CN114958713A - 一种管状结构的三维细胞培养支架 - Google Patents
一种管状结构的三维细胞培养支架 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114958713A CN114958713A CN202210606003.4A CN202210606003A CN114958713A CN 114958713 A CN114958713 A CN 114958713A CN 202210606003 A CN202210606003 A CN 202210606003A CN 114958713 A CN114958713 A CN 114958713A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- scaffold
- cell culture
- dimensional cell
- tubular structure
- cellulose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 74
- 229920001690 polydopamine Polymers 0.000 claims abstract description 41
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 229920001046 Nanocellulose Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 65
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 65
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical group CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 21
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 20
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 20
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 19
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 18
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 17
- GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N methyl-cyclopentane Natural products CC1CCCC1 GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 14
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 12
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 claims description 12
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 6
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 claims description 4
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 claims description 4
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 claims description 3
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229920005573 silicon-containing polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 58
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 6
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 210000001650 focal adhesion Anatomy 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 229920002201 Oxidized cellulose Polymers 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 3
- 239000005002 finish coating Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940107304 oxidized cellulose Drugs 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CRWJEUDFKNYSBX-UHFFFAOYSA-N sodium;hypobromite Chemical compound [Na+].Br[O-] CRWJEUDFKNYSBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- KEJOCWOXCDWNID-UHFFFAOYSA-N Nitrilooxonium Chemical compound [O+]#N KEJOCWOXCDWNID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000016446 peptide cross-linking Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
- C12N5/0691—Vascular smooth muscle cells; 3D culture thereof, e.g. models of blood vessels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/30—Synthetic polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
- C12N2533/78—Cellulose
Abstract
本发明涉及生物材料制备领域，公开了一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，基底支架为管状，修饰涂层的制备方法包括如下步骤：（1）聚多巴胺表面修饰；（2）氧化纳米纤维素交联；（3）短肽修饰。提供了一种管状结构的三维细胞培养支架，通过修饰涂层增强细胞的黏附能力和生长、增殖能力，使得细胞可以顺利附着在支架上进行生长，实现细胞的体外三维培养，有效模拟细胞外基质环境，可以单独或组合用于体外细胞三维培养和细胞模型构建，特别是体内管状器官的模型构建，研究细胞行为，也可以用于植入式材料和器件的生物表面构建，提升材料的生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料制备领域，尤其是涉及一种管状结构的三维细胞培养支架。
背景技术
细胞是生物体结构和功能的基本单位。目前，在体外细胞培养中，很大程度上都是在二维培养条件下完成的。然而二维细胞培养技术培养得到的细胞在体外环境下会逐渐丧失其体内原有的性状，在形态、结构和功能等方面与体内自然生长状态下的细胞相去甚远，因此其应用受到大量限制。三维细胞培养技术目前正得到广泛发展，在三维空间结构中培养得到的细胞可以保留天然细胞微环境中的物质结构基础，可以更好地模拟体内细胞的生长和发展过程。然而，不论是在二维还是三维的细胞体外培养中，与周围环境进行通讯的主要方式之一即为细胞黏附，同时细胞黏附也对细胞生长、迁移、增殖、分化、凋亡等生理过程至关重要的影响因素。
对于三维细胞体外培养，由于体内许多器官的结构都是管状结构，因此在组织工程领域有大量文献报道了管状结构组织工程支架的制备方法，可以模拟体内管状结构器官，特别是血管等的形成过程。中国专利公开号“CN103173353A”公开了一种多层管状结构细胞培养支架及其制备方法和用途，该支架包括位于高分子弹性膜层和与其贴合的高分子固定层，所述高分子弹性膜层的弹性使得所述支架自动卷曲成多层管状结构；可以为提供一种将单种/多种细胞层状分布在多层管状结构细胞培养支架的方法及由该方法制得的单种/多种细胞层状分布的三维管状结构的用途，其用于模拟血管或肠道多种细胞层状分布的人体器官、用于病变或受损器官修复和作为体外研究模型。在管状结构细胞培养的过程中，细胞与培养材料相接触后，首先要先黏附在材料表面，然后才能进行铺展、增殖等行为，因此细胞与材料的黏附性能对细胞培养效果具有重要影响。目前使用的管状结构细胞培养材料对于细胞的黏附能力较差，导致细胞培养效果较差。
发明内容
本发明是为了克服现有管状结构细胞培养装置细胞黏附能力差、细胞培养效果不佳的问题，提供一种管状结构的三维细胞培养支架。通过管状支架实现细胞的三维培养，通过支架表面的修饰涂层增强培养过程中细胞对支架的黏附能力，修饰涂层包括聚多巴胺层、纳米纤维素层及短肽层，通过多种吸附效应增强细胞吸附能力和生长活性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种管状结构的三维细胞培养支架，支架包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：
（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到多巴胺溶液中，自聚合后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；
（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后的纳米纤维素溶解后加入TEMPO和NaBr，反应后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，充分交联后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；
（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有RGD肽和催化剂的溶液中，充分反应后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。
对体内微环境的仿生设计是调控细胞行为的可靠手段，因此管状结构的细胞培养支架可以实现体外细胞的三维培养，通过空间结构内的细胞生长发育过程更好地实现对细胞生长的观察。管状支架也可以模拟体内的血管结构，有助于培养得到的细胞实现更好地应用。对于细胞在管状结构培养支架上的生长，细胞在支架上的黏附是其形成三维结构的基础。首先在支架表面通过多巴胺的自聚合作用在其表面形成一层聚多巴胺层，聚多巴胺层可以与多种基底材料形成良好的作用力，因此可以牢固固定在基底支架的表面，聚多巴胺本身具有较强的黏附性能，可以改善基底材料的生物相容性，促进细胞附着在基底材料上。同时聚多巴胺上存在较多可反应的羟基和氨基等活性官能团，因此可以进行进一步交联。
在聚多巴胺表面修饰后，再在其上交联一定数量的氧化纳米纤维素。纳米纤维素经过氧化反应后表面羟基转化为羧基和醛基，可以与聚多巴胺表面的活性基团进行反应交联，从而将纳米纤维素附着到支架表面。支架表面的拓扑结构对于细胞黏附也具有显著影响，根据细胞与材料表面之间缝隙宽度可以分为焦点粘附、直接粘附和间接粘附，其中焦点粘附是作用力最强的粘附，此时细胞与材料表面的缝隙大致为10~20nm。纳米纤维素自身直径为纳米级，将其交联到材料表面后可以显著提升细胞的焦点粘附效应，增强其在支架上的粘附能力。此后，再在氧化纳米纤维素表面通过肽键交联部分RGD酞。RGD肽是一类含有精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸序列的短肽，存在于多种生物细胞外基质中，能特异性地识别细胞表面的整合素并与之结合，从而进一步增强细胞的黏附作用，加强细胞的增殖能力，更有利于细胞在三维管状结构的培养支架上的生长。并且氧化纳米纤维素表面存在较多负电，不利于细胞的吸附，通过短肽交联可以减少氧化纳米纤维素表面的负电荷，从而使得细胞可以顺利黏附在管状结构培养支架表面。
作为优选，步骤（1）中多巴胺溶液的浓度为0.5~2mg/mL，pH为7.5~8.5，自聚合时间为20~30h。多巴胺溶液浓度较高时会导致修饰的聚多巴胺层过厚，影响后续交联过程；多巴胺溶液浓度较低则可能导致修饰的聚多巴胺层过薄。无法对支架表面进行良好涂层修饰。
作为优选，步骤（2）纳米纤维素的直径为5~20nm，纳米纤维素长度为0.5~1.5μm，溶液中纳米纤维素的浓度为10~50mg/mL。此直径下的纳米纤维素在交联到管状结构细胞培养支架表面后可以增强细胞的焦点吸附效应，从而增强细胞的黏附能力。
作为优选，步骤（2）中中纳米纤维素、TEMPO和NaBr的质量比为(1~5):(0.1~1):(1~2)，反应时间为6~10h，反应pH为6~7。TEMPO催化氧化纤维素的过程中，其首先与NaBr形成NaBrO，随后NaBrO将TEMPO氧化成亚硝鎓离子，亚硝鎓离子将伯醇羟基氧化成醛基(中间体)，并最终生成羧基。通过氧化过程可以提升纤维素在水溶液中的稳定性，更有利于后续将其与聚多巴胺表面修饰的基底支架进行交联。如果反应时间过长，则可能导致生成的羧基过多，导致氧化纳米纤维素携带更多的负电荷，不利于细胞的附着；反应时间过少则可能导致羧基生成不足，无法与聚多巴胺层或短肽形成足够交联。
作为优选，步骤（2）中交联温度为25~30℃，交联时间为4~8h。
作为优选，步骤（3）中的反应时间为12~18h，反应温度为20~30℃，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。4-二甲氨基吡啶可以催化短肽与氧化纳米纤维素或聚多巴胺层的反应交联，将RGD肽交联到管状结构细胞培养支架的表面。
作为优选，基底支架材质为玻璃、硅或生物可降解聚合物中的一种。
作为优选，生物可降解聚合物为聚氨酯、聚乳酸、聚己内酯中的一种或其组合。
作为优选，基底支架上设有网孔，所述网孔的孔径为50~500μm。通过网孔的设计更有效地模拟细胞外基质环境，并且也可以控制细胞在管状结构细胞培养支架上的位置和数量，更好地进行三维细胞体外培养。
作为优选，所述基底支架的长度为18~22mm，外径为20~24mm，高度为4~6mm。
因此，本发明具有如下有益效果：（1）提供了一种管状结构的三维细胞培养支架，细胞可以顺利附着在支架上进行生长，实现细胞的体外三维培养，有效模拟细胞外基质环境；（2）在管状结构细胞培养支架表面通过反应制备修饰涂层，修饰涂层包括聚多巴胺层、氧化纤维素和RGD肽，聚多巴胺层可以实现修饰涂层与基底之间的良好结合、提供可反应基团，氧化纤维素可以提升细胞的焦点粘附，RGD肽可以减少氧化纤维素表面的负电对细胞附着的负面影响，同时通过其与细胞表面整合素的结合增强细胞的附着和增殖能力；（3）可以单独或组合用于体外细胞三维培养和细胞模型构建，特别是体内管状器官的模型构建，研究细胞行为，也可以用于植入式材料和器件的生物表面构建，提升材料的生物相容性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。应理解，这些实施例适用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的范围限制；实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中采用的条件。
下述实施例中未作特殊说明，所有原料均来自于商购或通过本领域的常规方法制备而得。
实施例1
一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述基底支架的长度为20mm，外径为22mm，高度为5mm，基底支架材质为玻璃，基底支架上还设有网孔，所述网孔的孔径为300μm，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：
（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到浓度为1.0mg/mL、pH为8.0的多巴胺溶液中，自聚合25h后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；
（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后直径为5~20nm、长度为0.5~1.5μm的纳米纤维素溶解，纳米纤维素的浓度为30mg/mL，然后加入TEMPO和NaBr，纳米纤维素、TEMPO和NaBr的质量比为3:0.5:1.5，在pH6.5条件下反应8h后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，在28℃下充分交联6h后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；
（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有RGD肽和催化剂的溶液中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，RGD肽的浓度为2mmol/L，4-二甲氨基吡啶的浓度为4mmol/L，在25℃下充分反应16h后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。
实施例2
一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述基底支架的长度为18mm，外径为20mm，高度为4mm，基底支架材质为硅，基底支架上还设有网孔，所述网孔的孔径为500μm，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：
（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到浓度为2mg/mL、pH为8.5的多巴胺溶液中，自聚合20h后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；
（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后直径为5~20nm、长度为0.5~1.5μm的纳米纤维素溶解，纳米纤维素的浓度为50mg/mL，然后加入TEMPO和NaBr，纳米纤维素、TEMPO和NaBr的质量比为5:1:2，在pH7.0条件下反应6h后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，在25℃下充分交联8h后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；
（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有RGD肽和催化剂的溶液中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，RGD肽的浓度为2mmol/L，4-二甲氨基吡啶的浓度为4mmol/L，在20℃下充分反应18h后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。
实施例3
一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述基底支架的长度为22mm，外径为24mm，高度为6mm，基底支架材质为聚氨酯，基底支架上还设有网孔，所述网孔的孔径为50μm，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：
（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到浓度为0.5mg/mL、pH为7.5的多巴胺溶液中，自聚合30h后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；
（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后直径为5~20nm、长度为0.5~1.5μm的纳米纤维素溶解，纳米纤维素的浓度为10mg/mL，然后加入TEMPO和NaBr，纳米纤维素、TEMPO和NaBr的质量比为1:0.1:1，在pH6.0条件下反应10h后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，在30℃下充分交联4h后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；
（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有RGD肽和催化剂的溶液中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，RGD肽的浓度为2mmol/L，4-二甲氨基吡啶的浓度为4mmol/L，在30℃下充分反应12h后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。
实施例4
一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述基底支架的长度为20mm，外径为22mm，高度为5mm，基底支架材质为质量比为3:1的聚氨酯和聚乳酸，基底支架上还设有网孔，所述网孔的孔径为200μm，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：
（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到浓度为1.5mg/mL、pH为8.0的多巴胺溶液中，自聚合25h后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；
（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后直径为5~20nm、长度为0.5~1.5μm的纳米纤维素溶解，纳米纤维素的浓度为40mg/mL，然后加入TEMPO和NaBr，纳米纤维素、TEMPO和NaBr的质量比为4:0.8:1.5，在pH7.0条件下反应10h后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，在30℃下充分交联6h后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；
（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有RGD肽和催化剂的溶液中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，RGD肽的浓度为1.5mmol/L，4-二甲氨基吡啶的浓度为3mmol/L，在25℃下充分反应16h后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。
实施例5
一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述基底支架的长度为20mm，外径为22mm，高度为5mm，基底支架材质为聚己内酯，基底支架上还设有网孔，所述网孔的孔径为100μm，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：
（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到浓度为1.0mg/mL、pH为7.5的多巴胺溶液中，自聚合20h后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；
（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后直径为5~20nm、长度为0.5~1.5μm的纳米纤维素溶解，纳米纤维素的浓度为25mg/mL，然后加入TEMPO和NaBr，纳米纤维素、TEMPO和NaBr的质量比为2:0.4:1.2，在pH6.0条件下反应7h后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，在25℃下充分交联8h后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；
（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有RGD肽和催化剂的溶液中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，RGD肽的浓度为3mmol/L，4-二甲氨基吡啶的浓度为4mmol/L，在20℃下充分反应18h后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，不进行修饰涂层的制备。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，在修饰涂层的制备过程中不进行聚多巴胺层的制备。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于，在修饰涂层的制备过程中不进行氧化纳米纤维素层的制备。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于，在修饰涂层的制备过程中不进行短肽修饰。
将制备得到的管状结构细胞培养支架用于人微血管内皮细胞株(HMEC-1)的三维细胞培养过程中，具体方法如下：取传代周期在第2代和第6代之间的HMEC-1细胞，首先在无血清的DEME培养基（含10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）中培养24h。将管状结构细胞培养支架放入培养皿中，然后加入融化的基质胶，使基质胶充分贴合管状结构细胞培养支架，在10℃冰箱中预冷后加入无血清培养24h后的HMEC-1细胞制成的细胞悬液，放入培养箱中继续培养48~72h。
由于在管状结构细胞培养支架表面进行了修饰涂层的制备，增强了其对细胞的黏附效果，因此使用实施例1~5制备得到的管状结构细胞培养支架可以在三维细胞培养过程中使得HMEC-1细胞顺利贴壁到支架表面，在后续培养过程中形成血管内皮细胞管状结构。对比例1的支架没有修饰涂层，因此细胞在其上的黏附能力不足，无法进行三维细胞培养，细胞只能在培养皿表面和支架与培养皿的接触部分贴壁生长，无法形成类似血管的结构。对比例2的支架没有进行聚多巴胺层的制备，导致后续的修饰涂层无法与基底支架形成良好的结合，使得细胞无法顺利在支架表面形成良好的管状结构。对比例3制备得到的支架由于缺少氧化纳米纤维素层，一方面短肽修饰的过程中与支架表面的结合不足，另一方面由于缺少了氧化纳米纤维素提供的焦点粘附效应，从而导致细胞的贴壁与生长效果不佳。对比例4制备得到的支架未进行短肽修饰，可能由于氧化纳米纤维素表面负电荷过多降低了细胞的黏附效果，导致细胞在支架上部贴壁效果较差，同时由于失去了短肽对细胞生长的促进作用，形成的细胞层的生长也较为缓慢。
Claims (10)
1.一种管状结构的三维细胞培养支架，其特征是，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：
（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到多巴胺溶液中，自聚合后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；
（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后的纳米纤维素溶解后加入TEMPO和NaBr，反应后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，充分交联后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；
（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有RGD肽和催化剂的溶液中，充分反应后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。
2.根据权利要求1所述的一种管状结构的三维细胞培养支架，其特征是，步骤（1）中多巴胺溶液的浓度为0.5~2mg/mL，pH为7.5~8.5，自聚合时间为20~30h。
3.根据权利要求1所述的一种管状结构的三维细胞培养支架，其特征是，步骤（2）纳米纤维素的直径为5~20nm，纳米纤维素长度为0.5~1.5μm，溶液中纳米纤维素的浓度为10~50mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种管状结构的三维细胞培养支架，其特征是，步骤（2）中纳米纤维素、TEMPO和NaBr的质量比为(1~5):(0.1~1):(1~2)，反应时间为6~10h，反应pH为6~7。
5.根据权利要求1所述的一种管状结构的三维细胞培养支架，其特征是，步骤（2）中交联温度为25~30℃，交联时间为4~8h。
6.根据权利要求1所述的一种管状结构的三维细胞培养支架，其特征是，步骤（3）中的反应时间为12~18h，反应温度为20~30℃，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。
7.根据权利要求1所述的一种管状结构的三维细胞培养支架，其特征是，基底支架材质为玻璃、硅或生物可降解聚合物中的一种。
8.根据权利要求7所述的一种管状结构的三维细胞培养支架，其特征是，生物可降解聚合物为聚氨酯、聚乳酸、聚己内酯中的一种或其组合。
9.根据权利要求1所述的一种管状结构的三维细胞培养支架，其特征是，基底支架上设有网孔，所述网孔的孔径为50~500μm。
10.根据权利要求1所述的一种管状结构的三维细胞培养支架，其特征是，所述基底支架的长度为18~22mm，外径为20~24mm，高度为4~6mm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210606003.4A CN114958713B (zh) | 2022-05-31 | 2022-05-31 | 一种管状结构的三维细胞培养支架 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210606003.4A CN114958713B (zh) | 2022-05-31 | 2022-05-31 | 一种管状结构的三维细胞培养支架 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114958713A true CN114958713A (zh) | 2022-08-30 |
| CN114958713B CN114958713B (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=82957448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210606003.4A Active CN114958713B (zh) | 2022-05-31 | 2022-05-31 | 一种管状结构的三维细胞培养支架 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114958713B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117625541A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-01 | 零壹人工智能科技研究院(南京)有限公司 | 一种脑胶质瘤类器官构建方法及药敏检测方法 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5863531A (en) * | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
| CN106267339A (zh) * | 2016-07-19 | 2017-01-04 | 福建工程学院 | 一种高模量超亲水生物支架制备方法 |
| WO2017209521A1 (ko) * | 2016-05-31 | 2017-12-07 | 주식회사 아모라이프사이언스 | 세포배양용 또는 조직공학용 지지체 |
| CN108210994A (zh) * | 2018-03-06 | 2018-06-29 | 福建工程学院 | 一种均匀化聚多巴胺涂层修饰生物支架的制备方法 |
| CN109758606A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-05-17 | 哈尔滨市第一医院 | 一种rgd多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架及其制备方法 |
| CN111676191A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-18 | 山东省医药生物技术研究中心（山东省病毒研究所） | 一种基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法 |
| CN111705036A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-25 | 山东省医药生物技术研究中心（山东省病毒研究所） | 一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法 |
| CN111714706A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-09-29 | 领博生物科技(杭州)有限公司 | 可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架、血管支架的制备方法及活性人工血管 |
| CN111803629A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-10-23 | 南京邮电大学 | 一种基于纳米纤维素晶的有机无机杂化多功能生物材料及其制备方法和应用 |
| CN114181904A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-03-15 | 华中科技大学 | 模拟骨物理特征的肿瘤细胞三维培养支架及其制备与应用 |
-
2022
- 2022-05-31 CN CN202210606003.4A patent/CN114958713B/zh active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5863531A (en) * | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
| WO2017209521A1 (ko) * | 2016-05-31 | 2017-12-07 | 주식회사 아모라이프사이언스 | 세포배양용 또는 조직공학용 지지체 |
| KR20170135769A (ko) * | 2016-05-31 | 2017-12-08 | 주식회사 아모라이프사이언스 | 세포배양용 또는 조직공학용 지지체 |
| CN106267339A (zh) * | 2016-07-19 | 2017-01-04 | 福建工程学院 | 一种高模量超亲水生物支架制备方法 |
| CN108210994A (zh) * | 2018-03-06 | 2018-06-29 | 福建工程学院 | 一种均匀化聚多巴胺涂层修饰生物支架的制备方法 |
| CN109758606A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-05-17 | 哈尔滨市第一医院 | 一种rgd多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架及其制备方法 |
| CN111714706A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-09-29 | 领博生物科技(杭州)有限公司 | 可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架、血管支架的制备方法及活性人工血管 |
| CN111803629A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-10-23 | 南京邮电大学 | 一种基于纳米纤维素晶的有机无机杂化多功能生物材料及其制备方法和应用 |
| CN111676191A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-18 | 山东省医药生物技术研究中心（山东省病毒研究所） | 一种基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法 |
| CN111705036A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-25 | 山东省医药生物技术研究中心（山东省病毒研究所） | 一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法 |
| CN114181904A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-03-15 | 华中科技大学 | 模拟骨物理特征的肿瘤细胞三维培养支架及其制备与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 丁祥龙;王敬旭;郭泽鸿;赖春花;高岩;林曦;徐淑兰;: "RGD肽段修饰TiO_2纳米管对MG63成骨细胞黏附增殖能力的影响", 口腔疾病防治, no. 11, pages 706 - 711 * |
| 马亮;王洪;杨述华;邵增务;孟春庆;段德宇;李艳军;: "RGD序列肽修饰的丝素蛋白仿生支架材料对骨髓间充质干细胞黏附、增殖的影响", 中国组织工程研究与临床康复, no. 48, pages 9667 - 9670 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117625541A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-01 | 零壹人工智能科技研究院(南京)有限公司 | 一种脑胶质瘤类器官构建方法及药敏检测方法 |
| CN117625541B (zh) * | 2024-01-26 | 2024-04-02 | 零壹人工智能科技研究院(南京)有限公司 | 一种脑胶质瘤类器官构建方法及药敏检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114958713B (zh) | 2024-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4214051B2 (ja) | エラスチン架橋体およびその製造方法 | |
| Zhu et al. | Endothelial cell functions in vitro cultured on poly (L‐lactic acid) membranes modified with different methods | |
| US5578442A (en) | Graft copolymers of polycationic species and water-soluble polymers, and use therefor | |
| Andukuri et al. | Effect of endothelium mimicking self-assembled nanomatrices on cell adhesion and spreading of human endothelial cells and smooth muscle cells | |
| CA2692005C (fr) | Support collagenique modifie par greffage covalent de molecules d'adhesion : procedes et applications pour l'ingenierie de tissu contractile, la therapie cellulaire en thoracique et cardiovasculaire | |
| WO1992017218A1 (fr) | Vaisseau sanguin artificiel et composite | |
| WO2009042829A1 (en) | Bioactive hydrogel fibers | |
| CN109758611B (zh) | 一种活性生物组织工程支架的溶喷制备方法 | |
| WO2004085606A1 (ja) | 細胞培養基質および細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品 | |
| JP2009213716A (ja) | 血管組織形成法 | |
| CN114958713B (zh) | 一种管状结构的三维细胞培养支架 | |
| Yuan et al. | Advances in biomedical application of nanocellulose-based materials: a review | |
| Wang et al. | Thermo-triggered ultrafast self-healing of microporous coating for on-demand encapsulation of biomacromolecules | |
| CN109793934B (zh) | 一种组织工程化心肌补片及其制备和应用 | |
| Vigneswari et al. | Elucidating the surface functionality of biomimetic rgd peptides immobilized on nano-p (3hb-co-4hb) for h9c2 myoblast cell proliferation | |
| Xu et al. | Tubular silk fibroin/gelatin-tyramine hydrogel with controllable layer structure and its potential application for tissue engineering | |
| Ramirez-Calderon et al. | Delivery of endothelial cell-laden microgel elicits angiogenesis in self-assembling ultrashort peptide hydrogels in vitro | |
| Soman et al. | Interpenetrating polymer network (Ipn)-hydrogels | |
| CN102940909B (zh) | 一种修饰组织工程支架的方法 | |
| CN102690436B (zh) | 一种能够定向调控软骨细胞积聚的活性微球及其制备方法 | |
| KR20120087049A (ko) | 친수성기가 도입된 인공혈관 | |
| CN102250373B (zh) | 一种微纳米拓扑智能膜及其制备方法 | |
| JP6143163B2 (ja) | 弾性組織様構造体の製造方法 | |
| JP2010518998A (ja) | 医学的または外科的用途のためのインプラント材料 | |
| JP2011092491A (ja) | 埋め込み部材 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |