CN115916407A - 器官芯片的冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有三维组织结构以及功能的器官芯片(Organ‑on‑a‑chip)的冷冻保存以及解冻方法。具体为，涉及将具有包括细胞以及水凝胶的微通道结构的器官芯片进行冷冻保存以及解冻的方法，从而具有在冷冻保存以及解冻前后，能够维持三维组织的结构以及功能的优秀效果。

Description

器官芯片的冷冻保存方法
技术领域
本发明涉及具有三维组织结构以及功能的器官芯片(Organ-on-a-chip)的冷冻保存以及解冻方法。具体为，涉及将具有包括细胞以及水凝胶的微通道结构的器官芯片进行冷冻保存以及解冻的方法，在冷冻保存以及解冻前后，能够维持三维组织的结构以及功能，从而购买冷冻的器官芯片的实际使用者(end user)在解冻之后能够容易使用。
背景技术
器官芯片(Organ-on-a-chip)是通过在小的芯片培养构成特定器官的细胞组织，从而模拟该器官的形态以及生理特性来实现所希望的功能的技术。可以利用器官芯片详细研究特定器官的细胞组织的活动以及在微环境下的物理化学反应的机制，而且可以用作用于评价新药开发的药物毒性以及功效的模型。
单纯的细胞或者二维结构的器官芯片的冷冻保存以及解冻可以利用目前公知的方法。一般，以往的细胞冷冻是将细胞进行酶处理，从而将细胞分散至冷冻保存液内，制成浮游状态之后来进行，作为浮游细胞组织体的类器官或者球状体等的冷冻也是通过相同的方法进行。当以浮游状态分散至冷冻保存液内时，含有相比细胞的量充分多的量的冷冻保存液而能够在热传递方面完成均匀的传递，从而技术上的考虑事项相对少，因此可以使用以往的细胞冷冻方法(Han,Sung-Hoon,et al.World journal of gastroenterology 23.6(2017):964；He,Andy,et al.Biopreservation and biobanking 18.3(2020):222-227；以及Clinton,James,and Penney McWilliams-Koeppen.Current protocols in cellbiology 82.1(2019):e66)。
然而，与所述浮游细胞组织体不同的是，实现三维器官组织的结构和功能的器官芯片(以下，“三维器官芯片”)是通过基于微流体设计的细胞组织体来模拟器官内存在的细胞组织的结构和功能，因此技术上的考虑事项多，而难以应用以往的一般的冷冻保存方法。
即，在热传递以及冷冻保护剂的扩散传递方面，所述浮游细胞组织体的热以及保护剂传递出现放射状的一维现象，与此相反地，在三维器官芯片中，随着复杂的通道形状而出现三维。另外，当为完成与体内类似形态的三维细胞培养的三维器官芯片时，利用细胞外基质(ECM)，因此，由于所述ECM经历冷冻以及解冻时产生的膨胀和收缩而形成在组织内部的细胞的网络连接被断开，导致不能原样维持细胞组织体的功能以及结构。因此，与以往的细胞以及浮游细胞组织体的冷冻不同，在三维器官芯片的冷冻保存方法中，需要考虑各种技术上的问题。
在所述浮游细胞组织体中，利用组织体的大小、构成细胞的存活率、构成细胞的蛋白质表达等来评价组织的功能保存，与此相反地，在形成在三维器官芯片的组织中，利用细胞-细胞间接触以及结合力、组织的物质渗透率、特定细胞的极化(polarization)等进一步评价组织的功能。这种仅是三维器官芯片的组织功能在人体内药物渗透率、药物功效以及毒性评价以及预测中属于非常重要的指标，在三维器官芯片的冷冻以及解冻过程中，维持所述组织的结构以及功能是极其重要的。然而，目前为止尚未出现能够维持所述结构以及功能的器官芯片的冷冻保存以及解冻方法。
因此，本发明人开发出在三维器官组织的冷冻保存以及解冻之后也能维持冷冻前所具有的器官组织的结构以及功能的方法，由此完成了本发明。
【现有技术文献】
【专利文献】
(专利文献0001)韩国公开专利公报第10-2017-0139048号
【非专利文献】
(非专利文献0001)Han,Sung-Hoon,et al."Long-termculture-inducedphenotypic difference and efficient cryopreservation of small intestinalorganoids by treatment timing of Rho kinase inhibitor."World journal ofgastroenterology 23.6(2017):964
(非专利文献0002)He,Andy,et al."Cryopreservation of viable humantissues:Renewable resource for viable tissue,cell lines,and organoiddevelopment."Biopreservation and biobanking 18.3(2020):222-227
(非专利文献0003)Clinton,James,and Penney McWilliams-Koeppen."Initiation,expansion,and cryopreservation of human primary tissue-derivednormal and diseased organoids in embedded three-dimensional culture."Currentprotocols in cell biology 82.1(2019):e66
发明内容
技术课题
本发明的目的在于，在经过将实现特定器官或者组织的结构和功能的器官芯片进行冷冻保存的过程之后，对其进行冷冻以及解冻之后也依旧保全冷冻之前所具有的特定器官或者组织的结构的功能，从而使实际使用者(end user)在实验室、研究所、制药公司等进行解冻之后，能够容易使用器官芯片(Organ-on-a-chip)。
另外，本发明的目的在于，即便在冷冻以及解冻之后也能保全在三维器官芯片的组织功能中作为评价细胞-细胞间结合力、组织的物质渗透率等的代表性的指标的TEER(跨上皮电阻；Transepithelial electrical resistance)值。
技术方案
本发明提供一种器官芯片的冷冻保存方法，其包括：制造器官芯片的步骤，所述器官芯片包括器官芯片组织部以及器官芯片屏障部，所述器官芯片组织部包括包括细胞以及水凝胶的微通道结构的第二通道，所述器官芯片屏障部包括包括细胞的微通道结构的第一通道；向所述器官芯片屏障部中包括的微通道灌流含有冷冻保护剂(cryoprotectant)的保存液的步骤；冷藏保存所述器官芯片的步骤；以及冷却所述器官芯片进行冷冻的步骤。
灌流所述保存液的步骤包括：为了向微通道内均匀分布保存液，利用静水压差向所述第一通道流通保存液一定时间的步骤；以及利用移液管向侧面通道替换保存液的步骤。
冷藏保存所述器官芯片的步骤包括：为了使向微通道内注入的保存液均匀扩散至作为三维水凝胶通道的第二通道，以冷藏状态保存一定时间的步骤。
本发明还提供一种器官芯片的解冻方法，其包括解冻按照所述方法冷冻的器官芯片的步骤。
发明效果
本发明的冷冻保存以及解冻方法使冷冻保存的三维组织或者器官在解冻之后也维持冷冻前的结构和功能，从而能够在实验室、研究所、制药公司等容易使用器官芯片。
尤其是，通过本发明的冷冻保存以及解冻方法，维持二维-三维组织结合而成的组织屏障或者三维组织屏障的结构以及功能，而且将细胞以及组织屏障细胞的细胞存活率以及细胞功能维持90％以上，维持组织的功能以及结构中所需的受体蛋白质等的蛋白质维持表达。
另外，本发明的冷冻保存以及解冻方法维持冷冻保存前的组织屏障的结构以及功能，保护TEER值以及渗透性等，从而能够有效使用在评价新药的功效以及毒性等中。
附图说明
图1以及2是包括第一通道以及第二通道的器官芯片的透视图以及剖面图。
图3以及4是包括第一通道、第二通道以及侧面通道的器官芯片的透视图以及剖面图。
图5以及6是包括第一通道、第二通道以及支架的器官芯片的透视图以及剖面图。
图7以及8是包括第一通道、第二通道、侧面通道以及支架的器官芯片的透视图以及剖面图。
图9是随着作为冷冻保护剂使用二甲基亚砜(DMSO)、丙三醇(glycerol)以及乙二醇(EG)而示出的TEER值。
图10以及11是随着DMSO浓度以及冷藏保存而示出的TEER值。
图12示出根据本发明的器官芯片冷冻保存以及解冻方法的器官芯片的冷冻前以及解冻后的水凝胶膨胀以及收缩的比较结果。
图13至15示出根据本发明的器官芯片冷冻保存以及解冻方法的冷冻前以及解冻后的蛋白质以及细胞核(nucleus)表达的比较结果。
符号说明：
100：器官芯片屏障部
110：第一通道
111：组织屏障细胞
112：支架
120：侧面通道
200：器官芯片组织部
210：第二通道
211：内部组织细胞
具体实施方式
以下，参考附图详细说明本申请的实施形态以及实施例以供本发明所属技术领域中具有通常知识的人能够容易实施。然而，本申请可以实现为各种形态，不限于在此说明的实施形态以及实施例。
在整个本申请说明书中，当提及到某一部分“包括”某种构成要素时，在没有特别相反的记载的情况下，并不是排除其他构成要素，而是指还可以包括其他构成要素。
本发明提供一种器官芯片的冷冻保存方法，其包括：制造器官芯片的步骤，所述器官芯片包括器官芯片组织部以及器官芯片屏障部，所述器官芯片组织部包括包括细胞以及水凝胶的微通道结构的第二通道，所述器官芯片屏障部包括包括细胞的微通道结构的第一通道；向所述器官芯片屏障部中包括的微通道灌流含有冷冻保护剂(cryoprotectant)的保存液的步骤；冷藏保存所述器官芯片的步骤；以及冷却所述器官芯片进行冷冻的步骤。
本申请中使用的术语“器官芯片(Organ-on-a-chip)”是指通过向小的芯片培养构成特定器官以及组织的一种以上的细胞，从而制成能够模拟该器官以及组织的形态以及生理特性来实现所期望的结构或者功能的芯片。
本申请中使用的术语“细胞”是指包括植物细胞、动物细胞(例如，哺乳动物细胞)、细菌细胞以及霉菌细胞等的生物学细胞。
本申请中使用的术语“水凝胶”作为通过共价键、氢键、范德瓦尔斯(van derwaals)结合或者物理结合等之类的凝聚力而交联的亲水性高分子，是指在水溶液上在内部含有大量的水，从而具有能够膨润的三维高分子网络结构的物质。
本申请中使用的术语“微通道”或者“微通道结构”作为能够供流体流动的细微大小的通道，是指包括具有毫米(millimeter)、微米(micrometer)或者纳米(nanometer)维度的通道的结构。
本申请中使用的术语“保存液”或者“冷冻保存液”是指含有冷冻保存剂(cryoprotective agents)以及向组织和细胞传递冷冻保存剂的运载溶液(vehiclesolution)等的液体，是指用于使在冷冻以及解冻过程中伴随的组织以及细胞的损伤最小化。
本申请中使用的术语“冷冻保护剂”是指用于使在冷冻时因水的结晶化现象导致的细胞的损伤最小化的添加剂，本申请中包括二甲基亚砜(DMSO)、丙三醇(glycerol)、乙二醇(ethylene glycol)等，而且不限于此。优选二甲基亚砜(DMSO)或者丙三醇(glycerol)，最优选DMSO。
在所述保存液中，冷冻保护剂的浓度可以优选为3v/v％以上，可以更加优选为5v/v％以上，可以最优选为10v/v％。
在一实施形态中，所述保存液可以进一步包括胎牛血清(FBS)。
在一实施形态中，所述“器官芯片屏障部”可以进一步包括位于“第一通道”以及第二通道的侧面的微通道结构的“侧面通道”。
在一实施形态中，所述“第一通道”可以包括组织屏障细胞。所述组织屏障细胞可以包括血管内皮细胞；皮肤细胞；癌细胞；分泌腺细胞；肌细胞；以及支气管、大肠、小肠、胰腺或者肾脏的上皮细胞。
本申请中使用的术语“组织屏障细胞”起到维持组织的特定结构的作用，是指起到从外部刺激保护组织的作用的细胞。不仅如此，是指利用组织屏障细胞之间或者与细胞外基质的强烈的结合力，使物质选择性地透过，而且起到使组织内物质浓度维持恒定的作用的细胞。组织屏障细胞可以包括上皮组织细胞(Epithelial tissue cell)以及血管内皮细胞(Vascular endothelial cell)。
在另一实施形态中，所述器官芯片可以在第一通道和第二通道之间进一步包括支架(Scaffold)。所述支架和第二通道可以为彼此接触的形态或者具有10μm以下的间距。
本申请中使用的术语“支架”是指为了组织建构以及细胞功能的控制而人工制造的细胞外基质(extracellular matrix；ECM)。优选为，所述支架可以包括基于多孔膜(porous membrane)的结构的细胞外基质的主要蛋白质，但不限于此。
在一实施形态中，所述微通道结构的高度可以为10μm至3mm。优选为，所述微通道结构的高度可以为100至500μm。更加优选为，所述微通道结构的高度可以为200至300μm。
在一实施形态中，所述微通道结构可以包括能够引导以及调节液体的灌流的入口以及出口。能够引导以及调节所述灌流的方法可以包括利用所述入口和出口的静水压差(Hydrostatic pressure difference)的方法、将外部泵连接到所述入口以及出口的方法，但不限于此。
灌流所述保存液的步骤可以包括：为了向微通道内均匀分布保存液，利用静水压差在数分钟期间(例如，1～5分钟)向所述第一通道流通保存液多次(例如，2～3次)的步骤；以及利用移液管向所述侧面通道替换保存液多次(例如，2～3次)的步骤。
冷藏保存所述器官芯片的步骤包括：为了使向微通道内注入的保存液均匀扩散至作为三维水凝胶通道的第二通道，以冷藏状态保存一定时间的步骤。所述冷藏保存时间可以为不足30分钟，可以优选为10至20分钟，可以更加优选为在4℃下15分钟。
在一实施形态中，所述水凝胶可以是具有70％以上的水分。优选为，所述水凝胶可以是具有80％以上的水分。
在另一实施形态中，所述水凝胶可以是包括选自由胶原蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、矿物质、血纤维蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、肽、聚乙二醇以及海藻酸而成的组中的一种以上。优选为，所述水凝胶可以是胶原蛋白凝胶、血纤维蛋白凝胶、层粘连蛋白凝胶、基底胶、源自动物的肿瘤基膜提取物凝胶、组织去细胞化细胞外基质凝胶、肽胶、聚乙二醇胶或者海藻酸胶，但不限于此。
在又一实施形态中，在冷冻前后，所述水凝胶的膨胀以及收缩可以不超过20％。优选为，在冷冻前后，所述水凝胶的膨胀以及收缩可以不超过10％。
在一实施形态中，所述第二通道可以包括内部组织细胞。所述内部组织细胞可以选自由星形细胞、周细胞、神经细胞、神经干细胞、神经胶质细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、肠上皮细胞、角质形成细胞、皮肤成纤维细胞、足细胞以及肾小球内皮细胞而成的组中的一种以上，但不限于此。
本申请中使用的术语“内部组织细胞”是指构成人体的器官以及组织的细胞，表示上皮组织(Epithelial tissue)、肌组织(Muscle tissue)、神经组织(Nervous tissue)或者结缔组织(Connective tissue)，但不限于此，包括构成人体组织的所有细胞。
在一实施形态中，所述第二通道可以进一步包括细胞培养液或者细胞悬浮液。相对于水凝胶，可以以0.1至1的重量比含有细胞培养液或者细胞悬浮液。
在一实施形态中，所述第二通道中包含的细胞的浓度可以是105至107cells/ml，所述第二通道中包含的细胞的数量可以是103至105。
在一实施形态中，可以以1至200μl/min的流速灌流所述保存液30秒以上，在另一实施形态中，可以在常温下灌流所述保存液。优选为，可以在4至10℃的温度下灌流所述保存液。
在另一实施形态中，所述保存液可以包括选自由包括生长因子、药物、蛋白质以及核酸的可溶性因子、不溶性因子以及纳米材料而成的组中的一种以上。
本申请中使用的术语“生长因子”是指包括细胞分泌的细胞因子、激素、核酸等的促进细胞的生长、分裂、修复以及分化等的细胞活动的物质。生长因子作为可溶性因子的一种，是指VEGF(血管内皮生长因子)、EGF(表皮生长因子)、FGF(纤维原细胞生长因子)、胰岛素、生长激素等之类通过细胞分泌从液态扩散的物质。
本申请中使用的术语“可溶性因子”是指可以通过受体(receptor)向细胞内部吸收的因子。
本申请中使用的术语“不溶性因子”是指细胞外基质、源自细胞外基质的肽、葡糖胺聚糖(glycosaminoglycan)之类不被细胞吸收而在外部刺激细胞的因子。
本申请中使用的术语“纳米材料”是指通过人工合成制成的约100nm大小以下的纳米颗粒、脂质体、石墨烯等的物质。
在一实施形态中，所述器官芯片的冷却可以是以0.5至5℃/min的速度进行至到达-80℃为止。优选为，所述器官芯片的冷却可以是以1至2℃/min的速度进行至到达-80℃为止。
在另一实施形态中，还可以包括：将所述器官芯片冷却至-80℃之后，使用液体氮将到达-80℃的所述器官芯片冷却至-196℃的步骤。
本发明提供一种器官芯片的冷冻以及解冻方法，其包括：制造器官芯片的步骤，所述器官芯片包括器官芯片组织部以及器官芯片屏障部，所述器官芯片组织部包括包括细胞以及水凝胶的微通道结构的第二通道，所述器官芯片屏障部包括包括细胞的微通道结构的第一通道；向所述器官芯片屏障部中包括的微通道灌流含有冷冻保护剂的保存液的步骤；冷藏保存所述器官芯片的步骤；冷却所述器官芯片进行冷冻的步骤；以及解冻所述冷冻的器官芯片的步骤。
本申请中使用的术语“解冻液”作为解冻过程中添加的物质，是指用于使解冻时伴随的细胞或者组织的损伤最小化的溶液。
在一实施形态中，所述器官芯片的解冻可以是在35至40℃下进行。优选为，所述器官芯片的解冻可以是在37℃下进行。
在一实施形态中，可以是在35至40℃下以32μl/min的流速或者2至8dyne/cm2的切应力灌流所述解冻液30秒以上。在另一实施形态中，所述解冻液可以是包括动物细胞培养液；以及选自由包括生长因子、药物、蛋白质以及核酸的可溶性因子、不溶性因子以及纳米材料而成的组中的一种以上。
本发明提供一种器官芯片的冷冻以及解冻方法，其特征为，在冷冻以及解冻前后，器官芯片的渗透率差为20％以下。
本发明提供一种器官芯片的冷冻以及解冻方法，其特征为，在冷冻以及解冻前后，器官芯片的TEER值为80％以上，优选为保持90％以上。
本发明提供一种器官芯片的冷冻以及解冻方法，其特征为，在冷冻以及解冻前后，器官芯片的受体蛋白质(receptor protein)以及细胞紧密连接(Cell tight junction)蛋白质维持表达。
本申请中使用的术语“微流体元件(millifluidic、microfluidic ornanofluidic device)”是指包括微通道等的芯片，所述微通道在由包括有机高分子物质的包括塑料、玻璃、金属或者硅的各种材料制成的基板上设置为供流体流动。
本申请中使用的术语“培养液”或者“细胞培养液”是指具有可以生育细胞的溶液成分和环境的溶液。根据细胞的性质设计成分以及浓度，可以直接使用一般市售的各种细胞培养液或者根据目标细胞的性质而添加附加成分来使用。
以下，参考附图详细说明本发明的器官芯片。本发明可以包括具体化为图1至8的形态的器官芯片，但不限于此。
本发明的器官芯片包括器官芯片屏障部100和器官芯片组织部200。
器官芯片屏障部100包括包括组织屏障细胞111的微通道结构的第一通道110。另外，器官芯片组织部200包括包括内部组织细胞211以及水凝胶的微通道结构的第二通道210。
器官芯片屏障部100可以包括位于包括组织屏障细胞111的微通道结构的第一通道110以及第二通道210的侧面的微通道结构的侧面通道120。
本发明的器官芯片可以在第一通道和第二通道之间包括支架112。
以下，通过实施例更加详细说明本发明，但是以下实施例仅是说明的目的，不用于限定本申请发明的范围。
【实施例1】
器官芯片的制造
向本发明的器官芯片的第一通道以及第二通道各自注入10μl的纤连蛋白(fibronectin)，在保温箱培养1小时。去除第一通道以及第二通道的细胞贴壁启动子(celladhesion promotor)，向第二通道注入107cells/ml的血管周细胞(pericyte)溶液。将所述芯片以翻转的状态在保温箱培养3小时之后，去除第二通道的培养液。向第二通道注入107cells/ml的以1:9体积比混合星形细胞(astrocyte)和水凝胶(hydrogel)的混合物之后，在保温箱培养30分钟。向侧面通道以及第一通道注入培养液，向孔储藏室(wellreservoir)填充培养液培养1天之后，向第一通道注入107cells/ml的人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell，hBMEC)溶液。在保温箱培养1小时之后，替换第一通道的培养液，培养1整天。替换第一通道以及侧面通道的培养液，向侧面通道插入插头之后，将第一通道注入口一侧连接到注射泵(syringe pump)，将另一侧连接到培养液槽，以4dynes/cm2灌流培养24小时。
【实施例2】
器官芯片的冷冻保存
从所述实施例2的器官芯片去除孔储藏室的所有培养液，利用培养液清洗第一通道以及侧面通道。利用4～10℃的冷冻保存液(50％培养液、40％FBS、10％DMSO)清洗侧面通道2次。去除第一通道两侧注入口的培养液，向注入口投入30μl的冷冻保存液，利用静水压差使冷冻保存液流通(消耗1分钟)。去除相反侧注入口的保存液，向注入口进一步投入30μl的冷冻保存液，利用静水压差使冷冻保存液流通(消耗1分钟)。将所述芯片放入填充有异丙醇(isopropanol)的冷冻集装箱中，在4℃下冷藏保存15分钟之后，保存至深度冷冻柜(-80℃)。
【实施例3】
器官芯片的解冻
从深度冷冻柜取出所述实施例3的器官芯片，浸入到恒温水槽(37℃)以使底部接触恒温水槽，解冻10分钟之后，利用37℃的培养液替换侧面通道的培养液2次。去除第一通道两侧注入口的保存液，向注入口投入30μl的37℃培养液，利用静水压差使培养液流通(消耗1分钟)。去除相反侧注入口的培养液，向注入口进一步投入30μl的37℃培养液，利用静水压差使培养液流通(消耗1分钟)。向孔储藏室填充37℃培养液，培养24小时以上。
【实施例4】
利用冷冻保护剂确认组织功能的维持
为了根据冷冻保护剂的种类来确认组织功能的维持效果，按照所述实施例2的冷冻保存方法，作为冷冻保护剂分别使用二甲基亚砜(DMSO)、丙三醇(glycerol)以及乙二醇(ethylene glycol，EG)进行实验，并测定TEER(跨上皮电阻；Transepithelial electricalresistance)值。TEER值属于在所述三维器官芯片的组织功能中用于评价细胞-细胞间结合力以及组织的物质渗透率等的代表性的指标，细胞在冷冻保存以及解冻之后也能持续生长，因此当解冻之后培养24小时时，如果保持TEER值或者TEER值增加，则可以被评为优秀的冷冻保护剂。
如下计算TEER值(ohm/cm2)，将冷冻前的TEER值设为1，从而与冷冻后的TEER值进行比较平价(标准化；normalized)。
【细胞培养的芯片-芯片(no cell)】
图9中示出所述实验结果。
如图9所示，当作为冷冻保护剂使用EG时，确认到TEER值相比冷冻前更低，从而可以确认到不适合作为本发明的冷冻保护剂。
另外，确认到丙三醇其TEER值相比冷冻前维持相同，DMSO其TEER值上升，从而可以确认到丙三醇和DMSO可以用作本发明的冷冻保护剂，DMSO为最优秀的冷冻保护剂。
【实施例5】
通过冷冻保护剂(DMSO)以及冷藏保存确认组织功能的维持
使用所述实施例2的冷冻保存方法，进行通过二甲基亚砜(DMSO)的各种含量确认三维组织功能维持效果的实验。另外，通过4℃的冷藏保存，进一步确认三维组织功能维持效果。通过与实施例4相同的方法测定TEER(Transepithelial electrical resistance)值，图10以及11中示出该结果。
如图10所示，确认到当DMSO含量为3％时，TEER值相比冷冻前维持相同，随着DMSO含量增加至5％以及10％，TEER值上升。因此，可以确认到当DMSO含量为3％以上时优选，当5％以上时更优选，当10％时最优选。
另外，如图11所示，确认到当在冷冻保存之前进行冷藏保存15分钟时，相比没有进行冷藏保存的情况，TEER值上升。然而，确认到当在冷冻保存之前进行冷藏保存30分钟时，TEER值反而下降。因此，可以确认到在冷冻保存之前，将冷藏保存优选进行不足30分钟，更优选进行15分钟。
【实施例6】
通过器官芯片的冷冻保存以及解冻确认水凝胶的膨胀以及收缩
通过根据所述实施例1至3的本发明的器官芯片的冷冻保存以及解冻方法，确认冷冻保存以及解冻的器官芯片的水凝胶膨胀以及收缩，图12中示出该结果。
如图12所示，比较根据本发明的器官芯片冷冻保存以及解冻方法的器官芯片的冷冻前以及解冻后的水凝胶膨胀以及收缩程度的结果，确认到与冷冻前相比，解冻后的水凝胶膨胀约1.4％水平。因此，可以确认到根据本发明的冷冻保存以及解冻方法的器官芯片在冷冻保存以及解冻之后也不改变组织的结构而维持组织的结构。
【实施例7】
通过器官芯片的冷冻保存以及解冻确认蛋白质表达
通过根据所述实施例1至3的本发明的器官芯片冷冻保存以及解冻方法，确认冷冻保存以及解冻的器官芯片的蛋白质表达以及细胞数量，图13至15中示出该结果。
如图13以及14所示，比较根据本发明的器官芯片冷冻保存以及解冻方法的冷冻前以及解冻后的蛋白质表达的结果，确认到解冻之后包括ZO-1(闭锁小带蛋白1)、VE-Cadherin(血管内皮钙粘蛋白)以及CLDN5(封闭蛋白5)的细胞连接蛋白质表达以及细胞核(nucleus)表达还维持与冷冻前类似的水平。
另外，如图15所示，比较根据本发明的器官芯片冷冻保存以及解冻方法的冷冻前以及解冻后的蛋白质表达的结果，确认到解冻之后三维星形细胞的GFAP以及AQP4表达以及细胞核(nucleus)表达还维持与冷冻前类似的水平。
因此，可以确认到根据本发明的冷冻保存以及解冻方法的器官芯片在冷冻保存以及解冻之后也维持细胞数、组织的结构以及功能。

Claims (25)

1.一种器官芯片的冷冻保存方法，其包括：
制造器官芯片的步骤，所述器官芯片包括器官芯片组织部以及器官芯片屏障部，所述器官芯片组织部包括包括细胞以及水凝胶的微通道结构的第二通道，所述器官芯片屏障部包括包括细胞的微通道结构的第一通道；
向所述器官芯片屏障部中包括的微通道灌流含有冷冻保护剂的保存液的步骤；
冷藏保存所述器官芯片的步骤；以及
冷却所述器官芯片进行冷冻的步骤。
2.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜或者丙三醇。
3.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜。
4.根据权利要求3所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，在所述保存液中，所述二甲基亚砜的浓度为3v/v％以上。
5.根据权利要求3所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，在所述保存液中，所述二甲基亚砜的浓度为5v/v％以上。
6.根据权利要求3所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，在所述保存液中，所述二甲基亚砜的浓度为10v/v％。
7.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，冷藏保存所述器官芯片不足30分钟。
8.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，冷藏保存所述器官芯片10至20分钟。
9.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，在4℃下冷藏保存所述器官芯片15分钟。
10.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述保存液进一步包括胎牛血清。
11.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述器官芯片屏障部进一步包括位于第二通道的侧面的微通道结构的侧面通道。
12.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述第一通道包括组织屏障细胞。
13.根据权利要求12所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述组织屏障细胞包括血管内皮细胞；皮肤细胞；癌细胞；分泌腺细胞；肌细胞；以及支气管、大肠、小肠、胰腺或者肾脏的上皮细胞。
14.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述器官芯片在第一通道和第二通道之间进一步包括支架。
15.根据权利要求14所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述支架和第二通道为彼此接触的形态或者具有10μm以下的间距。
16.根据权利要求14所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述支架具有多孔膜的结构。
17.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述水凝胶包括选自由胶原蛋白凝胶、血纤维蛋白凝胶、层粘连蛋白凝胶、源自动物的肿瘤基膜提取物凝胶、组织去细胞化细胞外基质凝胶、肽胶、聚乙二醇胶或者海藻酸胶而成的组中的一种以上。
18.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，在冷冻前后，所述水凝胶的膨胀以及收缩不超过20％。
19.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，在冷冻前后，所述水凝胶的膨胀以及收缩不超过10％。
20.根据权利要求1所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述第二通道包括内部组织细胞。
21.根据权利要求20所述的器官芯片的冷冻保存方法，其特征在于，所述内部组织细胞选自由星形细胞、周细胞、神经细胞、神经干细胞、神经胶质细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、肠上皮细胞、角质形成细胞、皮肤成纤维细胞、足细胞以及肾小球内皮细胞而成的组中的一种以上。
22.一种器官芯片的冷冻以及解冻方法，其包括：
制造器官芯片的步骤，所述器官芯片包括器官芯片组织部以及器官芯片屏障部，所述器官芯片组织部包括包括细胞以及水凝胶的微通道结构的第二通道，所述器官芯片屏障部包括包括细胞的微通道结构的第一通道；
向所述器官芯片屏障部中包括的微通道灌流含有冷冻保护剂的保存液的步骤；
冷藏保存所述器官芯片的步骤；
冷却所述器官芯片进行冷冻的步骤；以及
解冻所述冷冻的器官芯片的步骤。
23.根据权利要求22所述的器官芯片的冷冻以及解冻方法，其特征在于，在冷冻以及解冻前后，器官芯片的渗透率差为20％以下。
24.根据权利要求22所述的器官芯片的冷冻以及解冻方法，其特征在于，在冷冻以及解冻前后，器官芯片的跨上皮电阻值维持80％以上。
25.根据权利要求22所述的器官芯片的冷冻以及解冻方法，其特征在于，在冷冻以及解冻前后，器官芯片的受体蛋白质以及细胞紧密连接蛋白质维持表达。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100688443B1 (ko) * 2005-03-11 2007-03-02 경상남도 세포성 인공조직의 장기보관을 위한 무혈청성 동결보존액및 이를 이용한 세포성 인공조직의 동결보존방법
US10087422B2 (en) * 2011-12-09 2018-10-02 President And Fellows Of Harvard College Organ chips and uses thereof
CN107810059B (zh) 2015-04-22 2021-03-23 伯克利之光生命科技公司 在微流体装置上冷冻和存档细胞
CN105831105B (zh) * 2016-04-12 2018-12-14 上海理工大学 微流体细胞处理芯片及其应用方法
CN105994250A (zh) * 2016-05-19 2016-10-12 电子科技大学 一种基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除方法
WO2018104935A1 (en) * 2016-12-06 2018-06-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Cryopreservation method of biological specimen
KR102045931B1 (ko) * 2018-04-05 2019-11-18 오가노이드사이언스 주식회사 오가노이드의 동결방법

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