WO2019059702A2

WO2019059702A2 - 나노섬유 기반 장기간 초대 간세포 3차원 배양시스템 및 배양방법

Info

Publication number: WO2019059702A2
Application number: PCT/KR2018/011215
Authority: WO
Inventors: 곽종영; 송민규; 김소희; 최민호
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2019-03-28
Also published as: WO2019059702A3; WO2019059702A9

Abstract

본 발명은 나노섬유 기반 장기간 초대 간세포 배양시스템 및 배양방법에 관한 것으로, 상기 초대 간세포 배양시스템은 나노섬유로 이루어진 지지체를 사이에 두고 인간 초대 간세포와 간 비실질세포를 이격시켜 직접 공배양하지 않고 간접적으로 공배양함으로써 증식성이 낮은 초대 간세포를 장기간 본래의 생리활성을 유지하도록 in vitro 상에서 3차원 세포배양을 할 수 있는 장점이 있다. 이러한 초대 간세포 배양시스템은 간조직 유사 환경으로서 고가의 혈청을 사용하지 않고 저가의 비용으로 손쉽게 초대 간세포를 배양할 수 있으며, 간 약물대사효소(시토크롬 P450 효소) 유도 및 억제를 통한 약물-약물 간 상호작용 분석, 간 수송체의 기능적 업테이크(uptake) 분석 및 약물 유도 간 손상 분석 등 다양한 분야에 활용할 수 있다.

Description

나노섬유 기반 장기간 초대 간세포 3차원 배양시스템 및 배양방법

본 발명은 나노섬유 기반 장기간 초대 간세포 배양시스템 및 배양방법에 관한 것으로, 나노섬유로 이루어진 지지체를 사이에 두고 인간 초대 간세포와 간 비실질세포를 이격시켜 직접 공배양하지 않고 간접적으로 3차원 공배양하는 것을 특징으로 하는 장기간 초대 간세포 배양시스템 및 배양방법에 관한 것이다.

본 발명은 과학기술정보통신부가 지원한 미래유망 융합기술 파이오니아사업의 "나노칩 기반으로 개발된 자가손상 방어 면역네트워크의 기능화 및 실용화" 연구과제(과제고유번호: 2015-001923, 주관기관: 아주대학교 산학협력단, 연구기간: 2015.03.01 ~ 2018.02.28) 및 보건복지부가 지원한 연구중심병원육성 R＆D 사업의 "3D 면역칩 기반 비임상 개발 서비스 플랫폼" 연구과제의 지원을 받아 수행되었다(과제고유번호: HI16C0992, 주관기관: 아주대학교 산학협력단, 연구기간: 2016.04.01 ~ 2024.12.31).

약물 대사, 당신생, 지질대사 등의 기능을 갖는 간은 생체 내에서 다양하고 중요한 역할을 담당하고 있다. 이러한 다양한 간기능의 연구, 또는 발암물질을 포함한 각종의 약물의 대사 해독의 검정법 확립 등을 위해 간세포의 배양은 매우 중요하다.

지금까지 간세포의 배양에서는 배양 세포로서 일반 간세포주나 초대 배양 간세포 등이 이용되고 있지만, 일반 간세포의 상당수는 간암 세포이며 간의 실질세포와는 다른 성질을 가지는 것이기 때문에 간암 세포를 이용하여 얻어진 실험 결과를 그대로 생체에 있어서의 대사 등의 생명 현상을 반영한 것으로서 받아들이기 어려운 문제점이 있었고, 초대 배양 간세포가 간세포에 가까워 배양 세포로서 바람직한 것으로 인식되어 왔다.

또한, 초대 배양 간세포는 생체 내에 있어서의 각종 약물 또는 독물 등의 화학물질 등의 영향(약효, 독성 등)을 측정하거나, 생체 내에서 화학물질 등이 시토크롬 P-450의 작용을 받아 어떠한 성질의 반응 대사산물이 되는지, 예를 들면 발암성 물질 등의 유해 물질이 되는지의 여부 등을 조사하기 위해 유용한 바, 장기간 기능을 유지한 초대 배양 간세포의 배양 방법은 매우 중요하다.

그러나, 간세포는 초대 배양 시 1~2일 이내 죽거나, William’s E medium과 같은 특수 배지, 덱사메타손, 인슐린 등을 포함시킨 배지 조성물에서 배양해야 하며 간세포가 생존하더라도 생체 본래의 생리활성 및 세포 접착성이 현저하게 저하하는 문제가 있다. 간세포의 스페로이드 배양 기술(WO2015182159)은 있지만 이 기술 또한 상기의 특수 배양액이 필요하다. 따라서 장기간 본래의 생리활성을 갖는 초대 간세포 배양 기술의 개발이 필요한 실정이다.

임상실험을 시험에 대한 위험성과 윤리적 문제가 따르기 때문에, 그 대체 방안으로서 세포실험이나 동물실험을 시행하고 있다. In vitro 및 전임상 동물시험 대체 간조직-특이 독성 마커 측정 기술 개발이 필요하다. 간세포의 배양이 아직 대체적으로 2차원적 수준에 머물고 있기 때문에 세포 생존기간이 짧고, 세포 기능이 배양 후 급격히 떨어짐으로써 생체의 다양한 반응을 측정하는데 한계를 가지고 있다.

그러나 아직까지 인체 간조직의 생물학적, 생리학적 및 화학 반응의 특성을 반영할 수 있는 3차원 간세포 배양 기술이 없기 때문에 다양한 독성실험과 약물대사실험의 어려움을 겪고 있다.

간에서 대사된 약물 대사산물을 측정할 수 있는 간세포 배양 시스템의 개발 또한 필요한데 이를 위하여 간세포의 생존이 최대한으로 유지될 수 있는 배양 조건이 되어야 한다. 3차원으로 배양된 간세포를 사용할 경우 약물 평가나 독성평가에서 실제 인체 내의 결과와 보다 가까운 결과가 도출될 수 있다.

종래의 이차원 배양은 콜라겐이 코팅된 배양 디쉬에서 세포를 파종하고 다시 세포위에 matrigel을 얹어서 배양하는 sandwich 방법이 있으나, 이러한 배양에서는 간세포의 장기간 배양이 어려우며 William’s E medium에 여러 가지 성장인자나 약물을 추가하는 고비용의 배양방법이며 2차원 배양의 한계를 가진다. 또한 최근에는 간세포, 혈관내피세포 및 섬유아세포를 바이오프린팅 기술로서 직접 공배양하여 간조직 유사 3차원 배양을 하는 방법(WO2014151921) 등이 있으나, 나노섬유 지지체의 다른 층에 부착시킨 상태에서 잘 제어된 환경의 챔버 내에서 3차원 분리 공동 배양하여 생체 간조직 미세환경을 모사하는 기술은 전무한 실정이다.

이에, 본 발명에서는 낮은 생존능을 개선하여 장기간 배양할 수 있고 본래의 생리활성을 갖는 초대 간세포 공배양시스템 및 3차원 배양방법을 제공하는 데에 그 목적이 있다.

상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 초대 간세포(primary hepatocyte)를 배양한 제1층; 및 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 간 비실질세포를 배양한 제2층을 포함하며, 상기 제1층과 제2층은 인접하여 적층되는 초대 간세포 3차원 배양시스템을 제공한다.

또한, 본 발명은 나노섬유로 이루어진 지지체를 사이에 두고 초대 간세포와 간 비실질세포를 이격시켜 직접 공배양하지 않고 간접적으로 공배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 배양방법을 제공한다.

본 발명에 따른 초대 간세포 배양시스템은 나노섬유로 이루어진 지지체를 사이에 두고 인간 초대 간세포와 간 비실질세포를 이격시켜 직접 공배양하지 않고 간접적으로 공배양함으로써 생존성이 낮은 초대 간세포를 장기간 본래의 생리활성을 유지하도록 in vitro 상에서 3차원 세포배양을 할 수 있는 장점이 있다. 이러한 초대 간세포 배양시스템은 간조직 유사 환경으로서 고가의 혈청을 사용하지 않고 저가의 비용으로 손쉽게 초대 간세포를 배양할 수 있으며, 간 약물대사효소(시토크롬 P450 효소) 유도 및 억제를 통한 약물-약물 간 상호작용 분석, 간 수송체의 기능적 업데이크 분석, 약물 유도 간 손상 분석, 및 지방간증용 in vitro 간세포 모델 및 이를 이용한 지방간증 치료제 스크리닝 등 다양한 분야에 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 도시한 것이며(왼쪽은 종전 공배양 시스템, 가운데는 간 조직, 오른쪽은 본 발명에 따른 공배양 시스템),

도 2는 본 발명에서 사용한 마우스 초대 간세포의 분리 후 유세포분석기로 간세포의 순도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 이용한 초대 간세포의 7일간의 생존율을 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 이용하여 소혈청을 첨가하거나 첨가하지 않은 배양액에서 초대 간세포의 1일 내지 3일간의 배양 상태 및 생존율을 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 이용하여 소혈청을 첨가하거나 첨가하지 않은 배양액에서 NIH3T3 섬유아세포의 3일간의 배양상태 및 생존율을 나타낸 것이고,

도 6은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 이용하여 소혈청을 첨가하거나 첨가하지 않은 배양액에서 초대 간세포의 5일간의 배양상태 및 생존율을 나타낸 것이고,

도 7은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 이용하여 섬유아세포와 공배양을 하거나 단독으로 배양한 초대 간세포의 5일간의 배양에서 간세포 응집체를 형성하는 정도의 차이를 투명 나노섬유를 통하여 미분간섭(Differential interference contrast, DIC) 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 것이고,

도 8은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 이용하여 섬유아세포와 공배양을 하거나 단독으로 배양한 초대 간세포의 5일 ~ 9일간의 배양에서 실시간으로 동일 부위의 세포응집체의 변화를 나타낸 것이고,

도 9는 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 이용하여 소혈청을 첨가하거나 첨가하지 않은 배양액에서 초대 간세포의 5일간의 배양 후 나노섬유에서 세포상태를 확인할 수 있는 주사전자현미경 이미지를 나타낸 것이고,

도 10은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 이용하여 섬유아세포와 공배양을 하거나 단독으로 배양한 초대 간세포의 5일간의 배양에서 세포내 알부민 발현정도를 공초점현미경 결과로 나타낸 것이고,

도 11은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 이용하여 섬유아세포와 공배양을 하거나 단독으로 배양한 초대 간세포의 5일간의 배양에서 세포내 E-카드헤린(E-cadherin) 발현 정도를 공초점현미경 결과로 나타낸 것이고,

도 12는 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 이용한 비실질세포로서 인간 간성상세포인 LX-2 세포와 3T3 마우스 섬유아세포와의 공배양에서 세포 응집이 일어나지 않을 정도의 밀도로 7일간 배양한 초대 간세포의 생존율을 나타낸 것이고,

도 13은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 간세포 공배양 시스템을 구성하는 간세포 배양용 PVA 나노섬유의 세포부착능을 증강시키기 위하여 후코이단 함유 PVA 나노섬유를 이용하여 섬유아세포와 공배양을 하거나 단독으로 배양한 초대 간세포의 1일 내지 3일간의 배양에서 세포부착 정도를 나타낸 것이고,

도 14는 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 초대 간세포 공배양 시스템을 이용하여 간세포의 약물대사능을 측정하기 위하여 5일간 배양한 초대 간세포에 페나세틴(phenacetin)을 투여하고 24시간 후 배양액에 남아 있는 페나세틴(phenacetin)과 페나세틴(phenacetin)의 대사체인 아세트아미노펜(acetaminophen)의 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 배양 후 생존하고 있는 초대 간세포 수와 대사된 약물의 농도를 기반으로 계산한 페나세틴(phenacetin) 대사 활성도를 비교한 결과를 표 1에 나타낸 것이고,

도 15는 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 초대 간세포 공배양 시스템을 이용하여 장기간 생존하는 초대 간세포에 의한 약물대사능을 측정하기 위하여 일정기간 동안 배양한 초대 간세포에 페나세틴(phenacetin)을 처리하고 24 시간 후 배양액에 남아 있는 페나세틴(phenacetin) 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,

도 16은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 초대 간세포 공배양 시스템을 이용하여 장기간 생존하는 초대 간세포의 기능을 측정하기 위하여 일정기간 배양한 간세포의 배양액에 분비되는 우레아(urea)의 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,

도 17은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 초대 간세포 공배양 시스템을 이용하여 장기간 생존하는 초대 간세포의 단백질 분비기능을 측정하기 위하여 일정기간 배양한 간세포의 배양액에 분비되는 트랜스페린(transferrin)의 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자는 초대 간세포의 낮은 생존능과 in vitro 배양 시 생체 본래의 생리활성 및 세포 접착성이 현저하게 저하하는 문제를 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 간세포 및 비-실질세포(혈관내피세포 및 섬유아세포)를 나노섬유 지지체의 다른 층에 각각 부착시킨 상태에서 잘 제어된 환경의 챔버 내에서 3차원 분리 공동 배양하여 생체 간조직 미세환경을 모사하는 기술로서, 나노섬유 지지체를 사이에 두고 인간 초대 간세포와 간 비실질세포를 이격시켜 직접 공배양하지 않고 간접적으로 분리 공배양함으로써 증식성이 낮은 초대 간세포를 장기간 본래의 생리활성을 유지하도록 in vitro 상에서 3차원 세포배양을 할 수 있다는 점을 밝혀 내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 초대 간세포(primary hepatocyte)를 배양한 제1층; 및 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 간 비실질세포를 배양한 제2층을 포함하며, 상기 제1층과 제2층은 인접하여 적층되는 초대 간세포 3차원 배양시스템을 제공한다.

본 발명에 따른 배양시스템은 나노섬유 지지체를 포함하여 초대 간세포와 간 비실질세포 간의 직접 공배양을 방지하고 간접 분리 공배양을 유도할 수 있기 때문에 초대 간세포와 간 비실질세포 간의 직접 공배양에 의한 문제점, 예를들어 초대 간세포와 간 비실질세포 간 성장속도의 차이로 인해 간세포보다 성장속도가 빠른 섬유아세포가 빨리 자라는 문제가 있어 섬유아세포의 생존을 더디게 하여 공배양 해야 하는 문제점이 있으며, 또한 직접 공배양에 의해 간세포의 원래 기능을 소멸할 수도 있다.

또한, 본 발명은 나노섬유로 이루어진 지지체를 사이에 두고 초대 간세포와 간 비실질세포를 이격시켜 직접 공배양하지 않고 간접적으로 공배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양방법을 제공한다.

본 발명에 따른 배양방법은 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 초대 간세포(primary hepatocyte)를 배양하는 단계; 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 간 비실질세포를 배양하는 단계; 및 상기 초대 간세포가 배양된 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유로 이루어진 지지체와 간 비실질세포가 배양된 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유로 이루어진 지지체를 적층하여 공배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양방법을 제공한다.

본 발명에 따른 배양시스템/배양방법은 초대 간세포와 간 비실질세포 간의 직접 공배양을 방지하고 간접 공배양을 유도할 수 있다.

상기 초대 간세포는 인간, 래트 또는 마우스로부터 유래한 초대 배양 간세포일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 간 비실질세포는 간섬유아세포, 간혈관내피세포, 간성상세포 및 쿠퍼세포(Kupffer cell)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 배양시스템/배양방법은 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유의 투명한 특성으로 인해 실시간으로 초대 간세포를 미분간섭 현미경으로 관찰할 수 있다.

상기 나노섬유는 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유 또는 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유에 초대 간세포의 부착성을 향상시키기 위하여 세포부착인자, 특히 후코이단을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유에 간 비실질세포의 부착성을 향상시키기 위하여 세포부착인자, 특히 후코이단을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 공배양은 간세포와 간 비실질세포의 세포 비율이 1:1 ∼ 1:3 일 수 있다.

상기 초대 간세포의 파종 밀도가 1×10⁴ 내지 3×10⁴ 세포/cm²의 밀도이며, 나노섬유 상에 부착하면서 배양되는 원반형의 스페로이드를 형성할 수 있다.

상기 초대 간세포의 배양에는 통상적으로 간세포 배양에 사용하는 William’s E 배양액에 여러 가지 약물을 추가하여 배양하는 배양액을 대체하여 DMEM 배지에서도 간세포가 장기간 생존할 수 있지만 DMEM 배지에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 초대 간세포 배양시스템을 이용한 간 약물대사효소 유도 및 억제를 통한 약물-약물 간 상호작용 분석방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 초대 간세포 배양시스템을 이용한 간세포에 의한 약물의 기능적 업테이크(uptake) 분석방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 초대 간세포 배양시스템을 이용한 간 기능 분석방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<참조예 1> 3차원 간세포 배양용 PVA 나노섬유 제조

한국특허 제1665918호의 방법에 따라 3차원 간세포 배양용 PVA 나노섬유를 제조하였고, 이러한 PVA 나노섬유는 물에 안정하고 투명하며 세포 부착성이 우수하며 100-200 nm 평균 직경을 나타내었다.

<참조예 2> 3차원 간세포 배양용 PCL 나노섬유 제조

한국특허 제1684698호의 방법에 따라 3차원 간세포 배양용 후코이단-PCL 나노섬유를 제조하였고, 이러한 후코이단-PCL 나노섬유는 세포 부착성, 세포 침윤 및 3차원 세포 성장에 유용한 지지체이며 400-500 nm 평균 직경을 나타내었다.

<실시예 1> NIH3T3 섬유아세포 3차원 배양 플레이트 제조

24웰 플레이트 바닥에 PDMS 용액을 2.5 ml으로 넣은 뒤 80℃로 예열된 슬라이드 워머에서 굳혔다. 그러나 24웰에 한정되지 않고 다양한 크기의 플레이트를 사용할 수 있다. PDMS가 완전히 굳기 전 접착력이 있는 상태에서 실온으로 옮겨 5분간 식혔다. 일정하게 굳은 PDMS 위에 12Ø 크기로 잘려진 PCL 나노섬유 매트를 부착하였다. PCL이 부착된 플레이트는 70% 에탄올을 1 ml 채워서 UV 상자에서 18시간 이상 멸균시켜 주었다. 에탄올을 제거한 뒤 세포배양 배지 1 ml을 채워서 37℃ 이산화탄소 세포 배양기에 넣어서 18시간 이상 적신 후 사용하였다.

< 실시예 2> 간세포 배양 플레이트 제조

준비된 트랜스웰의 멤브레인이 제거된 원형 바닥에 PDMS를 얇게 펴 바르고 80℃로 예열된 슬라이드 워머에서 10분에서 15분 동안 굳혔다. PDMS가 완전히 굳기 전 접착력이 있는 상태에서 실온으로 옮겨 5분간 식혔다. 일정하게 굳은 PDMS 위에 12Ø로 잘려진 PVA 나노섬유 멤브레인을 트랜스웰 바닥에 부착시켰다. PVA가 부착된 트랜스웰에 HCl을 승화시킨 기체를 이용하여 1분 동안 처리를 해 주었다. 반응된 트렌스웰에 디메틸포름아마이드(dimethylformamide) 용액을 10 μl 첨가하여 PVA를 안정화시켜 주었다. 첨가된 디메틸포름아마이드 용액은 팬을 이용하여 공기 중에 휘발시키며 PVA가 원래의 흰색으로 돌아올 때까지 건조시켜 주었다. 건조된 PVA 트랜스웰은 UV 상자에서 18시간 이상 멸균시켜 사용하였다.

< 실시예 3> 마우스 초대 간세포의 조제

초대 간세포의 조제는 계내(in situ) 콜라겐아제 관류법에 따랐다. 상세하게는 이하와 같다. C57블랙/6 마우스(4 내지 6주령)를 에테르를 이용하여 마취하고 핀으로 다리를 고정한 후, 복부를 절개하였다. 간문맥과 복대정맥의 위치를 확인한 후 개복하고, 간문맥에 카테터를 삽입하여 버블을 제거한 50 ml 주사기에 전관유액(Ca²⁺와 Mg² ⁺불포함, 25 mM HEPES, 0.5 mM EGTA, pH 7.4, 1% 프리모신을 포함하는 Hanks balanced salt solution (HBSS))을 분당 2~3 ml으로 주입하였다.

간장이 부풀어 오르는 것을 확인한 후 동시에 간장 하부의 하대 정맥을 절개하여 혈액을 방출시켰다. 50~60 ml의 HBSS액을 분당 8 ml씩 주입하고 간장으로부터의 탈혈이 충분히 이루어진 것을 확인한 후에 관류를 멈추었다. 관류액을 콜라겐아제(collagenase)를 용해한 용액(100 유닛의 콜라겐아제 타입 IV를 포함하는 디엠이엠(DMEM) 로우 글루코즈를 포함하는 배지)으로 바꾸어 관류를 행하였다. 관류를 행하는 중 콜라겐아제의 효과를 높이기 위해 절개된 정맥을 조여주고 풀어주고를 반복하면서 간장이 부풀어 오르는지 확인하였다. 본 실시 예에서는 100 유닛의 콜라겐아제를 포함하는 배지를 이용하여 관류를 행하지만, 방법에 따라 30% 내외의 변경이 가능하며 이것에 한정되지 않는다.

세포 사이 조직이 콜라겐아제에 의해 소화된 것을 핀셋으로 조직 내 세포의 회복 유무를 확인한 후 관류를 멈추었다. 횡격막을 제거하여 간장을 다른 장기로부터 분리하고, 37℃에서 데워진 콜라겐아제 관류액을 이용하여 간장을 세포배양 플레이트로 옮겨 갔다. 간장을 핀셋을 이용하여 세절하고 분리된 세포가 간장 밖으로 흘러나오게 간장을 흔들어주고 피펫팅을 이용하여 세포까지 분산시켰다. 이어서 세포 거름망 여과를 이용해 미소화된 조직을 제거하였다. 세포 현탁액(디엠이엠 로우 글루코즈 배지와 디엠이엠 에프 12 배지를 1:1로 섞어 10% FBS를 포함하는 배지)을 섞어 50×g, 4℃, 2분의 원심 분리를 3~5회 반복하여 비실질세포를 제거하였다.

도 2에서와 같이 분리된 세포는 유세포 분석기를 이용하여 세포의 순도가 90% 이상임을 확인하였고, 해마토사이트를 이용하여 세포 수를 확인하고 간세포의 생존율은 트리판블루 배제법을 이용하여 계측하고 초대 간세포를 배양하였다.

< 실시예 4> 3차원 초대 간세포 공배양 시스템

도 1은 본 발명에 따른 간접 분리 3차원 초대 간세포 공배양 시스템을 도시한 것(왼쪽은 종전 공배양 시스템, 가운데는 간 조직, 오른쪽은 본 발명에 따른 공배양 시스템)으로서, 종전에는 트랜스웰을 이용하여 간세포와 간 비실질세포를 직접 공배양하였지만, 본 발명에서는 참조예 1 및/또는 참조예 2에서 제조된 나노섬유를 이용하여 간세포로 이루어진 간세포층과 간 비실질세포인 섬유아세포로 이루어진 간 비실질세포층을 분리하여 직접 공배양이 아닌 간접 공배양을 통해 간 비실질세포층에서 배양된 섬유아세포의 성장인자들이 나노섬유를 통해 간세포층에 배양된 간세포로 이동하여 간세포의 성장에 필요한 영양분을 충분히 제공하면서 간세포와 섬유아세포가 비슷한 성장속도로 자랄 수 있도록 하였다.

< 실시예 5> 생존 및 사멸세포 세포 염색

배양되어진 초대 간세포의 생존율을 확인하기 위해 Live & Dead 세포 염색을 행한다. 생존율 확인에 상용되어진 키트는 BIOMAX사의 EZ-View^TM Live/Dead cell staining kit를 사용하였다. 도 3, 도 4, 도 5, 및 도 6에서와 같이 생존 및 사멸 세포 염색 키트의 칼세인(Calcein-AM)의 경우 살아 있는 세포에만 선택적으로 통과하여 강한 녹색의 형광으로 세포를 염색하고 프로피디움 요오드화물(PI)은 사멸된 세포 또는 손상된 세포의 붕괴된 세포막을 통해 유입되어 DNA를 붉은 형광으로 염색하였다. 이들 두 종류의 시약을 이용하여 간세포의 생존율을 측정하였다. 염색 키트 내에 칼세인과 프로피디움 요오드화물을 상온에서 녹인 후 세포배양 배지 3 ml에 칼세인 용액 3 μl와 프로피디움 요오드화물 2 μl를 혼합하였다. 간세포의 생존율 염색은 시간대 별로 24, 72, 120, 178 시간별로 준비하였다. 트랜스웰에서 배양된 세포를 새로운 24웰 플레이트로 옮긴 후 배양된 세포의 배지를 조심스럽게 제거하고 혼합된 염색 시약을 400 μl씩 분주하였다. 염색 시약을 함유한 세포를 20분간 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다. 본 실시예에서는 세포 염색 시간을 20분으로 한정하지 않으며 최적의 염색 시간은 세포의 농도 및 종류마다 달라진다. 염색된 세포의 생존 및 사멸 세포 확인은 나노스코프시스템의 K1-Fluo 형광현미경을 이용하여 490 nm와 545 nm의 파장에서 관찰하였다.

도 3에 도시된 바와 같이 3T3 섬유아세포와 공배양을 하여 7일 동안 배양을 한 경우(+Fibroblasts)에는 생존 세포의 수가 유지되면서 세포간 응집체로서 나타났으며 간세포를 단독으로 배양한 경우(-Fibroblasts)에는 나노섬유에 부착하는 세포의 수가 7일 때 현저히 감소하면서 사멸세포의 수의 비율이 증가하는 것으로 나타났다.

< 실시예 6> 배양 기간에 따른 초대 간세포 생존 및 형태 관찰

배양되어진 초대 간세포의 생존율이 7일 배양 후에도 80% 이상을 유지하므로 간세포 파종 후 배양 조건에 따른 간세포의 나노섬유에의 부착, 생존 및 부착형태 등을 미분간섭과 공초점현미경으로 관찰하였다.

도 4에 도시된 바와 같이, 초대 간세포 파종 1일 후에 소혈청이 들어 있는 배양 조건(+FBS)에서는 간세포 단독 배양이나 섬유아세포와의 공배양에서 세포의 사멸은 잘 일어나지 않으며 세포도 두 조건에서 유사한 양상을 보였으나 소혈청이 들어 있지 않은 배양 조건(-FBS)에서는 세포의 수가 적게 부착되는 것으로 나타났다. 배양 3일 후에는 단독 배양한 간세포의 수가 현저히 적어지면서 사멸된 세포의 수가 증가하는 것으로 나타났으나 공배양 시 부착된 세포가 서로 응집하는 양상을 보이고 대부분의 세포는 생존한 것으로 나타났으나 소혈청이 들어 있지 않은 배양 조건에서는 세포들이 응집하는 현상보다 분리된 형태로 부착된 것으로 보였다.

도 5에 도시된 바와 같이, 윗층의 간세포와 함께 아래층 챔버에서 비교적 큰 공극을 가지는 PCL 나노섬유 지지체에서 3일간 배양한 3T3 세포는 소혈청이 들어 있는 경우에는 대부분의 세포가 생존하면서 부착되어 있으며 소혈청이 들어 있지 않은 경우에도 80% 이상의 세포가 생존하는 것으로 나타났다.

< 실시예 7> 공배양 초대 간세포의 응집 현상 관찰

도 6에 도시된 바와 같이, 소혈청이 들어 있으면서 공배양한 간세포는 배양 5일 후에 현저하게 세포응집체로 구성되었으나 단독배양을 한 경우 소규모의 세포응집체로 나타났다. 소혈청이 들어 있지 않는 경우에는 세포응집도는 더욱 떨어지지만 생존세포는 나노섬유에 부착된 것으로 나타났다. 이러한 응집체는 투명 PVA 나노섬유 위에서 미분간섭 현미경 및 형광염색으로 쉽게 관찰할 수 있었다.

도 7에 도시된 바와 같이, 공배양한 간세포와 단독 배양한 간세포의 세포응집체의 다양한 형태를 나타내었다. 공배양을 한 경우 응집체의 크기는 수백 마이크로미터로 컸으며 나노섬유에 부착한 상태이면서 스페로이드와 같은 형상을 나타내었다. 이에 비교하여 단독 배양의 경우 세포 응집은 일어났으나 그 크기는 100 마이크로미터 이하의 다양한 크기로 나타났다.

도 8에 도시된 바와 같이, 간세포 응집의 변화를 미분간섭 현미경으로 관찰하였을 때 스페로이드 형태의 응집체는 배양 기간이 지날수록 부착되는 정도가 증가하다가 일정 부분은 다시 큰 응집체에서 분리되는 현상이 나타났으며 대부분의 응집체가 나노섬유에서 부착되어 있으나 일부의 응집체는 나노섬유에서 떨어져 배양액 내 부유 상태로 존재하는 것으로 나타났다.

도 9에 도시된 바와 같이, 간세포 응집이 일어나지 않은 조건으로 1×10⁴세포/cm²의 간세포를파종하고 2시간 후 부착하지 않은 세포를 포함한 배양액을 제거하고 다시 배지를 넣고 공배양하였을 경우 부착되는 간세포는 초기 파종된 세포 수에 비교하여 1/5 수준 정도이었다. 이러한 조건에서 배양된 간세포는 대부분의 경우 큰 세포응집이 일어나지 않고 수개의 생존하는 세포가 모여 있는 양상으로 나타났으며 LX-2 간성상세포 나 3T3 섬유아세포와 공배양을 한 경우에 부착된 생존 세포수가 현저히 많았다. 따라서 나노섬유 지지체의 일정 면적에서 파종된 세포의 수에 따라서 세포응집도는 다르게 나타나는 것으로 알 수 있었다.

< 실시예 8> 주사전자 현미경 관찰

PVA 나노섬유에서 공배양한 간세포의 형태는 나노섬유를 백금코팅한 후 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM)(JSM-6700F, Japan)을 사용하였다.

도 10의 전자현미경 소견에서, 간세포는 매우 가느다란 섬유에 의하여 응집체를 이루는 것으로 나타났으며 나노섬유 위의 또 다른 얇은 막과 같은 층을 바닥으로 하여 응집체를 구성하는 세포는 단일 층에서부터 여러 층의 세포로 구성되어 마치 스페로이드 모양으로 형성되는 것처럼 보였다. 공배양을 하지 않은 간세포들은 구형의 스페로이드를 형성하였으며 소혈청이 들어 있지 않은 배양 상태의 간세포는 더욱 작은 구형으로 보였다.

< 실시예 9> 알부민, 액틴 , 카드헤린 형광염색 분석

마우스 초대 간세포를 3차원 공배양 모델에서 일정 시간 배양한 후, 상층의 챔버에 부착된 PVA 나노섬유 멤브레인의 세포질 내 알부민, 액틴(F-actin) 및 E-카드헤린(E-cadherin) 염색을 실시하였다. 이를 위하여 24웰 플레이트에서 분리된 나노섬유 멤브레인을 4% 파라포름알데히드 고정액에 넣은 후, 실온에서 20분 동안 고정하였다. 그 다음 인산완충용액으로 2회 세척 후 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)용액으로 상온에서 5분 동안 침투시키고 인산완충용액으로 2회 세척하였다. 비특이적인 염색을 제거하기 위하여, 0.2% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich)용액으로 실온에서 20분 동안 블록킹한 후 인산완충용액으로 2회 세척하였다. 그 후 FITC-결합 항-알부민항체, 액틴-검출용 PE-결합 Phalloidine, 및 FITC-결합 항-E-adherin 항체를 0.2% 소혈청 알부민 용액에 1:40의 비율로 희석하여 40분 동안 반응시킨 다음, 트리스 완충용액으로 3회 세척하여 슬라이드유리에 올려놓고 세포의 핵염색을 위한 DAPI (Vector Lab)용액으로 대조염색하여 덮개유리를 덮어 봉입한 후 공초점 레이저 현미경(K1 나노스코프)을 이용하여 세포를 관찰하였다.

도 11에서 알부민으로 초록색 형광염색을 하고 팔로이딘으로 붉은 형광염색을 하였을 때, 도 11의 위 그림에서 나타낸 바와 같이 5일간 배양 후 생존하고 있는 세포질 내에서 염색되는 알부민의 양은 배양 1일 후의 세포와 큰 차이를 보이지 않는 것으로 보아 이들 세포에서는 알부민 생성이 감소되지 않고 유지되는 것으로 나타났다. 세포 내 액틴의 발현과 분포 정도를 팔로이딘으로 염색한 경우 주로 세포와 세포 사이에서 검출되는 것으로 나타났다. 도 11의 아래 그림은 3차원적으로 세포 덩어리의 형태를 확인하였을 때 세포덩어리는 얇은 두께를 가진 원반형의 모양으로 스페로이드를 형성하는 것으로 나타나며 알부민 등은 세포덩어리 전체적으로 균일하게 보였다.

도 12에서, 간세포와 같은 상피세포에서 주로 발현되는 E-카드헤린 및 N-카드헤린의 발현 양상을 측정하였다. 도 12의 위 그림에서 녹색형광으로 나타난 E-카드헤린은 5일 동안 배양한 간세포의 세포질 내에서 균일하게 나타났으며 세포간의 부착면에는 증가되는 현상은 나타나지 않았다. 도 9에서와 같이 팔로이딘 염색을 하였을 때 이들은 주로 세포간의 공간에 분포하는 것으로 나타났다. 이러한 양상은 형광염색과 미분간섭 영상이 합쳐진 경우에 더욱 뚜렷이 알 수 있었다. 도 12의 아래 그림에서 녹색형광으로 나타나는 E-카드헤린은 5일 동안 배양한 간세포의 세포질 내에서 거의 증가를 보이지 않았다. 이들 결과로부터 배양된 간세포는 지속적으로 E-카드헤린을 발현하고 N-카드헤린의 발현은 일어난 않음으로써 상피-간엽 전이 현상(Epithelial-mesenchymal transition)은 일어나지 않으며 스페로이드와 같은 세포응집은 하이드로 젤에서 형성되는 스페로이드와 유사한 양상을 나타내었다.

< 실시예 10> 세포부착성을 증강시키는 인자인 후코이단의 영향

도 13에서 간세포를 파종시키고 2시간 후에 배양액을 덜어낸 경우(Changed media)와 파종된 상태대로(Unchanged media) 배양하는 경우에 부착된 간세포의 수적 차이에 의하여 배양 1일 내지 3일 후 세포응집체를 형성하는 정도가 다르게 나타남으로써 세포부착을 증강시키면서 배양하는 방법을 고안하였다.

해양 천연물 유래 후코이단은 세포부착능력이 우수한 물질로서 PVA 나노섬유의 제조 시 PVA와 가교제를 포함하는 용액에 후코이단을 함유하여 전기방사를 시행하였다. 이때, 후코이단이 포함된 PVA 나노섬유는 10 mg/ml 농도로 후코이단(Fucus vesiculosis fucoidan, Sigma)을 녹인 PVA/poly acrylic acid/glutaraldehyde 용액으로 전기방사하여 제조된 것을 사용하였다.

도 13에 도시된 바와 같이, 후코이단을 함유하는 후코이단-PVA에서 배양한 간세포는 부착 정도가 증가하였으며 세포응집체를 구성하는 정도도 증가하는 것으로 나타났다.

< 실시예 11> 약물대사 평가

Transwell을 이용하여 PVA를 장착한 insert에 마우스에서 분리한 간세포 3×10⁴개를 깔고 그 아래 3T3 세포를 DMEM 배지로 공배양하는 생체모사 간세포 공배양 시스템 개발에 성공함에 따라 PVA 나노섬유에 간세포를 배양하고 PCL 나노섬유에 3T3 섬유아세포를 일정 기간 배양한 후 페나세틴(phenacetin)을 50 μM 혹은 500 μM으로 처리하고 24시간 후에 남아있는 약물의 농도는 고성능 액체크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하여 측정하고 약물대사의 정도를 기존의 2차원 초대 간세포 배양과 비교하였다.

도 14에 도시된 바와 같이 초대 간세포를 단독배양하거나 아래층에 3T3 세포와 공배양을 한 후 5일 째 CYP1A2의 대표기질로 알려진 페나세틴(phenacetin)을 50 μM의 농도로 처리하고 24시간 후에 배지를 걷어 페나세틴(phenacetin)과 CYP1A2의 대사체인 아세트아미노펜(acetaminophen)의 농도를 분석하였다. 정량할 샘플 50 μL와 아세토니트릴(acetonitrile) 100 μL를 혼합하여 14000 rpm 상에서 10분간 원심분리한 후 얻은 상층액(130 μL)을 질소가스에서 건조하여 다시 용액(10 mM Potassium phosphate : acetonitrile, 65% : 35% (v/v))에 녹인 후 HPLC (Shimazu Prominence LC-20A)로 측정하였다. 유속은 1 mL/min로 진행하였으며 흡광도 245 nm에서 10분간 측정하였다. 배양 1일 후 초대 간세포는 모든 배양 조건에서 페나세틴(phenacetin)을 대사하는 능력이 있어서 배양액에 남아 있는 농도는 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 2차원 배양 조건에서 2일간 배양한 초대 간세포는 생존율이 급격히 떨어짐으로써 대사되는 페나세틴(phenacetin)의 양이 현저히 감소하여 배양액에는 높은 농도의 약물이 남아 있는 것으로 나타났으나 이에 비교하여 3차원 배양 조건에서 초대 간세포는 투여한 약물의 75%~85% 정도가 감소하는 것으로 나타났다. 또한 섬유아세포(3T3)와 공배양한 초대 간세포 배양에서 페나세틴(phenacetin)을 처리한 경우 배양액에 남아 있는 페나세틴(phenacetin)의 농도는 단독배양한 간세포의 경우와 비교하여 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 3차원 배양조건에서 장기간 배양한 초대 간세포에 의하여 약물의 대사가 충분히 일어난다는 것을 제시하고 있다. 또한 CYP1A2의 대사체인 아세트아미노펜(acetaminophen)의 농도를 분석하였을 때 대사체인 아세트아미노펜(acetaminophen)은 다음 대사체인 글루쿠로나이드(glucuronide) 포합체 또는 설페이트(sulfate) 포합체로 바로 진행되므로 남아있는 아세트아미노펜(acetaminophen)의 양은 극히 적었으며 두 군 간에 유의성이 있는 차이는 없었다.

표 1에 나타낸 바와 같이 초대 간세포와 섬유아세포는 간접 공배양을 하였기 때문에 위층에 남아 있는 세포 수에 대한 대사된 페나세틴(phenacetin)의 농도를 측정하여 약물의 대사활성도(metabolic activity)를 직접 비교분석할 수 있는 장점이 있다. 이와 같은 간접 공배양 시스템과 비교하여 간세포와 섬유아세포 등을 포함한 여러 종류의 기질세포를 직접 공배양한 경우는 두 종류 이상의 세포가 혼재하여 있고 섬유아세포의 증식 등에 의하여 배양된 초대 간세포에 의한 약물대사의 활성도를 측정하기는 매우 어렵다. 따라서 생체 내의 약물대사 활성도 측정도를 구현하기 위하여는 비간접적 공배양 시스템을 통한 in vitro 시스템이 가장 적합하다고 판단된다.

도 15에 도시된 바와 같이 장기간 배양한 초대 간세포를 페나세틴(phenacetin) (500 μM)으로 처리한 후 24시간 뒤에 대사되는 정도를 비교하였다. 2차원 배양에서 초대 간세포는 세포배양 1일에 후에 약물을 처리하였을 때 배양액에서 검출된 농도는 350 μM 정도로서 약물대사 능력을 어느 정도 가졌으나 배양 3일 후에는 대부분의 초대 간세포가 세포사멸하여 배양액에 약물이 그대로 남아 있는 것으로 나타났다. 3차원 배양에서는 배양 15일 후에도 세포 생존율은 80%로 초대 간세포의 생존율이 높게 유지되었으며 배양액에서 검출된 페나세틴(phenacetin)의 농도는 350 μM ~ 400 μM 정도로서 약물대사가 일어난다는 것을 보였으며 특히, 섬유아세포(3T3)를 공배양하였을 때는 배양 15일 후에는 200 μM 정도의 페나세틴(phenacetin)이 측정되어 약물대사 효율이 더욱 높은 것으로 나타났다. 따라서 도 15의 가장 아래 그림에서와 같이 배양된 초대 간세포에 처리한 약물이 대사되고 배양액에 남은 약물의 농도로 약물대사 정도를 비교하였을 때 2차원 배양에서는 약물의 대사가 배양 후 1-2일 동안에만 이루어지나 3D 배양에서는 2차원 배양과 비교하여 지속적으로 약물대사 능력을 가진다는 것을 알 수 있다.

	Unit	-3T3 cells	+3T3 cells
Concentration of phenacetin	μM	40.0±2.5	29.3±4.8
Media volume	μL	500	500
Cell numbers of hepatocytes	Cells	18,300±2,500

< 실시예 12> 우레아 (Urea) 및 트랜스페린 ( transferrin ) 분비 측정

도 16에 도시된 바와 같이 초대 간세포의 기능을 측정하기 위하여 배양한 간세포(1×10⁴)에서 분비되는 우레아(urea)의 양을 QuantiChrom^TM Urea Assay Kit (BioAssay Systems사, 미국)를 사용하여 측정하였다. 20일 동안 배양한 간세포에서 배양액으로 분비되는 우레아(urea)의 양은 지속적으로 증가하였으며 섬유아세포(3T3) (1×10⁴)와 공배양하였을 경우 우레아(urea)의 분비는 간세포의 단독 배양 때보다는 증가하는 것으로 나타남으로써 간세포 기능이 유지되는 것을 알 수 있다.

도 17에 도시된 바와 같이 배양한 초대 간세포(1×10⁴)에서 분비되는 트랜스페린(Transferrin)의 양을 ELISA kit(Abcam사, 미국)을 사용하여 측정하였다. 배양 후 10일 정도까지는 트랜스페린(transferrin)의 분비가 지속적으로 증가하였으나 그 이후에는 더 이상의 분비의 증가는 측정되지 않았으며 이러한 경향은 단독배양이나 공배양에서 동일하게 나타났으며 섬유아세포(3T3) 세포를 공배양하였을 때 트랜스페린(transferrin)의 분비는 단독배양에 비교하여 유의하게 증가되는 것으로 나타났다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 초대 간세포(primary hepatocyte)를 배양한 제1층; 및

폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 간 비실질세포를 배양한 제2층을 포함하며,

상기 제1층과 제2층은 인접하여 적층되는 초대 간세포 3차원 배양시스템.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 초대 간세포의 부착성을 향상시키기 위하여 세포부착인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양시스템.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 간 비실질세포의 부착성을 향상시키기 위하여 세포부착인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양시스템.
청구항 3에 있어서, 상기 세포부착인자는 후코이단인 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양시스템.
청구항 1에 있어서, 상기 초대 간세포의 파종 밀도는 1×10⁴ 내지 3×10⁴ 세포/cm²의 밀도이며, 나노섬유 상에 부착하면서 배양되는 원반형의 스페로이드를 형성하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양시스템.
청구항 1에 있어서, 상기 배양시스템은 초대 간세포와 간 비실질세포 간의 직접 공배양을 방지하고 간접 공배양을 유도하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양시스템.
청구항 1에 있어서, 상기 간 비실질세포는 간섬유아세포, 간혈관내피세포, 간성상세포 및 쿠퍼세포(Kupffer cell)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양시스템.
청구항 2에 있어서, 상기 배양시스템은 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유의 투명한 특성으로 인해 실시간으로 초대 간세포를 관찰하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양시스템.
나노섬유로 이루어진 지지체를 사이에 두고 초대 간세포와 간 비실질세포를 이격시켜 직접 공배양하지 않고 간접적으로 공배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양방법.
청구항 9에 있어서, 상기 나노섬유는 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유 또는 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유에서 선택된 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양방법.
청구항 10에 있어서, 상기 배양방법은

폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 초대 간세포(primary hepatocyte)를 배양하는 단계;

폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유로 이루어진 지지체 상에 간 비실질세포를 배양하는 단계; 및

상기 초대 간세포가 배양된 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유로 이루어진 지지체와 간 비실질세포가 배양된 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유로 이루어진 지지체를 적층하여 공배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양방법.
청구항 11에 있어서, 상기 폴리비닐알콜(PVA) 나노섬유에 초대 간세포의 부착성을 향상시키기 위하여 세포부착인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양방법.
청구항 11에 있어서, 상기 폴리카프로락톤(PCL) 나노섬유에 간 비실질세포의 부착성을 향상시키기 위하여 세포부착인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양방법.
청구항 13에 있어서, 상기 세포부착인자는 후코이단인 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양방법.
청구항 11에 있어서, 상기 공배양은 간세포와 간 비실질세포의 세포 비율이 1:1 ~ 1:3 인 것을 특징으로 하는 초대 간세포 3차원 배양방법.
청구항 11에 있어서, 상기 초대 간세포의 파종 밀도는 1×10⁴ 내지 3×10⁴ 세포/cm²의 밀도이며, 나노섬유 상에 부착하면서 배양되는 원반형의 스페로이드를 형성하는 것을 특징으로 하는 초대 간세포의 3차원 배양 방법.
청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 초대 간세포 배양시스템을 이용한 간 약물대사효소 유도 및 억제를 통한 약물-약물 간 상호작용 분석방법.
청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 초대 간세포 배양시스템을 이용한 간세포에 의한 약물의 기능적 업테이크(uptake) 분석방법.
청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 초대 간세포 배양시스템을 이용한 간 기능 분석방법.