadiene-acrylonitrile terpolymer, polycarbonate, polyvinyl chloride and the like.
  • polyethylenes such as low density polyethylene, high density polyethylene, and ultrahigh molecular weight polyethylene, polypropylene, polymethyl methacrylate, polystyrene, polytetrafluoroethylene, polyvinylidene difluoride, and the like.
  • Fluorine resin ethylene-vinyl acetate copolymer, polyamide, sty
  • fluororesins such as polytetrafluoroethylene and polyvinylidene difluoride have a high transparency of the porous resin sheet when cells or tissues are placed on a placement portion together with a storage solution such as vitrification solution, The visibility of cells or tissues under a transmission microscope is greatly improved, and it is possible to provide a cryopreservation jig that is particularly excellent in the visibility of cells or tissues.
  • a membrane filter for filtration which is commercially available for physics and chemistry experiment use or research use, can also be used as the porous resin sheet.
  • the porous metal sheet used as the storage liquid absorber includes copper, copper alloy, aluminum, aluminum alloy, gold, gold alloy, silver, silver alloy, tin, zinc, lead, titanium, nickel, stainless steel, etc.
  • a porous metal sheet made of metal As the porous metal oxide sheet, a porous metal oxide sheet made of a metal oxide such as silica, alumina, zirconium, quartz glass, or the like can be preferably used.
  • the porous metal sheet and the porous metal oxide sheet may be a porous sheet containing two or more kinds of the above-described metals and metal oxides. Among these, a porous metal oxide sheet is preferable because it can provide a cryopreservation jig having excellent cell or tissue visibility.
  • a generally known method can be used as a method for producing a porous metal sheet and a porous metal oxide sheet used as a preservation solution absorber.
  • a method such as a powder metallurgy method or a spacer method can be used.
  • a so-called powder space holder method in which resin injection molding and powder metallurgy are combined can be preferably used.
  • a method described in International Publication No. 2006/041118 or Japanese Patent No. 4577862 can be used.
  • Metal sheet after mixing the metal powder and the resin serving as a spacer, forming by applying pressure, firing the metal powder by baking in a high temperature environment, vaporizing the resin serving as the spacer, Metal sheet can be obtained.
  • a resin binder can be mixed in addition to the metal powder and the resin serving as the spacer.
  • the manufacturing method of metal porous bodies such as the foaming melting method and gas expansion method which inject
  • the manufacturing method like the slurry foaming method which manufactures a metal porous body using a foaming agent can also be used.
  • the preservation solution absorber is a porous metal oxide sheet, for example, the methods described in JP2009-29692A and JP2002-160930A can be used.
  • the surface of the porous body such as the porous resin sheet, the porous metal sheet, and the porous metal oxide sheet described above can be subjected to a hydrophilic treatment in order to enhance the affinity with the surface layer.
  • Hydrophilic treatment methods include graft modification methods, coating methods by applying non-eluting hydrophilic substances, general surface modification methods using various energies such as corona discharge, plasma treatment, and excimer laser. Can be used.
  • the pore diameter of the porous body is 0.02 to 130 ⁇ m.
  • the thickness is preferably 0.05 to 60 ⁇ m.
  • the pore diameter is less than 0.02 ⁇ m, the absorption performance of the preservation solution may not be sufficient when the preservation solution is dropped. Moreover, there exists a problem that manufacture of a porous sheet is difficult. On the other hand, in the range where the pore diameter exceeds 130 ⁇ m, the absorption performance of the preservation solution may not be sufficient.
  • the pore diameter of the porous body is the diameter of the largest pore measured by a bubble point test.
  • the average pore diameter is measured from image observation of the surface and cross section of the porous body.
  • the porosity of the preservation solution absorber is preferably 20% by volume or more, more preferably 30% by volume or more. Further, when the preservation solution absorber is a porous body such as the above-described porous resin sheet, porous metal sheet, and porous metal oxide sheet, the pores inside the porous body are not only in the thickness direction, A continuous structure is also preferred in a direction perpendicular to the thickness direction. With such a structure, since the pores inside the porous body can be used effectively, high absorption performance of the preservation solution can be obtained.
  • the thickness of the preservation solution absorber and the porosity of the porous body can be appropriately selected according to the type of cells or tissues used, the amount of the preservation solution dripped together with the cells or tissues, and the like.
  • the above porosity is defined by the following formula.
  • an adhesive layer can be provided between the storage liquid absorber and the non-absorbent support.
  • the adhesive layer can contain an instantaneous adhesive composition, a hot melt adhesive composition, a photocurable adhesive composition, and the like represented by a moisture curable adhesive substance.
  • polyvinyl alcohol hydroxy Water-soluble polymer compounds such as cellulose, polyvinyl pyrrolidone, starch paste, vinyl acetate resin, acrylic resin, epoxy resin, urethane resin, elastomer resin, cyanoacrylate resin, fluorine resin, silicone resin, Nitrocellulose resin, nitrile rubber resin, styrene-butadiene resin, urea resin, styrene resin, phenol resin, polyimide resin, polyamide resin, polyester resin, bismaleimide resin, olefin resin, EVA
  • a composition containing a water-insoluble resin such as a resin is preferred. Available.
  • the adhesive layer may contain one type of resin or may contain a plurality of types of resins.
  • the solid content of the adhesive layer is preferably in the range of 0.01 to 100 g / m 2 , more preferably in the range of 0.1 to 50 g / m 2 .
  • the area of the mounting portion of the cryopreservation jig of the present invention may be set as appropriate according to the amount of the preserving solution dripped together with the cells or tissues, and is not particularly limited. It is preferably 1 mm 2 or more per 1 ⁇ L, more preferably 2 to 400 mm 2 . Further, in the same cryopreservation jig, when the placement unit has a plurality of storage liquid absorbers on the non-absorbent support, one continuous storage liquid absorber portion is It is preferable that it is an area.
  • the method for producing the mounting part in the present invention is not particularly limited.
  • the mounting part having a surface layer on the support or the storage liquid absorber forms a surface layer on the support or the storage liquid absorber.
  • the formation method of the surface layer in this invention is not specifically limited.
  • the surface layer can be formed on the support or the storage liquid absorber by applying a coating liquid containing a water-soluble polymer to the support or the storage liquid absorber and then drying the coating liquid. .
  • the surface layer may be formed using a coating solution containing a water-soluble polymer and inorganic fine particles.
  • the coating solution may contain water, a solvent such as an organic solvent, and the like.
  • a method for applying the coating liquid is not particularly limited, and may be appropriately selected.
  • the cryopreservation jig of the present invention may have a grip portion together with the placement portion. Having a gripping portion is preferable because workability at the time of cryopreservation work and melting work is improved.
  • FIG. 1 is an overall view showing an example of a cell or tissue cryopreservation jig according to the present invention.
  • the cryopreservation jig 7 includes a gripping portion 1 and a placement portion 2.
  • the gripping portion is preferably a liquid nitrogen resistant material.
  • a liquid nitrogen resistant material for example, various metals such as aluminum, iron, copper, and stainless alloy, ABS resin, polypropylene resin, polyethylene resin, fluorine resin, various engineer plastics, and glass can be preferably used.
  • the grip portion 1 has a cylindrical shape, but its shape is arbitrary.
  • a cap may be placed on the mounting portion 2 to which the cells or tissues have been attached before freezing. 1 is made into a shape in which the diameter of the cylinder continuously decreases from the side not having the placement portion 2 toward the side having the placement portion 2, thereby improving workability when covering the cap. It is also possible.
  • the shape of the mounting portion 2 is preferably a strip shape or a sheet shape in terms of handling.
  • the gripping portion 1 is made of resin
  • the mounting portion 2 can be connected to the gripping portion 1 by insert molding when molding.
  • a structure insertion portion (not shown) can be produced in the grip portion 1 and the mounting portion 2 can be connected with an adhesive.
  • adhesives silicone-based or fluorine-based adhesives that are resistant to low temperatures can be suitably used.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of an example of the placement portion in FIG.
  • the mounting portion 2 a has a structure having the surface layer 3 on the support 4.
  • FIGS. 3 to 5 are schematic cross-sectional views showing an example of a cryopreservation jig in which the mounting portion has a preservation solution absorber and has a layer containing a water-soluble polymer compound on the preservation solution absorber. is there.
  • the storage liquid absorber 5 shown in FIGS. 3 to 5 is a structure having pores 9 (pores).
  • the cross-sectional structure of the preservation liquid absorber 5 shown in FIGS. 3 to 5 is an example, and the present invention is not limited to these.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional structure diagram illustrating an example of the case where the placement unit illustrated in FIG. 1 includes a storage liquid absorber. In FIG.
  • the mounting portion 2 b has a structure having the storage liquid absorber 5 and the surface layer 3 on the storage liquid absorber 5.
  • a manufacturing method in which the above-described coating liquid is applied to the storage liquid absorber by a slide hopper method can be used.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional structure diagram showing another example in the case where the mounting portion shown in FIG. 1 has a storage liquid absorber.
  • the mounting portion 2 c has a structure having the surface layer 3 over the entire porous body of the storage liquid absorber 5.
  • the surface layer does not need to form the continuous layer in the preservation
  • This structure is preferable because it does not block the pores of the porous body, and therefore can absorb both the absorbability of the vitrification solution during freezing and the peelability of cells or tissues during melting.
  • FIG. 4 shows an example of the present invention.
  • a manufacturing method in which the above-described coating solution is applied by dip coating can be used.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional structure diagram showing another example in the case where the mounting portion shown in FIG. 1 has a storage liquid absorber.
  • the mounting portion 2 d has a support 4 and an adhesive layer 6 in addition to the form of FIG. 4 having the surface layer 3 over the entire porous body of the storage liquid absorber 5.
  • the porous body used for the preservation solution absorber 5 is poor in self-supporting property, the operation during freezing and thawing can be performed more reliably.
  • FIG. 6 is an example of a schematic cross-sectional structure when the surface layer of the mounting portion contains inorganic fine particles.
  • the mounting portion 2 e has a structure having inorganic fine particles 8 arranged in layers on the support 4.
  • a coating solution containing a water-soluble polymer compound and inorganic fine particles is applied on a support by a slide hopper method or a dip coating method.
  • a manufacturing method such as a method can be used.
  • FIG. 7 is another example of a schematic diagram of a cross-sectional structure when the surface layer of the mounting portion contains inorganic fine particles.
  • the mounting portion 2 f has a structure in which inorganic fine particles 8 are scattered on the support 4.
  • FIG. 8 is a schematic cross-sectional structure diagram showing an example of a case where the mounting portion has a storage liquid absorber and the surface layer contains inorganic fine particles.
  • the mounting portion 2 g has inorganic fine particles 8 on the surface of the storage liquid absorber 5.
  • an inorganic fine particle 8 having a particle diameter larger than the pore diameter of the storage liquid absorber 5 is used, and a coating containing the inorganic fine particle 8 and a water-soluble polymer compound is used.
  • the liquid may be applied by an application method such as the above slide hopper method or dip coating method.
  • FIG. 9 is a schematic cross-sectional structure diagram showing another example in the case where the mounting portion has a storage liquid absorber and the surface layer contains inorganic fine particles.
  • the mounting portion 2 h contains inorganic fine particles 8 on the outermost surface of the storage liquid absorber 5 and also has inorganic fine particles 8 inside the pores of the storage liquid absorber 5.
  • an inorganic fine particle 8 having a particle diameter smaller than the pore diameter of the storage liquid absorber 5 is used, and a coating containing the inorganic fine particle 8 and a water-soluble polymer compound is used.
  • the liquid may be applied by an application method such as the above slide hopper method or dip coating method.
  • the inorganic fine particles 8 having a particle diameter smaller than the pore diameter of the preservation solution absorber 5 are used, the pore diameter becomes small as the inorganic fine particles 8 enter the inside of the pores.
  • the inorganic fine particles may be arranged in layers on the surface of the storage liquid absorber 5.
  • 6 to 9 are schematic cross-sectional views showing an example of a mounting portion having a layer containing a water-soluble polymer compound and an inorganic fine particle compound on the outermost surface. 6 to 9 described above, the surface layer 3 (water-soluble polymer compound) is omitted and only the inorganic fine particles 8 are shown.
  • the cell or tissue is covered with a cap or the cryopreservation jig as described above.
  • liquid nitrogen is not sterilized and cells or tissues are frozen by direct contact with liquid nitrogen, the sterilized state may not be guaranteed even if the cryopreservation jig is sterilized. Therefore, the cell or tissue may be frozen without contacting the liquid nitrogen directly by capping the mounting part to which the cell or tissue is attached before freezing or by sealing the cryopreservation jig in the container. .
  • the cap and the container are preferably made of various metals, various resins, glass, ceramics, etc., which are liquid nitrogen resistant materials.
  • the shape is not particularly limited.
  • the cap does not contact the main body, such as a semi-spindle or dome-like cap such as a pencil cap, or a cylindrical straw cap, and blocks cells or tissues from the outside. Any shape is possible as long as it is possible.
  • the container is not particularly limited as long as it can enclose or store the cryopreservation jig without being in contact with the cells or tissues placed thereon and can be sealed.
  • the cryopreservation jig can be used in combination with a cap or a container capable of blocking the cells or tissues on such a placement portion from the outside unless the effects of the present invention are impaired. . Moreover, the cryopreservation jig
  • the cryopreservation jig of the present invention is preferably used in, for example, the cryotop method.
  • the conventional cryotop method is usually used for storing a single cell or a small number of cells less than 10 cells, but the cryopreservation jig of the present invention can store more cells (for example, 10 cells). (Preservation of ⁇ 1000000 cells)).
  • it can also be suitably used for preserving sheet-like cells (so-called cell sheets) composed of a plurality of cells.
  • the cryopreservation jig of the present invention in the cryopreservation operation of cells or tissues, the cells or tissues can be easily recovered when thawing the cells or tissues after freezing.
  • the mounting part has a preservation solution absorber, and when the cell or tissue is frozen, it absorbs excess vitrification liquid adhering to the outer periphery of the cell or tissue.
  • a preservation solution absorber when cells or tissues are frozen and thawed, they are not easily damaged by extracellular vitrification solution, and the cells or tissues can be cryopreserved with an excellent survival rate.
  • the method for cryopreserving cells or tissues using the cryopreservation jig of the present invention is not particularly limited.
  • cells or tissues soaked in a preservation solution are first dropped onto the mounting portion together with the preservation solution, and the cells Alternatively, it is preferable to remove as much as possible the extra preservation solution adhering to the periphery of the tissue using a pipette or the like.
  • the placement part of the cryopreservation jig has a preservation solution absorber, the above operation is not necessary, and the excess preservation solution is automatically removed.
  • the cell or tissue can be frozen by immersing the cryopreservation jig in liquid nitrogen or the like while holding the cell or the tissue on the mounting portion.
  • a cap capable of blocking the cell or tissue on the mounting unit from the outside world is attached to the mounting unit, or a cryopreservation jig is sealed in the container, and liquid nitrogen or the like is used. It can also be immersed in it.
  • the cell or tissue immersed in the preservation solution is placed together with the preservation solution, and frozen in a state where the cell or tissue is held on the placement part.
  • a method of cryopreserving a cell or tissue by freezing the cell or tissue by immersing the storage jig in liquid nitrogen is also one aspect of the present invention.
  • the preservation solution those usually used for freezing cells such as eggs and embryos can be used.
  • a cryoprotectant glycerol, ethylene glycol, etc.
  • a physiological solution such as the above-described phosphate buffered saline.
  • a preservative solution obtained by the inclusion, and various antifreeze agents such as glycerol, ethylene glycol, DMSO (dimethyl sulfoxide) (at least 10% by mass, more preferably 20% by mass with respect to the total mass of the storage solution)
  • the above vitrification liquid can be used.
  • save liquid is preferable.
  • the cryopreservation jig is taken out from a cooling solvent such as liquid nitrogen, and the placing portion on which the frozen cells or tissues are placed is immersed in the thawing solution. to recover.
  • Examples of cells that can be cryopreserved using the jig for cryopreservation of the present invention include, for example, mammals (eg, humans, cows, pigs, horses, rabbits, rats, mice, etc.) eggs, embryos, and sperm. And pluripotent stem cells such as artificial pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells). Moreover, cultured cells, such as a primary cultured cell, a subcultured cell, and a cell line cell, are mentioned.
  • the cell is a fibroblast, a cancer-derived cell such as pancreatic cancer / hepatoma, epithelial cell, vascular endothelial cell, lymphatic endothelial cell, nerve cell, chondrocyte, tissue stem cell, And adherent cells such as immune cells.
  • tissues that can be cryopreserved include tissues composed of the same or different types of cells, such as tissues such as ovary, skin, corneal epithelium, periodontal ligament, and myocardium.
  • the present invention is particularly suitable for cryopreservation of tissues having a sheet-like structure (for example, cell sheets, skin tissues, etc.).
  • the cryopreservation jig of the present invention is not limited to a tissue directly collected from a living body, for example, cultured skin grown and grown in vitro, a so-called cell sheet constructed in vitro, JP 2012-205516 A It can also be suitably used for cryopreservation of an artificial tissue such as a proposed tissue model having a three-dimensional structure.
  • the cryopreservation jig of the present invention is suitably used as a cryopreservation jig for cells or tissues as described above.
  • Example 1 A transparent PET film (total light transmittance of 91%, haze value of 5.5%) subjected to easy adhesion treatment as a support is used, and high purity polyvinyl alcohol EG- manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. is used on the support.
  • a 5 mass% aqueous solution of 05P (saponification degree: 86.5 to 89 mol%) is applied by a slide hopper method so that the solid content upon drying is 5 g / m 2 , dried at room temperature, and the form shown in FIG.
  • the mounting part was prepared. This placing part was cut into a size of 2 mm ⁇ 20 mm (40 mm 2 ) and joined to a grip part made of ABS resin, and the cryopreservation jig of Example 1 was manufactured in the form shown in FIG.
  • the mouse egg taken out from the equilibrium solution is immersed in a vitrification solution (30% by volume ethylene glycol, 0.5% by volume glycerol, 69.5% the above-mentioned modified phosphate buffer, 0.5M sucrose) at a temperature of 4 ° C. It was. After immersion in the vitrification solution for 30 seconds, the mouse egg was placed on the placement part of the cryopreservation jig of Example 1 or Comparative Example 1, and the mouse egg was observed using a pipette under a transmission microscope. The excess vitrification solution in the periphery was removed as much as possible. Then, it was immersed in liquid nitrogen and frozen by vitrification. The frozen cryopreservation jig was stored in a liquid nitrogen storage container until thawed.
  • a vitrification solution 30% by volume ethylene glycol, 0.5% by volume glycerol, 69.5% the above-mentioned modified phosphate buffer, 0.5M sucrose
  • the peelability at the time of melting was evaluated according to the following criteria.
  • Example 2 A transparent PET film (total light transmittance 91%, haze value 5.5%) subjected to easy adhesion treatment is used as a support, and a hot melt urethane resin Purmelt manufactured by Henkel Japan Co., Ltd. is used as an adhesive layer on the support. QR 170-7141P was applied so that the solid content at the time of drying was 30 g / m 2 . Before the adhesive layer is completely cured, a hydrophilized polytetrafluoroethylene porous material (pore size 0.2 ⁇ m, porosity 71%, thickness 35 ⁇ m) manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd. is applied as a preservation solution absorber. Combined.
  • the laminate thus obtained was dip-coated by immersing it in a 2% by mass aqueous solution of high-purity polyvinyl alcohol EG-05P (saponification degree: 86.5 to 89 mol%) manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry. Then, the substrate was dried at room temperature to prepare a mounting portion having a layer containing a water-soluble polymer compound having the form shown in FIG. The coating amount of the layer containing the water-soluble polymer compound was 1.6 g / m 2 in terms of the solid content when dried. In the same manner as in Example 1, this mounting part was cut into a size of 2 mm ⁇ 20 mm, and then joined to a grip part made of ABS resin to produce the cryopreservation jig of Example 2 in the form shown in FIG. did.
  • Example 3 A cryopreservation jig of Example 3 was produced in the same manner as Example 2 except that the concentration of the aqueous solution of polyvinyl alcohol EG-05P was changed to 1% by mass. In addition, the coating amount of the layer containing the water-soluble polymer compound included in the cryopreservation jig of Example 3 was 0.5 g / m 2 in terms of solid content when dried.
  • Example 4 A cryopreservation jig of Example 4 was produced in the same manner as in Example 2 except that the concentration of the aqueous solution of polyvinyl alcohol EG-05P was changed to 0.2% by mass. In addition, the coating amount of the layer containing the water-soluble polymer compound included in the cryopreservation jig of Example 4 was 0.1 g / m 2 in terms of solid content when dried.
  • Example 5 Except for providing a layer containing a water-soluble polymer compound by immersing the laminate in a 1% by mass aqueous solution of another polyvinyl alcohol, Kuraray Co., Ltd. PVA103 (degree of saponification 98-99 mol%) In the same manner as in Example 2, a cryopreservation jig of Example 5 was produced. In addition, the coating amount of the layer containing the water-soluble polymer compound included in the cryopreservation jig of Example 5 was 0.5 g / m 2 in terms of solid content when dried.
  • Example 6 In the same manner as in Example 2, except that a layer containing a water-soluble polymer compound was prepared by immersing the laminate in a 1% by mass aqueous solution of PN505 manufactured by Zerais Co., Ltd. instead of polyvinyl alcohol. The cryopreservation jig of Example 6 was produced. In addition, the coating amount of the layer containing the water-soluble polymer compound included in the cryopreservation jig of Example 6 was 0.5 g / m 2 in terms of solid content when dried.
  • Example 7 A stainless steel porous body (pore diameter 1.5 ⁇ m, porosity 65%, thickness 1 mm) manufactured by Taisei Kogyo Co., Ltd. was used as a storage liquid absorber, and a 1% by mass aqueous solution of polyvinyl alcohol EG-05P was used. By dipping, it was dip-coated and dried at room temperature to produce a mounting portion having a layer containing a water-soluble polymer compound in the form shown in FIG. In addition, the application quantity of the layer containing the water-soluble polymer compound of Example 7 was 0.4 g / m ⁇ 2 > in the solid content at the time of drying. In the same manner as in Example 1, this placement part was joined to a grip part made of ABS resin, and the cryopreservation jig of Example 7 was produced in the form shown in FIG.
  • Comparative Example 2 For the preparation of the cryopreservation jig of Example 2, for the cryopreservation of Comparative Example 2 that does not have a layer containing a water-soluble polymer compound in the same manner as Example 2 except that it is not immersed in an aqueous solution.
  • a jig was produced. That is, the cryopreservation jig was prepared on a transparent PET film (total light transmittance 91%, haze value 5.5%) subjected to an easy adhesion treatment, and an adhesive layer (Helkel Japan Co., Ltd. hot melt urethane resin Purmelt).
  • a polytetrafluoroethylene porous material (pore diameter 0.2 ⁇ m, porosity 71%, thickness 35 ⁇ m) subjected to hydrophilic treatment is bonded via QR 170-7141P).
  • the absorbability of the vitrification liquid was evaluated according to the following criteria. A: After adding the vitrification solution, it was less than 6 seconds until the excess vitrification solution around the mouse egg was absorbed and disappeared. ⁇ : After dropping the vitrification solution, it was 6 to 30 seconds until the excess vitrification solution around the mouse egg was absorbed and disappeared. X: Excess vitrification solution around the mouse egg remained at 30 seconds after dropping the vitrification solution.
  • cryopreservation jig of the present invention provides excellent absorbability of the vitrification solution in addition to excellent peelability upon melting.
  • Example 8 Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd., which is a polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group on the support, using a transparent PET film (total light transmittance 91%, haze value 5.5%) treated with easy adhesion as the support ) Gosenex WO-320R (saponification degree: 88.3 mol%) 5 mass% aqueous solution was applied by a slide hopper method so that the solid content upon drying would be 5 g / m 2 , dried at room temperature, then 120 ° C. Then, a heat treatment was performed for 40 hours to prepare a mounting portion having the form shown in FIG. 2 having a surface layer on the support. The mounting portion was cut into a size of 2 mm ⁇ 20 mm (40 mm 2 ) and joined to a gripping portion made of ABS resin, and the cryopreservation jig of Example 8 was manufactured in the form shown in FIG.
  • cryopreservation jig of Example 8 a cryopreservation jig was produced in the same manner except that the transparent PET film was used as it was to form the mounting portion. Therefore, since the cryopreservation jig is the same as that of Comparative Example 1 described above, the cryopreservation jig is described as Comparative Example 1 in Table 3 described later.
  • phosphate buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.9 mM CaCl 2 .2H 2 O, 0.5 mM MgCl 2) containing extremely low concentration of phenol red using the collected mouse blastocyst stage embryo as a pH indicator 6H 2 O, 1.5 mM KH 2 PO 4 , 8 mM Na 2 HPO 4 , 5.6 mM glucose, 0.3 mM Na pyruvate, 65 ⁇ g / ml dibekacin sulfate, 1 mg / ml polyvinyl pyrrolidone, 14.8 mM L-proline, 200 mM trehalose) for 10 minutes in a 15 ° C.
  • mice embryo was once taken out, and then the mouse embryo was equilibrated at a temperature of 15 ° C. (7.5% by volume DMSO (dimethyl sulfoxide), 7.5% by volume ethylene glycol, 17% by volume fetal calf serum, 68% by volume). It was immersed in the above-mentioned modified phosphate buffer solution for 5 minutes. Subsequently, the mouse embryo taken out from the equilibration solution was vitrified at a temperature of 4 ° C.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the mouse embryo was placed on the placement part of the cryopreservation jig of Example 8 or Comparative Example 1, and the mouse embryo was observed with a pipette under a transmission microscope. The excess vitrification solution in the periphery was removed as much as possible. Then, it was immersed in liquid nitrogen and frozen by vitrification. The frozen cryopreservation jig was stored in a liquid nitrogen storage container until thawed.
  • the peelability of cells or tissues was evaluated according to the following criteria.
  • ⁇ When the cryopreservation jig was immersed in the melt, it took 40 to 60 seconds to peel off the mouse embryo while shaking the gripping portion.
  • Example 9 A transparent PET film (total light transmittance 91%, haze value 5.5%) subjected to easy adhesion treatment is used as a support, and a hot melt urethane resin Purmelt manufactured by Henkel Japan Co., Ltd. is used as an adhesive layer on the support. QR 170-7141P was applied so that the solid content at the time of drying was 30 g / m 2 . Before the adhesive layer is completely cured, a hydrophilized polytetrafluoroethylene porous material (pore size 0.2 ⁇ m, porosity 71%, thickness 35 ⁇ m) manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd. is applied as a preservation solution absorber. Combined.
  • the laminate thus obtained was immersed in a 2% by mass aqueous solution of Nichigo-G polymer AZF8035W (saponification degree: 98.4 mol%) manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry, which is a polyvinyl alcohol having an ethanediol group.
  • Nichigo-G polymer AZF8035W (saponification degree: 98.4 mol%) manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry, which is a polyvinyl alcohol having an ethanediol group.
  • a heat treatment was performed at 120 ° C. for 40 hours to produce a mounting portion having a surface layer having the form shown in FIG.
  • the solid content of the surface layer was 1.6 g / m 2 .
  • this mounting portion was cut into a size of 2 mm ⁇ 20 mm, and then joined to a gripping portion made of ABS resin to produce the cryopreservation jig of Example 9 in the form shown in FIG. did.
  • Example 10 Except for performing dip coating using a 2% by weight aqueous solution of Nichigo-G polymer OKS-8041 (saponification degree 88.9 mol%) manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry, which is a polyvinyl alcohol having an ethanediol group, In the same manner as in Example 9, the cryopreservation jig of Example 10 was produced. The solid content of the surface layer of the cryopreservation jig of Example 10 was 1.6 g / m 2 .
  • Example 11 was carried out in the same manner as in Example 9 except that dip coating was performed using a 2% by mass aqueous solution of Gohsenx WO-320R (saponification degree: 88.3 mol%), which is a polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group.
  • a cryopreservation jig was prepared. The solid content of the surface layer of the cryopreservation jig of Example 11 was 1.6 g / m 2 .
  • Example 12 A cryopreservation jig of Example 12 was produced in the same manner as Example 11 except that the concentration of the aqueous solution of Gohsenx WO-320R was changed to 0.5% by mass.
  • the solid content of the surface layer of the cryopreservation jig of Example 12 was 0.5 g / m 2 .
  • Example 13 The same as Example 9 except that dip coating was performed using a 2% by weight aqueous solution of GOHSEX WO-320N (saponification degree 99 mol%) manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry, which is a polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group. Thus, a cryopreservation jig of Example 13 was produced. The solid content of the surface layer of the cryopreservation jig of Example 13 was 1.6 g / m 2 .
  • Example 14 The cryopreservation of Example 14 was carried out in the same manner as Example 9 except that dip coating was performed using a 2% by mass aqueous solution of PVA103 (saponification degree: 98.5 mol%) manufactured by Kuraray Co., Ltd., which is polyvinyl alcohol. A jig was prepared. The solid content of the surface layer of the cryopreservation jig of Example 14 was 1.6 g / m 2 .
  • a cryopreservation jig having no surface layer was also produced in the same manner as in Example 9 except that the immersion in an aqueous solution was not performed in the preparation of the cryopreservation jig of Example 9 described above.
  • This cryopreservation jig is a transparent PET film (total light transmittance 91%, haze value 5.5%) subjected to an easy adhesion treatment, and an adhesive layer (Helkel Japan Co., Ltd. hot melt urethane resin Purmelt QR).
  • cryopreservation jig is described as Comparative Example 2.
  • the absorbability of the preservation solution was evaluated according to the following criteria. A: After adding the vitrification solution, it was less than 6 seconds until the excess vitrification solution around the mouse embryo was absorbed and disappeared. ⁇ : After dropping the vitrification solution, it was 6 to 30 seconds until the excess vitrification solution around the mouse embryo was absorbed and disappeared. X: Excess vitrification solution around the mouse embryo remained at 30 seconds after dropping the vitrification solution.
  • cryopreservation jig of the present invention provides excellent absorbability of the vitrification solution in addition to excellent releasability upon melting.
  • Example 15 A transparent PET film (total light transmittance 91%, haze value 5.5%) subjected to easy adhesion treatment as a support is polyvinyl alcohol having a saponification degree of 94 mol% or less on the support.
  • a 5% by mass aqueous solution of Kuraray PVA505 (saponification degree 73.5 mol%, polymerization degree 500) was applied by a slide hopper method so that the solid content at the time of drying was 5 g / m 2.
  • a heat treatment was carried out at 40 ° C. for 40 hours to produce a mounting portion having the form shown in FIG. 2 having a surface layer on the support. This placing part was cut into a size of 2 mm ⁇ 20 mm (40 mm 2 ) and joined to a grip part made of ABS resin, and a cryopreservation jig of Example 15 was produced in the form shown in FIG.
  • cryopreservation jig of Example 15 a cryopreservation jig was produced in the same manner except that the transparent PET film was used as it was to form the mounting portion. Therefore, since the cryopreservation jig is the same as that of Comparative Example 1 described above, the cryopreservation jig is described as Comparative Example 1 in Table 5 described later.
  • ⁇ Freezing mouse embryo> A method similar to that for freezing mouse embryos using the cryopreservation jig of Example 8 described above, except that the cryopreservation jigs of Example 15 and Comparative Example 1 were each used as the cryopreservation jig.
  • the mouse embryo was vitrified and frozen.
  • the frozen cryopreservation jig was stored in a liquid nitrogen storage container until thawed.
  • the holding part of the cryopreservation jig is shaken to give vibration to the mounting part, or by applying a suction pressure using a pipette, so that 60 minutes after the mouse embryo is immersed in the melt.
  • the collection operation was performed until the second passed.
  • the peelability of mouse embryos during the melting operation was evaluated according to the following criteria. These results are shown in the item “Peelability of cells or tissues” in Table 5.
  • the peelability of cells or tissues was evaluated according to the following criteria.
  • cryopreservation jig of the present invention exhibits excellent peelability upon melting.
  • Example 16 A transparent PET film (total light transmittance 91%, haze value 5.5%) subjected to easy adhesion treatment is used as a support, and a hot melt urethane resin Purmelt manufactured by Henkel Japan Co., Ltd. is used as an adhesive layer on the support. QR 170-7141P was applied so that the solid content at the time of drying was 30 g / m 2 . Before the adhesive layer is completely cured, a hydrophilized polytetrafluoroethylene porous material (pore size 0.2 ⁇ m, porosity 71%, thickness 35 ⁇ m) manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd. is applied as a preservation solution absorber. Combined.
  • the laminate thus obtained is immersed in a 2% by weight aqueous solution of PVA505 (saponification degree: 73.5 mol%, polymerization degree: 500), which is polyvinyl alcohol having a saponification degree of 94 mol% or less, so that dip coating is performed. Then, after drying at room temperature, a heat treatment was performed at 120 ° C. for 40 hours to produce a mounting portion having a surface layer having the form shown in FIG. The solid content of the surface layer was 1.6 g / m 2 .
  • this mounting portion was cut into a size of 2 mm ⁇ 20 mm, and then joined to a gripping portion made of ABS resin to produce the cryopreservation jig of Example 16 in the form shown in FIG. did.
  • Example 17 Example 16 except that dip coating was performed using a 2% by mass aqueous solution of PVA217 (saponification degree 88 mol%, polymerization degree 1700) manufactured by Kuraray Co., Ltd., which is polyvinyl alcohol having a saponification degree of 94 mol% or less. Similarly, the cryopreservation jig of Example 17 was produced. The solid content of the surface layer of the cryopreservation jig of Example 17 was 1.6 g / m 2 .
  • Example 18 Example 16 except that dip coating was performed using a 2% by weight aqueous solution of PVA205 (saponification degree 88 mol%, polymerization degree 500) manufactured by Kuraray Co., Ltd., which is polyvinyl alcohol having a saponification degree of 94 mol% or less. Similarly, a cryopreservation jig of Example 18 was produced. The solid content of the surface layer of the cryopreservation jig of Example 18 was 1.6 g / m 2 .
  • Example 19 Except for performing dip coating using a 2 mass% aqueous solution of Gohsenol EG03P (saponification degree 88 mol%, polymerization degree 300) manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd., which is polyvinyl alcohol having a saponification degree of 94 mol% or less, in the same manner as in Example 16, the cryopreservation jig of Example 19 was produced.
  • the solid content of the surface layer of the cryopreservation jig of Example 19 was 1.6 g / m 2 .
  • Example 20 Freezing of Example 20 was performed in the same manner as in Example 16 except that it was performed using a 2% by mass aqueous solution of PVA105 (saponification degree: 98.5 mol%, polymerization degree: 500) manufactured by Kuraray Co., Ltd., which is polyvinyl alcohol. A storage jig was prepared. The solid content of the surface layer of the cryopreservation jig of Example 20 was 1.6 g / m 2 .
  • a cryopreservation jig having no surface layer was also produced in the same manner as in Example 16 except that the immersion in an aqueous solution was not performed in the preparation of the cryopreservation jig of Example 16 described above.
  • This cryopreservation jig is a transparent PET film (total light transmittance of 91%, haze value of 5.5%) subjected to an easy adhesion treatment, and an adhesive layer (Helkel Japan Co., Ltd. hot melt urethane resin Purmelt QR).
  • the absorbability of the preservation solution was evaluated according to the following criteria. ⁇ : Excess vitrification solution around the mouse embryo was absorbed within 30 seconds after dropping the vitrification solution. X: Excess vitrification solution around the mouse embryo remained at 30 seconds after dropping the vitrification solution.
  • cryopreservation jig of the present invention provides excellent absorbability of the vitrification liquid in addition to excellent peelability upon melting.
  • Example 21 A transparent PET film (total light transmittance 91%, haze value 5.5%) subjected to easy adhesion treatment is used as a support, and a hot melt urethane resin Purmelt QR 170 manufactured by Henkel Japan Co. is used as an adhesive layer on the support. -7141P was applied so that the solid content at the time of drying was 30 g / m 2 . Before the adhesive layer was completely cured, a cellulose mixed ester porous material (pore size 0.2 ⁇ m, porosity 73%, thickness 133 ⁇ m) manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd. was bonded as a preservation solution absorber.
  • the laminated body thus obtained was made into 20 mass% of ST-ZL (average particle diameter 85 nm), which is colloidal silica manufactured by Nissan Chemical Industries, as a silica concentration, and high-purity polyvinyl alcohol EG manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry. After dipping in an aqueous solution (coating solution) containing ⁇ 05P (degree of saponification of 86.5 to 89 mol%) in an amount of 1% by mass as the solid content concentration of the polyvinyl alcohol, it was further dried at room temperature. Then, a heat treatment was performed for 1 day to prepare a mounting portion having a water-soluble polymer compound and inorganic fine particles on the surface.
  • ST-ZL average particle diameter 85 nm
  • ⁇ 05P degree of saponification of 86.5 to 89 mol%
  • the solid content application amount of the inorganic fine particles at this time was 3 g / m 2 .
  • the mounting portion was cut into a size of 2 mm ⁇ 20 mm (40 mm 2 ), and then joined to a gripping portion made of ABS resin, and the cryopreservation jig of Example 21 was manufactured in the form shown in FIG.
  • Example 22 ⁇ Production of vapor phase silica dispersion> Water 430 parts Modified ethanol 22 parts Cationic polymer 3 parts (Dimethyldiallylammonium chloride homopolymer, manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd., Charol DC902P, average molecular weight 9000) Gas phase method silica 100 parts (average primary particle diameter 7 nm, specific surface area 300 m 2 / g by BET method)
  • Dimethyldiallylammonium chloride homopolymer was added to water and denatured ethanol as a dispersion medium, and then vapor phase silica was added and predispersed to prepare a crude dispersion. Next, this crude dispersion was treated twice with a high-pressure homogenizer to prepare a dispersion of vapor-phase process silica having a silica concentration of 20% by mass. The average particle diameter of the vapor phase method silica was 100 nm.
  • cryopreservation jig of Example 21 In the production of the cryopreservation jig of Example 21, an aqueous solution containing 10% by mass of the gas phase method silica dispersion as a silica concentration and 1% by mass of polyvinyl alcohol EG-05P as a solid content concentration of the polyvinyl alcohol was used. A cryopreservation jig of Example 22 was produced in the same manner as Example 21 except for the above. In addition, the solid content application amount of the inorganic fine particles at this time was 3 g / m 2 .
  • Example 23 In the production of the cryopreservation jig of Example 21, as a preservation solution absorber to be bonded to the support through the adhesive layer, the cellulose mixed ester porous body was replaced with a hydrophilic treatment manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd. A cryopreservation jig of Example 23 was produced in the same manner as in Example 21, except that a polytetrafluoroethylene porous material (pore diameter 0.2 ⁇ m, porosity 71%, thickness 35 ⁇ m) was used. In addition, the solid content application amount of the inorganic fine particles at this time was 3 g / m 2 .
  • Example 24 In the preparation of the cryopreservation jig of Example 23, as a coating solution used for dip coating of the laminate, MP-4540 (average particle size 450 nm), colloidal silica manufactured by Nissan Chemical Industries, Ltd., having a silica concentration of 5% by mass.
  • a cryopreservation jig of Example 24 was produced in the same manner as Example 23, except that an aqueous solution containing 2% by mass of polyvinyl alcohol EG-05P as the solid content concentration of the polyvinyl alcohol was used.
  • the solid content application amount of the inorganic fine particles at this time was 1 g / m 2 .
  • FIG. 10 When the surface of the placement part of the cryopreservation jig of Example 24 was observed using a scanning electron microscope, a microscope observation image as shown in FIG. 10 was observed.
  • the scale bar is 5 ⁇ m.
  • Example 25 In the preparation of the cryopreservation jig of Example 23, as a coating solution used for dip coating of the laminate, Percoll (average particle size 30 nm), which is colloidal silica manufactured by GE Healthcare Japan, is used as a silica concentration of 20% by mass.
  • a cryopreservation jig of Example 25 was produced in the same manner as in Example 23 except that an aqueous solution containing 1% by mass of polyvinyl alcohol EG-05P as the solid content concentration of the polyvinyl alcohol was used.
  • the solid content application amount of the inorganic fine particles at this time was 1 g / m 2 .
  • Example 26 In the production of the cryopreservation jig of Example 21, a transparent PET film (total light transmittance 91%, haze value 5.5%) subjected to easy adhesion treatment was used as a support.
  • a cryopreservation jig of Example 26 was produced in the same manner as in Example 21 except that it was dip-coated by dipping in the same coating solution as in Example 21 and dried at room temperature. The solid content of the inorganic fine particles at this time was 3 g / m 2 .
  • cryopreservation jig of Example 21 a cryopreservation jig was produced in the same manner except that the transparent PET film was used as it was to form the mounting portion. Therefore, since the cryopreservation jig is the same as that of Comparative Example 1 described above, the cryopreservation jig is described as Comparative Example 1 in Table 7 described later.
  • the laminate for polyprefluoroethylene was used in the same manner except that the laminate including the polytetrafluoroethylene porous body was used as it was without dip coating, and was used as a mounting portion. A tool was prepared.
  • This cryopreservation jig is a transparent PET film (total light transmittance of 91%, haze value of 5.5%) subjected to an easy adhesion treatment, and an adhesive layer (Helkel Japan Co., Ltd. hot melt urethane resin Purmelt QR).
  • cryopreservation jig is described as Comparative Example 2.
  • Human hepatocyte spheroids were prepared using Prime Surface (registered trademark) 96U plates manufactured by Sumitomo Bakelite. HepG2 cells grown in Eagle's minimum essential medium (EMEM) supplemented with 10% serum on the petri dish were detached and collected from the petri dish by trypsin treatment, and then seeded on a Prime Surface 96U plate at a cell concentration of 50 cells per well. . After culturing on the plate for 3 days at 37 ° C. and 2% CO 2 , spheroid formation was confirmed. A spheroid having a shape close to a sphere and a diameter close to 100 ⁇ m was selected and used for the subsequent evaluation tests.
  • Prime Surface registered trademark
  • EMEM Eagle's minimum essential medium
  • save liquid absorbers other than Example 26 and Comparative Example 1 it confirmed that the vitrification liquid around a spheroid was fully removed under the transmission microscope or the reflection microscope. Then, it was frozen by dipping in liquid nitrogen.
  • the vitrification solution around the spheroid was sufficiently removed as much as possible under a transmission microscope using a pipette, and then immersed in liquid nitrogen and frozen. .
  • A When the cryopreservation jig was immersed in the melt, the spheroids could be peeled from the device within 30 seconds by shaking the gripping portion up and down, left and right, or pipetting.
  • ⁇ When the cryopreservation jig was immersed in the melt, the gripping part was shaken up and down, left and right, and pipetting was performed, and it took 30 seconds to 1 minute to peel the spheroid from the device.
  • X Spheroids could not be peeled off within 1 minute.
  • ⁇ Absorptivity of preservation solution One spheroid is immersed in a vitrification solution (30% by volume ethylene glycol, 0.5% by volume glycerol, 69.5% the above modified phosphate buffer, 0.5M sucrose) and then frozen and stored together with the vitrification solution. When placed on the placement part of the jig for use, the absorbability of the preservation solution was evaluated.
  • the cryopreservation jigs of Examples 21 to 25 having the preservation solution absorber had good absorbability and did not require an operation for removing excess vitrification solution using a pipette or the like. In particular, Example 24 exhibited excellent absorbency, and excess vitrification liquid was absorbed and removed within 10 seconds.
  • ⁇ Visibility of cells or tissues One spheroid is immersed in a vitrification solution (30% by volume ethylene glycol, 0.5% by volume glycerol, 69.5% the above modified phosphate buffer, 0.5M sucrose) and then frozen and stored together with the vitrification solution.
  • a vitrification solution (30% by volume ethylene glycol, 0.5% by volume glycerol, 69.5% the above modified phosphate buffer, 0.5M sucrose
  • the present invention is not limited to livestock such as cattle and animal embryo transfer, artificial insemination, artificial insemination to humans, iPS cells, ES cells, commonly used cultured cells, for inspection or transplantation collected from living organisms. It can be used for cryopreservation of cells or tissues, cells or tissues cultured in vitro, and the like.

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Abstract

本発明は、細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、水溶性高分子化合物を含有する層を有することを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具、およびこれを用いた凍結保存方法に関する。

Description

細胞又は組織の凍結保存用治具および凍結保存方法
　本発明は、細胞又は組織などを凍結保存する際に使用する凍結保存用治具、およびこれを用いた凍結保存方法に関する。
　細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術においては、胚を凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて胚を融解し、移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。
　一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を失わせずに長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要なときに使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。
　細胞又は組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３～０．５℃／分の速度）で、－３０～－３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（－１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固体となるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。
　しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、温度制御をするための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。
　前記緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化保存法が提案されている。ガラス化保存法とは、グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液の凝固点降下により、氷点下でも氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この水溶液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶を生じさせないまま固体化させることができる。このように固体化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む水溶液をガラス化液という。
　前記ガラス化法の具体的な操作としては、ガラス化液に細胞又は組織を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（－１９６℃）で冷却する。ガラス化法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。
　ガラス化保存法を用いると、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、ガラス化液に含まれる高濃度の耐凍剤には化学的毒性がある。このため、細胞又は組織の凍結保存時には細胞又は組織周囲に存在するガラス化液が少ない方が好ましく、細胞がガラス化液に暴露される時間、つまりは凍結までの時間が短時間であることが好ましい。さらには、解凍後ただちにガラス化液を希釈する必要がある。
　ガラス化保存法を用いた細胞又は組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化保存法の適用が凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。
　ガラス化保存法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化保存法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化保存法が有効であることが示されている。このように、ガラス化法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。
　特許文献３、特許文献４では、ヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用した卵凍結保存用具を使用して、顕微鏡観察下で該フィルム上に極少量のガラス化液と共に卵子又は胚を載置し、凍結保存する方法が提案されている。
　特許文献５では、卵子又は胚をガラス化液と共にガラス化保存液除去材の上に載置し、下部から吸引することで卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を除き、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案されている。なお、ガラス化保存液除去材としては、金網、紙などの天然物や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが記載されている。また余分なガラス化液を除き、また細胞を載置する際の作業性を向上することが可能な凍結保存用治具として、例えば、特定のヘーズ値を有するガラス化液吸収体を有するガラス化凍結保存用治具が特許文献６に記載されている。
　一方、特許文献７には細胞を培地とともに保存する際に用いられる細胞保存容器に関し、該容器の内面が、細胞が付着しにくい材料で形成された容器、具体的には容器の内面に親水性材料や疎水性材料等が結合または被覆された容器により、保存中における容器壁面への細胞の接着を防止できることが記載され、親水性材料としてアクリルアミド系重合体やポリビニルアルコール等が例示され、疎水性材料としてフッ素樹脂やシリコーン樹脂が例示されている。
特許第３０４４３２３号公報 特開２００８－５８４６号公報 特開２００２－３１５５７３号公報 特開２００６－２７１３９５号公報 国際公開第２０１１／０７０９７３号 特開２０１４－１８３７５７号公報 特開２００４－１８５０４号公報
Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３４５：１７０－１７２（１９９０）
　特許文献３、特許文献４では、卵子又は胚を載置するフィルムの幅を制限することにより、少ない量のガラス化液とともに卵子又は胚を凍結保存し、優れた生存率を得る方法が提案されている。しかしながら、この方法では、作業者の操作によって、極少量のガラス化液とともに卵子又は胚をフィルム上に載置する際に、操作の難度が高いといった問題があった。また、この方法をもとにしたクライオトップ法では、より少ない量のガラス化液と共に卵子又は胚を凍結保存するために、一度ガラス化液と共に卵子又は胚をフィルム上に載せた後に、余分なガラス化液を吸引してフィルム上から除去するといった煩雑な操作がされることもある。さらに、卵子又は胚を凍結後に融解する際、しばしばフィルム上の卵子又は胚がフィルム上に固着してしまい、これらを回収する際にも高い技量が要求されるという問題もある。
　特許文献５では、卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を除くことにより、優れた生存率でこれらの生殖細胞を凍結保存させる方法が提案されている。しかしながら、上記公報記載の方法では、余分なガラス化液を除く際に、下部からの吸引操作を必要とするため、煩雑な操作となり、短時間でガラス化凍結保存操作を行う場合には不向きである。さらには、下部からの吸引が不十分であると余分なガラス化液が残存する問題がある。また、特許文献３、特許文献４と同様に、凍結後に融解する際、卵子又は胚がフィルム上に固着してしまい、回収する際にも高い技量が要求されるという問題もある。特許文献６では、卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を作業者が除く必要はなく、良好な作業性が得られるものの、ガラス化液吸収体がガラス化液を吸収する際に、卵子又は胚は、ガラス化液吸収体にとりわけ強固に固着することから、卵子又は胚を回収する際にとりわけ高い技量が要求されるという問題があった。
　本発明は、細胞又は組織の凍結保存作業を容易にかつ確実に行うことが可能な、細胞又は組織の凍結保存用治具を提供することを主な課題とする。より具体的には、細胞又は組織をガラス化液等の保存液に浸漬し、細胞又は組織を保存液と共に該凍結保存用治具に載置して凍結保存した後、該細胞又は組織を融解する際に、細胞又は組織を容易に剥離、回収することができる凍結保存用治具を提供することを第一の課題とする。また、前記した細胞又は組織を容易に回収できることに加え、ガラス化液等の保存液の優れた吸収性を有する凍結保存用治具を提供することを第二の課題とする。更には、凍結保存後の細胞又は組織を容易に剥離、回収することができる凍結保存方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する細胞又は組織の凍結保存用治具（本明細書中、「細胞又は組織の凍結保存用治具」を、単に「凍結保存用治具」ともいう）によって、上記課題を解決できることを見出した。
（１）細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、水溶性高分子化合物を含有する層を有することを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具。
（２）上記水溶性高分子化合物が、エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールから選択される少なくとも１種類であることを特徴とする、上記（１）に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
（３）上記水溶性高分子化合物が、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールであることを特徴とする、上記（１）に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
（４）上記水溶性高分子化合物を含有する層が更に無機微粒子を含有することを特徴とする、上記（１）～（３）のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
（５）上記載置部が保存液吸収体を有し、該保存液吸収体上に上記水溶性高分子化合物を含有する層を有することを特徴とする、上記（１）～（４）のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
（６）上記（１）～（５）のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具の載置部上に、保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置し、細胞又は組織を載置部に保持した状態で凍結保存用治具を液体窒素の中に浸漬することにより細胞又は組織を凍結することを特徴とする、細胞又は組織の凍結保存方法。
（７）上記保存液が、保存液の全質量に対して１０質量％以上の耐凍剤を含むガラス化液であることを特徴とする、上記（６）に記載の細胞又は組織の凍結保存方法。
　上記（１）の発明によれば、細胞又は組織の凍結保存作業において、凍結した細胞又は組織を融解する際に、細胞又は組織を容易に回収することができる凍結保存用治具を提供することができる。上記（２）～（４）の発明によれば、凍結した細胞又は組織を融解する際に、細胞又は組織をとりわけ容易に回収することができる凍結保存用治具を提供することができる。上記（５）の発明によれば、上記した効果に加えて、細胞又は組織を凍結保存用治具の載置部に載置する際、細胞又は組織の外周に付着した余分な保存液を保存液吸収体が吸収することから、余分な保存液を除くためのその他の操作（例えば、保存液吸収体下部からの吸引除去操作や、マイクロピペット等を用いた細胞又は組織周囲からの直接的な吸引除去操作）を特に必要とせずに、細胞又は組織の凍結保存作業を容易かつ簡便に行うことが可能な、細胞又は組織の凍結保存用治具を提供することができる。上記（６）および（７）の発明によれば、凍結保存後の細胞又は組織を容易に剥離、回収することができる凍結保存方法を提供することができる。
図１は、本発明の細胞又は組織の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。 図２は、図１中の載置部の一例の断面構造概略図である。 図３は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の一例を示す断面構造概略図である。 図４は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。 図５は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。 図６は、載置部の表面層が無機微粒子を含有する場合の断面構造概略図の一例である。 図７は、載置部の表面層が無機微粒子を含有する場合の断面構造概略図の別の一例である。 図８は、載置部が保存液吸収体を有し、表面層が無機微粒子を含有する場合の一例を示す断面構造概略図である。 図９は、載置部が保存液吸収体を有し、表面層が無機微粒子を含有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。 図１０は実施例２４の凍結保存用治具の載置部表面の走査型電子顕微鏡観察画像である。
　本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を凍結保存する際に用いられるものである。本明細書中で細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。
　本発明の凍結保存用治具は、凍結保存操作に用いるものであり、好ましくはガラス化凍結保存操作に用いるものである。このため本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具として好適に使用される。詳細には、本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織が載置された凍結保存用治具を液体窒素等の冷却溶媒に浸漬し凍結させるためのものである。また凍結保存用治具上に載置された細胞又は組織を融解する際には、細胞又は組織を凍結保存用治具と共に冷却媒体から取り出し、融解液中に浸漬させて融解する。本発明の凍結保存用治具を用いて凍結保存操作を行う場合、細胞又は組織は、通常、保存液と共に載置部の水溶性高分子化合物を含有する層上に載置される。本発明の凍結保存用治具を用いると、細胞又は組織を載置した際にこれを確実に保持することができ、また融解時には容易に細胞又は組織を回収できることから、細胞又は組織の凍結保存にかかる作業を容易にかつ確実に行うことができる。本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織の凍結保存用具、細胞又は組織の保存用具、細胞又は組織の凍結保存器具、細胞又は組織の保存用器具と言い換えることができる。
　本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、水溶性高分子化合物を含有する層（以下、本発明における表面層あるいは単に表面層とも記載）を有する。かかる表面層は融解液に対して可溶性であることが好ましい。ここで可溶性とは２５℃の融解液に対する表面層の溶解度が０．２質量％以上であることを意味する。本発明の凍結保存用治具は上述の通り、凍結操作時に、細胞又は組織を保存液と共に凍結保存用治具の水溶性高分子化合物を含有する層上に載置した後に、冷媒（例えば液体窒素）に浸漬、凍結し、融解時には、凍結した細胞又は組織を凍結保存用治具と共に取り出し、融解液中に浸漬して融解するものであるが、細胞又は組織を融解する際に、水溶性高分子化合物を含有する層の全体又は一部が融解液中に溶解することにより、細胞又は組織が凍結保存用治具の載置部に固着することなく、容易に剥離・回収することが可能となる。
　本発明においては、上記載置部が保存液吸収体を有することが好ましく、該保存液吸収体上に上記水溶性高分子化合物を含有する層（表面層）を有することが好ましい。
　本発明の凍結保存用治具の載置部が保存液吸収体を有し、更に該載置部の最表面に本発明における表面層を有する場合には、上記効果に加えて、該保存液吸収体が余分な保存液を吸収するので、余分な保存液を除くためのその他の操作を特に必要とせず、作業性が格段に向上する。また、そのように操作された細胞又は組織は極少量の保存液に覆われており、凍結作業する場合でも速やかに凍結状態にすることができる。さらに、前記したガラス化凍結法においては、保存液が多量の耐凍剤を含有することによる化学的毒性が問題となるが、載置部が保存液吸収体を有する凍結保存用治具によれば、載置された細胞又は組織周辺のガラス化液が極少量となることで、細胞又は組織の生存率の向上が期待できる。載置部が保存液吸収体を有する場合、保存液吸収体と表面層との間に、別の層を有さないことが好ましい。
　以下に、本発明の凍結保存用治具の構成を説明する。
　本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、水溶性高分子化合物を含有する層を有する。ここで細胞又は組織を載置する載置部の最表面とは、細胞又は組織が保存液とともに載置される表面部分に相当する。本発明において載置部は、本発明における表面層を、各種樹脂フィルム、金属、ガラス、ゴム等の非吸収性支持体上や、保存液吸収体上に有することが好ましく、特に保存液吸収体上に本発明における表面層を有することが好ましい。なお、本発明において該表面層は、細胞又は組織を載置する載置部全体において均一な層を形成していなくても良く、例えば海島状やストライプ状の層であっても良い。すなわち、本発明における表面層は、細胞又は組織を保存液と共に載置する箇所の最表面に存在することが重要であり、細胞又は組織が載置されない箇所においては、該表面層が存在していても、存在していなくても良い。このように載置部は、表面層をその最表面全体に有してもよく、最表面の一部に有してもよい。
　本発明において表面層が含有する水溶性高分子化合物としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、デンプンおよびその誘導体、ゼラチン、カゼイン、アルギン酸およびその塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、スチレン・マレイン酸共重合体塩、スチレン・アクリル酸共重合体塩等が挙げられる。中でも、アルギン酸およびその塩やゼラチンは保存液に対する溶解性と適度な被膜形成作用が得られることから好ましく、ポリビニルアルコールは、非生物由来素材であり、かつ細胞又は組織に対しても低毒性であるため、特に好ましい。これらの水溶性高分子化合物は、単独で用いても良いし、２種類以上を併用しても良い。また表面層は、融解液に対する溶解度が１０質量％を下回らない範囲で、架橋剤を含有することができる。なお、本発明の水溶性高分子化合物の水溶性とは、２５℃における水に対する溶解量が少なくとも０．５質量％以上であることを意味し、より好ましくは５質量％以上である。
　表面層が含有する水溶性高分子化合物の固形分量は、０．０１～１００ｇ／ｍ２であることが好ましく、より好ましくは０．１～１０ｇ／ｍ２である。水溶性高分子化合物の固形分量が１００ｇ／ｍ２を超える場合には、融解液中への水溶性高分子化合物の溶出・混入が多くなり、好ましくない。一方で、水溶性高分子化合物の固形分量が０．０１ｇ／ｍ２を下回る場合には、融解する際に、細胞又は組織を容易に剥離できない場合がある。
　本発明において表面層は、水溶性高分子化合物としてエタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールから選択される少なくとも１種類を含有することが好ましい。エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールは、その被膜の優れた親水性、適度な強度、適度な溶解性が奏功し、融解作業の際に、細胞又は組織が載置部に固着することなく、とりわけ容易に剥離・回収することが可能となる。エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールは、様々なケン化度の該ポリビニルアルコールを用いることができるが、細胞又は組織の良好な剥離性が得られる観点から、これらポリビニルアルコールのケン化度は９４ｍｏｌ％以下であることが好ましい。また、これらの該ポリビニルアルコールは、単独で用いても良いし、２種類以上を併用しても良い。エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールは、例えば日本合成化学工業（株）から市販される物を入手し、使用することができる。
　表面層が、エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールから選択される少なくとも１種類のポリビニルアルコールを含有する場合、かかる表面層は、その他の水溶性高分子化合物を一又は二種類以上含有することができる。該水溶性高分子化合物としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、デンプンおよびその誘導体、ゼラチン、カゼイン、アルギン酸およびその塩、エタンジオール基およびエチレンオキサイド基を有さないポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、スチレン・マレイン酸共重合体塩、スチレン・アクリル酸共重合体塩等が挙げられる。その他の水溶性高分子化合物の含有量は、エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールから選択される少なくとも１種類のポリビニルアルコールの固形分量に対して、５０質量％以下であることが好ましい。
　本発明において表面層は、水溶性高分子化合物としてケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールを含有することが好ましい。ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールの被膜を表面層として用いることで、優れた細胞又は組織の剥離性が得られることから、融解作業の際に、細胞又は組織が載置部に固着することなく、容易に回収することが可能となる。さらに、ケン化度が８１ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールを選択することで、あるいはケン化度が９４ｍｏｌ％以下でかつ、重合度が４００以下であるポリビニルアルコールを選択することで、細胞又は組織の剥離性にとりわけ優れた凍結保存用治具を得ることができる。これらの該ポリビニルアルコールは、単独で用いても良いし、２種類以上を併用しても良い。
　表面層が、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコール含有する場合、かかる表面層は、その他の水溶性高分子化合物を一又は二種類以上含有することができる。該水溶性高分子化合物としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、デンプンおよびその誘導体、ゼラチン、カゼイン、アルギン酸およびその塩、ケン化度が９４ｍｏｌ％を超えるポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、スチレン・マレイン酸共重合体塩、スチレン・アクリル酸共重合体塩等が挙げられる。その他の水溶性高分子化合物の含有量は、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールの固形分量に対して、５０質量％以下であることが好ましい。
　本発明において表面層は、上記した水溶性高分子化合物に加え、更に無機微粒子を含有することが好ましい。無機微粒子は表面層の親水性を低下させず、また表面層に微細な凹凸を形成し載置部と細胞又は組織の接触面積を低下させることが可能となるため、細胞又は組織が凍結保存用治具の載置部に固着することなく、より容易に剥離・回収することが可能となる。
　かかる無機微粒子としては、例えば軽質炭酸カルシウム、重質炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、二酸化チタン、酸化亜鉛、水酸化亜鉛、珪酸カルシウム、珪酸マグネシウム、非晶質合成シリカ、アルミナ、アルミナ水和物、水酸化マグネシウム等が挙げられる。かかる無機微粒子の平均粒子径（一次粒子が凝集して二次凝集体を形成している無機微粒子では平均二次粒子径、二次粒子を形成しない無機微粒子においては平均一次粒子径）は１μｍ以下が好ましく、より好ましくは６００ｎｍ以下である。無機微粒子の平均粒子径の下限は特に限定されないが、６ｎｍ以上であることが好ましい。平均粒子径は、例えば、一次粒子が凝集して二次凝集体を形成している無機微粒子であれば、レーザー散乱式の粒度分布計（例えば、堀場製作所社製、ＬＡ９１０）を用いて個数メジアン径として求めることができる。また二次粒子を形成しない無機微粒子であれば、一次粒子径が判別できるまで分散された粒子の電子顕微鏡写真より一定面積内に存在する１００個の粒子の平均粒子径として求めることができる。中でも一次粒子同士は凝集せず、二次粒子を形成しない無機微粒子（以下、単一粒子分散性の無機微粒子という。）は、載置部における細胞又は組織との接触面積が比較的小さくなることから好ましい。このような観点から、コロイダルシリカが好適である。コロイダルシリカは、例えば日産化学工業工業（株）からスノーテックス（登録商標）として市販されている。また、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）から市販されているパーコール（商品名）のような、ポリビニルピロリドンを粒子表面に被覆したようなコロイダルシリカも好ましく用いることができる。
　本発明において、載置部が後述する保存液吸収体を有する場合には、該保存液吸収体が有する細孔を無機微粒子が閉塞することなく、載置部の最表面に水溶性高分子化合物及び無機微粒子を含有する層を設けることが好ましい。このため無機微粒子の粒子径は保存液吸収体が有する細孔径よりも大きくすることもできるし、また保存液吸収体の吸収性が著しく減少しない範囲であれば、保存液吸収体の細孔内部に、無機微粒子が存在することも可能である。
　本発明の凍結保存用治具が有する無機微粒子の固形分量としては、０．０１～１００ｇ／ｍ２であることが好ましく、より好ましくは０．１～１０ｇ／ｍ２である。無機微粒子の固形分量が１００ｇ／ｍ２を超える場合には、融解液中への無機微粒子の溶出・混入が多くなり、好ましくない。一方で、無機微粒子の固形分量が０．０１ｇ／ｍ２を下回る場合には、融解する際に、細胞又は組織を容易に剥離できない場合がある。
　本発明において表面層が上記した水溶性高分子化合物に加え更に無機微粒子を含有する場合、水溶性高分子化合物に対する無機微粒子の含有比率（無機微粒子の合計質量／水溶性高分子化合物の合計質量）は１～１００であることが好ましく、より好ましくは、１．６７～５０である。水溶性高分子化合物に対する無機微粒子の含有比率をこのような範囲にすることにより、載置部の表面（該表面層）は適度な凹凸を維持でき、融解作業時に容易に細胞又は組織を回収することができる。また、例えば、凍結保存用治具使用前の無機微粒子の脱落（粉落ち）や、凍結作業時にガラス化液を滴下した際の無機微粒子の意図しない脱落を抑制することができる。
　本発明において載置部は、細胞または組織を凍結保存する際に、これらを支持する目的で支持体を有し、該支持体上に表面層を有することが好ましい。かかる支持体（非吸収性支持体）としては、例えば、各種樹脂フィルム、金属、ガラス、ゴム等が挙げられる。このような支持体は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂フィルムは、取り扱いの観点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。また支持体の全光線透過率が８０％以上であると、載置部に載置した細胞又は組織を透過型顕微鏡を用いて容易に確認することができるため好ましい。さらに、温度伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で金属製支持体も好適に用いることができる。金属製支持体の具体例としては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、ステンレスなどを挙げることができる。上記した支持体の厚さは１０μｍ～１０ｍｍであることが好ましい。また、目的に応じて、支持体の表面をコロナ放電処理のような電気的な方法や、化学的な方法により易接着処理することもでき、さらには粗面化することもできる。さらに、支持体と表面層の間に別の層を一又は複数有していても良いし、支持体の表側に表面層を有し、裏側に、別の層を一又は複数有していても良い。また、表面層を支持体の表裏に設けることもできる。支持体は後述する保存液吸収体であっても良い。
　次に、本発明の凍結保存用治具が保存液吸収体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有する場合について説明する。
　前述の通り、本発明の細胞又は組織の載置部が保存液吸収体を有する場合、細胞又は組織に付着した保存液の量が多くても保存液吸収体が保存液を除くことができるため、保存液の除去操作が不要となり作業性が格段に向上する。またそのように操作された細胞又は組織は極少量の保存液に覆われており、凍結操作する場合でも速やかに凍結状態にすることができる。さらに、前記したガラス化凍結法においてはグリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液が保存液として利用され、この保存液には多量の耐凍剤による化学的毒性が存在するが、載置部が保存液吸収体を有する凍結保存用治具によれば、載置された細胞又は組織周辺のガラス化液が極少量となることで、細胞又は組織の生存率の向上が期待できる。したがって載置部が保存液吸収体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有する凍結保存用治具は、ガラス化凍結保存用治具として好適である。
　本発明において、載置部が保存液吸収体を有する場合には、該保存液吸収体が有する細孔を閉塞することなく、載置部の最表面に表面層を設けることが好ましい。また、保存液吸収体の吸収性が著しく低下しない範囲であれば、保存液吸収体の細孔内部に、表面層が存在することも可能である。
　本発明において、載置部が保存液吸収体を有する場合には、表面層の固形分量が多くなるほど、保存液吸収体が有する細孔が狭くなるために、保存液の吸収性は低下する傾向にある。一方、融解作業の際の細胞又は組織の剥離性は、表面層の固形分量が多くなるほど優位である。用いる保存液吸収体の厚み、細孔径、空隙率によるが、載置部が保存液吸収体を有する場合における表面層の固形分量は、上記性能のバランスを考え、適宜調整でき、好ましくは０．１～５ｇ／ｍ２である。
　本発明の凍結保存用治具が有する保存液吸収体としては、繊維からなるシート、多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の各種シートが挙げられる。本発明における「多孔性」とは、上記したシートが表面に気孔（細孔）を有する構造体であることを意味し、シート表面及び内部に連続的な気孔を有する構造体であることがより好ましい。また保存液吸収体（上記した各種シート）の厚みは１０μｍ～５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２０μｍ～２．５ｍｍである。保存液吸収体が、薄いシートである場合には、補強部材として前記した非吸収性支持体を用いることができる。
　本発明において、保存液吸収体として用いる繊維からなるシートとしては、紙又は不織布が例示され、紙はバインダーなどの結着剤成分の紙全体に占める割合が１０質量％以下である紙が好ましく、より好ましくは５質量％以下であり、更に３質量％以下である紙が好ましい。これにより優れた保存液の吸収性が得られる。また、該紙に含まれる製紙用薬品の紙全体に占める割合は１質量％以下であることが好ましい。通常紙に含まれている製紙用薬品のうち、例えば蛍光増白剤や染料、カチオン系のサイズ剤などには細胞への影響が懸念される場合がある。
　繊維からなるシートが紙である場合、密度が０．１～０．６ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０～１３０ｇ／ｍ２の紙であることが好ましい。特に密度が０．１２～０．３ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０～１００ｇ／ｍ２である紙は、保存液の吸収性に優れ、さらには、透過型顕微鏡を用いて載置部上に載置した細胞又は組織を観察することができるような、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好ましい。
　繊維からなるシートが不織布である場合、該不織布が含有する繊維としては、セルロース繊維、セルロース繊維からなる再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、さらにはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維、ポリエステル繊維、ナイロン繊維、アクリル繊維、ポリプロピレン繊維、ポリエチレン繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ビニロン繊維、ガラス繊維、絹繊維などが挙げられ、これら繊維を各種混合した不織布も用いることができる。中でもセルロース繊維、セルロース繊維由来の繊維でセルロース再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、更にはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維が好ましい。
　繊維からなるシートが不織布である場合、密度が０．１～０．４ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０～１３０ｇ／ｍ２の不織布であることが好ましい。特に密度が０．１２～０．３ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０～１００ｇ／ｍ２である不織布は、保存液の吸収性に優れ、さらには細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好ましい。
　保存液吸収体として用いられる不織布においても前記した紙と同様に、バインダーなどの結着剤成分の不織布に占める割合が１０質量％以下である不織布が好ましく、より好ましくは５質量％以下であり、更に３質量％以下である不織布が好ましい。特に結着剤を含有しない不織布が好ましい。
　不織布は紙と異なり様々な製造方法があるが、上記した結着剤成分が低減された不織布としては、スパンボンド法、メルトブロー法で製造された不織布、更には湿式法又は乾式法で繊維を並べた後、水流交絡法又はニードルパンチ法で製造された不織布が好適に使用できる。また上記した通り、本発明において不織布が含有する好ましい繊維としては、セルロース繊維、セルロース繊維由来の繊維でセルロース再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、更にはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維が挙げられるが、これら繊維を用いて製造する場合は、湿式法、乾式法関わらず水流交絡法又はニードルパンチ法での製造方法が好適である。
　本発明において、保存液吸収体として用いる多孔性樹脂シートとしては、例えば特公昭４２－１３５６０号公報や、特開平０８－２８３４４７号公報に記載される、少なくとも一軸方向に延伸し、樹脂の融点以上に加熱し焼結することで得た微細繊維状構造により多孔質構造を形成した樹脂シート、特開２００９－２３５４１７号公報に記載される、乳化重合又は粉砕等の方法によって得られた熱可塑性樹脂の固体粉末を金型に充填し、加熱、焼結して粉末粒子表面を融着させて冷却することにより、多孔質構造を形成した樹脂シート等が挙げられる。多孔性樹脂シートを保存液吸収体として用いた場合、保存液の吸収性に優れ、さらには細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため、好ましい。
　上記した多孔性樹脂シートを形成する樹脂としては、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子ポリエチレン等の各種ポリエチレンやポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレンやポリビニリデンジフロライド等のフッ素樹脂、エチレン－酢酸ビニル共重合体、ポリアミド、スチレン－アクリロニトリル共重合体、スチレン－ブタジエン－アクリロニトリル三元共重合体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。中でもポリテトラフルオロエチレンやポリビニリデンジフロライド等のフッ素樹脂は、細胞又は組織をガラス化液等の保存液と共に載置部に載置した場合、該多孔性樹脂シートの透明性が高くなり、透過顕微鏡観察下での細胞又は組織の視認性が飛躍的に高まり、細胞又は組織の視認性にとりわけ優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好適である。また多孔性樹脂シートとしては、理化学実験用途や研究用途として市販されている、濾過用のメンブレンフィルターも使用できる。
　本発明において、保存液吸収体として用いる多孔性金属シートとしては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、錫、亜鉛、鉛、チタン、ニッケル、ステンレス等の金属からなる多孔性金属シートが挙げられる。また多孔性金属酸化物シートとしては、シリカ、アルミナ、ジルコニウム、石英ガラスなどの金属酸化物からなる多孔性金属酸化物シートを好ましく利用することができる。また多孔性金属シートおよび多孔性金属酸化物シートは、上記した金属および金属酸化物をそれぞれ２種類以上含有する多孔性シートであっても良い。中でも多孔性金属酸化物シートは、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため、好ましい。
　本発明において、保存液吸収体として用いる多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シートの製造方法としては、一般に知られた方法を使用することができる。ガラス化液吸収体が多孔性金属シートの場合には、粉末冶金法、スペーサー法などの方法を使用することができる。また、樹脂射出成型と粉末冶金法を組み合わせた所謂パウダースペースホルダー法も好ましく使用できる。例えば、国際公開第２００６／０４１１１８号や特許第４５７８０６２号公報に記載された方法などを用いることができる。より具体的には、金属粉末とスペーサーとなる樹脂を混合後、圧力をかけて成型した後、高温環境下で焼成することで、金属粉末を焼き固め、スペーサーとなる樹脂を気化させて、多孔性金属シートを得ることができる。パウダースペースホルダー法等を用いる場合には、金属粉末とスペーサーとなる樹脂に加えて、樹脂のバインダーを混合することができる。また、金属粉末を高温で加熱した後に、ガスを注入して空隙を作製する発泡溶融法、ガス膨張法などの金属多孔質体の製造方法も使用することができる。さらには、発泡剤を用いて金属多孔質体を製造するスラリー発泡法のような製造方法も使用することができる。保存液吸収体が多孔性金属酸化物シートの場合には、例えば、特開２００９－２９６９２号公報や特開２００２－１６０９３０号公報に記載された方法などを用いることができる。
　上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体の表面は、表面層との親和性を高めるために、親水化処理することもできる。親水化処理の方法としては、グラフト改質法、非溶出性の親水性物質を塗布することによるコーティング法、コロナ放電、プラズマ処理、エキシマレーザー等の各種エネルギーを用いた一般的な表面改質方法を使用することができる。
　保存液吸収体が、上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体である場合には、該多孔質体の細孔径は、０．０２～１３０μｍであることが好ましく、より好ましくは０．０５～６０μｍである。細孔径が０．０２μｍ未満の範囲では、保存液の滴下時に保存液の吸収性能が十分でない場合がある。また、多孔性シートの製造が難しいという問題がある。一方、細孔径が１３０μｍを超える範囲では、保存液の吸収性能が十分でない場合がある。なお、多孔質体の細孔径は、多孔性樹脂シートの場合には、バブルポイント試験により測定される最も大きい細孔の直径である。また多孔性金属シートおよび多孔性金属酸化物シートの場合には、該多孔質体の表面及び断面の画像観察から測定した平均細孔直径である。
　保存液吸収体の空隙率は２０容量％以上であることが好ましく、より好ましくは３０容量％以上である。また保存液吸収体が、上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体である場合、多孔質体の内部の気孔は、厚み方向のみならず、厚み方向に対して垂直な方向に対しても連続的な構造であることが好ましい。このような構造を有すると、多孔質体内部の気孔を有効に用いることができるために、保存液の高い吸収性能が得られる。保存液吸収体の厚み、多孔質体の空隙率は、用いる細胞又は組織の種類や細胞又は組織と共に滴下される保存液の滴下量等に応じて、適宜選択することができる。
　上記した空隙率とは、以下の式で定義される。ここで空隙容量Ｖは水銀ポロシメーター（測定器名称　Ａｕｔｏｐｏｒｅ　ＩＩ　９２２０　製造者　ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い測定・処理された、保存液吸収体における細孔半径３ｎｍから４００ｎｍまでの累積細孔容積（ｍｌ／ｇ）に、保存液吸収体の乾燥固形分量（ｇ／平方メートル）を乗ずることで、単位面積（平方メートル）当たりの数値として求めることができる。また保存液吸収体の厚みＴは保存液吸収体の断面を電子顕微鏡で撮影し測長することで得ることができる。
Ｐ＝（Ｖ／Ｔ）×１００（％）
　Ｐ：空隙率（％）
　Ｖ：空隙容量（ｍｌ／ｍ２）
　Ｔ：厚み（μｍ）
　載置部が保存液吸収体に加えて補強部材として非吸収性支持体を有する場合には、保存液吸収体と非吸収性支持体との間に、接着層を設けることができる。接着層としては、湿気硬化性の接着物質に代表されるような瞬間接着組成物、ホットメルト接着組成物、光硬化性接着組成物などを含有することが可能であり、例えば、ポリビニルアルコール、ヒドロキシセルロース、ポリビニルピロリドン、澱粉糊のような水溶性高分子化合物、酢酸ビニル系樹脂、アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂、ウレタン系樹脂、エラストマー系樹脂、シアノアクリレート系樹脂、フッ素系樹脂、シリコーン系樹脂、ニトロセルロース系樹脂、ニトリルゴム系樹脂、スチレン－ブタジエン系樹脂、ユリア系樹脂、スチレン系樹脂、フェノール系樹脂、ポリイミド系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂、ビスマレイミド系樹脂、オレフィン系樹脂、ＥＶＡ系樹脂などの非水溶性樹脂を含有する組成物が好ましく利用できる。接着層は、一種類の樹脂を含有しても良いし、複数種類の樹脂を含有しても良い。接着層の固形分量は、０．０１～１００ｇ／ｍ２の範囲が好ましく、更に０．１～５０ｇ／ｍ２の範囲がより好ましい。
　本発明の凍結保存用治具が有する載置部の面積は、細胞又は組織と共に滴下される保存液の滴下量等に応じて適宜設定すれば良く、特に限定されないが、例えば、滴下する保存液１μＬにつき１ｍｍ２以上とすることが好ましく、２～４００ｍｍ２とすることがより好ましい。また、同一の凍結保存用治具において、載置部が、非吸収性支持体上に保存液吸収体を複数有する形態である場合には、連続している１つの保存液吸収体部分が前記した面積であることが好ましい。
　本発明における載置部の製造方法は特に限定されないが、例えば、支持体上又は保存液吸収体上に表面層を有する載置部は、支持体上又は保存液吸収体上に表面層を形成することにより得ることができる。本発明における表面層の形成方法は特に限定されない。例えば、水溶性高分子を含有する塗布液を支持体又は保存液吸収体に塗布した後、その後に乾燥を行うことにより、支持体上又は保存液吸収体上に表面層を形成することができる。表面層が無機微粒子を含む場合には、水溶性高分子及び無機微粒子を含有する塗布液を用いて表面層を形成すればよい。塗布液は、水、有機溶媒等の溶剤等を含んでもよい。塗布液を塗布する方法も特に限定されず、適宜選択すればよい。
　以上、本発明の凍結保存用治具の載置部について説明してきた。本発明の凍結保存用治具は、載置部と共に把持部を有していても良い。把持部を有すると、凍結保存作業時及び融解作業時の作業性が良好となるため、好ましい。
　図１は本発明の細胞又は組織の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。図１において凍結保存用治具７は、把持部１と載置部２から構成される。
　把持部は耐液体窒素素材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアプラスチック、更にはガラスなどを好適に用いることができる。図１中、把持部１は円柱形であるが、その形状は任意である。また、後述するように、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させないことを目的に、凍結前に細胞又は組織を付着させた載置部２にキャップを被せることがあるが、この場合、把持部１を、載置部２を有さない側から、載置部２を有する側に向かって、円柱の径が連続的に小さくなる形状とすることで、キャップを被せる際の作業性を向上させることも可能である。載置部２の形状は、ハンドリング上、短冊状又はシート状であることが好ましい。
　図１の把持部１と載置部２の接続方法について説明する。把持部１が樹脂の場合、例えば、成形加工するときにインサート成形により載置部２を把持部１に接続することができる。更に、把持部１に図示しない構造体挿入部を作製して接着剤にて載置部２を接続することができる。接着剤は様々なものが使用できるが、低温に強いシリコーン系やフッ素系の接着剤を好適に用いることができる。
　図２は、図１中の載置部の一例の断面構造概略図である。図２中、載置部２ａは、支持体４上に表面層３を有する構造である。このような構造の載置部２ａを得るためには、例えば、支持体上に水溶性高分子化合物を含有する塗布液をスライドホッパー方式で塗布する方法や、ディップコーティングで塗布する方法などの製造方法を用いることができる。
　図３～５は、載置部が保存液吸収体を有し、該保存液吸収体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有する凍結保存用治具の一例を示す断面構造概略図である。図３～５に示す保存液吸収体５は、細孔９（気孔）を有する構造体である。図３～５に示す保存液吸収体５の断面構造は一例であり、これらに限定されない。
　図３は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の一例を示す断面構造概略図である。図３中、載置部２ｂは、保存液吸収体５と保存液吸収体５上に表面層３を有する構造である。このような構造の載置部２ｂを得るためには、例えば、前記した塗布液を、保存液吸収体にスライドホッパー方式で塗布する製造方法を用いることができる。
　図４は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。図４中、載置部２ｃは、保存液吸収体５の多孔質体全体にわたって表面層３を有する構造である。このように、保存液吸収体上に表面層が存在する場合、表面層は保存液吸収体表面において連続した層を形成する必要はなく、保存液吸収体の孔表面に存在しても良い。この構造は、多孔質体の細孔を閉塞しないため、凍結時のガラス化液の吸収性と融解時の細胞又は組織の剥離性を両立することができるため好ましい。この態様においても、微視的には載置部の最表面には本発明における表面層が存在するので、図４は本発明の一例を示すものであるといえる。このような構造の載置部２ｃを得るためには、例えば、上記した塗布液をディップコーティングで塗布する製造方法を用いることができる。
　図５は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。図５中、載置部２ｄは、保存液吸収体５の多孔質体全体にわたって表面層３を有する図４の形態に加えて、支持体４と接着層６を有する。この構造の場合、例えば保存液吸収体５に用いる多孔質体が自立性に乏しい場合であっても、凍結時・融解時の操作をより確実に行うことができる。
　図６は、載置部の表面層が無機微粒子を含有する場合の断面構造概略図の一例である。図６中、載置部２ｅは、支持体４上に層状に配置された無機微粒子８を有する構造を有する。このような構造の載置部２ｅを得るためには、例えば、支持体上に水溶性高分子化合物及び無機微粒子を含有する塗布液をスライドホッパー方式で塗布する方法や、ディップコーティング方式で塗布する方法などの製造方法を用いることができる。
　図７は、載置部の表面層が無機微粒子を含有する場合の断面構造概略図の別の一例である。図７中、載置部２ｆは、支持体４上に無機微粒子８が点在した構造である。
　図８は、載置部が保存液吸収体を有し、表面層が無機微粒子を含有する場合の一例を示す断面構造概略図である。図８中、載置部２ｇは、保存液吸収体５の表面上に、無機微粒子８を有する。このような構造の載置部２ｇを得るためには、保存液吸収体５の細孔径よりも粒子径が大きい無機微粒子８を利用し、該無機微粒子８と水溶性高分子化合物を含有する塗布液を、上記したスライドホッパー方式や、ディップコーティング方式等の塗布方法で塗布すれば良い。
　図９は、載置部が保存液吸収体を有し、表面層が無機微粒子を含有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。図９中、載置部２ｈは、保存液吸収体５の最表面に無機微粒子８を含有すると共に、保存液吸収体５の細孔内部にも、無機微粒子８を有する。このような構造の載置部２ｈを得るためには、保存液吸収体５の細孔径よりも粒子径が小さい無機微粒子８を利用し、該無機微粒子８と水溶性高分子化合物を含有する塗布液を、上記したスライドホッパー方式や、ディップコーティング方式等の塗布方法で塗布すれば良い。また保存液吸収体５の細孔径よりも粒子径が小さい無機微粒子８を利用した場合であっても、該無機微粒子８が細孔内部に入り込むことで細孔径が小さくなることから、図９にて示したように、保存液吸収体５の表面上に、層状に無機微粒子が配置される場合もある。図６～図９に示す載置部の断面概略図は、最表面に、水溶性高分子化合物及び無機微粒子化合物を含有する層を有する載置部の一例を示す断面概略図である。なお、上記した図６から図９においては、表面層３（水溶性高分子化合物）を省略し、無機微粒子８のみを記載した。
　本発明の、細胞又は組織の凍結保存用治具により、細胞又は組織を長期凍結保存する場合、前述の通り、細胞又は組織を外界と遮断するためにキャップを被せる、又は該凍結保存用治具を任意の形状の容器に入れて密閉することも可能である。液体窒素が滅菌されておらず、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させて凍結させる場合においては、凍結保存用治具が滅菌されていても滅菌状態を保証できない場合がある。よって凍結前に細胞又は組織を付着させた載置部にキャップをして、又は凍結保存用治具を容器中に密閉して、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させないで凍結させることがある。また、欧州など海外先進国では前記のように液体窒素に直接接触させない凍結方法が主流である。このような理由からキャップ及び容器は耐液体窒素性のある素材である各種金属、各種樹脂、ガラス、セラミックなどで作製することが好ましい。形状としては特に限定されず、例えば、キャップは、鉛筆用のキャップのような半紡錘状又はドーム状等のキャップ、円柱状のストローキャップなど本体部と接触せず、細胞又は組織を外界と遮断できるような形状ならどのような形状でも良い。容器は、載置された細胞又は組織に接触せずに、凍結保存用治具を被包又は収納して密閉できるものであれば良く、その形状は特に限定されない。
　本発明においては、本発明の効果を損なわない限り、凍結保存用治具をこのような載置部上の細胞又は組織を外界と遮断することができるキャップ又は容器と組み合わせて使用することができる。また、このようなキャップ又は容器と組み合わせて使用される凍結保存用治具も、本発明に包含される。
　本発明の凍結保存用治具は、例えば、クライオトップ法において好適に用いられるものである。また、従来のクライオトップ法は、通常、単一の細胞又は１０個未満の少数の細胞の保存に用いられるが、本発明の凍結保存用治具は、より多くの細胞の保存（例えば、１０～１００００００個の細胞の保存）においても好適に用いることができる。さらには、複数の細胞からなるシート状の細胞（いわゆる細胞シート）の保存にも好適に用いることができる。本発明の凍結保存用治具を用いると、細胞又は組織の凍結保存作業において、細胞又は組織を凍結後に融解する際に、細胞又は組織を容易に回収することができる。また、載置部が保存液吸収体を有することにより、上記した効果に加えて、細胞又は組織を凍結する際に、細胞又は組織の外周に付着した余分なガラス化液を吸収することから、細胞又は組織の凍結時及び融解時に細胞外のガラス化液による損傷を受けにくく、細胞又は組織を優れた生存率で凍結保存することができる。
　本発明の凍結保存用治具を用いて細胞又は組織を凍結保存する方法は特に限定されず、例えば、まず保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置部上に滴下し、該細胞又は該組織の周囲に付着している余分な保存液をピペットなどを用いて可能な限り除くことが好ましい。このとき、該凍結保存用治具の載置部が保存液吸収体を有する場合には、上記操作は必要なく、自動的に余分な保存液が除かれる。次いで、前記細胞又は前記組織を載置部に保持した状態で凍結保存用治具を液体窒素等の中に浸漬することにより、細胞又は組織を凍結することができる。この際、前記した載置部上の細胞又は組織を外界と遮断することができるキャップを載置部に装着して、又は凍結保存用治具を前記した容器に密閉して、液体窒素等の中に浸漬することもできる。
　このように、上記細胞又は組織の凍結保存用治具の載置部上に、保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置し、細胞又は組織を載置部に保持した状態で凍結保存用治具を液体窒素の中に浸漬することにより細胞又は組織を凍結する細胞又は組織を凍結保存する方法も、本発明の１つである。
　保存液は、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、上述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤（グリセロール、エチレングリコール等）を含有させることで得られた保存液や、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの各種耐凍剤を多量に（少なくとも保存液の全質量に対して１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上）含むガラス化液を使用できる。中でも、保存液としては、保存液の全質量に対して１０質量％以上の耐凍剤を含むガラス化液が好ましい。融解作業の際は、液体窒素等の冷却溶媒中から、該凍結保存用治具を取り出し、凍結された細胞又は組織を載せた載置部を融解液中に浸漬させ、その後、細胞又は組織を回収する。
　本発明の凍結保存用治具を用いて凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、精子等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。本発明は、特にシート状構造を有する組織（例えば、細胞シート、皮膚組織など）の凍結保存に好適である。本発明の凍結保存用治具は、直接生体から採取した組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２－２０５５１６号公報で提案されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織の凍結保存についても、好適に用いることができる。本発明の凍結保存用治具は、上記のような細胞又は組織の凍結保存用治具として好適に用いられる。
　以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に、日本合成化学工業（株）製の高純度ポリビニルアルコールＥＧ－０５Ｐ（ケン化度８６．５～８９ｍｏｌ％）の５質量％水溶液を乾燥時の固形分量が５ｇ／ｍ２となるように、スライドホッパー方式にて塗布し、室温乾燥させ、図２に示す形態の載置部を作製した。この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさ（４０ｍｍ２）に裁断し、ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例１の凍結保存用治具を作製した。
（比較例１）
　実施例１の凍結保存用治具の作製において、透明ＰＥＴフィルムをそのまま用いて載置部とした以外は同様にして、比較例１の凍結保存用治具を作製した。
＜マウス卵子の凍結操作＞
　採取したマウス卵子をｐＨ指示薬として極低濃度のフェノールレッドが含まれる修正リン酸緩衝液（１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、２．７ｍＭ　ＫＣｌ、０．９ｍＭ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、５．６ｍＭ　グルコース、０．３ｍＭ　ピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌ　硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌ　ポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭ　Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭ　トレハロース）に、１５℃の環境下で１０分間浸漬させた。その後、マウス卵子を一旦取り出し、次にこのマウス卵子を温度１５℃の平衡液（７容量％エチレングリコール、０．５容量％グリセロール、９２．５容量％上記修正リン酸緩衝液）に５分間浸漬させた。次いで、平衡液から取り出したマウス卵子を温度４℃のガラス化液（３０容量％エチレングリコール、０．５容量％グリセロール、６９．５％上記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた。３０秒間のガラス化液への浸漬後、マウス卵子を実施例１又は比較例１の凍結保存用治具の載置部上に載置し、透過型顕微鏡観察下で、ピペットを用いてマウス卵子周辺の余分なガラス化液をできるだけ除いた。その後、液体窒素中に浸漬し、ガラス化凍結させた。凍結させた凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。
＜マウス卵子の融解操作と剥離性の評価＞
　マウス卵子を載置した実施例１又は比較例１の凍結保存用治具を液体窒素中から取り出し、温度３７℃の融解液（上記修正リン酸緩衝液に１Ｍスクロースを添加した溶液）に浸漬させた。浸漬後のマウス卵子の様子を透過型光学顕微鏡で観察し、融解時のマウス卵子の剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表１の「融解時の剥離性」の項目に示す。
　融解時の剥離性は以下の基準で評価した。
◎：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をわずかに振動させる程度でマウス卵子を剥離することができる（剥離に要する時間は１分以内）。
○：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部を上下左右にゆすることでマウス卵子を剥離することができる（剥離に要する時間は１分以内）。
×：把持部を上下左右にゆすることでは、１分以内にマウス卵子を剥離することができなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果から、本発明の凍結保存用治具は、融解時に優れた剥離性を示すことが判る。
（実施例２）
　支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に接着層として、ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ　ＱＲ　１７０－７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ２となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を貼り合わせた。このようにして得られた積層体を、日本合成化学工業社製の高純度ポリビニルアルコールＥＧ－０５Ｐ（ケン化度８６．５～８９ｍｏｌ％）の２質量％水溶液に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥させ、図５に示す形態の水溶性高分子化合物を含有する層を有する載置部を作製した。なお、水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で１．６ｇ／ｍ２であった。実施例１と同様に、この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさに裁断し、その後ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例２の凍結保存用治具を作製した。
（実施例３）
　ポリビニルアルコールＥＧ－０５Ｐの水溶液の濃度を１質量％とした以外は、実施例２と同様にして、実施例３の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例３の凍結保存用治具が有する水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で０．５ｇ／ｍ２であった。
（実施例４）
　ポリビニルアルコールＥＧ－０５Ｐの水溶液の濃度を０．２質量％とした以外は、実施例２と同様にして、実施例４の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例４の凍結保存用治具が有する水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で０．１ｇ／ｍ２であった。
（実施例５）
　別のポリビニルアルコールである（株）クラレ製ＰＶＡ１０３（ケン化度９８～９９ｍｏｌ％）の１質量％水溶液に積層体を浸漬させて水溶性高分子化合物を含有する層を設けた以外は、実施例２と同様にして、実施例５の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例５の凍結保存用治具が有する水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で０．５ｇ／ｍ２であった。
（実施例６）
　ポリビニルアルコールにかえて、ゼラチンであるゼライス（株）製ＰＮ５０５の１質量％水溶液に積層体を浸漬させて水溶性高分子化合物を含有する層を設けた以外は、実施例２と同様にして、実施例６の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例６の凍結保存用治具が有する水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で０．５ｇ／ｍ２であった。
（実施例７）
　太盛工業（株）製の親水化処理されたステンレス多孔質体（細孔径１．５μｍ、空隙率６５％、厚み１ｍｍ）を保存液吸収体とし、ポリビニルアルコールＥＧ－０５Ｐの１質量％水溶液に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥させ、図４に示す形態の水溶性高分子化合物を含有する層を有する載置部を作製した。なお、実施例７の水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で０．４ｇ／ｍ２であった。実施例１と同様に、この載置部をＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例７の凍結保存用治具を作製した。
（比較例２）
　実施例２の凍結保存用治具の作製において、水溶液への浸漬を行わない以外は実施例２と同様にして、水溶性高分子化合物を含有する層を有さない比較例２の凍結保存用治具を作製した。すなわち該凍結保存用治具は、易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）上に、接着層（ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ　ＱＲ　１７０－７１４１Ｐ）を介して、親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）が貼り合わされたものである。
（比較例３）
　実施例７の凍結保存用治具の作製において、水溶液への浸漬を行わない以外は実施例７と同様にして、水溶性高分子化合物を含有する層を有さない比較例３の凍結保存用治具を作製した。
＜ガラス化液の吸収性の評価＞
　先の実施例１、比較例１での凍結操作と同様の方法で、修正リン酸緩衝液、平衡液、ガラス化液に順に浸漬させたマウス卵子を０．４μＬのガラス化液と共に、実施例２～７、および比較例２、比較例３の凍結保存用治具が有する載置部上にオリジオ社製ストリッパーピペッターを用いて滴下した。実施例２～６および比較例２については透過型光学顕微鏡を用いて、実施例７と比較例３については反射型光学顕微鏡を用いて観察しながら、滴下後のガラス化液の吸収の様子を以下の基準で評価した。これらの結果を表２の「ガラス化液の吸収性」の項目に示す。
　ガラス化液の吸収性は以下の基準で評価した。
◎：ガラス化液を滴下後、マウス卵子周辺の余分なガラス化液が吸収され、見えなくなるまで、６秒未満だった。
○：ガラス化液を滴下後、マウス卵子周辺の余分なガラス化液が吸収され、見えなくなるまで６～３０秒だった。
×：ガラス化液を滴下後、３０秒の時点で、マウス卵子周辺の余分なガラス化液が残存していた。
＜マウス卵子の融解操作と剥離性の評価＞
　実施例２～７、および比較例２、比較例３の凍結保存用治具を用いた融解操作と剥離性の評価は、先の実施例１、比較例１の各凍結保存用治具と同様の方法にて評価した。ただし、実施例７と比較例３の評価においては、透過型光学顕微鏡にかえて反射型光学顕微鏡を用いた。この結果を表２の「融解時の剥離性」の項目に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から、本発明の凍結保存用治具によって、融解時の優れた剥離性に加えて、ガラス化液の優れた吸収性が得られることが判る。
（実施例８）
　支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に、エチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒ（ケン化度８８．３ｍｏｌ％）の５質量％水溶液を乾燥時の固形分量が５ｇ／ｍ２になるように、スライドホッパー方式で塗布し、室温乾燥後、１２０℃で４０時間加熱処理を行い、支持体上に表面層を有する図２に示す形態の載置部を作製した。この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさ（４０ｍｍ２）に裁断し、ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例８の凍結保存用治具を作製した。
　また、上記実施例８の凍結保存用治具の作製において、透明ＰＥＴフィルムをそのまま用いて載置部とした以外は同様にして、凍結保存用治具を作製した。よって該凍結保存用治具は先に記載した比較例１と同じであるから、後述する表３中、該凍結保存用治具を比較例１として記載した。
＜マウス胚の凍結作業＞
　採取したマウス胚盤胞期胚をｐＨ指示薬として極低濃度のフェノールレッドが含まれる修正リン酸緩衝液（１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、２．７ｍＭ　ＫＣｌ、０．９ｍＭ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、５．６ｍＭ　グルコース、０．３ｍＭ　ピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌ　硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌ　ポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭ　Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭ　トレハロース）に、１５℃の環境下で１０分間浸漬させた。その後、マウス胚を一旦取り出し、次にこのマウス胚を温度１５℃の平衡液（７．５容量％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、７．５容量％エチレングリコール、１７容量％ウシ胎児血清、６８容量％上記修正リン酸緩衝液）に５分間浸漬させた。次いで、平衡液から取り出したマウス胚を温度４℃のガラス化液（１５容量％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、１５容量％エチレングリコール、１４容量％ウシ胎児血清、５６容量％上記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた。３０秒間のガラス化液への浸漬後、マウス胚を実施例８又は比較例１の凍結保存用治具の載置部上に載置し、透過型顕微鏡観察下で、ピペットを用いてマウス胚周辺の余分なガラス化液をできるだけ除いた。その後、液体窒素中に浸漬し、ガラス化凍結させた。凍結させた凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。
＜マウス胚の融解作業と剥離性の評価＞
　マウス胚を載置した実施例８又は前述した比較例１の凍結保存用治具を液体窒素中から取り出し、温度３７℃の融解液（上記修正リン酸緩衝液に１Ｍスクロースを添加した溶液）に浸漬させた。浸漬後のマウス胚の様子を透過型光学顕微鏡で観察し、融解時のマウス胚の剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表３の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。なお表３中に記載される比較例１は、先に示した通り、易接着処理された透明ＰＥＴフィルムをそのまま用いて載置部とした凍結保存用治具である。
　細胞又は組織の剥離性は以下の基準で評価した。
◎：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆすりながらマウス胚を剥離することができた（剥離に要した時間は２０秒未満）。
○：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆすりながらマウス胚を剥離することができた（剥離に要した時間は２０秒以上４０秒未満）。
△：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆすりながらマウス胚を剥離するのに、４０～６０秒を要した。
×：把持部をゆすることでは、６０秒以内にマウス胚を剥離することができなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３の結果から、本発明の凍結保存用治具は、融解時に優れた剥離性を示すことが判る。
（実施例９）
　支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に接着層として、ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ　ＱＲ　１７０－７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ２となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を貼り合わせた。このようにして得られた積層体を、エタンジオール基を有するポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のＮｉｃｈｉｇｏ－Ｇ　ｐｏｌｙｍｅｒ　ＡＺＦ８０３５Ｗ（ケン化度９８．４ｍｏｌ％）の２質量％水溶液に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥後、１２０℃で４０時間加熱処理を行い、図５に示す形態の表面層を有する載置部を作製した。なお、表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２であった。実施例８と同様に、この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさに裁断し、その後ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例９の凍結保存用治具を作製した。
（実施例１０）
　エタンジオール基を有するポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のＮｉｃｈｉｇｏ－Ｇ　ｐｏｌｙｍｅｒ　ＯＫＳ－８０４１（ケン化度８８．９ｍｏｌ％）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例９と同様にして、実施例１０の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１０の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２であった。
（実施例１１）
　エチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールであるゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒ（ケン化度８８．３ｍｏｌ％）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例９と同様にして、実施例１１の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１１の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２であった。
（実施例１２）
　ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒの水溶液の濃度を０．５質量％とした以外は、実施例１１と同様にして、実施例１２の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１２の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、０．５ｇ／ｍ２であった。
（実施例１３）
　エチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のゴーセネックスＷＯ－３２０Ｎ（ケン化度９９ｍｏｌ％）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例９と同様にして、実施例１３の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１３の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２であった。
（実施例１４）
　ポリビニルアルコールである（株）クラレ製のＰＶＡ１０３（ケン化度９８．５ｍｏｌ％）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例９と同様にして、実施例１４の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１４の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２であった。
　また比較例として、前述した実施例９の凍結保存用治具の作製において、水溶液への浸漬を行わない以外は実施例９と同様にして表面層を有さない凍結保存用治具も作製した。この凍結保存用治具は、易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）上に、接着層（ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ　ＱＲ　１７０－７１４１Ｐ）を介して、親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）が貼り合わされたものであり、前述した比較例２と同じである。よって後述する表４中、該該凍結保存用治具を比較例２として記載した。
＜保存液の吸収性の評価＞
　先の実施例８、比較例１での凍結作業と同様の方法で、修正リン酸緩衝液、平衡液、ガラス化液に順に浸漬させたマウス胚を０．３μＬのガラス化液と共に、実施例９～１４、および比較例２の凍結保存用治具が有する載置部上にオリジオ社製ストリッパーピペッターを用いて滴下した。滴下後のガラス化液の吸収の様子を反射型光学顕微鏡を用いて観察しながら、以下の基準で評価した。これらの結果を表４の「保存液の吸収性」の項目に示す。
　保存液の吸収性は以下の基準で評価した。
◎：ガラス化液を滴下後、マウス胚周辺の余分なガラス化液が吸収され、見えなくなるまで、６秒未満だった。
○：ガラス化液を滴下後、マウス胚周辺の余分なガラス化液が吸収され、見えなくなるまで６～３０秒だった。
×：ガラス化液を滴下後、３０秒の時点で、マウス胚周辺の余分なガラス化液が残存していた。
＜マウス胚の融解作業と剥離性の評価＞
　実施例９～１４、および比較例２の凍結保存用治具を用いた融解作業と剥離性の評価は、先の実施例８、比較例１の各凍結保存用治具と同様の方法にて評価した。この結果を表４の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４の結果から、本発明の凍結保存用治具によって、融解時の優れた剥離性に加えて、ガラス化液の優れた吸収性が得られることが判る。
（実施例１５）
　支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールである（株）クラレ製のＰＶＡ５０５（ケン化度７３．５ｍｏｌ％、重合度５００）の５質量％水溶液を乾燥時の固形分量が５ｇ／ｍ２になるように、スライドホッパー方式で塗布し、室温乾燥後、１２０℃で４０時間加熱処理を行い、支持体上に表面層を有する図２に示す形態の載置部を作製した。この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさ（４０ｍｍ２）に裁断し、ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例１５の凍結保存用治具を作製した。
　また、上記実施例１５の凍結保存用治具の作製において、透明ＰＥＴフィルムをそのまま用いて載置部とした以外は同様にして、凍結保存用治具を作製した。よって該凍結保存用治具は先に記載した比較例１と同じであるから、後述する表５中、該凍結保存用治具を比較例１として記載した。
＜マウス胚の凍結作業＞
　凍結保存用治具として、実施例１５及び比較例１の凍結保存用治具をそれぞれ使用した以外は、上述した実施例８の凍結保存用治具を用いたマウス胚の凍結作業と同様の方法で、マウス胚をガラス化凍結させた。凍結させた凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。
＜マウス胚の融解作業と剥離性の評価＞
　マウス胚を載置した実施例１５又は前述した比較例１の凍結保存用治具を液体窒素中からとりだし、温度３７℃の融解液（上記修正リン酸緩衝液に１Ｍスクロースを添加した溶液）に浸漬させた。浸漬後、マウス胚の様子を透過型光学顕微鏡で観察しながら、融解作業を行った。融解作業の際、凍結保存用治具上のマウス胚を融解液に浸漬させた直後から３０秒間は、凍結保存用治具上からマウス胚を回収する操作は行わずに、凍結保存用治具上のマウス胚を静かに融解液中に浸漬させた。３０秒経過後、凍結保存用治具の把持部をゆすることで、載置部に振動を与えたり、ピペットを用いて吸引圧を与えたりすることで、マウス胚の融解液浸漬後から６０秒が経過するまで回収操作を行った。上記融解作業の際のマウス胚の剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表５の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。
　細胞又は組織の剥離性は以下の基準で評価した。
◎：融解作業の際に、載置部上のマウス胚を剥離しやすかった（把持部を上下左右にゆする操作のみで比較的良好に剥離した）。
○：融解作業の際に、載置部上のマウス胚を剥離することができた（把持部を上下左右にゆする操作のみで剥離することができた）。
△：融解作業の際に、載置部上のマウス胚を剥離することができたが、やや剥離しづらかった。
×：６０秒以内にマウス胚を剥離することができなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５の結果から、本発明の凍結保存用治具は、融解時に優れた剥離性を示すことが判る。
（実施例１６）
　支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に接着層として、ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ　ＱＲ　１７０－７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ２となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を貼り合わせた。この様にして得られた積層体を、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールであるＰＶＡ５０５（ケン化度７３．５ｍｏｌ％、重合度５００）の２質量％水溶液に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥後、１２０℃で４０時間加熱処理を行い、図５に示す形態の表面層を有する載置部を作製した。なお、表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２であった。実施例１５と同様に、この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさに裁断し、その後ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例１６の凍結保存用治具を作製した。
（実施例１７）
　ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールである（株）クラレ製のＰＶＡ２１７（ケン化度８８ｍｏｌ％、重合度１７００）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例１６と同様にして、実施例１７の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１７の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２であった。
（実施例１８）
　ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールである（株）クラレ製のＰＶＡ２０５（ケン化度８８ｍｏｌ％、重合度５００）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例１６と同様にして、実施例１８の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１８の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２であった。
（実施例１９）
　ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のゴーセノールＥＧ０３Ｐ（ケン化度８８ｍｏｌ％、重合度３００）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例１６と同様にして、実施例１９の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１９の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２であった。
（実施例２０）
　ポリビニルアルコールである（株）クラレ製のＰＶＡ１０５（ケン化度９８．５ｍｏｌ％、重合度５００）の２質量％水溶液を用いて行った以外は、実施例１６と同様にして、実施例２０の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例２０の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２であった。
　また比較例として、前述した実施例１６の凍結保存用治具の作製において、水溶液への浸漬を行わない以外は実施例１６と同様にして表面層を有さない凍結保存用治具も作製した。この凍結保存用治具は、易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）上に、接着層（ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ　ＱＲ　１７０－７１４１Ｐ）を介して、親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）が貼り合わされたものであり、前述した比較例２と同じである。よって後述する表６中、該凍結保存用治具を比較例２として記載した。
＜保存液の吸収性の評価＞
　先の実施例１５、比較例１での凍結作業と同様の方法で、修正リン酸緩衝液、平衡液、ガラス化液に順に浸漬させたマウス胚を０．４μＬのガラス化液と共に、実施例１６～２０、および比較例２の凍結保存用治具が有する載置部上にオリジオ社製ストリッパーピペッターを用いて滴下した。滴下後のガラス化液の吸収の様子を反射型光学顕微鏡を用いて観察しながら、以下の基準で評価した。これらの結果を表６の「保存液の吸収性」の項目に示す。
　保存液の吸収性は以下の基準で評価した。
○：ガラス化液を滴下後、３０秒以内に、マウス胚周辺の余分なガラス化液が吸収された。
×：ガラス化液を滴下後、３０秒の時点で、マウス胚周辺の余分なガラス化液が残存していた。
＜マウス胚の融解作業と剥離性の評価＞
　実施例１６～２０、および比較例２の凍結保存用治具を用いた融解作業と剥離性の評価は、先の実施例１５、比較例１の各凍結保存用治具と同様の方法にて評価した。この結果を表６の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６の結果から、本発明の凍結保存用治具によって、融解時の優れた剥離性に加えて、ガラス化液の優れた吸収性が得られることが判る。
（実施例２１）
　支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に接着層として、ヘンケルジャパン社製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ　ＱＲ　１７０－７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ２となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）製のセルロース混合エステル多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７３％、厚み１３３μｍ）を貼り合わせた。このようにして得られた積層体を、日産化学工業社製のコロイダルシリカであるＳＴ－ＺＬ（平均粒子径８５ｎｍ）をシリカ濃度として２０質量％、日本合成化学工業社製の高純度ポリビニルアルコールＥＧ－０５Ｐ（ケン化度８６．５～８９ｍｏｌ％）を該ポリビニルアルコールの固形分濃度として１質量％含む水溶液（塗布液）に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥させた後に、さらに１２０℃で１日間加熱処理を行い、表面に水溶性高分子化合物と無機微粒子を有する載置部を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分塗布量は、３ｇ／ｍ２であった。この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさ（４０ｍｍ２）に裁断し、その後ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例２１の凍結保存用治具を作製した。
（実施例２２）
＜気相法シリカ分散液の作製＞
　水　４３０部
　変性エタノール　２２部
　カチオン性ポリマー　３部
　（ジメチルジアリルアンモニウムクロライドホモポリマー、第一工業製薬社製、シャロールＤＣ９０２Ｐ、平均分子量９０００）
　気相法シリカ　１００部
　（平均一次粒子径７ｎｍ、ＢＥＴ法による比表面積３００ｍ２／ｇ）
　分散媒の水と変性エタノールの中にジメチルジアリルアンモニウムクロライドホモポリマーを添加し、次いで気相法シリカを添加し予備分散して粗分散液を作製した。次にこの粗分散液を高圧ホモジナイザーで２回処理して、シリカ濃度が２０質量％の気相法シリカの分散液を作製した。気相法シリカの平均粒子径は１００ｎｍであった。
　実施例２１の凍結保存用治具の作製において、上記気相法シリカ分散液をシリカ濃度として１０質量％、ポリビニルアルコールＥＧ－０５Ｐを該ポリビニルアルコールの固形分濃度として１質量％含む水溶液を用いた以外は実施例２１と同様にして、実施例２２の凍結保存用治具を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分塗布量は、３ｇ／ｍ２であった。
（実施例２３）
　実施例２１の凍結保存用治具の作製において、接着層を介して支持体に貼り合わせる保存液吸収体として、セルロース混合エステル多孔体にかえて、アドバンテック東洋（株）製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を用いた以外は実施例２１と同様にして、実施例２３の凍結保存用治具を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分塗布量は、３ｇ／ｍ２であった。
（実施例２４）
　実施例２３の凍結保存用治具の作製において、積層体のディップコーティングに用いる塗布液として、日産化学工業社製のコロイダルシリカであるＭＰ－４５４０（平均粒子径４５０ｎｍ）をシリカ濃度として５質量％、ポリビニルアルコールＥＧ－０５Ｐを該ポリビニルアルコールの固形分濃度として２質量％含む水溶液を用いた以外は実施例２３と同様にして、実施例２４の凍結保存用治具を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分塗布量は、１ｇ／ｍ２であった。
　実施例２４の凍結保存用治具の載置部の表面を、走査型電子顕微鏡を用いて観察したところ、図１０のような顕微鏡観察像が観察された。図１０中、スケールバーは５μｍである。
（実施例２５）
　実施例２３の凍結保存用治具の作製において、積層体のディップコーティングに用いる塗布液として、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製のコロイダルシリカであるパーコール（平均粒子径３０ｎｍ）をシリカ濃度として２０質量％、ポリビニルアルコールＥＧ－０５Ｐを該ポリビニルアルコールの固形分濃度として１質量％含む水溶液を用いた以外は、実施例２３と同様にして実施例２５の凍結保存用治具を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分塗布量は、１ｇ／ｍ２であった。
（実施例２６）
　実施例２１の凍結保存用治具の作製において、支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上を、実施例２１と同様の塗布液に浸漬することでディップコーティングし、室温乾燥させた以外は実施例２１と同様にして、実施例２６の凍結保存用治具を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分量は、３ｇ／ｍ２であった。
（比較例４）
　実施例２１の凍結保存用治具の作製において、保存液吸収体としてセルロース混合エステル多孔体を有する積層体を、ディップコーティングせずにそのまま用いて載置部とした以外は同様にして、比較例４の凍結保存用治具を作製した。
　実施例２１の凍結保存用治具の作製において、透明ＰＥＴフィルムをそのまま用いて載置部とした以外は同様にして、凍結保存用治具を作製した。よって該凍結保存用治具は先に記載した比較例１と同じであるから、後述する表７中、該凍結保存用治具を比較例１として記載した。
　さらに前述した実施例２３の凍結保存用治具の作製において、ポリテトラフルオロエチレン多孔体を含む積層体を、ディップコーティングせずにそのまま用いて載置部とした以外は同様にして凍結保存用治具を作製した。この凍結保存用治具は、易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）上に、接着層（ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ　ＱＲ　１７０－７１４１Ｐ）を介して、親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）が貼り合わされたものであり、前述した比較例２と同じである。よって後述する表７中、該凍結保存用治具を比較例２として記載した。
＜ヒト肝細胞スフェロイドの作製＞
　ヒト肝細胞スフェロイドは、住友ベークライト社製のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）　９６Ｕプレートを用いて作製した。シャーレ上、１０％の血清を添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で増殖させたＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理によってシャーレから剥離・回収した後に、１ウェルあたり５０ｃｅｌｌの細胞濃度でＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６Ｕプレート上に播種した。３７℃、２％ＣＯ２の条件下において、プレート上で３日間培養した後に、スフェロイドの形成を確認した。スフェロイドの中から、形状が球形に近く、かつ直径が１００μｍに近いものを選択し、以降の評価試験に用いた。
＜スフェロイドの凍結作業＞
　スフェロイド１個をガラス化液（３０容量％エチレングリコール、０．５容量％グリセロール、６９．５％下記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた後に、ガラス化液と共に、実施例２１～２６及び比較例１、比較例２、比較例４の凍結保存用治具の載置部上に載置した。凍結作業にあたっては、実施例２３～２６、比較例１、比較例２については、従来の一般的な操作の通り、透過型顕微鏡下で観察しながら作業を行った。実施例２１、実施例２２、および比較例４の場合には、載置部の光透過性が低いため、反射型顕微鏡を用いて観察しながら作業を行った。また、実施例２６と比較例１以外の保存液吸収体を有する凍結保存用治具については、透過型顕微鏡又は反射型顕微鏡下で、スフェロイド周辺のガラス化液が十分に除去されたことを確認した後、液体窒素に浸漬して凍結した。実施例２６と比較例１の凍結保存用治具については、透過型顕微鏡下で、ピペットを用いて、スフェロイド周辺のガラス化液を可能な限り十分除去した後に、液体窒素に浸漬して凍結した。
＜融解作業と剥離性の評価＞
　スフェロイドを載置した実施例２１～２６及び比較例１、比較例２、比較例４の凍結保存用治具を液体窒素中から取り出し、温度３７℃の融解液（修正リン酸緩衝液（１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、２．７ｍＭ　ＫＣｌ、０．９ｍＭ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、５．６ｍＭ　グルコース、０．３ｍＭ　ピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌ　硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌ　ポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭ　Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭ　トレハロース）に１Ｍスクロースを添加した溶液）に浸漬させた。浸漬後のスフェロイドの様子を透過型光学顕微鏡又は反射型顕微鏡で観察しながら、ピペットを用いて、載置部からのスフェロイドの回収操作を行い、融解時のスフェロイドの剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表７の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。
◎：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部を上下左右にゆすったり、ピペッティングしたりすることで、デバイスからスフェロイドを３０秒以内に剥離することができた。
〇：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部を上下左右にゆすったり、ピペッティングしたりし、デバイスからのスフェロイドの剥離に３０秒～１分を要した。
×：１分以内にスフェロイドを剥離することができなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　＜保存液の吸収性＞
　スフェロイド１個をガラス化液（３０容量％エチレングリコール、０．５容量％グリセロール、６９．５％上記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた後に、ガラス化液と共に、凍結保存用治具の載置部上に載置した際に、保存液の吸収性を評価した。保存液吸収体を有する実施例２１～２５の凍結保存用治具は、良好な吸収性を有し、ピペット等を用いて余分なガラス化液を除く操作を必要としなかった。とりわけ、実施例２４は優れた吸収性を示し、１０秒以内に余分なガラス化液が吸収・除去された。
＜細胞又は組織の視認性＞
　スフェロイド１個をガラス化液（３０容量％エチレングリコール、０．５容量％グリセロール、６９．５％上記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた後に、ガラス化液と共に、凍結保存用治具の載置部上に載置した際に、透過型顕微鏡下でスフェロイドを観察した際の作業性を、細胞又は組織の視認性として評価した。実施例２１、実施例２２の凍結保存用治具と比較して、実施例２３～２６の凍結保存用治具は、より明瞭に載置されたスフェロイドの形態を観察することが可能だった。
　本発明は、牛などの家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精などの他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織などの凍結保存に用いることができる。
１　把持部
２、２ａ～２ｈ　載置部
３　表面層
４　支持体
５　保存液吸収体
６　接着層
７　凍結保存用治具
８　無機微粒子
９　細孔（気孔）

Claims (7)

  1. 　細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、水溶性高分子化合物を含有する層を有することを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具。
  2. 　前記水溶性高分子化合物が、エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールから選択される少なくとも１種類であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
  3. 　前記水溶性高分子化合物が、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
  4. 　前記水溶性高分子化合物を含有する層が更に無機微粒子を含有することを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
  5. 　前記載置部が保存液吸収体を有し、該保存液吸収体上に前記水溶性高分子化合物を含有する層を有することを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具の載置部上に、保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置し、細胞又は組織を載置部に保持した状態で凍結保存用治具を液体窒素の中に浸漬することにより細胞又は組織を凍結することを特徴とする、細胞又は組織の凍結保存方法。
  7. 　前記保存液が、保存液の全質量に対して１０質量％以上の耐凍剤を含むガラス化液であることを特徴とする、請求項６に記載の細胞又は組織の凍結保存方法。
     
     
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019208120A1 (ja) * 2018-04-26 2019-10-31 三菱製紙株式会社 凍結保存液及び凍結保存方法
JP2020504725A (ja) * 2016-12-20 2020-02-13 ティシュー テスティング テクノロジーズ エルエルシーＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｌｃ 実用的で機能的な組織バンキング用の大容量組織サンプルの無氷保存
JP2020096554A (ja) * 2018-12-18 2020-06-25 三菱製紙株式会社 細胞又は組織の凍結保存用治具
JP2020103224A (ja) * 2018-12-28 2020-07-09 三菱製紙株式会社 凍結保存用治具
US11737452B2 (en) * 2017-06-14 2023-08-29 New York University In Abu Dhabi Corporation System and method for paper-based cryopreservation

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018230477A1 (ja) 2017-06-12 2018-12-20 三菱製紙株式会社 細胞又は組織の凍結保存用治具
AU2018310000B2 (en) * 2017-07-31 2021-08-05 Two Cells Co., Ltd. Composition for cryopreservation, method for producing cryopreserved material, cell preparation, method for producing cell preparation, and kit for cryopreservation
JP7030661B2 (ja) * 2018-09-07 2022-03-07 三菱製紙株式会社 凍結保存液
JP7232693B2 (ja) * 2019-04-10 2023-03-03 三菱製紙株式会社 凍結保存用治具
CN114981403A (zh) * 2020-03-19 2022-08-30 国峯工业株式会社 球状体形成促进剂
CN111763623A (zh) * 2020-07-21 2020-10-13 四川省人民医院 一种冷冻胚胎的辅助激活装置
KR102278277B1 (ko) * 2021-02-10 2021-07-15 의료법인마리아의료재단 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 이를 이용한 유리화 방법

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004018504A (ja) * 2002-06-20 2004-01-22 Jms Co Ltd 細胞保存容器
WO2011070973A1 (ja) * 2009-12-08 2011-06-16 学校法人北里研究所 動物の胚または卵子のガラス化保存用細管
JP2012219017A (ja) * 2011-04-04 2012-11-12 St Marianna Univ School Of Medicine 生体試料を凍結保存するための凍結保存用具
JP2014100111A (ja) * 2012-11-21 2014-06-05 Terumo Corp 移植片の保存輸送容器
WO2014185457A1 (ja) * 2013-05-16 2014-11-20 三菱製紙株式会社 細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具
WO2015115313A1 (ja) * 2014-01-31 2015-08-06 三菱製紙株式会社 細胞または組織のガラス化凍結保存用治具
JP2015188405A (ja) * 2014-03-28 2015-11-02 三菱製紙株式会社 細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4245744A (en) 1978-01-18 1981-01-20 Air Products And Chemicals, Inc. Polyvinyl acetate latex impregnated towelette
JPH02117381A (ja) 1988-10-27 1990-05-01 Terumo Corp 細菌分離培養器具
JPH03289955A (ja) 1990-04-04 1991-12-19 Okayama Pref Gov 胚の凍結保存法
JP3672201B2 (ja) 1991-12-26 2005-07-20 雪印乳業株式会社 哺乳動物胚移植用ストロー及びその製造法
US5981044A (en) 1993-06-30 1999-11-09 The Procter & Gamble Company Multi-layered tissue paper web comprising biodegradable chemical softening compositions and binder materials and process for making the same
JPH07289235A (ja) 1994-04-21 1995-11-07 Dainippon Printing Co Ltd シート状培養用容器
US5965438A (en) 1995-06-07 1999-10-12 Phyton, Inc. Cryopreservation of plant cells
JPH10121021A (ja) 1996-10-17 1998-05-12 Koyo Sangyo Kk 合板製造用接着剤及びこれを用いた合板の製造方法
JPH10248860A (ja) 1997-03-10 1998-09-22 Meiji Milk Prod Co Ltd ストロー内希釈型の哺乳動物胚ガラス化保存 ストロー
JP3578631B2 (ja) 1998-06-16 2004-10-20 サンエム・パッケージ株式会社 マスク
JP3044323B1 (ja) 1999-01-07 2000-05-22 農林水産省畜産試験場長 細胞の凍結保存方法
JP2000212532A (ja) 1999-01-19 2000-08-02 Hitachi Chem Co Ltd 金属箔用接着剤組成物及びそれを用いた接着剤付金属箔、金属張積層板
JP4143219B2 (ja) 1999-05-19 2008-09-03 日水製薬株式会社 簡易培地及びその製造方法
US6506959B2 (en) 2000-04-11 2003-01-14 Kao Corporation Absorbent article
PT1340062E (pt) 2000-12-07 2013-01-25 Fraunhofer Ges Forschung Método e dispositivo de armazenamento criogénico
JP4373025B2 (ja) 2001-04-18 2009-11-25 株式会社北里サプライ 卵凍結保存用具および筒状部材保持器具
JP4070186B2 (ja) * 2002-04-26 2008-04-02 日本合成化学工業株式会社 ポリビニルアルコール系樹脂フイルム積層体およびその用途
TWI333545B (en) 2003-04-02 2010-11-21 Cholestech Corp Adhered membranes retaining porosity and biological activity
JP4242227B2 (ja) 2003-07-23 2009-03-25 芳詔 福田 哺乳動物の胚または卵子の凍結保存容器
ES2812629T3 (es) 2004-11-24 2021-03-17 Techlab Inc Dispositivo para la detección de analitos
US7867613B2 (en) 2005-02-04 2011-01-11 Oxane Materials, Inc. Composition and method for making a proppant
EP2545976B1 (en) 2006-02-13 2016-08-03 Donaldson Company, Inc. Web comprising fine fiber and reactive, adsorptive or absorptive particulate
KR101084429B1 (ko) 2006-03-17 2011-11-21 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬 생체 친화성 투명 시트, 그의 제조 방법 및 세포 시트
JP4324181B2 (ja) 2006-06-13 2009-09-02 株式会社北里サプライ 卵凍結保存用具
JP5224703B2 (ja) 2007-03-13 2013-07-03 株式会社北里バイオファルマ 採取組織片ガラス化凍結保存用具、組織片凍結保存用プレートおよび採取組織片ガラス化凍結保存方法
FR2918924B1 (fr) 2007-07-19 2012-10-26 Georgia Pacific France Feuille composite, rouleau d'une telle feuille, paquet de feuilles, et procede de fabrication
KR20120088786A (ko) 2009-12-08 2012-08-08 가부시끼가이샤 제이엠에스 다공성 부재, 다공화 방법 및 상기 다공성 부재의 제조 방법
CN103179852B (zh) 2010-05-28 2015-04-08 格尼亚有限公司 改良的显微操作和储存装置以及方法
US9516876B2 (en) 2011-10-04 2016-12-13 Kitazato Biopharma Co., Ltd. Cell cryopreservation tool
JP5915977B2 (ja) 2011-11-29 2016-05-11 学校法人明治大学 凍結細胞シートの製造方法
WO2013117925A1 (en) 2012-02-08 2013-08-15 University Of Warwick Cryopreservation of cells in absence of vitrification inducing agents
JP2014183757A (ja) * 2013-03-22 2014-10-02 Kitasato Institute 卵子又は胚のガラス化凍結保存用治具
CN203369308U (zh) 2013-04-09 2014-01-01 上海安久生物科技有限公司 一种生物样本玻璃化冷冻载体及生物样本冻存组合装置
CN203340879U (zh) 2013-06-19 2013-12-18 深圳华大基因科技有限公司 生物材料玻璃化冷冻保存承载工具
JP5862739B1 (ja) * 2013-09-30 2016-02-16 株式会社リコー 立体造形用粉末材料、硬化液、及び立体造形用キット、並びに、立体造形物の製造方法及び製造装置
WO2015064380A1 (ja) * 2013-10-29 2015-05-07 学校法人北里研究所 細胞または組織のガラス化凍結保存用治具
JP6124845B2 (ja) 2014-06-30 2017-05-10 三菱製紙株式会社 細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004018504A (ja) * 2002-06-20 2004-01-22 Jms Co Ltd 細胞保存容器
WO2011070973A1 (ja) * 2009-12-08 2011-06-16 学校法人北里研究所 動物の胚または卵子のガラス化保存用細管
JP2012219017A (ja) * 2011-04-04 2012-11-12 St Marianna Univ School Of Medicine 生体試料を凍結保存するための凍結保存用具
JP2014100111A (ja) * 2012-11-21 2014-06-05 Terumo Corp 移植片の保存輸送容器
WO2014185457A1 (ja) * 2013-05-16 2014-11-20 三菱製紙株式会社 細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具
WO2015115313A1 (ja) * 2014-01-31 2015-08-06 三菱製紙株式会社 細胞または組織のガラス化凍結保存用治具
JP2015188405A (ja) * 2014-03-28 2015-11-02 三菱製紙株式会社 細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3211066A4 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020504725A (ja) * 2016-12-20 2020-02-13 ティシュー テスティング テクノロジーズ エルエルシーＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｌｃ 実用的で機能的な組織バンキング用の大容量組織サンプルの無氷保存
US11246308B2 (en) 2016-12-20 2022-02-15 Tissue Testing Technologies Llc Ice-free preservation of large volume tissue samples for viable, functional tissue banking
JP7061610B2 (ja) 2016-12-20 2022-04-28 ティシュー テスティング テクノロジーズ エルエルシー 実用的で機能的な組織バンキング用の大容量組織サンプルの無氷保存
US11737452B2 (en) * 2017-06-14 2023-08-29 New York University In Abu Dhabi Corporation System and method for paper-based cryopreservation
WO2019208120A1 (ja) * 2018-04-26 2019-10-31 三菱製紙株式会社 凍結保存液及び凍結保存方法
JP2019187320A (ja) * 2018-04-26 2019-10-31 三菱製紙株式会社 細胞又は組織の凍結保存液
JP2020096554A (ja) * 2018-12-18 2020-06-25 三菱製紙株式会社 細胞又は組織の凍結保存用治具
JP7082039B2 (ja) 2018-12-18 2022-06-07 三菱製紙株式会社 細胞又は組織の凍結保存用治具
JP2020103224A (ja) * 2018-12-28 2020-07-09 三菱製紙株式会社 凍結保存用治具
JP7030680B2 (ja) 2018-12-28 2022-03-07 三菱製紙株式会社 凍結保存用治具

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