CN1293958A

CN1293958A - 保存生物材料的方法和设备

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Publication number: CN1293958A
Application number: CN99120299A
Authority: CN
Inventors: 弗拉基米尔·列昂尼多维奇·谢列布连尼科夫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2001-05-09

Abstract

一种保存血液、血液组分、血小板、器官、心脏、肾脏、组织等生物材料的方法及设备,该方法和设备包含三个要素:在低温下呈凝胶状的保存液,高于70个大气压的压力和低于摄氏10度的保存温度。

Description

保存生物材料的方法和设备

本发明涉及保存生物材料的方法和设备，更具体地说，涉及一种综合运用保存液、高压和低温三种手段来保存生物材料的方法和设备。

全血和血液组份，包括白血球、红血球、血小板和血浆，从采集到使用一般都经过一段保存时间。皮肤和肾、心、肝等器官组织，从采集到使用一般也经过一段保存时间。目前保存这些生物材料的方法大致有冷冻和非冷冻两种。

为防止冷冻温度对生物材料造成损害，需要使用防冻剂如DMSO(亚砜基二甲醛)和Thrombosol^TM。但是这些防冻剂对细胞有毒性，一般会使得所保存的生物材料的大部分功能减退或完全失去功能。此外，经过这种方法保存的生物材料在投入使用前要进行长时间的清洗，如冲淋处理。即便如此往往仍然难以避免异物的残留。冷冻法保存红血球可达30天以上，但保存白血球最多只有12小时。

用非冷冻法保存生物材料，保存时间非常有限。而且非冷冻方法常常需要辅以其它手段。例如血小板要加以机械搅拌以防止凝团，即使如此，保存时间也不会超过5天。

因此，医疗实践迫切需要一种新方法来延长生物材料的保存时间。

本发明的目的在于提供一种可用于保存生物材料的方法，这种方法可以克服现有保存方法存在的保存生物材料时间较短的缺点。

本发明的另一目的在于提供一种可用于保存生物材料的设备，可以有效保存生物材料较长的时间。

本发明的第一个目的的实现是由于下述三种手段的合并运用：

(1)在低温下变成凝胶状的保存液；(2)高于70个大气压的储存压力；(3)低于10摄氏度的储存温度。具体地说，所述保存液含有下述成分的一部或全部：明胶、蔗糖、葡萄糖、氯化钠；

本发明的第一个目的是这样实现的，构造一种保存血液、血液组分、血小板、器官、心脏、肾脏、组织等生物材料的方法，其特征在于三种手段的综合运用：在降温时能变为凝胶状的保存液，高于70个大气压的保存压力和低于10摄氏度的保存温度，所述保存液除了含有水以外包含以下成分的一种或几种：明胶、蔗糖、葡萄糖、氯化钠。

在本发明提供的生物材料的保存方法中，所用保存液含有下列几种成分的一部或全部：低于5．0％的明胶、低于5．0％的蔗糖、低于5．0％的葡萄糖、低于5．0％的氯化钠。

在本发明提供的生物材料的保存方法中，所用保存液含有下列几种成分的一部或全部：1．0％至3．0％的明胶、1．0％至2．0％的蔗糖、1．0％至3．0％的葡萄糖、0．2％至0．6％的氯化钠。

按照本发明提供的保存血液、血液组分、血小板、器官、心脏、肾脏、组织等生物材料的方法，其特征在于三种手段的综合运用：在降温时能变为凝胶状的保存液，70至1000个大气压的保存压力和负12至0摄氏度的保存温度，所述保存液除了含有水以外包含以下成分的一种或几种：明胶、蔗糖、葡萄糖、氯化钠。

按照本发明提供的一种保存血液、血液组分、血小板、器官、心脏、肾脏、组织等生物材料的方法，其特征在于三种手段的综合运用：在15摄氏度以下能变为凝胶状的保存液，400至500个大气压的保存压力和负8至负7摄氏度的保存温度，所述保存液除了含有水以外包含以下成分的一种或几种：明胶、蔗糖、葡萄糖、氯化钠。

本发明的另一目的是这样实现的，构造一种保存生物材料的设备，包括：一个带侧壁的开口容器，其侧壁的内表面与端面通过一个园弧状过渡曲面相连，端面上开有密封槽，槽内装有软密封圈；一个与上述容器相配合的端盖，其底面带一突出部和密封构造，突出部侧面与底面通过一个园弧状过渡曲面相连；容器被端盖盖上时，端盖突出部正好塞入容器口，而密封构造正好塞入容器侧壁端面的密封槽，并压紧密封圈，形成密封；此时，端盖突出部侧面与容器侧壁内表面平行，其间形成第一间隙；端盖下表面与容器侧壁端面平行，其间形成第二间隙。

在本发明提供的生物材料保存设备中，第一间隙或第二间隙的宽度小于2．0毫米，或两者宽度均小于2．0毫米。

在本发明提供的生物材料保存设备中，容器和端盖能承受70到1000个大气压的压力。

在本发明提供的生物材料的保存设备中，包含一个保持器，可使端盖和容器方便、快捷、准确地配合。

在本发明提供的生物材料的保存设备中，包含一个放空阀，它与容器内腔相连，起保障内腔压力不超过设定值上限的作用。

在本发明提供的生物材料的保存设备中，包含一个与容器内腔相通的压力传感器。

在本发明提供的生物材料的保存设备中，包含一个与容器内腔相通的温度传感器。

在本发明提供的生物材料的保存方法中，包含一个位于容器内部的悬挂装置如钩、网、台、架，它能悬挂被保存的生物材料，使它们不和容器壁及端盖发生接触。

按照本发明提供的保存生物材料的方法，本发明提供的生物材料保存设备；其处理步骤为：用能变为凝胶状的保存液对生物材料加以处理；将生物材料和保存液封入储存袋；将储存袋放入容器；将压力传递液注满容器；给容器盖上端盖；冷却容器，逐渐达到高于70个大气压的压力和低于10摄氏度的温度；在此过程中，压力传递液沿第一和第二间隙结冰形成密封，而受冷膨胀的压力传递液产生高压。

实施本发明提供的生物材料保存方法和设备，可以有效延长生物材料的保存时间，具有极大的经济意义和社会意义。

附图和实例可进一步说明本发明的方法和设备。附图中：

图1是生化反应速率(以lnK表示)与温度的关系曲线。

图2是血浆和浓度为2．5％的NaCl溶液的相变曲线。

图3是另一组相变曲线图。

图4是本发明所提出的生物材料保存设备的剖面图。

图5是本发明所述容器的侧视(半剖面)和俯视图。

图6是本发明所述端盖的侧视(半剖面)图。

图7是端盖保持器的示意图。

一．导言

保存具有活性的生物材料，温度是必须考虑的最重要因素之一。细胞内部的温度下降得过低时，将会发生一系列不可逆转的生化和结构改变。在活细胞内部可能同时发生几百种生化反应。反应速率取决于若干因素，包括压力、温度、环境黏度、pH值、反应分子浓度等。

一个代谢过程通常包含一系列中间过程，反应物要经过一系列中间产物阶段，才能变为最终产物。每一个中间过程又由不同的酶参与催化。

在正常稳定状态下，单位时间内被转化的反应物的量等于同一时间内生成产物的量，而中间产物的量及浓度保持不变。因此，每一种中间产物的生成率(等于其前一阶段中间产物的转化率)和转化率(等于其后一阶段中间产物的生成率)应该相等，如此环环相扣。转化率和生成率都是反应速率。一般说来，它与反应物浓度成正比，比例系数是相应的化学反应速率常数。

对温度的依赖性由化学反应速率常数K决定：其中

A在某一温度范围内是常系数；

E表示1摩尔反应物质进行化学反应时的反应能量；

R是普适气体常数；

T为绝对温度。

对多数生化反应而言，E＞＞RT。取上式两端的自然对数，得：

ln K=ln A*(-E／RT)

图1表示lnK随温度变化的曲线。从30到37摄氏度A都保持为一常数。对不同的化学反应E和A的值是不同的。温度降低时，反应速率的平衡被打破，也就是说，各中间产物的浓度将会发生变化。这将导致细胞结构的破坏，例如细胞膜破裂，细胞死亡。

化学反应可能是吸热反应，也可能是放热反应。在水解过程中进行的反应可以释放出大量的能量。例如1摩尔葡萄糖氧化而释放的能量多达2883千焦耳。一旦生化反应的速率下降得太多，可能发生不可逆转的过程，最终导致细胞的彻底破坏。因此，系数A是温度的函数。

温度降到20摄氏度以下时，细胞膜的双层酯质发生相变，从胶体变为凝胶状。粘滞性大大提高。结果透过细胞膜进行的分子扩散和主动输运速率迅速降低，导致细胞内生化反应速率下降。细胞脱水，双层酯质表面积和细胞容积都发生收缩。

当渗透活动物质密度升高时，水分子回到细胞内部，使渗透压增高。细胞膜张力达到临界点后可能失去其屏障功能。细胞膜破裂的发展会导致细胞外形和结构的改变，同时使它们丧失主动调节适应的功能。

当温度降低到8摄氏度以下时，细胞浆也发生相变，成为凝胶状。在该温度下，分子扩散和主动输运速率以及生化反应速率都大为降低。

温度继续下降到负3摄氏度时，细胞内外的水都开始结冰。如果没有防冻剂，细胞外结冰使得细胞脱水，体积收缩，细胞内盐分和其它物质浓度上升。细胞内水结冰则导致细胞膜结构破裂。

由上述可见，本发明所提出的方法和设备意图在达到下列目标：

1．用能形成粘稠凝胶的保存液使生物材料悬浮。

2．将生物材料保存于尽可能低的温度下，同时又要维持其液体状态。在此条件下，生化反应速率相对降低，因此中间产物浓度的变化不大。

3．将溶液缓慢降温，使细胞内水分不受阻碍地安全地流出，而不至于在它发生从胶体过渡到凝胶态的相变时使细胞膜张力越过临界点而破裂。二．方法

本发明提出的保存生物材料的一种方法是：将生物材料浸入保存液，并置于高压低温环境。

保存液含1％至3％明胶。温度降低时，明胶在8至15摄氏度间发生相变，由胶体转变为凝胶状。它使生物细胞悬浮于保存液中，抑制了血小板的沉降和凝团。凝胶也支撑着细胞膜，使它不致在降温过程中由于细胞内体积的改变而发生大的变形。凝胶还降低了细胞与其周围环境之间的物质与能量交换，细胞的代谢水平也因此而下降。

保存液也可含蔗糖、葡萄糖和氯化钠。蔗糖能修复降温过程导致的细胞膜损坏。葡萄糖则为降温过程导致的低氧条件下的细胞代谢提供必要的养分。糖的酵解反应能产生每摩尔208焦耳的能量。蔗糖和葡萄糖还能吸引水分子，促进凝胶的形成，防止细胞内部渗透压的积聚。

氯化钠能阻碍水分在降温过程中向血小板流动，从而防止溶血。当温度降到20摄氏度以下时，血浆从胶体转变为凝胶状，排出的水分离开细胞。血小板进一步降温时，氯化钠的进一步浓缩阻碍水分回头进入血小板。此外，氯化钠还能使血浆的凝固点下降2．5摄氏度。

在某些情况下，保存液可采用下述配比：1．0％至3．0％明胶，1．0％至2．0％葡萄糖，1．0％至3．0％蔗糖，0．2％至0．6％氯化钠。在另一种情况下，可以采用2．9％明胶，1．17％葡萄糖，0．44％蔗糖，0．49％氯化钠。

生物材料保存在高于70个大气压的压力和低于10摄氏度的温度环境中。在某些情况下，压力要高到70至1000个大气压，温度要低到负12至0摄氏度。在另一些情况下，压力保持在400至500个大气压范围内，温度则控制在负8至负7摄氏度之间。

图2所示为血浆和浓度为2．5％的氯化钠溶液的相变曲线。在常压下血浆的凝固点为负2．5摄氏度。这是因为血浆含有多种化学成分，它们干扰了水中晶格结构的形成，从而降低了凝固点。细胞能冷冻到负4至负3摄氏度，细胞浆中的水分也不会结晶。常压下浓度为2．5％的氯化钠溶液的凝固点是负1．7摄氏度。

图3所示为水和浓度为2．5％的氯化钠溶液的相变曲线。氯化钠加入水中降低了凝固点，因此在同样的压力下可以达到更低的温度。“方法”线表明生物材料何以能够在高压和低温条件下保存而不致凝固。三．设备

图4所示为本发明所述生物材料保存设备(图中标号100)的装配图。它包含容器110和端盖130两大部分。

图5A-5B所示分别为容器110的剖面和俯视图。容器110上部开口111，侧壁112。侧壁112内表面113和端面114结合处形成半径为r1的过渡。端面114上开有密封槽115。槽底可嵌有O形橡胶密封圈116。容器110的大小可以有多种，以适应血袋、心、肝、肾等不同储存材料的需要。

图6所示为端盖130的剖面图。端盖设计得与容器相配合。其底面131包含一个突出部132和一个密封构造133。突出部侧面134与底面131结合处形成半径为r2的过渡。

当容器110被端盖130盖上时，端盖上的突出部132正好塞入容器口111，而密封构造133正好塞入容器侧壁端面的密封槽115，压紧在密封圈116上。此时，端盖突出部侧面134与容器侧壁内表面113平行，其间形成第一间隙140；端盖下表面131与容器侧壁端面114平行，其间形成第二间隙141，其沿半径方向延伸的长度超过第一间隙的宽度。

端盖突出部的下表面可以凹进，以减少材料用量而并不影响其机械强度。

当上述容器盛入保存液，盖上端盖，冷却到凝固点以下时，沿着容器壁和端盖表面会开始结冰。两个间隙里的冰正好帮助使端盖与容器之间的密封更紧密。容器内的高压将主要由这块冰封来承受，这样就降低了对密封部件115，116和133的强度和性能要求：它们只需要足以抵抗10个大气压就够用，然后沿间隙的冰封将取而代之。两个间隙的尺寸要求并不严格，但越小越好，以便冰封在压力加大到10个大气压前尽快形成。已经制作成功的一种容器样品的两个间隙宽度都不超过2毫米。

容器内部有悬挂装置117，用以防止盛放其中的生物材料与器壁直接接触。悬挂装置可以是网、台、架、隔板或其它合适的形式。

端盖可以设计得直接盖在容器上，也可以借助于一个保持器135。保持器的设计应使端盖的装卸十分方便而迅速。保持器与容器的配合可以采取类似刺刀那样的方式，或者用螺栓等其它方式。端盖保持器应带一个中心定位装置136以保证与端盖的连接定位准确。保持器本身可用两块材料拼装而成以便降低加工成本。137是装配孔。图7A到7C是两片装的端盖保持器的剖面和俯视图。

整具保存设备可以带有一个压力表150，其由弹性膜制作的探头151伸入容器内部。该装置还可以附上一个放空阀152，当压力超过设定值时起保护作用。实例

下面是采用本发明所述方法保存血小板的例子。在下述过程开始之前，肝素可用作抗凝剂。

1．按下列配比配制保存液：2．9％明胶，0．44％蔗糖，1．17％葡萄糖，0．49％氯化钠。与血小板混合。

2．将混合液注入储存袋(例如软硅胶袋)，排净空气后封口。

3．将混有血小板的保存液在1小时内冷却到15摄氏度。此间要不停搅拌直至保存液变成凝胶状。

4．在1至1. 5个小时内将储存袋冷却到6至8摄氏度。

5．将保存容器冷却到同一温度。

6．将储存袋放进容器，挂在悬挂装置上。

7．将容器充以浓度为2．5％的氯化钠溶液作传递压力之用。

8．盖紧端盖，确保容器内部无气体残留。

9．在1．5至2小时内将容器冷却到负7．5摄氏度，误差上下0．2摄氏度。此时氯化钠溶液中的水会沿容器壁结冰，如前所述形成密封。压力传递液是冷却时体积膨胀的液体，由于被密封，压力会逐渐升高。此压力通过压力传递液作用于容器内的储存袋。氯化钠降低了压力传递液的凝固点，因此得以达到需要的低温，而容器内的压力传递液却不致全部冰冻。袋内保存液的凝固点更低，在上述条件下内部压力将升高到500个大气压。保存液、高压和低温的联合作用使血小板得以保存达15天之久。用类似方法，红血球的保存期达30天以上，白血球达22天。

当需要血小板时，让容器在20摄氏度左右的室温下完全解冻，再打开容器。由于保存液的所有成分均无毒性，血小板取出后无须处理就能立即投入使用。

上述操作仅作为一个演示实例，并不代表本发明的全部内容。在本发明所述原则之下，具体应用则有多种多样的变化。

Claims

1、一种保存血液、血液组分、血小板、器官、心脏、肾脏、组织等生物材料的方法，其特征在于三种手段的综合运用：在降温时能变为凝胶状的保存液，高于70个大气压的保存压力和低于10摄氏度的保存温度，所述保存液除了含有水以外包含以下成分的一种或几种：明胶、蔗糖、葡萄糖、氯化钠。

2、根据权利要求1所述方法，其特征在于：其中所用保存液含有下列几种成分的一部或全部：低于5．0％的明胶、低于5．0％的蔗糖、低于5．0％的葡萄糖、低于5．0％的氯化钠。

3、根据权利要求1所述方法，其特征在于：其中所用保存液含有下列几种成分的一部或全部：1. 0％至3．0％的明胶、1．0％至2．0％的蔗糖、1．0％至3．0％的葡萄糖、0．2％至0．6％的氯化钠。

4、一种保存血液、血液组分、血小板、器官、心脏、肾脏、组织等生物材料的方法，其特征在于三种手段的综合运用：在降温时能变为凝胶状的保存液，70至1000个大气压的保存压力和负12至0摄氏度的保存温度，所述保存液除了含有水以外包含以下成分的一种或几种：明胶、蔗糖、葡萄糖、氯化钠。

5、根据权利要求4所述方法，其特征在于：其中所用保存液含有下列几种成分的一部或全部：低于5．0％的明胶、低于5．0％的蔗糖、低于5．0％的葡萄糖、低于5．％的氯化钠。

6、根据权利要求4所述方法，其特征在于：其中所用保存液含有下列几种成分的一部或全部：1. 0％至3．0％的明胶、1．0％至2．0％的蔗糖、1. 0％至3．0％的葡萄糖、0．2％至0．6％的氯化钠。

7、一种保存血液、血液组分、血小板、器官、心脏、肾脏、组织等生物材料的方法，其特征在于三种手段的综合运用：在15摄氏度以下能变为凝胶状的保存液，400至500个大气压的保存压力和负8至负7摄氏度的保存温度，所述保存液除了含有水以外包含以下成分的一种或几种：明胶、蔗糖、葡萄糖、氯化钠。

8、根据权利要求7所述方法，其特征在于：所用保存液含有下列几种成分的一部或全部：低于5．0％的明胶、低于5．0％的蔗糖、低于5．0％的葡萄糖、低于5．0％的氯化钠。

9、根据权利要求7所述方法，其特征在于：所用保存液含有下列几种成分的一部或全部：1．0％至3．0％的明胶、1．0％至2．0％的蔗糖、1. 0％至3．0％的葡萄糖、0．2％至0．6％的氯化钠。

10、一种保存生物材料的设备，其特征在于，包括：一个带侧壁的开口容器，其侧壁的内表面与端面通过一个园弧状过渡曲面相连，端面上开有密封槽，槽内装有软密封圈；一个与上述容器相配合的端盖，其底面带一突出部和密封构造，突出部侧面与底面通过一个园弧状过渡曲面相连；容器被端盖盖上时，端盖突出部正好塞入容器口，而密封构造正好塞入容器侧壁端面的密封槽，并压紧密封圈，形成密封；此时，端盖突出部侧面与容器侧壁内表面平行，其间形成第一间隙；端盖下表面与容器侧壁端面平行，其间形成第二间隙。

11、根据权利要求10所述设备，其特征在于：所述第一间隙或所述第二间隙的宽度小于2．0毫米，或两者宽度均小于2．0毫米。

12、根据权利要求10所述设备，其特征在于：容器和端盖能承受70到100个大气压的压力。

13、根据权利要求10所述设备，其特征在于：包含一个保持器，可使端盖和容器方便、快捷、准确地配合。

14、根据权利要求10所述设备，其特征在于：包含一个放空阀，它与容器内腔相连，起保障内腔压力不超过设定值上限的作用。

15、根据权利要求10所述设备，其特征在于：包含一个与容器内腔相通的压力传感器。

16、根据权利要求10所述设备，其特征在于：包含一个与容器内腔相通的温度传感器。

17、根据权利要求10所述设备，其特征在于：包含一个位于容器内部的悬挂装置如钩、网、台、架，它能悬挂被保存的生物材料，使它们不和容器壁及端盖发生接触。

18、一种保存生物材料的方法，采用权利要求10-17所述设备；其处理步骤为：用能变为凝胶状的保存液对生物材料加以处理；将生物材料和保存液封入储存袋；将储存袋放入容器；将压力传递液注满容器；给容器盖上端盖；冷却容器，逐渐达到高于70个大气压的压力和低于10摄氏度的温度；在此过程中，压力传递液沿第一和第二间隙结冰形成密封，而受冷膨胀的压力传递液产生高压。