JP2017532008A - 三次元複合細胞凝集体モデル並びにその製造方法及び応用 - Google Patents
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Abstract
Description
第一、天然又は化学合成高分子を使用して成長因子を徐々に放出するサブミクロンマイクロスフェアを製造する;
第二、真核細胞のタンパク質表現システムによって純化されるhE−cad−Fc融合タンパク質を希釈し、マイクロスフェアを浸し、4℃から37℃まで、0.5−24時間をインキュベートする;
第三、上澄み液を廃棄し、PBSで1−3回を溶出し、安定に固定されていない融合タンパク質hE−cad−Fcを除去し、hE−cad−Fc基質化のマイクロスフェアを得る;
第四、幹細胞と上記hE−cad−Fc基質化のマイクロスフェアを均一に混合し、懸滴法、遠心法等の方法によって幹細胞を誘導して三次元凝集体を形成させ、又は細胞をヒドロゲル、多孔ブラケット等の三次元培養環境に包み、それを自発に細胞凝集体を形成させる。
以下の具体的な実施例を結合して、本発明の前記技術的解決手段を更に説明する。
遺伝子組換え技術を利用して、ヒト上皮細胞カドヘリン(hE−cadherin)細胞外ドメイン(hE−cad)及びヒト免疫グロブリン(IgG1)のFc断片(Fc)を融合することにより、目的遺伝子hE−cad及びFcを含むプラスミドpcDNA3.1−hE−cad−Fcを得た。即ち:ヒトE−cadherin mRNA(Gene bank:NM004360.3)全長を鋳型とし、合成プライマーを利用してhE−cadherinの細胞外ドメイン断片を特異性に増幅した。プライマーの配列は以下のとおりである:
5’-CGCAAGCTTATGGGCCCTTG-GAGCCGCAGC-3’;
5’-TTGCGGCCGCAGGCAGGAATTTGCAATCCTGC-3’
実施例1で構築された目的遺伝子を含むプラスミドpcDNA3.1−hE−cad−Fcを293F細胞に導入し、72時間懸濁培養し、細胞培養の上澄み液を収集し、rProteinAFFカラムを利用してhE−cad−Fc融合タンパク質を純化した。純化された融合タンパク質を抗E−カドヘリン抗体を利用して免疫ブロット法で検出した。図3に示すように、図中には他の非特異性露出ストリップが現れず、分子量のサイズが約120KDであるストリップは還元状態E−カドヘリンであり(図3における1)、240KDであるストリップは非還元E−カドヘリン(図3における2)である。この結果は、本発明によりhE−cad−Fc融合タンパク質が製造され、その塩基配列は配列番号1の配列表<400>1に示す配列であり、該融合タンパク質の非還元状態が安定な二量体構造を形成することができることを説明している。
まず、化学合成ポリマーPLGAによって粒径範囲が15±5μmにあるマイクロスフェアを製造してEPパイプに置いた;次に上記hE−cad−Fc融合タンパク質溶液を10μg/mlまで希釈し、マイクロスフェアを浸し、37℃で2時間インキュベートした;遠心分離して上澄み液を廃棄し、PBSで3回溶出して、固定されない融合タンパク質hE−cad−Fcを除去し、hE−cad−Fcにより基質化表面改質されたPLGAマイクロスフェアを得て、且つそれをhE−cad−Fc−PLGAと名付けた。
本発明において、CCK−8法を用いてPLGAマイクロスフェア、hE−cad−Fc−PLGAの臍帯間葉系幹細胞の増殖に対する影響を検出した。まず、hE−cad−Fc−PLGA及びタンパク質が固定されていないPLGAマイクロスフェア(対照グループ)を間葉系幹細胞と1:1の数量比例で均一に混合し、各孔5000個の間葉系細胞、各孔5000個の間葉系細胞+5000個のPLGAマイクロスフェア、及び各孔5000個の間葉系細胞+5000h個のhE−cad−Fc−PLGAマイクロスフェアを取って96マイクロプレートに加え、37℃で5%のCO2インキュベータで5日間培養し、毎日細胞の活性を測定した。具体的な方法は以下のとおりである:各孔に10μlのCCK−8を加え、4時間インキュベートした後、酵素結合免疫測定装置でOD450nmを検出し、結果を記録し、時間を横軸とし、吸光度を縦軸として製図した。図6参照。
図8に示すように、ヒト上皮細胞接着因子hE−cad−Fc融合タンパク質をPLGAマイクロスフェア(hE−cad−Fc−PLGA)の表面に基質化固定し、間葉系幹細胞及び融合タンパク質マイクロスフェアを混合して形成される細胞凝集体を製造することにより、複合細胞三次元培養モデルを製造した。該モデルの具体的な構築方法は以下の通りである:
第一、化学合成高分子PLGAで製造されるマイクロスフェアは、粒径範囲が15±5μmにあった;
第二、真核細胞タンパク質表現システムを経て純化されたhE−cad−Fc融合タンパク質を10μg/mlに希釈し、マイクロスフェアを浸し、37℃で2時間インキュベートした;
第三、上澄み液を廃棄し、PBSで3回を溶出し、安定に固定されていない融合タンパク質hE−cad−Fcを除去した;
第四、細胞とhE−cad−Fc基質化マイクロスフェアを1:1の数量比例で均一に混合し、6*105cells/wellをStem Cell AggrewellTMで培養し、1000rpmで5分間遠心分離した後、16時間静置培養し、マイクロスフェア/細胞を誘導して複合三次元凝集体を形成した。
本発明を利用して、間葉系幹細胞とhE−cad−Fc−PLGA三次元複合細胞凝集体モデルを構築した。対照グループはMSC細胞凝集体及びMSC細胞とPLGAマイクロフェアとの複合凝集体である(製造方法は実施例5と同様である)。以上の細胞凝集体を超低粘着細胞培養プレートに移転し、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目にCCK−8法で細胞の活性を測定した。検出方法は実施例4と同様である。培養1日目及び5日目に細胞凝集体について生存細胞染色(FDA/PI)を行い、これにより凝集体内部細胞の生存状況を表示した。具体的な工程は以下のとおりである:培地にそれぞれFDA(PBSで1:1000希釈する)とPI(PBSで1:100希釈する)を加え、10分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。
本発明は、ウェスタンブロッティング法により、細胞内におけるシグナル伝達経路の変化を検出した。細胞内のE−カドヘリン、β−カテニン、p120−カテニン、α−カテニン膜タンパク質高分子、及びAKT−t308とERKを選択してリン酸化表現し、初期にhE−cad−Fc融合タンパク質により表面改質されるマイクロスフェアの細胞膜経路に対する影響を掲示した。
融合タンパク質分子hE−cad−Fcの塩基配列は、配列表<400>1の前記配列である:
ATGGGCCCTTGGAGCCGCAGCCTCTCGGCGCTGCTGCTGCTGCTGCAGGTCTCCTCTTGGCTCTGCCAGGAGCCGGAGCCCTGCCACCCTGGCTTTGACGCCGAGAGCTACACGTTCACGGTGCCCCGGCGCCACCTGGAGAGAGGCCGCGTCCTGGGCAGAGTGAATTTTGAAGATTGCACCGGTCGACAAAGGACAGCCTATTTTTCCCTCGACACCCGATTCAAAGTGGGCACAGATGGTGTGATTACAGTCAAAAGGCCTCTACGGTTTCATAACCCACAGATCCATTTCTTGGTCTACGCCTGGGACTCCACCTACAGAAAGTTTTCCACCAAAGTCACGCTGAATACAGTGGGGCACCACCACCGCCCCCCGCCCCATCAGGCCTCCGTTTCTGGAATCCAAGCAGAATTGCTCACATTTCCCAACTCCTCTCCTGGCCTCAGAAGACAGAAGAGAGACTGGGTTATTCCTCCCATCAGCTGCCCAGAAAATGAAAAAGGCCCATTTCCTAAAAACCTGGTTCAGATCAAATCCAACAAAGACAAAGAAGGCAAGGTTTTCTACAGCATCACTGGCCAAGGAGCTGACACACCCCCTGTTGGTGTCTTTATTATTGAAAGAGAAACAGGATGGCTGAAGGTGACAGAGCCTCTGGATAGAGAACGCATTGCCACATACACTCTCTTCTCTCACGCTGTGTCATCCAACGGGAATGCAGTTGAGGATCCAATGGAGATTTTGATCACGGTAACCGATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGGTCTTTAAGGGGTCTGTCATGGAAGGTGCTCTTCCAGGAACCTCTGTGATGGAGGTCACAGCCACAGACGCGGACGATGATGTGAACACCTACAATGCCGCCATCGCTTACACCATCCTCAGCCAAGATCCTGAGCTCCCTGACAAAAATATGTTCACCATTAACAGGAACACAGGAGTCATCAGTGTGGTCACCACTGGGCTGGACCGAGAGAGTTTCCCTACGTATACCCTGGTGGTTCAAGCTGCTGACCTTCAAGGTGAGGGGTTAAGCACAACAGCAACAGCTGTGATCACAGTCACTGACACCAACGATAATCCTCCGATCTTCAATCCCACCACGTACAAGGGTCAGGTGCCTGAGAACGAGGCTAACGTCGTAATCACCACACTGAAAGTGACTGATGCTGATGCCCCCAATACCCCAGCGTGGGAGGCTGTATACACCATATTGAATGATGATGGTGGACAATTTGTCGTCACCACAAATCCAGTGAACAACGATGGCATTTTGAAAACAGCAAAGGGCTTGGATTTTGAGGCCAAGCAGCAGTACATTCTACACGTAGCAGTGACGAATGTGGTACCTTTTGAGGTCTCTCTCACCACCTCCACAGCCACCGTCACCGTGGATGTGCTGGATGTGAATGAAGCCCCCATCTTTGTGCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAGTGTCCGCTGGATGTGAATGAAGCCCCCATCTTTGTGCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAGTGTCCGAGGACTTTGGCGTGGGCCAGGAAATCACATCCTACACTGCCCAGGAGCCAGACACATTTATGGAACAGAAAATAACATATCGGATTTGGAGAGACACTGCCAACTGGCTGGAGATTAATCCGGACACTGGTGCCATTTCCACTCGGGCTGAGCTGGACAGGGAGGATTTTGAGCACGTGAAGAACAGCACGTACACAGCCCTAATCATAGCTACAGACAATGGTTCTCCAGTTGCTACTGGAACAGGGACACTTCTGCTGATCCTGTCTGATGTGAATGACAACGCCCCCATACCAGAACCTCGAACTATATTCTTCTGTGAGAGGAATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACATCATTGATGCAGACCTTCCTCCCAATACATCTCCCTTCACAGCAGAACTAACACACGGGGCGAGTGCCAACTGGACCATTCAGTACAACGACCCAACCCAAGAATCTATCATTTTGAAGCCAAAGATGGCCTTAGAGGTGGGTGACTACAAAATCAATCTCAAGCTCATGGATAACCAGAATAAAGACCAAGTGACCACCTTAGAGGTCAGCGTGTGTGACTGTGAAGGGGCCGCCGGCGTCTGTAGGAAGGCACAGCCTGTCGAAGCAGGATTGCAAATTCCTGCCTGCGGCCGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTAC
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Claims (10)
- 内部にマイクロスフェアが含まれる幹細胞の凝集体であって、前記マイクロスフェアの表面には、遺伝子工学によって合成されるカドヘリンタンパク質ファミリーの融合タンパク質分子が固定化されており、前記幹細胞のカドヘリン接着分子を通じて、前記融合タンパク質分子と前記幹細胞との組み立てが進行し、前記マイクロスフェアを前記幹細胞と共培養することにより得られる、三次元複合細胞凝集体モデル。
- 前記ポリマーは、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、キトサン若しくはヒアルロン酸を含む天然ポリマー、又はポリ乳酸、ポログリコール酸、ポリ乳酸−グリコール酸、ポリエチレングリコール若しくはポリスチレンを含む化学合成ポリマーであり、且つ前記ポリマーの粒径の範囲が0.5〜40μmである、請求項1記載の三次元複合細胞凝集体モデル。
- 前記幹細胞は、胚性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項1記載の三次元複合細胞凝集体モデル。
- 前記融合タンパク質分子は、遺伝子工学技術を利用してE−カドヘリンタンパク質の細胞外ドメインを免疫グロブリンのFcドメインの遺伝子を組換え、E−カドヘリンタンパク質及びFcの二重機能を含む融合タンパク質遺伝子配列を構築し、遺伝子導入、発現及び分離純化を経て製造され、
前記融合タンパク質分子は、Fc媒介によってマイクロスフェアの表面に固定される、請求項1記載の前記三次元複合細胞凝集体モデル。 - 前記融合タンパク質分子hE−cad−Fcの塩基配列が配列番号1の配列である、請求項1の前記三次元複合細胞凝集体モデル。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法であって、
(1)天然又は化学合成高分子を用いて、増殖因子を徐々に放出するサブミクロンマイクロスフェアを製造し;
(2)真核細胞のタンパク質表現システムによって表現且つ純化されるhE−cad−Fc融合タンパク質を希釈し、マイクロスフェアを浸し、4℃から37℃までにおいて、0.5−24時間インキュベートし;
(3)上澄み液を廃棄し、PBSで1〜3回溶出することにより、安定的に固定されていない融合タンパク質hE−cad−Fcを除去し、hE−cad−Fc基質化のマイクロスフェアを得て;
(4)幹細胞と前記hE−cad−Fc基質化のマイクロスフェアとを均一に混合し、懸滴法、遠心法等の方法によって幹細胞を誘導して三次元凝集体を形成し、又は細胞をヒドロゲル、多孔ブラケット等の三次元培養環境に包み、それを自発に細胞凝集体を形成させる、方法。 - 前記hE−cad−Fc融合タンパク質の使用濃度は0.1−20μg/mlである、請求項6記載の三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法。
- 前記細胞と前記hE−cad−Fc基質化マイクロスフェアとの混合比例は1:1〜10:1である、請求項6記載の三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法。
- 前記細胞凝集体の製造方法は、48時間〜72時間懸滴培養し、又は遠心分離した後12〜24時間培養する、請求項6記載の三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法。
- 材料の幹細胞接着、増殖及び大量増幅並びに幹細胞の分化に対する経時、指向性の調節と誘導、並びに分化した細胞機能の表現と維持を向上させることに使用できる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の三次元複合細胞凝集体モデルの使用。
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