TWI671402B - 新穎中空微米粒子 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種中空微米粒子，包括：a)一中空微球；b)複數個連結分子，連接至該中空微球的表面；c)一多胜肽，連接至少一連結分子；以及d)一標靶分子，連接至少一連結分子。本發明之中空微球可利用中空結構、多胜肽及標靶分子可來提升負載細胞的量及移植成功的機率。此外，本發明更提供一種中空微球的製造方法及一細胞載體。

Description

新穎中空微米粒子
本發明係有關於一種微米粒子，且特別有關於連接多胜肽的中空微米粒子，其可作為一種細胞培養裝置以培養細胞。此外，本發明中空微米粒子也可作為一功能性生醫材料載體，進行體內的組織修復。
目前，已有針對人工組織移植及再生醫學進行各種基礎研究和技術開發，例如，幹細胞增生與分化的研究、細胞可接受且生物可降解支架的開發、以及各種組織工程工具的建立。以上皆為現今再生醫學重要的課題，其中以開發可傳送幹細胞或組織細胞的支架最為重要。
組織再生的支架材料為一平台，其可吸附細胞以形成組織。支架材料可作為移植細胞與宿主細胞間的暫時性屏障，其無毒且具生物相容性。此外，當所欲移植的細胞已在特定位置上充足地生長時，支架材料可在個體內降解。
一般來說，支架可由合成、天然聚合物或其複合材料製備。支架可製造成有各種形態和功能的結構。最常使用的生物可降解聚合物包括，乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己內酯(PCL)及其衍生物與聚合物。天然的生物可降解材料包括膠原蛋白、藻酸鹽、透明質酸、明膠、脫乙酰殼多醣與纖維素等。在支架的製造中，可添加各種不同形式的材料，如海綿、凝膠、纖維素或微珠等。
Wang,M.,et al揭露以PLGA支架培養ADSC，並輔以誘導分化的培養基促使幹細胞分化。ADSC於PLGA支架上培養，一般的培養基無法促使大量增生。顯示PLGA載體 不利於ADSC貼附生長的缺點。
Kim SE,et al揭露以PLGA多孔性微球培養 ADSC，並輔以改質肝素-多巴胺(Hep)及乳鐵蛋白(LF)促使細胞生長及分化。定量數據顯示，雖微球經修飾改質，但細胞於微球上之增生數量並不明顯。
由上述可知，目前在組織工程技術中仍有許多困 難需要克服。例如，細胞培養的空間過小、產量過低、所能攜帶的細胞量過少、移植成功的機會過低等。因此，業界急需一種生醫材料載體，可同時作為體外培養支架及體內移植載體。
有鑑於上述先前技術所存在之問題，本發明提供 一種中空微米粒子、其製備方法以及一種含有本發明中空微米粒子之細胞載體。本發明之中空微米粒子為中空多孔狀可大量培養細胞，並透過多胜肽與標靶分子，以提升載體功能。
本發明提供一種微米粒子，包括：a)一中空微球； b)複數個連結分子，連接該中空微球的表面；c)一多胜肽，連接至少一連結分子；以及d)一標靶分子，連接至少一連結分子。
在本發明一實施例中，中空微球為中空結構。
在本發明一實施例中，中空微球之材質係選自由：聚乳酸、聚(丁二酸丁二醇酯)、聚(丁二酸丁二醇酯-共-己二酸丁二醇酯)、聚(己二酸丁二醇酯-共-對苯二甲酸酯)、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己內酯、及聚乙烯醇或其混合物所組成之群組。
在本發明一實施例中，連結分子包括胺基、醇基(OH)、梭基(COOH)或腈基(CN)。
在本發明一實施例中，多胜肽包括IKVAV、RGD、YIGSR、REDV、DGEA、VGVAPG、GRGDS、LDV、RGDV、PDSGR、RYWLPR、LGTIPG、LAG、RGDS、RGDF、HHLGGALQAGDV、VTCG、SDGD、GREDVY、GRGDY、GRGDSP、VAPG、GGGGRGDSP、GGGGRGDY、FTLCFD、Poly-Lysine或MAX-1。
在本發明一實施例中，標靶分子包括透明質酸、氧化透明質酸、Colleagen、Glucocorticoid、Galectin或osteopontin。
本發明另提供一種中空微米粒子的製造方法，包括(a)提供一中空微球；(b)將該中空微球浸泡在一胺類溶液中，使該中空微球的表面產生胺基；(c)加入一多胜肽，使該多胜肽接枝至該中空微球表面的胺基；以及(d)加入一標靶分子，使該標靶分子連接至該中空微球表面的胺基。
本發明更提供一種細胞載體，包括如本發明之中空微米粒子與一細胞。
11‧‧‧微米粒子
13‧‧‧連結分子
15‧‧‧多胜肽
17‧‧‧標靶分子
100‧‧‧中空微球
第1圖為本發明中空微米粒子之結構示意圖。
第2圖為本發明中空微米粒子之製備方法。
第3a-3e圖為本發明PLGA微球、PLGA-NH2微球、PLGA-NH2-IKVAV、PLGA-NH2-IKVAV-oHA、實心PLGA-IKVAV微球的外部及內部形態。
第4圖顯示本發明中空微米粒子與實心微米粒子的懸浮狀況。
第5圖顯示本發明中空微米粒子的胺基改質程度。
第6圖顯示本發明中空微米粒子的IKAVA接枝程度。IKAVA的接枝程度為11.5mmole/mg。
第7圖顯示本發明中空微米粒子的oHA接枝程度。中空微米粒子的oHA接枝量約為每毫克微球有10.5mmole的oHA。
第8圖為傅立葉紅外線光譜儀的分析結果。PLGA、 PLGA-NH2、PLGA-NH2-IKVAV及PLGA-NH2-IKVAV-oHA微球分別具有不同的官能基。
第9圖為核磁共振儀的分析結果。PLGA、PLGA-NH2、PLGA-NH2-IKVAV及PLGA-NH2-IKVAV-oHA微球分別具有不同的官能基。
第10a-10b圖顯示以顯微鏡鏡檢ADSC於各中空微米粒子表面之附著情形。
第11圖顯示為ADSC於各中空微米粒子之表面附著情形之細胞數量。
第12a-12b圖顯示以顯微鏡鏡檢ADSC於各中空微米粒子表面之生長情形。
第13圖顯示為ADSC於各中空微米粒子之表面生長情形之細胞數量。
第14a-14b圖顯示以顯微鏡鏡檢HepG2於各中空微米粒子表面之附著情形。
第15圖顯示為HepG2於各中空微米粒子之表面附著情形之細胞數量。
第1、2圖顯示本發明之中空微米粒子及其製造方法。應注意的是，為了清楚描述本發明之特徵，第1、2圖僅為本發明實施例之簡單圖示，在實際應用時，此技藝人士可依不同的需求增加或修改第1、2圖之結構。
在本發明第一範疇中，本發明係提供一種中空微米粒子，包括：a)一中空微球；b)複數個連結分子，連接該中 空微球；c)一多胜肽，連接至少一連結分子；以及d)一標靶分子，連接至少一連結分子。
參照第1圖，中空微米粒子100包括中空微球11。
本發明中所述之“中空微球”係為一種微粒，包括一或多種聚合物，該微米粒子顆粒直徑係介於50~180μm，其中最佳為120μm。本發明之中空微球為球體狀，顆粒的形狀和尺寸並無特別限制。
本發明之中空微米粒子具有一3D中空結構，可用於培養及/或傳送細胞。由於3D細胞培養模式可模擬體內的3D結構微環境，以及提供更多的培養空間，因此可降低培養成本並增加細胞產量。
本發明所述之“細胞”係指任何來自動物個體的細胞，其可傳送至相同或不同的個體。細胞可為異種細胞、自體細胞或同種異體細胞。細胞可直接來自於動物個體的初代細胞，也可為一由經培養後所生成的細胞。本發明之細胞較佳為“幹細胞”。幹細胞係指任何具有分裂成未分化狀態且生成特定細胞。本發明之幹細胞可包括，但不限於，神經、肝、腎、脂肪、成骨細胞、破骨、肺泡、心臟、腸道或內皮幹細胞。
本發明中空微米粒子的的材質包括，但不限於，生物穩定性聚合物、生物可降解聚合物、富勒烯、脂質或它們的組合。生物穩定係指在生物體內不會降解的聚合物。生物可分解係指可使用於人體的某部位中，如暴露於體液(如血液)，可逐漸地被人體所吸收及/或消除。
在一實施例中，生物可分解聚合物包括脂肪族聚脂類、脂肪族共聚脂類、或脂肪族及芳香族共聚脂類的物質。生物可分解聚合物較佳為聚乳酸(PLA)、聚(丁二酸丁二醇酯)(PBS)、聚(丁二酸丁二醇酯-共-己二酸丁二醇酯)(PBSA)、聚(己二酸丁二醇酯-共-對苯二甲酸酯)(PBAT)、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己內酯 (PCL)、及聚乙烯醇(PVOH)或上述組合。
參照第1圖，在中空微球11表面上具有至少一 個連結分子13。
本發明中所述之“連結分子”係指一基團，包括 胺基(NH2)、醇基(OH)、梭基(COOH)或腈基(CN)，較佳為一胺基。
在一實施例中，為了在中空微米粒子的表面生成 至少一胺基，可將中空微米粒子置於胺類溶液中。生成胺基的方法並無特別限制，此技術領域人士自可選擇適當的方式。
參照第1圖，連結分子13與多胜肽15連結。
本發明之“多胜肽”係指2或以上胺基酸以胜 肽鍵結合在一起的胜肽或蛋白質。多胜肽可為一種短鏈胜肽、寡胜肽或寡聚物。本發明多胜肽的長度一般介於2至20個胺基酸，較佳2至10個胺基酸。本發明多胜肽可包括，但不限於2、3、4、5、6、7、8或9個胺基酸。在一實施例中，多胜肽包括IKVAV、RGD、YIGSR、REDV、DGEA、VGVAPG、GRGDS、LDV、RGDV、PDSGR、RYWLPR、LGTIPG、LAG、RGDS、RGDF、HHLGGALQAGDV、VTCG、SDGD、GREDVY、GRGDY、GRGDSP、VAPG、GGGGRGDSP、GGGGRGDY、FTLCFD、Poly-Lysine或MAX-1，較佳為IKVAV。
參照第1圖，連結分子13與標靶分子17連結。
本發明之“標靶分子”係指任何專一性結合至特定目標物的物質(例如，胜肽、蛋白質、核酸聚合物、適體或小分子化合物)。目標物可為一組織、細胞、細胞結構(例如，胞器)、蛋白質、胜肽、多醣類、或核酸聚合物。本發明所述之適體係指隨機地擇自於一依據與目標分子親合力所獲得的DNA或RNA分子(參照Cox and Ellington,Bioorg.Med.Chem.9：2525-2531(2001)；Lee et al,Nuc.Acids Res.32：D95-D100(2004))。適體可為核酸、蛋白質、小分子有機化合物、微生素、無機化合物、細胞及所有有機體。
本發明之標靶分子17包括，但不限於，抗體、 抗體片段、雙特異性抗體、親和體、雙抗體、微抗體、ScEv、適體，avimer、標靶肽、生長抑素、RGD肽、透明質酸、葉酸、葉酸類似物或已知可結合到與疾病相關的任何其它分子。此技術領域人士自可依據目標分子選擇適當的標靶分子。
本發明之中空微米粒子100可傳送細胞至特定組 織或器官。在一實施例中，將中空微球100用於培養細胞(如幹細胞)以及體內移植支撐物。中空微米粒子100具有連結分子13。由於連結分子13可被特定細胞的受器所辨識，因此可提升細胞的貼附能力。另外，標靶分子15可與特定組織或器官的受體蛋白結合，可提升中空微米粒子100的載體功能性。 藉此，本發明提供一種醫療用之細胞載體、組成物或製劑等，特別是針對肝纖維化的組織修復。
在本發明另一範疇中，本發明另提供一種中空微 米粒子的製造方法，包括：(a)提供一中空微球；(b)將該中空微球浸泡在一胺類溶液中，使該中空微球的表面產生胺基；(c)加入一多胜肽，使該多胜肽接接枝至該中空微球表面的胺基；以及(d)加入一標靶分子，使該標靶分子連接至該中空微球表面的胺基。詳細的製造程序可參照本發明實施例1。
參照第2a圖，提供一中空微球。此中空微球係為 一種微粒，且為微球體狀以及直徑約為120μm。中空微球的材料應具有生物可分解性，且中空微球可用於培養細胞以及作為細胞的載體。
參照第2b圖，將中空微球浸泡在一胺類溶液中， 使該微米粒子的表面產生胺基。本發明中所使用的胺類溶液包括1,6-己二胺的異丙醇溶液Glycine水溶液、adipic dihydrazide(ADH)水溶液、PEG胺化水溶液、NH2-PEG-NHS或NH2-PEG-NH2的DMSO溶液。本技術領域人士自可依據所使用的胺類溶液選擇適當的浸泡的時間及條件。
參照第2c圖，加入一多胜肽，使多胜肽接枝至 中空微球表面的胺基。在添加多胜肽前，可將中空微球置於一緩衝液中，以活化中空微球表面的胺基。本發明中所述之緩衝液包括，但不限於MES緩衝液、EDC水溶液或NHS水溶液。 接著加入多胜肽，多胜肽會與被活化的胺基反應而鍵結。緩衝液的pH值可介於2-10之間，較佳為3-9之間，更佳為4-8之間。本技術領域人士自可依據所使用的緩衝液來調整pH值，以活化胺基。多胜肽在反應溶液中的濃度為約0.01wt%至50wt%，較佳為1wt%至40wt%，更為10wt%至30wt%。
參照第2d圖，加入一標靶分子，使標靶分子連接至該中空微球表面未與多胜肽結合的胺基。
在一實施例中，標靶分子可自行與胺基反應。例如，以透明質酸(oHA)作為標靶分子，而透明質酸的醛基會與中空微球上的胺基反應，藉由亞胺鍵的生成而接枝。
在另一實施例，先將標靶分子置於一緩衝液中，以活化標靶分子上的羧基，再加入中空微球，使中空微球上胺基與活化的羧基鍵結。
本發明另提供一種細胞載體，包括本發明之中空微米粒子以及一細胞。
如上所述，“細胞”係指任何來自動物個體的細胞。細胞可為異種細胞、自體細胞或同種異體細胞。細胞可直接來自於動物個體的初代細胞，也可為一由經培養後所生成的細胞。本發明之細胞可為體細胞、人工細胞或幹細胞。
由上述可知，本發明中空微米粒子的中空結構有助於懸浮培養細胞，可增加細胞產量。比較傳統的細胞培養裝置及模式，可以更低的成本培養更多的細胞。
中空微米粒子的多胜肽可被特定細胞所辨識，以提升細胞的貼附力，進而增加每單位中空微米粒子所能攜帶的細胞量。所以相對於傳統或市售的細胞載體，本發明中空微米粒子所能攜帶的細胞量更多。
另一方面，在中空微米粒子上更具有一標靶分子，可專一性地結合至所欲的目標上，例如，特定組織、器官、部位或細胞。在一實施例中，標靶分子為一透明質酸，使中空微米粒子可專一性地與肝細胞結合。
綜上所述，本發明之中空微米粒子利用中空結構與多胜肽增加細胞負載量，並利用標靶分子使中空微米粒子專一性地結合至目標位置，將細胞移植至目標位置。藉由中空結構、多胜肽與標靶分子，可顯著地提升細胞移植的效力。
【實施例】
1. 中空微米粒子的製備
PLGA微球的製備
以二次乳化法製備PLGA中空微球。取0.9g PLGA溶於40ml二氯甲烷(2.25%)中，再加入20ml二次水後均勻震盪進行第一次乳化。取2.5g的PVA與250ml的二次水配製1% PVA水溶液，冷卻至10℃後，以500rpm攪拌1% PVA水溶液。將上述第一次乳化產物以滴管緩慢滴入攪拌中的1% PVA水溶液，以500rpm攪拌2小時使二氯甲烷揮發後停止。去除水溶液，以二次水清洗3次。以冷凍乾燥機，凍乾3天獲得PLGA微球，以篩網篩PLGA微球，篩出直徑約100-200μm之PLGA微球。參照第3a圖，以掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察PLGA微球外部及內部形態，內部呈中空多孔狀。
1.1 PLGA微球的胺基改質
將PLGA微球浸泡於10%的1,6-己二胺的異丙醇溶液中，反應3小時後，離心以獲得PLGA-NH2微球。保留上清液，做實施例2中的胺基接枝檢測(Ninhydrin分析)。以二次水清洗微球3次進行真空乾燥。PLGA微球表面上形成胺基(NH2)，為PLGA-NH2微球。參照第3b圖，PLGA-NH2微球表面呈現粗糙狀。
1.2 PLGA-IKVAV接枝
配製0.1M的MES緩衝液(pH 5.5)，加入N， N-二甲基氨基丙基碳二亞胺(EDC)與羥基琥珀酰亞胺(NHS)(比例為1：1)，接著加入IKVAV胜肽，使IKVAV：EDC：NHS的比例為5：5：1並且反應2小時活化羧基。加入PLGA-NH2微球進行接枝反應。，反應溶液中IKVAV重量百分濃度約14%，反應24小時後，形成PLGA-NH2-IKVAV微球。保留反應溶液進行實施例3的IKAVA接枝程度分析(TNBS分析)。參照第3c圖，IKVAV覆蓋於PLGA-NH2微球上，表面呈現較為平滑狀態。
1.3 PLGA-oHA接枝
最後，將150mg透明質酸(oHA)溶於8ml二次水，並緩慢地加入32ml的99.5%酒精。加入150mgPLGA-NH2-IKVAV微球後，於pH11下，以150rpm震盪24小時。保留上清做實施例4中的oHA接枝檢測(TNBS分析)。以二次水清洗微球2次，再分別以30%、95%酒精浸泡10分鐘後進行真空乾燥。透明質酸的醛基與PLGA-NH2-IKVAV微球上胺基反應，藉由亞胺鍵的生成而接枝形成本發明之微米粒子(PLGA-NH2-IKVAV-oHA)，如第3d圖所示。
1.4 PLGA空心微球與PLGA實心微球懸浮狀態
將細胞懸浮液(5x105cells/1ml medium)放入試管內，再將已無菌處理過後之微球放入，並分別觀察放入後0小時之PLGA空心微球與PLGA實心微球懸浮狀態。由第4圖可得知空心微球均勻懸浮於液體中，而實心微球則沉澱在管底部
2. 胺基接枝檢測
使用Ninhydrin分析來檢測胺基的接枝程度。將PLGA-NH2微球與ninhydrin藥劑反應後，隔水加熱20分鐘，試劑會與自由胺基反應產成深紫色溶液，再以UV-visible量測570nm波段的吸光質，以計算PLGA-NH2微球的胺基接枝程度。參照第5圖，胺基的接枝程度大於50%。
3. IKVAV接枝程度的分析
以TNBS分析(ACS Chem.Neurosci.,2013,4,1229-1235)來檢測IKVAV胺基與PLGA-NH2羧基的聚合反應。取1ml的PLGA-NH2-IKVAV微球與10mM的t-肼基甲酸叔丁酯(t-buty carbazate)於pH=9下反應24小時後，與2ml的TNBS溶液反應30分鐘。取1m1的反應溶液與1ml的0.5N HCl均勻混合，以UV偵測器測量340nm的吸光值。比較接枝前、後的吸光值以得知IKVAV的接枝程度。參照第6圖，IKAVA的接枝程度為11.5mmole/mg。
4. oHA接枝程度的分析
以TNBS分析來檢測oHA的接枝程度。取1ml微米粒子與10mM的t-肼基甲酸叔丁酯(PH=9)反應24hr。取出100μl與2ml TNBS溶液反應30分鐘後，再抽出1ml與1ml 0.5N HCl混合均勻，以UV偵測器量測340nm波段的吸光質，以計算微米粒子醛基接枝程度。參照第7圖，接枝量約為每毫克微球有10.5mmole的oHA。
5. 化學檢測
利用傅立葉紅外線光譜儀(FTIR)偵測PLGA、PLGA-NH2、PLGA-NH2-IKVAV、PLGA-NH2-IKVAV-oHA等微體的震動或旋轉的頻率，以紅外線光檢測材料之官能基，藉以推判氨基、oHA及IKVAV的接枝。參照第8圖，傅立葉紅外線光譜儀可分辨出PLGA、PLGA-NH2、PLGA-NH2-IKVAV、PLGA-NH2-IKVAV-oHA微球不同的官能基。由於本發明之微球是由PLA與PGA組成的聚合物，可在1090、1185、1375、1745、2943cm-1位置可觀察到吸收峰。此外，由於PLGA接枝NH2會有醯胺鍵，因此可在1550、1650、3358cm-1位置觀察到醯胺鍵的吸收峰，證明PLGA接枝上胺基。由於IKVAV的接枝中，羧基同樣也會與胺基反應生成醯胺鍵，因此醯胺鍵的數量大幅增加。證明微球上有IKVAV。而oHA的接枝過程中，oHA上之醛基會與胺基反應生成亞胺 鍵，因此可在1614cm-1處觀察到亞胺鍵的吸收峰，此外1414cm-1處也可觀察到oHA上之羧基，由此兩吸收峰的生成可間接證明oHA的接枝。
利用核磁共振儀(NMR)偵測PLGA、PLGA-NH2、PLGA-NH2-IKVAV、PLGA-NH2-IKVAV-oHA等微體的氫質子帶電度，藉以推判氨基、oHA及IKVAV的接枝。參照第9圖，核磁共振儀可分辨出PLGA、PLGA-NH2、PLGA-NH2-IKVAV、PLGA-NH2-IKVAV-oHA微球不同的官能基。由於本發明之微球是由PLA與PGA組成的聚合物，可在約1.5(CH3)、4.8(CH2)及5.3(CH)ppm位置可觀察到波峰。此外，由於PLGA接枝NH2及IKVAV會有胺基及醯胺鍵的產生，因此可在2.1(NH2)及3.8(amide)ppm處看到波峰位置觀察到胺基及醯胺鍵的波峰，證明PLGA接枝上胺基及IKVAV。而oHA的接枝過程中，oHA上之醛基會與胺基反應生成亞胺鍵，因此可在8.5(Schiff base)ppm處觀察到亞胺鍵的波峰，由上所述之波峰的生成可間接證明胺基、IKVAV及oHA的接枝。
6.物理檢測
利用Zeta potential及雷射粒徑分析儀偵測PLGA、PLGA-NH2、PLGA-NH2-IKVAV、PLGA-NH2-IKVAV-oHA等微體的表面電位及粒徑大小，以分散液與粒子間之電位差、 光散射的散射條變化，藉以推判微球體表面電荷電性分布、各組微球體平均粒徑及平均表面積。參照表二，Zeta potentia可分辨出PLGA、PLGA-NH2、PLGA-NH2-IKVAV、PLGA-NH2-IKVAV-oHA微球不同的電位及電荷分布。PLGA微球為-12.3mv，而經胺基改質接枝後，胺基上之正電會中和PLGA上之負電，因此整體呈現一個電中性的狀態；IKVAV胜肽序列含有正電殘基的胺基酸(Lys、Arg)胺基酸，因此胜肽序列經改質上微球後，微球表面電荷略呈正電，此結果也利於說明經改質後細胞貼附量增加的結果。最後，將PLGA-IKVAV改質oHA上去，oHA上之醛基與胺基形成亞胺鍵，消耗掉了帶正電的胺基，也因oHA帶有一個羧基殘基，故PLGA-IKVAV-oHA表面電位略微降低為1.09mv。根據此結果，微球經IKVAV及oHA改質後，呈現電中性偏正電荷的情形，此結果可利於細胞貼附，並且由於細胞上受器與IKVAV及oHA之間的特異性相互作用影響力，因此，對於細胞貼附的結果可看出有不小的差異。
根據表三，微球以雷射粒徑分析儀做粒徑及表面積測定。分析結果如上圖及表二，根據粒徑分析結果，微球大小分布約在50μm-200μm之間，平均粒徑約在120μm左右。微球在接枝及改質過程中，會於反應溶液中搖晃攪拌，造成粒徑較小的顆粒可能聚集成為較大顆的顆粒；相反的，聚集成較大顆的顆粒也可能會分散成小顆粒。因此，各組別中粒徑較大與較小之微球所佔比例會有差異。表面積代表細胞可貼附的平面空間，因微球表面為多孔狀，故表面積略低於理想值的0.045cm2/顆微球(以微球直徑120μm計算)。PLGA-NH2經過胺基改質，表面呈現粗糙狀， 因此表面積略為提升；而經過改質接枝後，IKVAV及oHA因覆蓋在微球表面，故表面呈現較為光滑，表面積下降。
7. 細胞生長
將脂肪幹細胞(ADSC)分別培養在Tissue culture polystyrene(TCPS)、空心PLGA、PLGA-NH2、PLGA-NH2-IKVAV及實心PLGA-NH2-IKVAV微球上。24小時後，再以SEM、螢光顯微鏡及WST-1 assay做細胞的定性及定量檢測，藉以比較不同培養載體及環境細胞的貼附程度。
微米粒子的細胞安全性檢測
將ADSC分別種入細胞培養液中(每組細胞數2x105)，待4小時細胞貼附完全，將不同階段的微球放入共同培養。培養48小時後，以Trypan blue做細胞數及存活率計算，做細胞毒性及材料適應性等細胞相容性的檢測。由結果得知，各階段微球細胞的狀況皆與控制組(TCPS)無明顯別，可得知此各階段微球不影響ADSC細胞之生長，因此微米粒子不對ADSC具有毒性。
ADSC貼附微米粒子
將微米粒子加入細胞懸浮液(1x106cells/1ml medium)中，放入37度培養箱進行細胞貼附與培養。每間隔10分鐘即將細胞-微球懸浮液拿出輕搖，使細胞能充分與微球均勻接觸並貼附。待細胞貼附後(約莫4-6小時)，將微球取出，以PBS沖掉未貼附之細胞，並以paraformaldehyde進行細胞固 定。以酒精對細胞及微球進行脫水處理。第10a圖為鏡檢下觀察細胞貼附PLGA及PLGA-NH2的數量並不多；而實心PLGA-IKVAV，因微球沉澱在試管底部，故大部分面積皆被遮蔽，因而產生細胞堆疊在同一表面之形態；相反的，空心微球經改質IKVAV或是IKVAV-oHA後，細胞可大量均勻的貼附在微球表面(。第10b圖為細胞以DAPI進行染色，並以螢光顯微鏡觀察，觀察結果與SEM鏡檢下觀察相似。第11圖為細胞以WST-1檢測之定量結果。結果可得知，經改質IKVAV胜肽之空心微球，細胞貼附在微球上之倍數明顯增加。
ADSC貼附於微米粒子之生長情形
將微球加入細胞懸浮液(1x106cells/ml medium)中，放入37度培養箱進行細胞貼附與培養。每間隔10分鐘即將細胞-微球懸浮液拿出輕搖，使細胞能充分與微球均勻接觸並貼附。約莫24小時後，每間隔約2小時將試管拿出輕搖，使沉澱的微球翻面，增加細胞生長空間及面積。約過72小時後，細胞已貼附於微米粒子並生長，將微球取出，以PBS沖掉未貼附之細胞，並以paraformaldehyde進行細胞固定。以酒精對細胞及微球進行脫水處理。進行SEM、DAPI染色及WST-1檢測。細胞貼附上微球72小時後，進行定性與定量檢測。第12a圖為以SEM觀察細胞生長在PLGA、PLGA-NH2、PLGA-IKVAV及PLGA-IKVAV-oHA等組別。鏡檢下觀察細胞生長在PLGA及PLGA-NH2之形態，雖部分包覆但未佈滿整顆 微球；實心PLGA-IKVAV，則因微球沉澱在試管底部，故大部分面積皆被遮蔽，因而細胞呈現一個堆疊在同一表面生長之形態；PLGA-IKVAV及PLGA-IKVAV-oHA，細胞則因大量均勻的貼附在微球表面，故細胞均勻的分布生長在微球上。第12b圖為細胞以DAPI進行染色，並以螢光顯微鏡觀察，觀察結果與SEM鏡檢下觀察相似。第13圖為細胞以WST-1檢測之定量結果。結果可得知，經改質IKVAV胜肽之空心微球，細胞在微球上生長之倍數明顯增加。
HepG2細胞CD44標靶分子與oHA作用貼附於微米粒子
將微米粒子加入HepG2細胞懸浮液(1x106cells/1ml medium)中，放入37度培養箱進行細胞貼附與培養。每間隔10分鐘即將細胞-微球懸浮液拿出輕搖，使細胞能充分與微球均勻接觸並貼附。待細胞貼附後(約莫4-6小時)，將微球取出，以PBS沖掉未貼附之細胞，並以paraformaldehyde進行細胞固定。以酒精對細胞及微球進行脫水處理。第14a圖為鏡檢下觀察細胞貼附PLGA及PLGA-NH2的數量並不多；而PLGA經改質接枝上oHA及IKVAV-oHA後則可觀察到細胞大量均勻的貼附在微球表面(第14a圖為細胞以DAPI進行染色，並以螢光顯微鏡觀察，觀察結果與第14b圖SEM鏡檢下觀察相似。第15圖為細胞以WST-1檢測之定量結果)，由此證明，經由oHA與CD44的媒介，可大量促使CD44 positive的細胞貼附，間 皆證實了oHA與CD44標靶的作用。根據第14b圖的SEM結果分析，PLGA上之細胞數並不多，因此可觀察到細胞貼附之形態；相對於其他組別，因細胞數量相對較多，而HepG2細胞有容易聚合在一起的特性，故呈現圓形的聚合形態。
所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。
由上述可知，熟習此技藝者能輕易地了解本發明之必要特徵，在不脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變與調整以應用於不同用途與條件。
<110>‧‧‧國璽幹細胞股份有限公司
<120>‧‧‧新穎中空微米粒子
<130>‧‧‧新穎中空微米粒子
<140>‧‧‧US 61/945,364
<141> 2014-02-02
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 1

Claims (3)

  1. 一種中空微球，包括：a)一中空微米粒子，該中空微米粒子具有一中空結構，該中空微米粒子之材質係選自由聚乳酸、聚(丁二酸丁二醇酯)、聚(丁二酸丁二醇酯-共-己二酸丁二醇酯)、聚(己二酸丁二醇酯-共-對苯二甲酸酯)、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己內酯和聚乙烯醇所組成之群組；b)複數個連結分子，連接該中空微米粒子的表面，該連結分子為一胺基；c)一多胜肽，連接至少一該胺基，其中該胺基與該多胜肽之羧基連接，該多胜肽係為SEQ ID NO：1；以及d)一標靶分子，連接至少一該胺基，其中該胺基與該標靶分子以亞胺鍵方式連接，該標靶分子係選自由透明質酸、氧化透明質酸、Colleagen、Glucocorticoid、Galectin和osteopontin所組成之群組；該中空微米粒子係以二次乳化法製備而得，該二次乳化法包括以下步驟：(1)取0.9g該中空微米粒子之材質溶於40ml二氯甲烷(2.25%)中，再加入20ml二次水後均勻震盪進行第一次乳化；(2)配製1%聚乙烯醇水溶液，冷卻至10℃後，以500rpm攪拌1%聚乙烯醇水溶液；(3)將上述第一次乳化產物緩慢滴入攪拌中的1%聚乙烯醇水溶液，以500rpm攪拌2小時使二氯甲烷揮發後停止；(4)去除水溶液，以二次水清洗3次；(5)以冷凍乾燥機，凍乾3天獲得該中空微米粒子之材質微球，以篩網篩該中空微米粒子之材質微球，篩出直徑約100-200μm之該中空微米粒子之材質微球。
  2. 一種細胞載體，包括如申請範圍第1項之中空微球與一細胞。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之細胞載體，其中該細胞附著於該中空微粒球的內部和/或表面。
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