JP7061610B2 - 実用的で機能的な組織バンキング用の大容量組織サンプルの無氷保存 - Google Patents
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Description
本非仮出願は、2016年12月20日に出願された米国仮特許出願第62/436,642号の利益を主張する。当該先行出願の開示は、その全体における参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、細胞、組織および臓器の保存の分野、特に二糖類(例えば、トレハロース、スクロース)などの糖を組み込んだ新しい無氷処方(例えば、ガラス化)、並びに、サンプル容量が4mLを超えてもサンプル材料特性および生物学的生存能力を向上させるプロトコルに関する。より具体的には、本発明は、保存後の細胞生存および組織機能を向上させるための、二糖類(例えば、トレハロースおよびスクロース)などの糖を、(例えば、10mLを超えるなど、4mLを超える体積を有する)細胞材料を含む大きなサンプル用の無氷ガラス化処方物に補充する方法に関する。
以下の説明では、本開示の理解を提供するために多数の詳細が述べられる。しかしながら、本開示の方法はこれらの詳細なしで実施されてもよく、記載された実施形態からの多数の変形または修正が可能であり得ることが当業者によって理解され得る。
本開示は、大容量の生きている材料/サンプル/器官/組織(「材料」、「サンプル」、「器官」、および「組織」という用語は互換的に使用され、細胞成分を含むあらゆる生物学的材料を包含する。)を保存するための方法に関する。
実施例
以下の無氷凍結保存製剤の補充実験では、二糖類(トレハロースとスクロース)を図1に示す量で様々なガラス化製剤(VS49、DP6、およびVS55)に添加し、様々な組織における氷形成の抑制における有効性にアクセスするための溶液(トレハロースおよび/またはスクロースなし)と比較する。
心臓弁と血管の調達:他のIACUCが承認したリサーチ研究で使用された動物または食品加工工場の死後のものから、過剰の心臓弁または血管を得た。組織を解剖し、すすぎ、そして抗生物質を含有する氷冷組織培養培地と共に一晩滅菌カップに入れ、そして次にインビトロ試験に割り当てた。図1の心臓弁組織はそれぞれ、肺動脈、弁尖および心筋からなる組織片で構成されていた。それらを分離し、そして下記に記載される代謝活性を評価するアッセイを用いて生存率について個々にアッセイした。
(凍結保存中の事象を視覚化するために使用される)クライオマクロスコープと呼ばれる装置を使用して、血管を有する0.5MスクロースDP6製剤を用いてさらなる一連の実験を行った。結果を図2に示す(フレッシュおよびガラス化ウサギ頸動脈の収縮反応、(上)ノルエピネフリンおよびフェニレフリン(下)用量反応曲線)。
血管生理学:ラドノティ(Radnoti)臓器入浴システムにおけるウサギ大腿動脈輪の機能を収縮薬のパネルを用いて記録するために、血管生理学研究用に新鮮な無氷凍結保存血管の2mmリングを準備した。等尺性収縮張力は、以前に採用された方法を使用して各薬物の濃度を増加させて添加した後に測定した。生理学的結果は、グラム張力/mg組織乾燥重量として表した。
ブタ大腿動脈凍結保存は、4および10mLの細胞材料体積で、VS55±0.6Mスクロース中で実施した。有意な保存は4mLですべての製剤において実証されたが、10mLではスクロースを含まないVS55は低い生存率を実証した。対照的に、スクロース補充製剤は、採用されたalamarBlue(図3;組織の輪がalamarBlue代謝アッセイを用いて評価された、VS55±0.6Mスクロースの4および10mLサンプルのブタ大腿動脈比較)および生理学アッセイ(図4;前収縮後にニトロプルシドナトリウムによって誘発されたブタ平滑筋弛緩であり、VS55単独は4mLのサンプルではうまくいくが10mLのサンプルではうまくいかず、スクロース補給は10mLのサンプルで機能性(弛緩)を維持する)の両方による生存率の保存を実証した。これらの結果は、二糖類の補充が、補充されていない(すなわち、二糖類が添加されていない)VS55溶液が(組織生存率の喪失を伴う氷形成のため)失敗する大容量(例えば10mL容量)での組織生存をもたらすことを示す。2つの収縮薬についても同様の結果が得られた。
対流対ナノ加温の比較のために、ウサギ胸部大動脈サンプルであって、ナノ粒子有りまたは無しのもの、0.6Mスクロースを有りまたは無しのものを、30mL容量のVS55でガラス化した。結果を図5に示す(対流(真ん中の棒)またはナノ加温化(最も右側の棒)のいずれかを用いたスクロース補給による改善された結果を示す30mLのウサギ胸部大動脈の結果)。
この一連の実験(その結果を図6Aおよび図6Bに示す)では、無傷の心臓弁を30mLの凍結防止剤容量で保存し、対流またはナノ加温法のいずれかによって再加温した心臓弁組織の生存率を比較する。
Claims (8)
- 少なくとも1つの糖を含む凍結保護製剤に細胞材料をさらし、
前記細胞材料に対して氷による損傷が生じない保存プロトコルに前記細胞材料を供し、
凍結保存細胞材料を得る、生きている大容量の細胞材料を保存する方法であって、
前記細胞材料は4mLを超える体積を有し、保存プロトコルの完了後の前記細胞材料の細胞生存率(%)が少なくとも60%であり、
前記保存プロトコルは、前記細胞材料が、凍結保護製剤中でインキュベートされ、該凍結保護製剤が、0.1~1Mの前記少なくとも1つの糖を含む、ことを含み、
前記少なくとも1つの糖が、トレハロースおよびスクロースからなる群から選択され、
前記細胞材料は、心臓弁および血管からなる群から選択される、方法。 - 前記細胞材料が10mLを超える体積を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞材料を前記保存プロトコルに供すると、前記細胞材料が少なくとも7日間無氷である、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの糖が、トレハロースである、請求項1に記載の方法。
- 前記保存プロトコルは、少なくとも1つの糖を含む凍結保護製剤中で前記細胞材料を冷却し、
さらなる凍結防止剤が、冷却前または冷却中に凍結防止剤配合物に添加され、前記さらなる凍結防止剤は糖とは異なり、
前記凍結保護製剤は、前記さらなる凍結防止剤を0.1~13.0Mの濃度で含有することをさらに含む、請求項1記載の方法。 - 前記さらなる凍結防止剤が、アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、アラニン、アルブミン、酢酸アンモニウム、凍結防止タンパク質、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸、クロロホルム、コリン、シクロヘキサンジオール、シクロヘキサンジオン、シクロヘキサントリオール、デキストラン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エリトリトール、エタノール、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、ホルムアミド、グルコース、グリセリン、グリセロリン酸塩、グリセリルモノアセテート、グリシン、糖タンパク質、ヒドロキシエチルデンプン、氷再結晶抑制剤、イノシトール、ラクトース、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メトキシプロパンジオール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチル尿素、メチルグルコース、メチルグリセロール、フェノール、プルロニックポリオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、プロパンジオール、ピリジンN-オキシド、ラフィノース、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、酢酸トリメチルアミン、尿素、バリンおよびキシロースからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞材料が、ヒト臓器およびヒト組織からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記培地がDMSO、ホルムアミドおよび/またはプロピレングリコールを含まない、請求項1に記載の方法。
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