CN102690436B - 一种能够定向调控软骨细胞积聚的活性微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种能够调控软骨细胞定向积聚的生物活性的多孔微球支架材料及其制备方法。其可应用于胚胎发育过程软骨细胞积聚、临床中软骨缺损修复过程中的代替物及构建软骨组织修复等领域的生物活性支架材料。该方法采用多孔聚酯类高分子微球制备-化学交联-干燥步骤完成活性多孔微球的制备。制备得到的微球具有良好的生物相容性和降解性、合理的理化性质和微观拓扑形貌、连通性良好的多孔结构以及由内向外的生物活性因子浓度梯度，从而能够在体外调控软骨定向积聚，为软骨细胞的体外功能表达提供良好的载体，同时为组织工程化软骨提供一种良好的生物支架材料。
Description
技术领域
本发明涉及胚胎发育过程软骨细胞积聚、临床中软骨缺损修复过程中的代替物及构建软骨组织修复的生物活性支架材料，具体地说是一种具有能够调控软骨细胞定向积聚的生物活性多孔微球支架材料的制备方法。
背景技术
细胞积聚不仅在软骨的胚胎发育中至关重要，而且积聚发生的时间、空间以及方式都会显著影响成体软骨的维持和再生。在胚胎发育期，软骨前体细胞积聚进而形成胚胎早期软骨肢芽的轮廓；随后,透明质酸酶降解细胞外基质导致的细胞积聚引发进一步的软骨细胞分化和组织形成。在成体软骨中,软骨细胞积聚在软骨陷窝中。胚胎期的细胞积聚主要表现在细胞与细胞之间通过神经细胞黏附分子和神经钙粘素的直接粘附；而在成体软骨中，细胞积聚主要由细胞膜表面的α10β1整合素与II型胶原等细胞外基质结合形成。tenascin-C和COMP（cartilageoligomeric matrixprotein）等细胞外基质成分在发育的不同阶段通过与细胞的整合素以及细胞表面受体CD44，CD105，CD166相互作用完成对细胞积聚的调控。细胞积聚还可以通过抵抗细胞凋亡而促进软骨形成。
有研究从不同侧面证明了适当的细胞积聚有利于软骨细胞分化和组织形成，同时也有研究表明磁珠介导的细胞积聚在体外适当条件下可以提升软骨细胞的细胞外基质分泌。在体外软骨细胞聚集的微团培养中，单个软骨细胞的成软骨效率是由Wnt/β-catenin信号通路调控，并在特定数量下达到峰值。间充质干细胞在壳聚糖修饰的聚乳酸与聚己内酯共聚物多孔支架材料中积聚并分化成软骨细胞，并且支架中添加的聚羟基丁酸酯（PHBV）微球促进细胞的积聚并浓集了细胞外基质。与软骨细胞在水凝胶中分散存在并保持球形、不贴附状态不同，软骨细胞在多孔材料中显著地积聚和增殖，这种积聚提升了成软骨能力并减少了凋亡。
目前很多方法可以调控细胞积聚，但都不适合在生物支架材料中应用。体外诱导干细胞或软骨细胞形成软骨最有效的方法是人为造成高密度细胞积聚来模仿胚胎发育过程，如小球培养（pellet）和微团培养（micromass）。介电泳力、离心力结合AggrewellTM、激光，微流芯片等技术可以体外人为积聚细胞，但尚未应用到三维支架材料和体内实验中。磁力介导细胞积聚比较成熟，但由于其有磁珠的残留，不适合用于再生医学。透明质酸酶和I型胶原能够促进软骨细胞积聚，而β1整合素抗体和胶原酶阻碍积聚的发生。在三维支架材料中，整合素对纤维粘连蛋白的特异性识别可以影响间充质干细胞分化。细胞在传统的三维多孔支架材料中趋向于局部浓集和积聚，但上述支架材料都缺乏主动调控细胞积聚的能力。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种具有能够在体外调控软骨定向积聚的生物活性多孔微球支架材料的制备方法，为软骨细胞的体外功能表达提供良好的载体，同时为组织工程化软骨提供一种良好的生物支架材料。
为实现上述目的，提供一种能够定向调控软骨细胞体外积聚的活性多孔微载体，通过该工艺制备的活性多孔微载体主要为含有生物活性的蛋白类、糖类以及趋化因子（Chemokine,Platelet-Derived Growth Factor）的多孔微载体。
生物活性多孔微载体的制备工艺，包括以下工艺步骤：
（1）多孔聚酯类高分子微球制备：将标记为W1相的1-2.5ml浓度为2.5-10.0wt%的NH4HCO3溶液，加入2-10ml浓度为1.0-6.25wt%的脂肪族聚酯高分子有机溶液中，该高分子有机溶液标记为O相，然后在冰浴中用均质搅拌机高速搅拌得到初乳液，迅速将所得W1/O相初乳液倒入100-400ml的0.1wt%的标记为W2相的聚乙烯醇PVA水溶液中，室温下机械搅拌得到W1/O/W2相二次乳液，在二次乳化过程中有机溶剂挥发最终得到多孔高分子微球，用去离子水反复冲洗所得微球，然后进行冷冻干燥；
（2）化学交联：将多孔微球浸入体积比为1∶1的乙醇/水混合溶剂中浸泡2-3h，以去除表面粘附的油脂和其它杂质；用水充分漂洗并烘干后，浸入1,6-己二胺浓度为0.02-0.10g/ml的异丙醇溶液中，37℃下反应5-15分钟，用无水乙醇终止反应，并用去离子水充分漂洗以去除未反应的己二胺；将胺解后的三维多孔支架浸入浓度为1wt％的戊二醛溶液中24小时，然后利用去离子水清洗，浸泡24小时以保证彻底去除戊二醛；将多孔微球浸入不同生物活性大分子的乙酸溶液中，溶液中生物活性大分子含量为2-10mg/ml,pH=3.5,反应24h，反应温度2-4℃；反应结束后用1.0wt％的醋酸溶液和去离子水分别浸泡24h以去除剩余的生物活性大分子；
（3）干燥：将反应制备得到的活性多孔微球在冷冻干燥机中干燥24h，即完成生物活性多孔载体微球的制备。
所述的高分子材料为聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乙醇酸中一种或从中选取几种进行复配。对于有机溶剂制备所使用的溶剂为二氯甲烷，其他有机溶剂不适合双乳化挥发法制备多孔微球。
而在活性成分修饰的步骤中，所使用的活性成分主要有明胶、二型胶原、RGD、壳聚糖、硫酸软骨素或者天然软骨细胞外基质中的活性成分以及PDGF等趋化因子。
本发明的技术效果如下：
具备特定形貌和生物活性的微球可以在生物支架材料中主动调控细胞积聚。经研究表明细胞在生物支架材料中的种植过程（Cell Seeding）中趋向随机分布，而现有的生物材料普遍缺乏预埋的活性位点主动调控细胞的分布。很多迹象显示这种主动调控可能显著减少细胞的凋亡并提升细胞的功能活性。除了活性位点，生化因子的浓度梯度也能调控细胞的迁移而诱导细胞定向积聚。软骨细胞及其前体细胞的直径在10μm左右，通过细胞膜表面的糖蛋白如整合素等与基质或材料结合进而粘附、增殖和迁移。调控细胞定向分布和积聚的微球应该具有如下特点：1）较大的比表面积和生物活性位点使细胞能够接触并粘附其表面；2）多孔、可降解结构能介导黏附在其表面的细胞迁移和积聚；3）生化因子的有效浓度梯度；4）可以加载细胞。基于上述理解，我们设计了在生物支架材料中主动介导细胞积聚的微球，它们具备如下特点：1）良好的生物相容性和降解性；并随着外层材料的降解，细胞进一步积聚；2）合理的理化性质和微观拓扑形貌；3）微球直径在100-150μm，具有连通性良好的多孔结构，孔径20-40μm；4）具备由内向外的生物活性因子浓度梯度。
附图说明
图1为生物活性微球制备示意图，其表明了将高分子微球修饰上生物活性分子（如明胶等），并通过调整微球的降解速率形成生化因子的浓度梯度，调控细胞的粘附与积聚。
具体实施方式
实施例1活性多孔微球的制备：
（1）多孔聚乳酸高分子微球制备：将1.25ml浓度为5%的NH4HCO3溶液（W1相）加入4ml浓度为3.13%的聚乳酸高分子有机溶液中（O相），然后在冰浴中用均质搅拌机高速搅拌得到初乳液（W1/O）,迅速将所得初乳液倒入400ml 0.1%的PVA水溶液中（W2相），室温下机械搅拌得到二次乳液（W1/O/W2）,在二次乳化过程中有机溶剂挥发最终得到多孔聚乳酸高分子微球，去离子水反复冲洗所得微球，最后冷冻干燥得到所需的微球；（2）化学交联：将多孔微球浸入50ml乙醇/水(1/1，v/v)混合溶剂中浸泡2—3h，以去除表面粘附的油脂和其它杂质。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml1-6己二胺浓度为0.06g/ml异丙醇溶液中，37度下反应5分钟，用无水乙醇终止反应，并用大量水充分漂洗以去除未反应的己二胺。将胺解后的三维多孔微球浸入50ml浓度为1wt％的戊二醛溶液中24小时，然后利用大量去离子水清洗，大约浸泡24小时以保证彻底去除戊二醛。然后将支架浸入50ml壳聚糖生物活性大分子（2mg,乙酸PH=3.5）的溶液中反应24个小时，反应温度为2－4℃。反应完之后分别用1.0％的醋酸溶液和去离子水分别浸泡24小时以去除剩余的生物活性大分子。（3）干燥：将反应制备得到的活性多孔微球在冷冻干燥机中干燥24h，即完成活性多孔微球的制备。
实施例2活性多孔微球的制备：
（1）多孔聚乳酸高分子微球制备：将1.25ml浓度为5%的NH4HCO3溶液（W1相）加入4ml浓度为3.13%的聚乳酸高分子有机溶液中（O相），然后在冰浴中用均质搅拌机高速搅拌得到初乳液（W1/O）,迅速将所得初乳液倒入400ml0.1%的PVA水溶液中（W2相），室温下机械搅拌得到二次乳液（W1/O/W2）,在二次乳化过程中有机溶剂挥发最终得到多孔聚乳酸高分子微球，去离子水反复冲洗所得微球，最后冷冻干燥得到所需的微球；（2）化学交联：将多孔微球浸入50ml乙醇/水(1/1，v/v)混合溶剂中浸泡2—3h，以去除表面粘附的油脂和其它杂质。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml1-6己二胺浓度为0.06g/ml异丙醇溶液中，37度下反应5分钟，用无水乙醇终止反应，并用大量水充分漂洗以去除未反应的己二胺。将胺解后的三维多孔微球浸入50ml浓度为1wt％的戊二醛溶液中24小时，然后利用大量去离子水清洗，大约浸泡24小时以保证彻底去除戊二醛。然后将支架浸入50ml明胶生物活性大分子（2mg,乙酸PH=3.8）的溶液中反应24个小时，反应温度为2－4℃。反应完之后分别用1.0％的醋酸溶液和去离子水分别浸泡24小时以去除剩余的生物活性大分子。（3）干燥：将反应制备得到的活性多孔微球在冷冻干燥机中干燥24h，即完成活性多孔微球的制备。
实施例3活性多孔微球的制备：
（1）多孔聚乳酸高分子微球制备：将1.25ml浓度为5%的NH4HCO3溶液（W1相）加入4ml浓度为3.13%的聚乳酸高分子有机溶液中（O相），然后在冰浴中用均质搅拌机高速搅拌得到初乳液（W1/O）,迅速将所得初乳液倒入400ml 0.1%的PVA水溶液中（W2相），室温下机械搅拌得到二次乳液（W1/O/W2）,在二次乳化过程中有机溶剂挥发最终得到多孔聚乳酸高分子微球，去离子水反复冲洗所得微球，最后冷冻干燥得到所需的微球；（2）化学交联：将多孔微球浸入50ml乙醇/水(1/1，v/v)混合溶剂中浸泡2—3h，以去除表面粘附的油脂和其它杂质。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己二胺浓度为0.06g/ml异丙醇溶液中，37度下反应5分钟，用无水乙醇终止反应，并用大量水充分漂洗以去除未反应的己二胺。将胺解后的三维多孔微球浸入50ml浓度为1wt％的戊二醛溶液中24小时，然后利用大量去离子水清洗，大约浸泡24小时以保证彻底去除戊二醛。然后将支架浸入50ml二型胶原生物活性大分子（2mg,乙酸PH=3.8）的溶液中反应24个小时，反应温度为2－4℃。反应完之后分别用1.0％的醋酸溶液和去离子水分别浸泡24小时以去除剩余的生物活性大分子。（3）干燥：将反应制备得到的活性多孔微球在冷冻干燥机中干燥24h，即完成活性多孔微球的制备。
实施例4活性多孔微球的制备：
（1）多孔聚乳酸高分子微球制备：将1.25ml浓度为5%的NH4HCO3溶液（W1相）加入4ml浓度为3.13%的聚乳酸高分子有机溶液中（O相），然后在冰浴中用均质搅拌机高速搅拌得到初乳液（W1/O）,迅速将所得初乳液倒入400ml 0.1%的PVA水溶液中（W2相），室温下机械搅拌得到二次乳液（W1/O/W2）,在二次乳化过程中有机溶剂挥发最终得到多孔聚乳酸高分子微球，去离子水反复冲洗所得微球，最后冷冻干燥得到所需的微球；（2）化学交联：将多孔微球浸入50ml乙醇/水(1/1，v/v)混合溶剂中浸泡2—3h，以去除表面粘附的油脂和其它杂质。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己二胺浓度为0.06g/ml异丙醇溶液中，37度下反应5分钟，用无水乙醇终止反应，并用大量水充分漂洗以去除未反应的己二胺。将胺解后的三维多孔微球浸入50ml浓度为1wt％的戊二醛溶液中24小时，然后利用大量去离子水清洗，大约浸泡24小时以保证彻底去除戊二醛。然后将支架浸入50ml天然软骨细胞外基质生物活性大分子（2mg,乙酸PH=3.8）的溶液中反应24个小时，反应温度为2－4℃。反应完之后分别用1.0％的醋酸溶液和去离子水分别浸泡24小时以去除剩余的生物活性大分子。（3）干燥：将反应制备得到的活性多孔微球在冷冻干燥机中干燥24h，即完成活性多孔微球的制备。
实施例5活性多孔微球的制备：
（1）多孔聚乳酸-羟基乙酸高分子微球制备：将1.25ml浓度为5%的NH4HCO3溶液（W1相）加入4ml浓度为3.13%的聚乳酸-羟基乙酸高分子有机溶液中（O相），然后在冰浴中用均质搅拌机高速搅拌得到初乳液（W1/O）,迅速将所得初乳液倒入400ml 0.1%的PVA水溶液中（W2相），室温下机械搅拌得到二次乳液（W1/O/W2）,在二次乳化过程中有机溶剂挥发最终得到多孔聚乳酸-羟基乙酸高分子微球，去离子水反复冲洗所得微球，最后冷冻干燥得到所需的微球；（2）化学交联：将多孔微球浸入50ml乙醇/水(1/1，v/v)混合溶剂中浸泡2—3h，以去除表面粘附的油脂和其它杂质。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己二胺浓度为0.06g/ml异丙醇溶液中，37度下反应5分钟，用无水乙醇终止反应，并用大量水充分漂洗以去除未反应的己二胺。将胺解后的三维多孔微球浸入50ml浓度为1wt％的戊二醛溶液中24小时，然后利用大量去离子水清洗，大约浸泡24小时以保证彻底去除戊二醛。然后将支架浸入50ml壳聚糖生物活性大分子（2mg,乙酸PH=3.5）的溶液中反应24个小时，反应温度为2－4℃。反应完之后分别用1.0％的醋酸溶液和去离子水分别浸泡24小时以去除剩余的生物活性大分子。（3）干燥：将反应制备得到的活性多孔微球在冷冻干燥机中干燥24h，即完成活性多孔微球的制备。
实施例6活性多孔微球的制备：
（1）多孔聚乳酸-羟基乙酸高分子微球制备：将1.25ml浓度为5%的NH4HCO3溶液（W1相）加入4ml浓度为3.13%的聚乳酸-羟基乙酸高分子有机溶液中（O相），然后在冰浴中用均质搅拌机高速搅拌得到初乳液（W1/O）,迅速将所得初乳液倒入400ml 0.1%的PVA水溶液中（W2相），室温下机械搅拌得到二次乳液（W1/O/W2）,在二次乳化过程中有机溶剂挥发最终得到多孔聚乳酸-羟基乙酸高分子微球，去离子水反复冲洗所得微球，最后冷冻干燥得到所需的微球；（2）化学交联：将多孔微球浸入50ml乙醇/水(1/1，v/v)混合溶剂中浸泡2—3h，以去除表面粘附的油脂和其它杂质。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己二胺浓度为0.06g/ml异丙醇溶液中，37度下反应5分钟，用无水乙醇终止反应，并用大量水充分漂洗以去除未反应的己二胺。将胺解后的三维多孔微球浸入50ml浓度为1wt％的戊二醛溶液中24小时，然后利用大量去离子水清洗，大约浸泡24小时以保证彻底去除戊二醛。然后将支架浸入50ml明胶生物活性大分子（2mg,乙酸PH=3.8）的溶液中反应24个小时，反应温度为2－4℃。反应完之后分别用1.0％的醋酸溶液和去离子水分别浸泡24小时以去除剩余的生物活性大分子。（3）干燥：将反应制备得到的活性多孔微球在冷冻干燥机中干燥24h，即完成活性多孔微球的制备。
实施例7活性多孔微球的制备：
（1）多孔聚乳酸-羟基乙酸高分子微球制备：将1.25ml浓度为5%的NH4HCO3溶液（W1相）加入4ml浓度为3.13%的聚乳酸-羟基乙酸高分子有机溶液中（O相），然后在冰浴中用均质搅拌机高速搅拌得到初乳液（W1/O）,迅速将所得初乳液倒入400ml 0.1%的PVA水溶液中（W2相），室温下机械搅拌得到二次乳液（W1/O/W2）,在二次乳化过程中有机溶剂挥发最终得到多孔聚乳酸-羟基乙酸高分子微球，去离子水反复冲洗所得微球，最后冷冻干燥得到所需的微球；（2）化学交联：将多孔微球浸入50ml乙醇/水(1/1，v/v)混合溶剂中浸泡2—3h，以去除表面粘附的油脂和其它杂质。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己二胺浓度为0.06g/ml异丙醇溶液中，37度下反应5分钟，用无水乙醇终止反应，并用大量水充分漂洗以去除未反应的己二胺。将胺解后的三维多孔微球浸入50ml浓度为1wt％的戊二醛溶液中24小时，然后利用大量去离子水清洗，大约浸泡24小时以保证彻底去除戊二醛。然后将支架浸入50ml二型胶原生物活性大分子（2mg,乙酸PH=3.8）的溶液中反应24个小时，反应温度为2－4℃。反应完之后分别用1.0％的醋酸溶液和去离子水分别浸泡24小时以去除剩余的生物活性大分子。（3）干燥：将反应制备得到的活性多孔微球在冷冻干燥机中干燥24h，即完成活性多孔微球的制备。
实施例8活性多孔微球的制备：
（1）多孔聚乳酸-羟基乙酸高分子微球制备：将1.25ml浓度为5%的NH4HCO3溶液（W1相）加入4ml浓度为3.13%的聚乳酸-羟基乙酸高分子有机溶液中（O相），然后在冰浴中用均质搅拌机高速搅拌得到初乳液（W1/O）,迅速将所得初乳液倒入400ml 0.1%的PVA水溶液中（W2相），室温下机械搅拌得到二次乳液（W1/O/W2）,在二次乳化过程中有机溶剂挥发最终得到多孔聚乳酸-羟基乙酸高分子微球，去离子水反复冲洗所得微球，最后冷冻干燥得到所需的微球；（2）化学交联：将多孔微球浸入50ml乙醇/水(1/1，v/v)混合溶剂中浸泡2—3h，以去除表面粘附的油脂和其它杂质。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己二胺浓度为0.06g/ml异丙醇溶液中，37度下反应5分钟，用无水乙醇终止反应，并用大量水充分漂洗以去除未反应的己二胺。将胺解后的三维多孔微球浸入50ml浓度为1wt％的戊二醛溶液中24小时，然后利用大量去离子水清洗，大约浸泡24小时以保证彻底去除戊二醛。然后将支架浸入50ml天然软骨细胞外基质生物活性大分子（2mg,乙酸PH=3.8）的溶液中反应24个小时，反应温度为2－4℃。反应完之后分别用1.0％的醋酸溶液和去离子水分别浸泡24小时以去除剩余的生物活性大分子。（3）干燥：将反应制备得到的活性多孔微球在冷冻干燥机中干燥24h，即完成活性多孔微球的制备。
实施例9活性多孔微球用于软骨细胞积聚：
（1）取一定量的活性多孔微球，75%的酒精浸泡两个小时，然后在紫外灯的照射下灭菌半个小时，取一定量的软骨细胞培养基浸泡活性多孔微球一昼夜，离心置于离心管中备用；（2）将软骨细胞消化离心后，用密度为1,000,000cells/ml的细胞悬浮液与一定量的活性多孔微球进行共混培养；（3）共混培养两周后通过FDA/PI染色后，用荧光共聚焦显微镜来观测细胞积聚的状态；（4）同时可以将积聚体植入到软骨缺损模型中观察软骨再生的过程。
Claims (4)
1.一种生物活性多孔载体微球在定向调控软骨细胞积聚中的应用，该生物活性多孔载体微球是以下工艺步骤制得：（1）多孔聚酯类高分子微球制备：将标记为W1相的1-2.5ml浓度为2.5-10.0wt%的NH4HCO3溶液，加入2-10ml浓度为1.0-6.25wt%的脂肪族聚酯高分子有机溶液中，该高分子有机溶液标记为O相，然后在冰浴中用均质搅拌机高速搅拌得到初乳液，迅速将所得W1/O相初乳液倒入100-400ml的0.1wt%的标记为W2相的聚乙烯醇PVA水溶液中，室温下机械搅拌得到W1/O/W2相二次乳液，在二次乳化过程中有机溶剂挥发最终得到多孔高分子微球，用去离子水反复冲洗所得微球，然后进行冷冻干燥；（2）化学交联：将多孔微球浸入体积比为1:1的乙醇/水混合溶剂中浸泡2-3h，以去除表面粘附的油脂和其它杂质；用水充分漂洗并烘干后，浸入1,6-己二胺浓度为0.02-0.10g/ml的异丙醇溶液中，37℃下反应5-15分钟，用无水乙醇终止反应，并用去离子水充分漂洗以去除未反应的己二胺；将胺解后的三维多孔支架浸入浓度为1wt％的戊二醛溶液中24小时，然后利用去离子水清洗，浸泡24小时以保证彻底去除戊二醛；将多孔微球浸入不同生物活性大分子的乙酸溶液中，溶液中生物活性大分子含量为2-10mg/ml,pH=3.5，反应24h，反应温度2-4℃；反应结束后用1.0wt％的醋酸溶液和去离子水分别浸泡24h以去除剩余的生物活性大分子；（3）干燥：将反应制备得到的活性多孔微球在冷冻干燥机中干燥24h，即完成生物活性多孔载体微球的制备，制得的生物活性多孔载体微球直径在100-150μm，孔径20-40μm。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）的脂肪族聚酯高分子有机溶液中，所使用的脂肪族聚酯高分子材料为聚羟基乙酸和/或聚乳酸。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）的脂肪族聚酯高分子有机溶液中，所使用的溶剂为二氯甲烷。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）中所使用的生物活性大分子选自明胶、二型胶原、RGD、壳聚糖、硫酸软骨素、天然软骨细胞外基质中的活性成分。
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| CN101249077A (zh) * | 2008-04-14 | 2008-08-27 | 西南交通大学 | 一种可降解聚合物多孔微球的制备方法及其用途 |
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Patent Citations (1)
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| "A Viscoelastic Chitosan-Modified Three-Dimensional Porous Poly(L-Lactide-co-ε-Caprolactone) Scaffold for Cartilage Tissue Engineering";Chao Li等;《Journal of Biomaterials Science》;20120101;第23卷(第1-4期);405-424 * |
| Chao Li等."A Viscoelastic Chitosan-Modified Three-Dimensional Porous Poly(L-Lactide-co-ε-Caprolactone) Scaffold for Cartilage Tissue Engineering".《Journal of Biomaterials Science》.2012,第23卷(第1-4期),405-424. |
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