CN111705036A - 一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法 - Google Patents

一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法。本发明所述方法以Collagel凝胶支架作为三维基质，通过将纤维环源干细胞与Collagel凝胶混合为细胞悬液进行培养，可以更好的模拟细胞生长所需的类组织样物理和空间三维结构，能更好的模拟体内生理环境的不同生物力学作用下细胞生长的微环境，促进纤维环源干细胞生长、增殖、粘附、分化等生物学功能，更适用于椎间盘组织修复和纤维环组织再生等医学组织工程领域以及生物力学领域的研究。

Description

一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的 方法
技术领域
本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法。
背景技术
椎间盘退变是一种常见疾病，尤其是随着人口老龄化和人们工作生活方式的改变，椎间盘突出、椎管狭窄等脊柱退行性疾病的发生率不断升高，部分症状严重患者甚至需要接受手术治疗。目前，髓核摘除和椎间融合是脊柱退行性疾病的主要手术疗法，但术中却不可避免地会造成纤维环的缺损。
纤维环是指位于椎间盘的周缘部、由纤维软骨组成的纤维组织，纤维环的纤维在椎体间斜行，并在横切面上排列成同心环状，相邻环的纤维具有相反的斜度，而相互交叉。纤维环的前方有坚强的前纵韧带，前纵韧带的深层纤维并不与纤维环的浅层纤维融合在一起，却十分加强纤维环的力量；而纤维环的后方有后纵韧带，并与之融合在一起，后纵韧带虽较前纵韧带为弱，亦加强纤维环后部的坚固性。简言之，纤维环在吸收震荡和保持髓核组织形态上发挥了重要作用。纤维环的损坏会导致椎间盘不再处于密闭环境，而椎间盘压力降低等一系列微环境改变均不利于椎间盘的修复和再生，术后长时间很可能会出现邻近节段退变、继发性脊柱不稳等一系列问题。因此，纤维环的完整性对限制髓核的突出及维持椎间盘的功能尤为重要。纤维环源干细胞具有向纤维环不同原始细胞分化的能力，利用组织工程技术重建纤维环结构可能成为比较理想的治疗方式。
研究表示，在体外建立模拟体内的三维生长环境，对于体外培养的纤维环源干细胞具有更好的促进生长及分化作用，尤其是体外建立适合细胞生长的生理微环境对纤维环源干细胞行为及生理功能具有重要影响。传统的经单层平面培养的细胞，由于无基质支持，纤维环源干细胞仅能贴壁生长，导致细胞的形态特征、基因表达、生长分化能力等均与天然的生理环境有所差异，无论是在细胞形态、结果和功能等多方面都与体内自然生理环境生长的细胞想去甚远，不利于纤维环源干细胞在椎间盘组织修复和纤维环组织再生中的应用，以及医学组织工程学的研究。
三维细胞培养技术(three-dimensionalcell culture，TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养技术可提供类似体内生长环境的三维支架或基质，模拟细胞生长的体内生理环境，形成三维生长架构，促进细胞建立起细胞间及细胞与细胞外基质的联系，促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动。
目前，纤维环源干细胞的三维培养法主要包括海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝胶及Matrigel凝胶法。其中，海藻酸钙凝胶法虽然操作时条件温和，对活细胞损伤小，但固定后却存在机械强度不高的缺陷；琼脂糖凝胶虽具有较大的空隙，允许大分子物质自由扩散，却更适合培养悬浮细胞；Matrigel凝胶法，是通过将生长状态良好的纤维环源干细胞经胰蛋白酶消化后，与Matrigel基质胶混悬后快速接种于培养板内，待形成凝胶后加入低糖DMEM完全培养基进行常规培养，整个过程存在步骤复杂、成本较高的缺陷，并且无法在生理环境的不同生物力学状态下保持长时间的高度凝胶状态，导致三维基质结构容易破坏，培养的纤维环源干细胞粘附能力较差，从而失去三维结构的支撑，细胞与细胞或细胞外基质的相互作用减弱，影响到细胞的生长和分化功能，不利于模拟体内生理性生物力学环境下，纤维环源干细胞生长的研究。
此外，多个研究中使用的三维基质多为合成聚合物或共聚物，但这些材料主要是由直径大约10-50μm的微纤维组成，纤维尺寸与大多数的细胞尺寸十分相近，在这种支撑材料中生长的细胞事实上仍处于二维环境中，不利于细胞的预期生长。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，以解决现有技术中传统三维细胞培养技术效果不理想的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制Collagel凝胶培养基质，备用；
所述Collagel凝胶培养基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM；
试剂B：FBS(胎牛血清)；
试剂C：1M Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM的混合液；
Collagel凝胶：2-10mg/ml COL1(Ⅰ型胶原蛋白)与0.01M HCl的混合液；
(2)取分离的纤维环源干细胞，制成单细胞悬液，并计数；
(3)将所述细胞与所述Collagel凝胶培养基质混合均匀，得到细胞-Colagel悬液；
(4)取细胞培养板，并以表面包被材料对所述细胞培养板表面进行包被，并培养过夜，备用；
(5)取步骤(3)得到的细胞-Colagel悬液加入至包被后的细胞培养板中，置于CO2培养箱中进行细胞培养，即得。
具体的，所述步骤(1)中，所述Collagel凝胶培养基质的配置步骤具体包括：
(a)取所述试剂A、试剂B和试剂C进行混合，备用；
(b)另取试剂D和Collagel，并调节混合液pH7.0-7.2，备用；
(c)分别将上述步骤(a)和(b)制备的混合液混匀，即得。
具体的，所述试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和Collagel的体积比为(6-10)：(2-8)：(0.5-2)：(1-3)：(30-40)，并优选为8：4：1：2：35。
具体的，所述步骤(3)中，还包括调节细胞浓度，使平均Collagel培养基基质中细胞浓度为2.0×105细胞/mL的步骤。
具体的，所述步骤(3)中，还包括将所述细胞-Colagel悬液进行固液分离并收集细胞以所述Collagel培养基质进行重悬的步骤。
具体的，所述步骤(4)中，所述表面包被材料包括弹性蛋白、层粘连蛋白以及ProNectin(RGD)。
具体的，所述表面包被材料包括2-10μg/mL弹性蛋白、5-30μg/mL层粘连蛋白以及5-30μg/mL ProNectin(RGD)，二者的具体加入量，根据培养板的大小不同，所加的包被材料体积略有差异，根据体积和各个蛋白的终浓度计算需要加的量，一般24孔板200ul/孔，6孔板加500ul/孔。
具体的，所述步骤(5)中，所述细胞培养步骤为置于35-40℃、3-8％CO2恒温培养。
具体的，所述步骤(5)中，还包括在培养的第3、5和7天，更换所述细胞培养板内培养基的步骤，以及观察培养细胞形态的步骤。
本发明还公开了由所述基于Collagel凝胶支架法三维培养的纤维环源干细胞。
本发明所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，以Collagel凝胶支架作为三维基质，通过将纤维环源干细胞与Collagel凝胶混合为细胞悬液进行培养，Collagel凝胶在液态时包裹细胞，固态时可以形成交联网络，形成模拟体内生长环境、具有三维结构的基质，可以更好地模拟细胞生长所需的类组织样物理和空间三维结构，能更好的模拟体内生理环境的不同生物力学作用下细胞生长的微环境；并且，由于Collagel凝胶的主要成分是胶原蛋白，胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白(约占总蛋白25％)，是细胞外基质中最常见的蛋白质，胶原蛋白纤维上还有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)等氨基酸序列，不仅可以促进培养的细胞在生长过程中均衡获取营养物质，还可以为细胞表层整合蛋白所识别和贴附，增强纤维环源干细胞与三维凝胶支架的粘附能力，形成进行气体交换和废物排出的理想生理场所，充分保障三维状态下的纤维环源干细胞组织水分、营养交换、细胞粘附和分化能力；尤其在生理环境的不同应力状态下以及模拟体内不同生物力学作用下，三维凝胶支架可保持稳固的三维结构，细胞不易于脱落，仍可维持细胞的三维生长状态，易于细胞形成合理的生理形态和结构，展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势，促进细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用，促进纤维环源干细胞生长、增殖、粘附、分化等生物学功能，更好的发挥生理功能，更适用于椎间盘组织修复和纤维环组织再生等医学组织工程领域以及生物力学领域的研究。
本发明所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，Collagel凝胶支架本身免疫排斥反应小，而且其交联过程不需其他化学试剂的引入，即可自我交联形成凝胶三维支架，且可维持稳定的pH值范围，制备工艺相对简单，有助于简化传统培养方法及降低成本；而且，Collagel凝胶支架可塑性高，并具有一定的机械强度，生物相容性也更为突出，不仅可以促进纤维环源干细胞的生长、增殖等生物学功能，还可促进其更好的粘附于三维凝胶支架、向特定的纤维环组织定向分化，更好的模拟体内不同生理性生物力学作用下细胞生长的微环境，污染率低、临床应用方便，可广泛应用于医药组织工程等领域。
本发明所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，以含有2-10μg/mL弹性蛋白、5-30μg/mL层粘连蛋白、5-30μg/mL ProNectin(RGD)的表面包被材料对细胞培养板表面进行包被处理；其中，弹性蛋白、层粘连蛋白是细胞外基质的主要成分，可提供细胞生长的基底膜基质，更好的模拟细胞生长的微环境，促进细胞与外界的相互作用；ProNectin(RGD)含有RGD氨基酸序列，可与细胞外整合蛋白相互作用，增强纤维环源干细胞的粘附能力。本发明所述方法将Collagel凝胶与培养板表面包被技术相联合，可以形成生物活性的三维基质和支架结构，可更好的模拟细胞生长的体内生理环境，促进细胞的生长、增殖、粘附、分化等功能。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为实施例1中培养细胞的显微镜照片图；
图2为实施例1中细胞形成的交联网状结构；
图3为实施例2中培养细胞的显微镜照片图；
图4为对比例1中培养细胞的显微镜照片图；
图5为对比例2中培养细胞的显微镜照片图；
图6为对比例3中培养细胞的显微镜照片图。
具体实施方式
实施例1
本实施例所述Collagel培养基基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM，288μl；
试剂B：FBS，144μl；
试剂C：Hepes(1M)，36μl；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM混合液，72μl；
Collagel：3mg/mlCOL1与0.01M HCl混合液，1260μl。
取288μl试剂A(5×MEM)、144μl试剂B(FBS)和36μl试剂C(Hepes，1M)置于试管1中进行充分混匀，备用；另取1260μlCollagel(3mg/ml COL1与0.01M HCl混合液)和72μl试剂D(0.1M NaOH与5×MEM混合液)置于试管2中进行充分混合，调节混合液的pH为7.0，备用；将试管1和试管2中混合液混匀，得到所需Collagel培养基质，备用。需要注意的是，上述所有试剂的保存和操作需要保持在4℃或冰上进行。
选取生长状态良好的纤维环源干细胞，待细胞达到90％融合时，加入0.25wt％胰蛋白酶(以细胞量计)进行消化、离心，收集细胞并计数；将细胞加入至所述Collagel培养基质中，调节细胞浓度，使平均Collagel培养基质中细胞浓度约2.0×105细胞/mL；离心并收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1.8ml Collagel培养基质中，经上下吹打混合均匀。
取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板(细胞培养板预先用含有5μg/mL弹性蛋白、10μg/mL层粘连蛋白、10μg/mL ProNectin(RGD)包被培养板表面，并于37℃过夜，备用)中，于37℃、5％CO2培养箱内培养，并在培养的第3、5和7天，更换孔内的100μL培养基并采用倒置显微镜观察细胞的形态。
本实施例培养所得细胞的显微镜照片图见附图1所示，在显微镜下可看到细胞均匀分布在凝胶中，呈立体生长状态，不同凝胶层面的细胞粘附凝胶基质状态良好，相比于二维贴壁生长的细胞，可看到明显的细胞伪足突出并相互交联，细胞胞浆饱满，折光性好。
继续培养上述细胞，待细胞生长较多后观察其形态，显微镜照片照片见附图2，可见，细胞生长较多后，细胞伪足突出和延伸增多，逐渐形成交联的细胞网状结构。
实施例2
本实施例所述Collagel培养基基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM，288μl；
试剂B：FBS，144μl；
试剂C：Hepes(1M)，36μl；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM混合液，72μl；
Collagel：3mg/mlCOL1与0.01M HCl混合液，1260μl。
取288μl试剂A(5×MEM)、144μl试剂B(FBS)和36μl试剂C(Hepes，1M)置于试管1中进行充分混匀，备用；另取1260μlCollagel(3mg/ml COL1与0.01M HCl混合液)和72μl试剂D(0.1M NaOH与5×MEM混合液)置于试管2中进行充分混合，调节混合液的pH为7.0-7.2，备用；将试管1和试管2中混合液混匀，得到所需Collagel培养基质，备用。需要注意的是，上述所有试剂的保存和操作需要保持在4℃或冰上进行。
选取生长状态良好的纤维环源干细胞，待细胞达到90％融合时，加入0.25wt％胰蛋白酶(以细胞量计)进行消化、离心，收集细胞并计数；将细胞加入至所述Collagel培养基质中，调节细胞浓度，使平均Collagel培养基质中细胞浓度约2.0×105细胞/mL；离心并收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1.8ml Collagel培养基质中，经上下吹打混合均匀。
取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板(细胞培养板预先用含有2μg/mL弹性蛋白、7μg/mL层粘连蛋白、15μg/mL ProNectin(RGD)包被培养板表面，并于37℃过夜，备用)中，于37℃、5％CO2培养箱内培养，并在培养的第3、5和7天，更换孔内的100μL培养基并采用倒置显微镜观察细胞的形态。
本实施例培养所得细胞的显微镜照片图见附图3所示，在显微镜下可看到细胞均匀分布在凝胶中，呈立体生长状态，不同凝胶层面的细胞粘附凝胶基质状态良好，相比于二维贴壁生长的细胞，可看到明显的细胞伪足突出并相互交联，细胞胞浆饱满，折光性好。
实施例3
本实施例所述Collagel培养基基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM，288μl；
试剂B：FBS，144μl；
试剂C：Hepes(1M)，36μl；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM混合液，72μl；
Collagel：3mg/mlCOL1与0.01M HCl混合液，1260μl。
取288μl试剂A(5×MEM)、144μl试剂B(FBS)和36μl试剂C(Hepes，1M)置于试管1中进行充分混匀，备用；另取1260μlCollagel(3mg/ml COL1与0.01M HCl混合液)和72μl试剂D(0.1M NaOH与5×MEM混合液)置于试管2中进行充分混合，调节混合液的pH为7.0-7.2，备用；将试管1和试管2中混合液混匀，得到所需Collagel培养基质，备用。需要注意的是，上述所有试剂的保存和操作需要保持在4℃或冰上进行。
选取生长状态良好的纤维环源干细胞，待细胞达到90％融合时，加入0.25wt％胰蛋白酶(以细胞量计)进行消化、离心，收集细胞并计数；将细胞加入至所述Collagel培养基质中，调节细胞浓度，使平均Collagel培养基质中细胞浓度约2.0×105细胞/mL；离心并收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1.8ml Collagel培养基质中，经上下吹打混合均匀。
取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板(细胞培养板预先用含有4μg/mL弹性蛋白、12μg/mL层粘连蛋白、15μg/mL ProNectin(RGD)包被培养板表面，并于37℃过夜，备用)中，于37℃、5％CO2培养箱内培养，并在培养的第3、5和7天，更换孔内的100μL培养基并采用倒置显微镜观察细胞的形态。
实施例4
本实施例所述Collagel培养基基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM，216μl；
试剂B：FBS，288μl；
试剂C：Hepes(1M)，18μl；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM混合液，108μl；
Collagel：2mg/mlCOL1与0.01M HCl混合液，1080μl。
取选定量的试剂A(5×MEM)、试剂B(FBS)和试剂C(Hepes，1M)置于试管1中进行充分混匀，备用；另取选定量的Collagel(2mg/ml COL1与0.01M HCl混合液)和试剂D(0.1MNaOH与5×MEM混合液)置于试管2中进行充分混合，调节混合液的pH为7.0-7.2，备用；将试管1和试管2中混合液混匀，得到所需Collagel培养基质，备用。需要注意的是，上述所有试剂的保存和操作需要保持在4℃或冰上进行。
选取生长状态良好的纤维环源干细胞，待细胞达到90％融合时，加入0.25wt％胰蛋白酶(以细胞量计)进行消化、离心，收集细胞并计数；将细胞加入至所述Collagel培养基质中，调节细胞浓度，使平均Collagel培养基质中细胞浓度约2.0×105细胞/mL；离心并收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1.8ml Collagel培养基质中，经上下吹打混合均匀。
取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板(细胞培养板预先用含有2μg/mL弹性蛋白、15μg/mL层粘连蛋白、5μg/mL ProNectin(RGD)包被培养板表面，并于37℃过夜，备用)中，于37℃、3％CO2培养箱内培养，并在培养的第3、5和7天，更换孔内的100μL培养基并采用倒置显微镜观察细胞的形态。
实施例5
本实施例所述Collagel培养基基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM，360μl；
试剂B：FBS，72μl；
试剂C：Hepes(1M)，72μl；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM混合液，36μl；
Collagel：10mg/mlCOL1与0.01M HCl混合液，1440μl。
取选定量的试剂A(5×MEM)、试剂B(FBS)和试剂C(Hepes，1M)置于试管1中进行充分混匀，备用；另取选定量的Collagel(10mg/ml COL1与0.01M HCl混合液)和72μl试剂D(0.1M NaOH与5×MEM混合液)置于试管2中进行充分混合，调节混合液的pH为7.0-7.2，备用；将试管1和试管2中混合液混匀，得到所需Collagel培养基质，备用。需要注意的是，上述所有试剂的保存和操作需要保持在4℃或冰上进行。
选取生长状态良好的纤维环源干细胞，待细胞达到90％融合时，加入0.25wt％胰蛋白酶(以细胞量计)进行消化、离心，收集细胞并计数；将细胞加入至所述Collagel培养基质中，调节细胞浓度，使平均Collagel培养基质中细胞浓度约2.0×105细胞/mL；离心并收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1.8ml Collagel培养基质中，经上下吹打混合均匀。
取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板(细胞培养板预先用含有10μg/mL弹性蛋白、5μg/mL层粘连蛋白、10μg/mL ProNectin(RGD)包被培养板表面，并于37℃过夜，备用)中，于37℃、8％CO2培养箱内培养，并在培养的第3、5和7天，更换孔内的100μL培养基并采用倒置显微镜观察细胞的形态。
对比例1
本对比例所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法同实施例1，其区别仅在于，不进行相应的细胞培养板包被的步骤。
本对比例培养所得细胞的显微镜照片图见附图4所示，可见，在不进行细胞培养板包被的方案中，处于培养瓶底部的细胞，仍较多的呈贴壁生长，较少形成细胞伪足突出样的三维生长结构，难以模拟体内细胞生长的三维基底膜环境，较难形成交细胞之间的交联网状结构。
因此，本发明所述细胞培养方法，通过对培养板的包被，相当于给细胞提供一层细胞外基质，细胞在立体环境中的生长，更好的粘附于细胞外基质，更类似于细胞在体内的生理环境，从而更好的模拟细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的生长环境、相互作用与信号通讯。
对比例2
本对比例所述仅仅通过细胞培养板包被后培养骨髓间充质干细胞，未经Collagel凝胶支架法三维培养，即将细胞与普通培养液混合后直接加入到包被的培养板中。
本对比例培养所得细胞的显微镜照片图见附图5所示，可见，普通贴壁培养的骨髓间充质干细胞，细胞呈贴壁生长状态，细胞之间生长密集、较少形成细胞伪足、未相互交联成网状，未呈现三维生长状态。
因此，仅通过培养板包被后培养的细胞，相当于仅模拟细胞生长的细胞外基质环境，而非立体的生长环境，不能更好的模拟细胞在体内的生理环境，细胞状态不理想。
对比例3
本对比例所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法同实施例1，其区别仅在于，所述三维培养步骤为采用传统的琼脂糖凝胶方法：将生长状态较好的纤维环源干细胞消化后制成单细胞悬液，用PBS液配制低熔点琼脂糖，将单细胞悬液与琼脂糖液混合，使形成细胞终浓度为2×105细胞/ml的3％琼脂糖细胞悬液，置于6孔培养板中，放于4℃冰箱内凝胶25min，加入2m1的DMEM(内含10％的FBS)，放于37℃，5％CO2培养箱内培养。
待细胞培养较多时，观察细胞的培养状态，培养所得细胞的显微镜照片图见附图6所示，可见，纵然细胞生长较多后，依然较难形成三维立体网络交联状，细胞重叠较多。
可见，传统的琼脂糖凝胶三维培养细胞，仅仅给细胞提供三维的凝胶网状结构，且网状结构较大，不能提供类似于细胞外基质成分的三维生理环境，细胞黏附程度较差，生长后期不易形成三维细胞交联网，不利于细胞的增殖和细胞间的通讯。
而由于人体内细胞外基质的主要成分是胶原蛋白、粘连蛋白、蛋白多糖等，本发明方法采用Collagel凝胶支架法培养细胞时，可以更好的模拟体内的三维生理环境，细胞可以更好的粘附于三维凝胶网，生长后期更容易形成细胞交联网，利于细胞的增殖和细胞间的通讯。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制Collagel凝胶培养基质，备用；
所述Collagel凝胶培养基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM；
试剂B：FBS(胎牛血清)；
试剂C：1M Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM的混合液；
Collagel凝胶：2-10mg/ml COL1(Ⅰ型胶原蛋白)与0.01M HCl的混合液；
(2)取分离的纤维环源干细胞，制成单细胞悬液，并计数；
(3)将所述细胞与所述Collagel凝胶培养基质混合均匀，得到细胞-Colagel悬液；
(4)取细胞培养板，并以表面包被材料对所述细胞培养板表面进行包被，并培养过夜，备用；
(5)取步骤(3)得到的细胞-Colagel悬液加入至包被后的细胞培养板中，置于CO2培养箱中进行细胞培养，即得。
2.根据权利要求1所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述Collagel凝胶培养基质的配置步骤具体包括：
(a)取所述试剂A、试剂B和试剂C进行混合，备用；
(b)另取试剂D和Collagel，并调节混合液pH7.0-7.2，备用；
(c)分别将上述步骤(a)和(b)制备的混合液混匀，即得。
3.根据权利要求1或2所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，其特征在于，所述试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和Collagel的体积比为(6-10)：(2-8)：(0.5-2)：(1-3)：(30-40)。
4.根据权利要求1-3任一项所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，还包括调节细胞浓度，使平均Collagel培养基基质中细胞浓度为2.0×105细胞/mL的步骤。
5.根据权利要求4所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，还包括将所述细胞-Colagel悬液进行固液分离并收集细胞以所述Collagel培养基质进行重悬的步骤。
6.根据权利要求1-5任一项所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述表面包被材料包括弹性蛋白、层粘连蛋白以及ProNectin(RGD)。
7.根据权利要求6所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，其特征在于，所述表面包被材料包括2-10μg/mL弹性蛋白、5-30μg/mL层粘连蛋白以及5-30μg/mL ProNectin(RGD)。
8.根据权利要求1-7任一项所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述细胞培养步骤为置于35-40℃、3-8％CO2恒温培养。
9.根据权利要求8所述基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，还包括在培养的第3、5和7天，更换所述细胞培养板内培养基的步骤，以及观察培养细胞形态的步骤。
10.由权利要求1-9任一项所述基于Collagel凝胶支架法三维培养的纤维环源干细胞。
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