WO2021261961A1 - 장기칩의 동결보존 방법 - Google Patents

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WO2021261961A1
WO2021261961A1 PCT/KR2021/008025 KR2021008025W WO2021261961A1 WO 2021261961 A1 WO2021261961 A1 WO 2021261961A1 KR 2021008025 W KR2021008025 W KR 2021008025W WO 2021261961 A1 WO2021261961 A1 WO 2021261961A1
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박규민
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(주) 멥스젠
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    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes

Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation and thawing method of an organ-on-a-chip having a three-dimensional tissue structure and function. Specifically, it relates to a method for cryopreserving and thawing an organ chip having a microchannel structure including cells and hydrogel, which can maintain the structure and function of a three-dimensional tissue before and after cryopreservation and thawing, so that the frozen organ chip The end user who purchased the product can use it easily after thawing.
  • Organ-on-a-chip It is a technology that implements a desired function by culturing the cell tissue constituting a specific organ on a small chip, mimicking the shape and physiological characteristics of the organ. Using this, it is possible to study in detail the behavior of cell tissues of specific organs and the mechanisms of physicochemical reactions in the microenvironment, and it can be used as a model for drug toxicity and efficacy evaluation of new drug development.
  • cryopreservation and thawing of organ chips with simple cells or two-dimensional structures currently known methods can be used.
  • conventional cell freezing is performed after dispersing the cells in a cryopreservation solution by enzymatic treatment of the cells to make them in a suspended state, and freezing of suspended cell tissues such as organoids or spheroids is also performed in the same way.
  • the cryopreservation solution contains a sufficiently large amount compared to the amount of cells, so that uniform transfer in terms of heat transfer can be achieved.
  • an organ chip that implements the structure and function of a three-dimensional organ tissue uses a microfluid-based designed cell tissue to provide the structure and function of the cellular tissue present in the organ. Since this is simulated, it is difficult to apply the existing general cryopreservation method due to many technical considerations.
  • the function preservation of the tissue is evaluated by the size of the tissue, the viability of the constituent cells, the protein expression of the constituent cells, etc.
  • the function of the tissue formed in the three-dimensional organ chip is the cell-cell contact and bonding force, the tissue of the material permeability, polarization of specific cells, etc. are additionally evaluated.
  • the tissue function of the 3D organ chip is a very important indicator for evaluating and predicting drug permeability, drug efficacy and toxicity in the human body, and maintains the structure and function of the tissue during freezing and thawing of the 3D organ chip. to do is most important.
  • methods for cryopreservation and thawing of organ chips capable of maintaining the above structure and function are not currently known.
  • the present inventors have completed the present invention by developing a method for maintaining the structure and function of the organ tissue before freezing even after cryopreservation and thawing of the three-dimensional organ tissue.
  • Patent Document 0001 Korean Patent Publication No. 10-2017-0139048
  • Non-Patent Document 0001 Han, Sung-Hoon, et al. "Long-term culture-induced phenotypic difference and efficient cryopreservation of small intestinal organoids by treatment timing of Rho kinase inhibitor.” World journal of gastroenterology 23.6 (2017): 964
  • Non-patent document 0002 He, Andy, et al. "Cryopreservation of viable human tissues: Renewable resource for viable tissue, cell lines, and organoid development.” Biopreservation and biobanking 18.3 (2020): 222-227
  • Non-Patent Document 0003 Clinton, James, and Penney McWilliams-Koeppen. "Initiation, expansion, and cryopreservation of human primary tissue-derived normal and diseased organoids in embedded three-dimensional culture.” Current protocols in cell biology 82.1 (2019): e66
  • the present invention preserves the structure and function of a specific organ or tissue that it had before freezing after freezing and thawing after undergoing the process of cryopreserving the organ chip embodying the structure and function of a specific organ or tissue as it is in laboratories and research institutes It aims to make it easy for end users to use Organ-on-a-chip after thawing in pharmaceutical companies, etc.
  • the purpose is to preserve the TEER (Transepithelial electrical resistance) value, which is a representative index for evaluating the cell-to-cell bonding force, the tissue material permeability, etc. in the tissue function of the three-dimensional organ chip, even after freezing and thawing.
  • TEER Transepithelial electrical resistance
  • the present invention provides an organ chip comprising a tissue part of an organ chip including a second channel of a microchannel structure including cells and hydrogel, and a barrier part of an organ chip including a first channel of a microchannel structure including cells.
  • Organ comprising the steps of: perfusing a preservative solution containing a cryoprotectant (cryoptotectant) into the microchannel included in the barrier part of the organ chip, refrigerated storage of the organ chip, and cooling and freezing the organ chip
  • a method for cryopreservation of chips is provided.
  • the step of perfusing the preservative solution may include: flowing the preservative solution through the first channel for a predetermined time using a hydrostatic pressure difference in order to uniformly distribute the preservative solution in the microchannel; and replacing the preservative solution in the side channel using a pipette.
  • the step of refrigerated storage of the organ chip includes the step of refrigerated storage for a certain period of time so that the preservative solution injected into the microchannel is uniformly diffused into the second channel, which is a three-dimensional hydrogel channel.
  • the present invention also provides a method for thawing organ chips, comprising the step of thawing organ chips frozen according to the above method.
  • the cryopreservation and thawing method of the present invention allows the three-dimensional tissue or organ stored frozen to maintain the structure and function before freezing even after thawing, so that the organ chip can be easily used in laboratories, research institutes, pharmaceutical companies, etc.
  • the cryopreservation and thawing method of the present invention the structure and function of a tissue barrier or three-dimensional tissue barrier created by combining two-dimensional and three-dimensional tissues is maintained, and the cell viability and cell function of cells and tissue barrier cells are improved. More than 90% is maintained, and the expression of proteins such as receptor proteins necessary to maintain the function and structure of the tissue is maintained.
  • cryopreservation and thawing method of the present invention maintains the structure and function of the tissue barrier prior to cryopreservation, thereby preserving the TEER value and permeability, and can be usefully used to evaluate the efficacy and toxicity of new drugs.
  • 1 and 2 are a perspective view and a cross-sectional view of a long-term chip including a first channel and a second channel.
  • 3 and 4 are perspective views and cross-sectional views of a long-term chip including a first channel, a second channel, and a side channel.
  • FIG 5 and 6 are perspective views and cross-sectional views of an organ chip including a first channel, a second channel, and a scaffold.
  • FIG. 7 and 8 are perspective views and cross-sectional views of an organ chip including a first channel, a second channel, a side channel, and a scaffold.
  • Figure 9 shows the TEER values according to the use of dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol (glycerol) and ethylene glycol (EG) as a cryoprotectant.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • glycerol glycerol
  • EG ethylene glycol
  • the present invention provides an organ chip comprising a tissue part of an organ chip including a second channel of a microchannel structure including cells and hydrogel, and a barrier part of an organ chip including a first channel of a microchannel structure including cells.
  • Organ comprising the steps of: perfusing a preservative solution containing a cryoprotectant into the microchannel included in the barrier part of the organ chip, refrigerated storage of the organ chip, and cooling and freezing the organ chip A method for cryopreservation of chips is provided.
  • organ-on-a-chip refers to culturing one or more cells constituting a specific organ and tissue on a small chip, thereby mimicking the morphology and physiological characteristics of the organ and tissue. It refers to a chip manufactured to implement a structure or function.
  • cell refers to biological cells, including plant cells, animal cells (eg, mammalian cells), bacterial cells and fungal cells, and the like.
  • hydrogel is a hydrophilic polymer crosslinked by cohesive forces such as covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds or physical bonds, and contains a large amount of water in an aqueous solution to swell three-dimensionally. It refers to a material having a polymer network structure.
  • microchannel or “microchannel structure” refers to a channel having a microscopic size through which a fluid can flow, and a channel having a dimension of millimeters, micrometers, or nanometers. structure that contains
  • cryopreservation solution refers to a liquid, including cryoprotective agents, and vehicle solutions that deliver cryopreservative agents to tissues and cells, and the like, which are frozen and thawed. It means to minimize damage to tissues and cells that accompany the process.
  • cryoprotectant refers to an additive for minimizing damage to cells due to crystallization of water during freezing, and in the present application, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol etc., but are not limited thereto. Dimethylsulfoxide (DMSO) or glycerol is preferred, and DMSO is most preferred.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the concentration of the cryoprotectant in the preservative may be preferably 3 v/v% or more, more preferably 5 v/v% or more, and most preferably 10 v/v%.
  • the preservative may further include fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • the "long-term chip barrier part” may further include a "side channel” of a microchannel structure positioned on the side of the "first channel” and the second channel.
  • the "first channel” may comprise tissue barrier cells.
  • the tissue barrier cells include vascular endothelial cells; skin cells; cancer cells; gland cells; muscle cells; and epithelial cells of the bronchus, large intestine, small intestine, pancreas or kidney.
  • tissue barrier cell refers to a cell whose role is to maintain a specific structure of a tissue and to protect the tissue from external stimuli. In addition, it refers to a cell that selectively permeates a substance by using a strong binding force between cells of the tissue barrier or with the extracellular matrix, and the concentration of the substance in the tissue plays a role in maintaining homeostasis. Tissue barrier cells include epithelial tissue cells and vascular endothelial cells.
  • the organ chip may further include a scaffold between the first channel and the second channel.
  • the scaffold and the second channel may be in contact with each other or have an interval of 10 ⁇ m or less.
  • the term “scaffold” refers to an artificially created extracellular matrix (ECM) for tissue construction and control of cellular functions.
  • the scaffold may include a major protein of the extracellular matrix based on the structure of a porous membrane, but is not limited thereto.
  • the height of the microchannel structure may be 10 ⁇ m to 3 mm.
  • the height of the microchannel structure may be 100 to 500 ⁇ m. More preferably, the height of the microchannel structure may be 200 to 300 ⁇ m.
  • the microchannel structure may include an inlet and an outlet capable of inducing and controlling the perfusion of the liquid agent.
  • the method for inducing and controlling the perfusion may include, but is not limited to, a method using a hydrostatic pressure difference between the inlet and the outlet, and a method of connecting an external pump to the inlet and the outlet.
  • the preservative solution is applied to the first channel several times (for example, 1 to 5 minutes) for several minutes (for example, 1 to 5 minutes) using a hydrostatic pressure difference. , 2-3 times) flowing; and replacing the preservative solution in the side channel several times (eg, 2-3 times) using a pipette.
  • the step of refrigerated storage of the organ chip includes the step of refrigerated storage for a certain period of time so that the preservative solution injected into the microchannel is uniformly diffused into the second channel, which is a three-dimensional hydrogel channel.
  • the refrigeration storage time may be less than 30 minutes, preferably 10 to 20 minutes, and more preferably 15 minutes at 4 °C.
  • the hydrogel may have a moisture content of 70% or more.
  • the hydrogel may have a moisture content of 80% or more.
  • the hydrogel may include one or more selected from the group consisting of collagen, laminin, hyaluronic acid, minerals, fibrin, fibronectin, elastin, peptides, polyethylene glycol, and alginate.
  • the hydrogel may be collagen gel, fibrin gel, laminin gel, matrigel, animal-derived tumor basement membrane extract gel, tissue decellularization extracellular matrix gel, peptide gel, polyethylene glycol gel, or alginate gel, but is not limited thereto. .
  • the expansion and contraction of the hydrogel before and after freezing may not exceed 20%.
  • the expansion and contraction of the hydrogel before and after freezing may not exceed 10%.
  • the second channel may contain internal tissue cells.
  • the internal tissue cell is one or more from the group consisting of astrocytes, epithelial cells, nerve cells, neural stem cells, glial cells, cardiomyocytes, smooth muscle cells, intestinal epithelial cells, keratinocytes, dermal fibroblasts, leg cells and glomerular endothelial cells. may be selected, but is not limited thereto.
  • internal tissue cells refers to cells constituting organs and tissues of the human body, and epithelial tissue, muscle tissue, nerve tissue, or connective tissue ( Connective tissue), but is not limited thereto, and includes all cells constituting human tissue.
  • the second channel may further include a cell culture solution or a cell suspension.
  • the cell culture solution or cell suspension may be included in a weight ratio of 0.1 to 1.
  • the concentration of cells included in the second channel may be 10 5 to 10 7 cells/ml, and the number of cells included in the second channel may be 10 3 to 10 5 cells.
  • the preservative solution may be perfused at a flow rate of 1 to 200 ⁇ l/min for at least 30 seconds, and in another embodiment, the preservative solution may be perfused at room temperature. Preferably, the preservative may be perfused at a temperature of 4 to 10 °C.
  • the preservative may include one or more selected from the group consisting of growth factors, drugs, soluble factors including proteins and nucleic acids, insoluble factors, and nanomaterials.
  • growth factor refers to a substance that promotes cellular activities such as growth, division, recovery and differentiation of cells, including cytokines, hormones, nucleic acids, etc. secreted by cells.
  • a growth factor is a type of soluble factor, and it means that it spreads in the liquid phase by cell secretion, such as VEGF, EGF, FGF, insulin, and growth hormone.
  • soluble factor refers to a factor that can be absorbed through a receptor into a cell.
  • insoluble factor refers to a factor that is not absorbed into cells, such as extracellular matrix, extracellular matrix-derived peptide, and glycosaminoglycan, and stimulates the cell from the outside.
  • nanomaterial refers to a material such as nanoparticles, liposomes, graphene, etc. having a size of about 100 nm or less made through artificial synthesis.
  • the cooling of the organ chip may be performed at a rate of 0.5 to 5 °C/min until reaching -80 °C.
  • the cooling of the organ chip may be made at a rate of 1 to 2 °C/min until it reaches -80 °C.
  • the method may further include cooling the organ chips reaching -80 °C to -196 °C using liquid nitrogen.
  • the present invention provides an organ chip comprising a tissue part of an organ chip including a second channel of a microchannel structure including cells and hydrogel, and a barrier part of an organ chip including a first channel of a microchannel structure including cells. Step, perfusion of a preservative solution containing a cryoprotectant (cryoptotectant) into the microchannel included in the barrier part of the organ chip, refrigerated storage of the organ chip, cooling and freezing the organ chip, and the frozen Provided is a method for freezing and thawing organ chips, comprising the step of thawing the organ chips.
  • a cryoprotectant cryoptotectant
  • thaw solution is added during the thawing process, and refers to a solution for minimizing damage to cells or tissues accompanying thawing.
  • the thawing of the organ chip may be made at 35 to 40 °C.
  • thawing of the organ chip may be performed at 37°C.
  • the thawing solution may be perfused at 35 to 40° C. at a flow rate of 8 to 32 ⁇ l/min or a shear stress of 2 to 8 dyne/cm 2 for 30 seconds or more.
  • the thawing solution is an animal cell medium; And it may include one or more selected from the group consisting of growth factors, drugs, soluble factors including proteins and nucleic acids, insoluble factors, and nanomaterials.
  • the present invention provides a method for freezing and thawing organ chips, characterized in that the difference in transmittance of the organ chips before and after freezing and thawing is 20% or less.
  • the present invention provides a method for freezing and thawing organ chips, characterized in that the TEER value of the organ chips is maintained at 80% or more, preferably 90% or more before and after freezing and thawing.
  • the present invention provides a method for freezing and thawing an organ chip, characterized in that the expression of receptor protein and cell tight junction protein of the organ chip is maintained before and after freezing and thawing.
  • microfluidic device millifluidic, microfluidic or nanofluidic device
  • a microfluidic device provided so that a fluid can flow on a substrate made of various materials including plastic, glass, metal, or silicon including organic polymer materials. It means a chip including channels, etc.
  • culture medium or “cell culture medium” refers to a solution having viable solution components and environments of cells. Components and concentrations are designed according to the properties of cells, and various commercially available cell cultures can be used as they are, or additional components can be added according to the properties of the target cells.
  • the present invention may include a long-term chip embodied in the form of FIGS. 1 to 8, but is not limited thereto.
  • the organ chip of the present invention includes the organ chip barrier part 100 and the organ chip tissue part 200 .
  • the organ chip barrier unit 100 includes a first channel 110 having a microchannel structure including tissue barrier cells 111 .
  • the organ chip tissue unit 200 includes a second channel 210 having a microchannel structure including internal tissue cells 211 and hydrogel.
  • the organ chip barrier unit 100 includes a side channel 120 of a microchannel structure positioned on the side of the first channel 110 and the second channel 210 of the microchannel structure including the tissue barrier cells 111 . can do.
  • the organ chip of the present invention may include a scaffold 112 between the first channel and the second channel.
  • 10 ⁇ l of each of fibronectin was injected into the first and second channels of the organ chip of the present invention, and cultured in an incubator for 1 hour.
  • Cell adhesion promoters of the first and second channels were removed, and 10 7 cells/ml of a pericyte solution was injected into the second channel.
  • the culture solution of the second channel was removed.
  • 10 7 cells/ml of a mixture of astrocytes and hydrogels in a 1:9 volume ratio was injected into the second channel, and then incubated in an incubator for 30 minutes.
  • the first channel contains 10 7 cells/ml of human brain microvascular endothelial cells. , hBMEC) solution was injected. After culturing for 1 hour in the incubator, the culture medium of the first channel was replaced and cultured for one day. After replacing the culture medium of the first channel and the side channel, plugging the side channel, one side of the first channel inlet port is connected to a syringe pump and the other side is connected to the culture medium tank at 4 dynes/cm 2 for 24 hours. during perfusion culture.
  • the culture solution in the well reservoir was removed from the organ chip of Example 2, and the first channel and the side channel were washed with the culture solution.
  • the side channels were washed twice with cryopreservation solution (50% culture solution, 40% FBS, 10% DMSO) at 4 to 10 °C.
  • the culture solution from both inlets of the first channel was removed, and 30 ⁇ l of the cryopreservation solution was put into the inlet, and the cryopreservation solution was flowed by a difference in hydrostatic pressure (takes 1 minute).
  • the preservative solution in the opposite inlet was removed, and 30 ⁇ l of the cryopreservation solution was additionally added to the inlet, and the cryopreservation solution was flowed through the hydrostatic pressure difference (takes 1 minute).
  • the chip was placed in a freezing container filled with isopropanol and stored refrigerated at 4° C. for 15 minutes, and then stored in a deep freezer (-80° C.).
  • the organ chip of Example 3 was taken out of the deep freezer and thawed for 10 minutes by immersing the bottom in a constant temperature water bath (37 ° C) to contact, and then the culture medium in the side channel was replaced twice with a culture medium at 37 ° C.
  • the preservative solution in both inlets of the first channel was removed, and 30 ⁇ l of the 37 °C culture solution was put into the inlet, and the culture solution was flowed with a difference in hydrostatic pressure (takes 1 minute).
  • the culture solution from the opposite inlet was removed, and 30 ⁇ l of the 37 °C culture solution was additionally put into the inlet, and the culture solution flowed through the hydrostatic pressure difference (takes 1 minute).
  • the well storage was filled with a culture medium at 37 °C and incubated for 24 hours or more.
  • TEER transepithelial electrical resistance
  • the TEER value corresponds to a representative indicator for evaluating the cell-cell bonding force and the material permeability of the tissue in the tissue function of the three-dimensional organ chip, and the cells can continue to grow even after cryopreservation and thawing, so culture for 24 hours after thawing In one case, if the TEER value is maintained or increased, it can be evaluated as a good cryoprotectant.
  • the TEER value (ohm/cm 2 ) was calculated as follows, and the TEER value before freezing was compared with the TEER value after freezing (normalized).
  • Example 2 Using the cryopreservation method of Example 2, an experiment was performed to confirm the effect of maintaining three-dimensional tissue function with various contents of dimethyl sulfoxide (DMSO). In addition, the effect of maintaining three-dimensional tissue function according to 4 °C refrigeration was additionally confirmed. Transepithelial electrical resistance (TEER) values were measured in the same manner as in Example 4, and the results are shown in FIGS. 10 and 11 .
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the DMSO content is preferable when it is 3% or more, more preferably when it is 5% or more, and most preferably when it is 10%.
  • the hydrogel after thawing was about 1.4% compared to that before freezing. It was confirmed that it expanded to a level. Therefore, it can be seen that the organ chip according to the cryopreservation and thawing method of the present invention maintains the tissue structure without deformation even after cryopreservation and thawing.
  • FIG. 15 as a result of comparing protein expression before and after freezing according to the cryopreservation and thawing method of the organ chip of the present invention, GFAP and AQP4 expression of three-dimensional astrocytes, and nucleus expression of the three-dimensional astrocytes were frozen even after thawing. It was confirmed that it was maintained at the same level as before.
  • the organ chip according to the cryopreservation and thawing method of the present invention maintains the number of cells and the structure and function of the tissue even after cryopreservation and thawing.

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Abstract

본 발명은 3차원 조직 구조 및 기능을 갖는 장기칩 (Organ-on-a-chip)의 동결보존 및 해동 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 세포 및 하이드로젤을 포함하는 미세채널 구조를 갖는 장기칩을 동결보존 및 해동하는 방법에 관한 것으로 동결보존 및 해동 전후에 3차원 조직의 구조 및 기능을 유지할 수 있는 우수한 효과를 갖는다.

Description

장기칩의 동결보존 방법
본 발명은 3차원 조직 구조 및 기능을 갖는 장기칩 (Organ-on-a-chip)의 동결보존 및 해동 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 세포 및 하이드로젤을 포함하는 미세채널 구조를 갖는 장기칩을 동결보존 및 해동하는 방법에 관한 것으로, 동결보존 및 해동 전후에 3차원 조직의 구조 및 기능을 유지할 수 있어, 동결된 장기칩을 구매한 실사용자 (end user)가 해동 후 쉽게 사용할 수 있다.
장기칩 (Organ-on-a-chip)은 작은 칩에 특정 장기를 구성하는 세포 조직을 배양함으로써, 해당 장기의 형태 및 생리적 특성을 모사하여 원하는 기능을 구현하는 기술이다. 이를 이용하여 특정 장기의 세포 조직의 거동 및 미세환경에서의 물리화학적 반응의 메커니즘을 상세하게 연구할 수 있으며, 신약개발의 약물 독성 및 효능 평가 등을 위한 모델로 이용될 수 있다.
단순한 세포 또는 2차원 구조의 장기 칩의 동결보존 및 해동은 현재 알려진 방법을 이용할 수 있다. 일반적으로, 기존의 세포 동결은 세포를 효소 처리하여 동결보존액 내에 세포를 분산시켜 부유 상태로 만든 후 수행되며, 부유세포조직체인 오가노이드 또는 스페로이드 등의 동결 또한 동일한 방법으로 수행된다. 동결보존액 내에 부유상태로 분산되는 경우, 세포의 양에 비해 충분히 많은 양의 동결보존액이 포함되어 열전달 측면에서 균일한 전달이 이루어질 수 있어, 상대적으로 기술적인 고려사항이 적기 때문에 기존 세포 동결 방법을 사용할 수 있다 (Han, Sung-Hoon, et al. World journal of gastroenterology 23.6 (2017): 964; He, Andy, et al. Biopreservation and biobanking 18.3 (2020): 222-227; 및 Clinton, James, and Penney McWilliams-Koeppen. Current protocols in cell biology 82.1 (2019): e66).
그러나 상기 부유세포조직체와 달리, 3차원 장기 조직의 구조와 기능을 구현한 장기칩 (이하 "3차원 장기칩")은 미세유체 기반으로 설계된 세포 조직체를 통하여 장기 내에 존재하는 세포 조직의 구조와 기능이 모사되기 때문에, 기술적인 고려사항들이 많아 기존의 일반적인 동결보존 방법을 적용하기 어렵다.
즉, 열전달 및 동결보호제의 확산 전달 측면에서 상기 부유세포조직체는 열 및 보호제 전달이 방사형의 1차원 현상으로 일어나는 반면, 3차원 장기칩에서는 복잡한 채널 형상을 따라 3차원으로 일어나게 된다. 또한, 체내와 유사한 형태의 3차원 세포배양이 이루어지는 3차원 장기칩의 경우에는 세포외기질 (ECM)을 이용하기 때문에, 상기 ECM이 동결 및 해동을 겪으면서 일어나는 팽창과 수축으로 인해 조직 내부에 형성된 세포의 네트워크 연결이 끊어져, 세포 조직체의 기능 및 구조를 그대로 유지할 수 없다. 따라서 기존의 세포 및 부유세포조직체의 동결과는 달리, 3차원 장기칩의 동결 보존 방법에 있어서 여러가지 기술적인 문제점들이 고려되어야 한다.
상기 부유세포조직체에서 조직의 기능 보존은 조직체의 크기, 구성 세포의 생존률, 구성 세포의 단백질 발현 등으로 평가되는 반면, 3차원 장기칩에 형성되는 조직의 기능은 세포-세포간 접촉 및 결합력, 조직의 물질 투과율, 특정 세포의 분극화 (polarization) 등이 추가적으로 평가된다. 이러한 3차원 장기칩만의 조직 기능은 인체 내 약물 투과율, 약물 효능 및 독성 평가 및 예측에 있어 매우 중요한 지표에 해당하며, 3차원 장기칩의 동결 및 해동의 과정에서 상기 조직의 구조 및 기능을 유지하는 것은 무엇보다 중요하다. 그러나, 상기 구조 및 기능을 유지할 수 있는 장기칩의 동결보존 및 해동 방법은 현재 알려져 있지 않다.
따라서, 본 발명자들은 3차원 장기 조직의 동결보존 및 해동 이후에도 동결 전에 갖고 있었던 장기 조직의 구조 및 기능을 유지하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 0001) 한국 공개특허공보 제10-2017-0139048호
[비특허문헌]
(비특허문헌 0001) Han, Sung-Hoon, et al. "Long-term culture-induced phenotypic difference and efficient cryopreservation of small intestinal organoids by treatment timing of Rho kinase inhibitor." World journal of gastroenterology 23.6 (2017): 964
(비특허문헌 0002) He, Andy, et al. "Cryopreservation of viable human tissues: Renewable resource for viable tissue, cell lines, and organoid development." Biopreservation and biobanking 18.3 (2020): 222-227
(비특허문헌 0003) Clinton, James, and Penney McWilliams-Koeppen. "Initiation, expansion, and cryopreservation of human primary tissue-derived normal and diseased organoids in embedded three-dimensional culture." Current protocols in cell biology 82.1 (2019): e66
본 발명은 특정 장기 또는 조직의 구조와 기능을 구현한 장기칩을 동결보존하는 과정을 거친 후, 이를 동결 및 해동시킨 후에도 동결 전에 가지고 있었던 특정 장기 또는 조직의 구조와 기능을 그대로 보전하여 실험실, 연구소, 제약회사 등에서 실사용자 (end user)가 해동 후 장기칩 (Organ-on-a-chip)을 쉽게 사용할 수 있도록 하는 것을 목적으로 한다.
또한, 3차원 장기칩의 조직 기능에서 세포-세포간 결합력, 조직의 물질 투과율 등을 평가하는 대표적인 지표인 TEER (Transepithelial electrical resistance) 값을 동결 및 해동 후에도 보존하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 세포 및 하이드로젤을 포함하는 미세채널 구조의 제2 채널을 포함하는 장기칩 조직부, 및 세포를 포함하는 미세채널 구조의 제1 채널을 포함하는 장기칩 장벽부를 포함하는 장기칩을 제조하는 단계, 상기 장기칩 장벽부에 포함된 미세채널에 동결보호제 (cryoptotectant)를 포함하는 보존액을 관류시키는 단계, 상기 장기칩을 냉장 보관하는 단계, 및 상기 장기칩을 냉각하여 동결하는 단계를 포함하는 장기칩의 동결보존 방법을 제공한다.
상기 보존액을 관류시키는 단계는, 미세채널 내에 보존액을 균일하게 분포하게 하기 위해, 상기 제1 채널에 보존액을 정수압차를 이용하여 일정 시간 동안 흘려주는 단계; 및 측면 채널에 보존액을 파이펫을 이용하여 교체하는 단계를 포함한다.
상기 장기칩을 냉장 보관하는 단계는, 미세채널 내에 주입한 보존액이 3차원 하이드로젤 채널인 제2 채널에 균일하게 확산되도록 하기 위해, 일정 시간 동안 냉장 상태로 보관하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 동결된 장기칩을 해동하는 단계를 포함하는 장기칩의 해동 방법을 제공한다.
본 발명의 동결보존 및 해동 방법은 동결 보관된 3차원 조직 또는 장기가 해동 후에도 동결 전의 구조와 기능을 유지하도록 하여, 실험실, 연구소, 제약회사 등에서 장기칩을 쉽게 사용할 수 있도록 한다.
특히, 본 발명의 동결보존 및 해동 방법을 통해, 2차원-3차원 조직이 결합되어 만드는 조직 장벽 혹은 3차원 조직 장벽의 구조 및 기능이 유지되고, 세포 및 조직장벽 세포의 세포 생존율 및 세포 기능이 90% 이상 유지되며, 조직의 기능 및 구조를 유지하는데 필요한 수용체 단백질 등의 단백질 발현이 유지된다.
또한, 본 발명의 동결보존 및 해동 방법은 동결보존 전의 조직 장벽의 구조 및 기능을 유지시켜, TEER 값 및 투과성 등을 보전시켜 신약의 효능 및 독성 등을 평가하는데 유용하게 활용할 수 있다.
도 1 및 2는 제1 채널 및 제2 채널을 포함하는 장기칩의 투시도 및 단면도이다.
도 3 및 4는 제1 채널, 제2 채널 및 측면 채널을 포함하는 장기칩의 투시도 및 단면도이다.
도 5 및 6은 제1 채널, 제2 채널, 및 스캐폴드를 포함하는 장기칩의 투시도 및 단면도이다.
도 7 및 8은 제1 채널, 제2 채널, 측면 채널, 및 스캐폴드를 포함하는 장기칩의 투시도 및 단면도이다.
도 9는 동결보호제로서 디메틸설폭시드 (DMSO), 글리세롤 (glycerol) 및 에틸렌글리콜 (EG) 사용에 따른 TEER 값을 나타낸다.
도 10 및 11은 DMSO 농도 및 냉장보관에 따른 TEER 값을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 장기칩 동결보존 및 해동 방법에 따른 장기칩의 동결 전 및 해동 후의 하이드로젤 팽창 및 수축의 비교를 나타낸다.
도 13 내지 15는 본 발명의 장기칩 동결보존 및 해동 방법에 따른 동결 전 및 해동 후의 단백질 및 nucleus 발현의 비교를 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 세포 및 하이드로젤을 포함하는 미세채널 구조의 제2 채널을 포함하는 장기칩 조직부, 및 세포를 포함하는 미세채널 구조의 제1 채널을 포함하는 장기칩 장벽부를 포함하는 장기칩을 제조하는 단계, 상기 장기칩 장벽부에 포함된 미세채널에 동결보호제 (cryoprotectant)를 포함하는 보존액을 관류시키는 단계, 상기 장기칩을 냉장 보관하는 단계, 및 상기 장기칩을 냉각하여 동결하는 단계를 포함하는 장기칩의 동결보존 방법을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "장기칩 (Organ-on-a-chip)"은 작은 칩에 특정 장기 및 조직를 구성하는 한 가지 이상의 세포를 배양함으로써, 해당 장기 및 조직직의 형태 및 생리적 특성을 모사하여 원하는 구조 또는 기능을 구현할 수 있도록 제작된 칩을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "세포"는 식물 세포, 동물 세포 (예컨대, 포유동물 세포), 박테리아 세포 및 곰팡이 세포 등을 포함하는 생물학적 세포를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "하이드로젤"은 공유 결합, 수소결합, van der waals 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "미세채널" 또는 "미세채널 구조"는 유체가 흐를 수 있는 미세한 크기의 채널로서, 밀리미터 (millimeter), 마이크로미터 (micrometer), 또는 나노미터 (nanometer)의 차원을 갖는 채널을 포함하는 구조를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "보존액" 또는 "동결보존액"은 동결보존제 (cryoprotective agents), 및 동결보존제를 조직과 세포로 전달하는 운반용액 (vehicle solution) 등을 포함하는 액체를 의미하는 것으로, 냉동 및 해동 과정에서 동반되는 조직 및 세포의 손상을 최소화하기 위한 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "동결보호제"는 동결 시, 물의 결정화 현상으로 인한 세포의 손상을 최소화하기 위한 첨가제를 의미하며, 본원에서는 디메틸설폭시드 (DMSO), 글리세롤 (glycerol), 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol) 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 디메틸설폭시드 (DMSO) 또는 글리세롤 (glycerol)이 바람직하고, DMSO가 가장 바람직하다.
상기 보존액에서 동결보호제의 농도는 바람직하게 3 v/v% 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5 v/v% 이상일 수 있고, 가장 바람직하게는 10 v/v%일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 보존액은 우태혈청 (FBS)을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 "장기칩 장벽부"는 "제1 채널" 및 제2 채널의 측면에 위치하는 미세채널 구조의 "측면 채널"을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 "제1 채널"은 조직 장벽 세포를 포함할 수 있다. 상기 조직 장벽 세포는 혈관내피세포; 피부세포; 암세포; 분비샘 세포; 근육 세포; 및 기관지, 대장, 소장, 췌장 또는 신장의 상피세포를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조직 장벽 세포"는 조직의 특정한 구조를 유지하는 역할을 하며, 조직을 외부 자극으로부터 보호하는 역할을 하는 세포를 의미한다. 뿐만 아니라, 조직 장벽 세포간 혹은 세포외 기질과의 강한 결합력을 이용하여, 선택적으로 물질을 투과시키며 조직 내 물질 농도가 항상성을 유지하는 역할을 하는 세포를 의미한다. 조직 장벽 세포는 상피조직세포 (Epithelial tissue cell) 및 혈관내피세포 (Vascular endothelial cell)을 포함한다.
다른 일 실시태양에서, 상기 장기칩은 제1 채널과 제2 채널 사이에 스캐폴드 (Scaffold)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 스캐폴드와 제2 채널은 서로 접촉한 형태 또는 10 μm 이하의 간격을 갖는 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "스캐폴드"는 조직 구축 및 세포기능 제어를 위해 인공적으로 만든 세포외 기질 (extracellular matrix; ECM)을 의미한다. 바람직하게, 상기 스캐폴드는 다공성 막 (porous membrane)의 구조를 기반으로 한 세포외 기질의 주요 단백질이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시태양에서, 상기 미세채널 구조의 높이는 10 μm 내지 3 mm일 수 있다. 바람직하게는, 상기 미세채널 구조의 높이는 100 내지 500 μm일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 미세채널 구조의 높이는 200 내지 300 μm 일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 미세채널 구조는 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함할 수 있다. 상기 관류를 유도 및 조절할 수 있는 방법은 상기 입구와 출구의 정수압차 (Hydrostatic pressure difference)를 이용하는 방법, 외부 펌프를 상기 입구 및 출구에 연결하는 방법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 보존액을 관류시키는 단계는, 미세채널 내에 보존액을 균일하게 분포하게 하기 위해, 상기 제1 채널에 보존액을 정수압차를 이용하여 수분 (예를 들어, 1 ~ 5분)동안 여러 번 (예를 들어, 2 ~ 3번) 흘려주는 단계; 및 상기 측면채널에 보존액을 파이펫을 이용하여 여러 번 (예를 들어, 2 ~ 3번) 교체하는 단계를 포함한다.
상기 장기칩을 냉장 보관하는 단계는, 미세채널 내에 주입한 보존액이 3차원 하이드로젤 채널인 제2 채널에 균일하게 확산되도록 하기 위해, 일정 시간 동안 냉장 상태로 보관하는 단계를 포함한다. 상기 냉장 보관 시간은 30분 미만일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 20분일 수 있고, 더욱 바람직하게는 4 ℃에서 15분일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 하이드로젤은 70% 이상의 수분을 갖는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 하이드로젤은 80% 이상의 수분을 갖는 것일 수 있다.
다른 일 실시태양에서, 상기 하이드로젤은 콜라겐, 라미닌, 히알루론산, 미네랄, 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴, 펩타이드, 폴리에틸렌글리콜 및 알지네이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 하이드로젤은 콜라겐젤, 피브린젤, 라미닌젤, 마트리젤, 동물 유래 종양 기저막 추출물젤, 조직 탈세포화 세포외 기질젤, 펩타이드젤, 폴리에틸렌글리콜젤 또는 알지네이트젤일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 일 실시태양에서, 동결 전후에 상기 하이드로젤의 팽창 및 수축이 20%를 초과하지 않는 것일 수 있다. 바람직하게는, 동결 전후에 상기 하이드로젤의 팽창 및 수축이 10%를 초과하지 않는 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제2 채널은 내부 조직 세포를 포함할 수 있다. 상기 내부 조직 세포는 성상세포, 주피세포, 신경세포, 신경줄기세포, 아교세포, 심근세포, 평활근세포, 창자 상피세포, 각질형성 세포, 피부섬유아세포, 다리세포 및 사구체 내피세포로 구성된 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "내부 조직 세포"는 인체의 장기 및 조직을 구성하고 있는 세포를 의미하며, 상피조직 (Epithelial tissue), 근육조직 (Muscle tissue), 신경조직 (Nervous tissue), 또는 결합조직 (Connective tissue)을 의미하나, 이에 한정되지 않는, 인체 조직을 이루고 있는 모든 세포를 포함한다.
일 실시태양에서, 상기 제2 채널은 세포 배양액 또는 세포 현탁액을 추가로 포함할 수 있다. 하이드로젤에 대하여 세포 배양액 또는 세포 현탁액은 0.1 내지 1의 중량비로 포함되는 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제2 채널에 포함된 세포의 농도는 105 내지 107 cells/ml일 수 있고, 상기 제2 채널에 포함된 세포의 수는 103 내지 105 개일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 보존액을 1 내지 200 μl/min의 유속으로 30초 이상 관류시킬 수 있고, 다른 일 실시태양에서, 상기 보존액을 실온에서 관류시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 보존액을 4 내지 10 ℃의 온도에서 관류시킬 수 있다.
다른 일 실시태양에서, 상기 보존액은 성장인자, 약물, 단백질 및 핵산을 포함하는 가용성 인자, 불용성 인자, 및 나노소재로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "성장인자"는 세포가 분비하는 사이토카인, 호르몬, 핵산 등을 포함하는 세포의 성장, 분열, 회복 및 분화 등의 세포활동을 촉진시키는 물질을 말한다. 성장인자는 가용성 인자의 한 종류로 VEGF, EGF, FGF, 인슐린, 성장호르몬 등과 같이 세포 분비에 의해 액상에서 퍼져나가는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "가용성 인자"는 세포 내부로 수용체 (receptor)를 통해 흡수될 수 있는 인자를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "불용성 인자"는 세포외 기질, 세포외 기질 유래 펩타이드, 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan)과 같이 세포에 흡수되지 않고, 세포를 외부에서 자극하는 인자를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "나노소재"는 인공 합성을 통해 만들어진 약 100 nm 크기 이하의 나노파티클, 리포좀, 그래핀 등의 물질을 의미한다.
일 실시태양에서, 상기 장기칩의 냉각은 -80 ℃에 도달할 때까지 0.5 내지 5 ℃/min의 속도로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 장기칩의 냉각은 -80 ℃에 도달할 때까지 1 내지 2 ℃/min의 속도로 이루어질 수 있다.
다른 일 실시태양에서, 상기 장기칩을 -80 ℃까지 냉각시킨 후, -80 ℃에 도달한 상기 장기칩을 액체질소를 사용하여 -196 ℃까지 냉각시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 세포 및 하이드로젤을 포함하는 미세채널 구조의 제2 채널을 포함하는 장기칩 조직부, 및 세포를 포함하는 미세채널 구조의 제1 채널을 포함하는 장기칩 장벽부를 포함하는 장기칩을 제조하는 단계, 상기 장기칩 장벽부에 포함된 미세채널에 동결보호제 (cryoptotectant)를 포함하는 보존액을 관류시키는 단계, 상기 장기칩을 냉장 보관하는 단계, 상기 장기칩을 냉각하여 동결하는 단계, 및 상기 동결된 장기칩을 해동하는 단계를 포함하는 장기칩의 동결 및 해동 방법을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "해동액"은 해동과정에서 첨가되는 것으로, 해동시 동반되는 세포 또는 조직의 손상을 최소화하기 위한 용액을 의미한다.
일 실시태양에서, 상기 장기칩의 해동은 35 내지 40 ℃에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 장기칩의 해동은 37 ℃에서 이루어질 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 해동액을 35 내지 40 ℃에서 8 내지 32 μl/min의 유속 또는 2 내지 8 dyne/cm2의 전단응력으로 30초 이상 관류시키는 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 해동액은 동물세포 배지; 및 성장인자, 약물, 단백질 및 핵산을 포함하는 가용성 인자, 불용성 인자 및 나노소재로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 동결 및 해동 전후에 장기칩의 투과율 차이가 20% 이하인 것을 특징으로 하는 장기칩의 동결 및 해동 방법을 제공한다.
본 발명은 동결 및 해동 전후에 장기칩의 TEER 값이 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 유지되는 것을 특징으로 하는 장기칩의 동결 및 해동 방법을 제공한다.
본 발명은 동결 및 해동 전후에 장기칩의 수용체 단백질 (receptor protein) 및 세포 밀착 연접 (Cell tight junction) 단백질 발현이 유지되는 것을 특징으로 하는 장기칩의 동결 및 해동 방법을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "미세유체소자 (millifluidic, microfluidic or nanofluidic device)"는 유기 고분자 물질을 포함하는 플라스틱, 유리, 금속 또는 실리콘을 포함하는 다양한 소재로 제조된 기판 위에 유체가 흐를 수 있도록 구비된 미세채널 등을 포함하고 있는 칩을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "배양액" 또는 "세포 배양액"은 세포의 생육 가능한 용액 성분과 환경을 갖는 용액을 의미한다. 성분 및 농도는　세포의 성질에 따라 설계되며, 일반적으로 시판되고 있는 각종　세포　배양액을 그대로 사용하거나, 목적　세포의 성질에 따라 추가 성분을 첨가하여 이용할 수 있다.
이하, 도면들을 참조하여 본 발명의 장기칩에 대해 상세히 설명하기로 한다. 본 발명은 도 1 내지 8의 형태로 구체화된 장기칩을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 장기칩은 장기칩 장벽부(100)와 장기칩 조직부(200)를 포함한다.
장기칩 장벽부(100)는 조직 장벽 세포(111)를 포함하는 미세채널 구조의 제1 채널(110)을 포함한다. 또한, 장기칩 조직부(200)는 내부 조직 세포(211) 및 하이드로젤을 포함하는 미세채널 구조의 제2 채널(210)을 포함한다.
장기칩 장벽부(100)는 조직 장벽 세포(111)를 포함하는 미세채널 구조의 제1 채널(110) 및 제2 채널(210)의 측면에 위치하는 미세채널 구조의 측면 채널(120)을 포함할 수 있다.
본 발명의 장기칩은 제1 채널과 제2 채널 사이에 스캐폴드(112)를 포함할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
장기칩의 제조
본 발명의 장기칩의 제1 채널 및 제2 채널에 피브로넥틴 (fibronectin)을 각각 10 μl를 주입하고, 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하였다. 제1 채널 및 제2 채널의 세포 부착 프로모터 (cell adhesion promotor)를 제거하고, 혈관주위세포 (pericyte) 용액 107 cells/ml을 제2 채널에 주입하였다. 상기 칩을 뒤집은 채로 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한 후, 제2 채널의 배양액을 제거하였다. 성상세포 (astrocyte)와 하이드로젤 (hydrogel)이 1:9 부피비로 혼합된 혼합물 107 cells/ml을 제2 채널에 주입한 후, 인큐베이터에서 30분 동안 배양하였다. 측면 채널 및 제1 채널에 배양액을 주입하고, 웰 저장소 (well reservoir)에 배양액을 채워 하루 동안 배양한 후, 제1 채널에 107 cells/ml의 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (human brain microvascular endothelial cell, hBMEC) 용액을 주입하였다. 인큐베이터에서 1시간 배양한 후, 제1 채널의 배양액을 교체하여 하루 동안 배양하였다. 제1 채널 및 측면 채널의 배양액을 교체하고, 측면 채널에 플러그를 꽂은 뒤, 제1 채널 주입구 한쪽은 실린지 펌프 (syringe pump), 다른 한쪽은 배양액 탱크에 연결하여 4 dynes/cm2으로 24시간 동안 관류 배양하였다.
[실시예 2]
장기칩의 동결보존
상기 실시예 2의 장기칩에서 웰 저장소의 배양액을 모두 제거하고, 제1 채널 및 측면 채널을 배양액으로 세척하였다. 4 ~ 10 ℃의 동결보존액 (50% 배양액, 40% FBS, 10% DMSO)으로 측면 채널을 2번 세척하였다. 제1 채널 양쪽 주입구의 배양액을 제거하고, 동결보존액 30 μl를 주입구에 투입하여 정수압차로 동결보존액을 흘려주었다 (1분 소요). 반대쪽 주입구의 보존액을 제거하고, 동결보존액 30 μl를 추가로 주입구에 투입하여 정수압차로 동결보존액을 흘려주었다 (1분 소요). 상기 칩을 이소프로판올 (isopropanol)이 채워진 동결 컨테이너에 넣고 15분 동안 4 ℃ 냉장보관 후, 딥프리저 (-80 ℃)에 보관하였다.
[실시예 3]
장기칩의 해동
상기 실시예 3의 장기칩을 딥프리저에서 꺼내어 항온 수조 (37 ℃)에 바닥이 접촉하도록 담구어 10분 동안 해동한 후, 37 ℃의 배양액으로 측면 채널의 배양액을 2번 교체하였다. 제1 채널 양쪽 주입구의 보존액을 제거하고, 37 ℃ 배양액 30 μl를 주입구에 투입하여 정수압차로 배양액을 흘려주었다 (1분 소요). 반대쪽 주입구의 배양액을 제거하고, 37 ℃ 배양액 30 μl를 추가로 주입구에 투입하여 정수압차로 배양액을 흘려주었다 (1분 소요). 웰 저장소에 37 ℃ 배양액을 채우고 24시간 이상 배양하였다.
[실시예 4]
동결보호제에 따른 조직 기능의 유지 확인
동결보호제의 종류에 따른 조직 기능의 유지 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2의 동결보존 방법에 따라, 동결보호제로 디메틸설폭시드 (DMSO), 글리세롤 (glycerol) 및 에틸렌글리콜 (ethylene glycol, EG)를 각각 사용하여 실험을 수행하고, TEER (Transepithelial electrical resistance) 값을 측정하였다. TEER 값은 상기 3차원 장기칩의 조직 기능에서 세포-세포간 결합력 및 조직의 물질 투과율 등을 평가하기 위한 대표적인 지표에 해당하며, 동결보존 및 해동 후에도 세포가 계속 성장할 수 있어서, 해동 후 24시간 배양한 경우 TEER 값이 유지되거나 증가하는 경우 우수한 동결보호제로 평가될 수 있다.
TEER 값 (ohm/cm2)은 하기와 같이 계산하고, 동결 전의 TEER 값을 1로 하여 동결 후의 TEER 값과 비교 평가하였다 (normalized).
[세포 배양된 칩 - 칩 (no cell)]
상기 실험 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 동결보호제로 EG를 사용한 경우 TEER 값이 동결 전과 비교하여 더 낮은 것을 확인하여, 본 발명의 동결보호제로 적절하지 않은 것을 알 수 있다.
또한, 글리세롤은 TEER 값이 동결 전과 비교하여 동일하게 유지되고, DMSO는 TEER 값이 상승하는 것을 확인하여, 글리세롤과 DMSO는 본 발명의 동결보호제로 사용가능하며, DMSO가 가장 우수한 동결보호제인 것을 알 수 있다.
[실시예 5]
동결보호제 (DMSO) 및 냉장보관에 따른 조직 기능의 유지 확인
상기 실시예 2의 동결보존 방법을 사용하여, 디메틸설폭시드 (DMSO)의 다양한 함량으로 3차원 조직 기능 유지 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 또한, 4℃ 냉장보관에 따른 3차원 조직 기능 유지 효과를 추가로 확인하였다. 실시예 4와 동일한 방법으로 TEER (Transepithelial electrical resistance) 값을 측정하였으며, 그 결과를 도 10 및 11에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, DMSO 함량이 3%일 때 TEER 값이 동결 전과 비교하여 동일하게 유지되고, DMSO 함량이 5% 및 10%로 증가함에 따라 TEER 값이 상승하는 것을 확인하였다. 따라서 DMSO 함량이 3% 이상일 때 바람직하며 5% 이상일 때 더욱 바람직하고, 10%일 때 가장 바람직한 것을 알 수 있다.
또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 동결보존 전 냉장보관을 15분 수행하는 경우 냉장보관을 수행하지 않는 경우보다 TEER 값이 상승하는 것을 확인하였다. 그러나, 동결보존 전 냉장보관을 30분 수행하는 경우 오히려 TEER 값이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 동결보전 전 냉장보관을 30분 미만으로 수행하는 것이 바람직하고, 15분 수행하는 것이 더욱 바람직한 것을 알 수 있다.
[실시예 6]
장기칩의 동결보존 및 해동에 따른 하이드로젤의 팽창 및 수축 확인
상기 실시예 1 내지 3에 따른 본 발명의 장기칩의 동결보존 및 해동 방법으로, 동결보존 및 해동된 장기칩의 하이드로젤 팽창 및 수축을 확인하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 장기칩 동결보존 및 해동 방법에 따른 장기칩의 동결 전 및 해동 후의 하이드로젤 팽창 및 수축 정도를 비교한 결과, 동결 전과 비교하여 해동 후의 하이드로젤이 약 1.4% 수준으로 팽창한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 동결보존 및 해동 방법에 따른 장기칩은 동결보존 및 해동 후에도 조직의 구조가 변형되지 않고 유지되는 것을 알 수 있다.
[실시예 7]
장기칩의 동결보존 및 해동에 따른 단백질 발현 확인
상기 실시예 1 내지 3에 따른 본 발명의 장기칩 동결보존 및 해동 방법으로, 동결보존 및 해동된 장기칩의 단백질 발현 및 세포 수를 확인하여, 그 결과를 도 13 내지 15에 나타내었다.
도 13 및 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 장기칩 동결보존 및 해동 방법에 따른 동결 전 및 해동 후의 단백질 발현을 비교한 결과, 해동 후에도 ZO-1, VE-Cadherin 및 CLDN5를 포함하는 세포 연접 단백질 발현, 및 nucleus 발현이 동결 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.
또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 장기칩 동결보존 및 해동 방법에 따른 동결 전 및 해동 후의 단백질 발현을 비교한 결과, 해동 후에도 3차원 성상세포의 GFAP 및 AQP4 발현, 및 nucleus 발현이 동결 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 동결보존 및 해동 방법에 따른 장기칩은 동결보존 및 해동 후에도 세포 수, 조직의 구조 및 기능이 유지되는 것을 알 수 있다.
[부호의 설명]
100: 장기칩 장벽부
110: 제1 채널
111: 조직 장벽 세포
112: 스캐폴드
120: 측면 채널
200: 장기칩 조직부
210: 제2 채널
211: 내부 조직 세포

Claims (25)

  1. 세포 및 하이드로젤을 포함하는 미세채널 구조의 제2 채널을 포함하는 장기칩 조직부, 및 세포를 포함하는 미세채널 구조의 제1 채널을 포함하는 장기칩 장벽부를 포함하는 장기칩을 제조하는 단계;
    상기 장기칩 장벽부에 포함된 미세채널에 동결보호제 (cryoptotectant)를 포함하는 보존액을 관류시키는 단계;
    상기 장기칩을 냉장 보관하는 단계; 및
    상기 장기칩을 냉각하여 동결시키는 단계
    를 포함하는 장기칩의 동결보존 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 동결보호제는 디메틸설폭시드 (DMSO) 또는 글리세롤 (glycerol)인 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 동결보호제는 디메틸설폭시드 (DMSO)인 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 보존액에서 디메틸설폭시드 (DMSO)의 농도는 3 v/v% 이상인 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 보존액에서 디메틸설폭시드 (DMSO)의 농도는 5 v/v% 이상인 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 보존액에서 디메틸설폭시드 (DMSO)의 농도는 10 v/v%인 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 장기칩을 30분 미만으로 냉장 보관하는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 장기칩을 10 내지 20분 동안 냉장 보관하는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 장기칩을 4℃에서 15분 동안 냉장 보관하는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 보존액은 우태혈청을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 장기칩 장벽부는 제2 채널의 측면에 위치하는 미세채널 구조의 측면 채널을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 제1 채널은 조직 장벽 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조직 장벽 세포는 혈관내피세포; 피부세포; 암세포; 분비샘 세포; 근육 세포; 및 기관지, 대장, 소장, 췌장 또는 신장의 상피세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 장기칩은 제1 채널과 제2 채널 사이에 스캐폴드 (Scaffold)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 스캐폴드와 제2 채널은 서로 접촉한 형태 또는 10 μm 이하의 간격을 갖는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 스캐폴드는 다공성 막 (porous membrane)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 콜라겐젤, 피브린젤, 라미닌젤, 동물 유래 종양 기저막 추출물젤, 조직 탈세포화 세포외 기질젤, 펩타이드젤, 폴리에틸렌글리콜젤 또는 알지네이트젤로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  18. 제1항에 있어서, 동결 전후에 상기 하이드로젤의 팽창 및 수축이 20%를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  19. 제1항에 있어서, 동결 전후에 상기 하이드로젤의 팽창 및 수축이 10%를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 제2 채널은 내부 조직 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 내부 조직 세포는 성상세포, 주피세포, 신경세포, 신경줄기세포, 아교세포, 심근세포, 평활근세포, 창자 상피세포, 각질형성 세포, 피부섬유아세포, 다리세포 및 사구체 내피세포로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결보존 방법.
  22. 세포 및 하이드로젤을 포함하는 미세채널 구조의 제2 채널을 포함하는 장기칩 조직부, 및 세포를 포함하는 미세채널 구조의 제1 채널을 포함하는 장기칩 장벽부를 포함하는 장기칩을 제조하는 단계;
    상기 장기칩 장벽부에 포함된 미세채널에 동결보호제 (cryoptotectant)를 포함하는 보존액을 관류시키는 단계;
    상기 장기칩을 냉장 보관하는 단계;
    상기 장기칩을 냉각하여 동결하는 단계; 및
    상기 동결된 장기칩을 해동하는 단계
    를 포함하는 장기칩의 동결 및 해동 방법.
  23. 제22항에 있어서, 동결 및 해동 전후에 장기칩의 투과율 차이가 20% 이하인 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결 및 해동 방법.
  24. 제22항에 있어서, 동결 및 해동 전후에 장기칩의 TEER 값이 80% 이상 유지되는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결 및 해동 방법.
  25. 제22항에 있어서, 동결 및 해동 전후에 장기칩의 수용체 단백질 (receptor protein) 및 세포 밀착 연접 (cell tight junction) 단백질 발현이 유지되는 것을 특징으로 하는, 장기칩의 동결 및 해동 방법.
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