TW201533101A - 製備中空微米粒子的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種製備中空微米粒子的方法，包括：(a)提供一中空微球；(b)將該中空微球浸泡在一胺類溶液中，使中空微球的表面產生胺基；(c)加入一多胜肽，且多胜肽接枝至該中空微球表面的胺基；以及(d)加入一標靶分子，且標靶分子連接至該中空微球表面未鍵結的胺基。

Description

製備中空微米粒子的方法
本發明係有關於一種中空微球，且特別有關於中空微球的製備方法。
目前，已有針對人工組織移植及再生醫學進行各種基礎研究和技術開發，例如，幹細胞增生與分化的研究、細胞可接受且生物可降解支架的開發、以及各種組織工程工具的建立。以上皆為現今再生醫學重要的課題，其中以開發可傳送幹細胞或組織細胞的支架最為重要。
組織再生的支架材料為一平台，其可吸附細胞以形成組織。支架材料可作為移植細胞與宿主細胞間的暫時性屏障，其無毒且具生物相容性。此外，當所欲移植的細胞已在特定位置上充足地生長時，支架材料可在個體內降解。
一般來說，支架可由合成、天然聚合物或其複合材料製備。支架可製造成有各種形態和功能的結構。最常使用的生物可降解聚合物包括，乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己內酯(PCL)及其衍生物與聚合物。天然的生物可降解材料包括膠原蛋白、藻酸鹽、透明質酸、明膠、脫乙酰殼多醣與纖維素等。在支架的製造中，可添加各種不同形式的材料，如海綿、凝膠、纖維素或微珠等。
Wang,M.,et al揭露以PLGA支架培養ADSC，並輔以誘導分化的培養基促使幹細胞分化。ADSC於PLGA支架上培養，一般的培養基無法促使大量增生。顯示PLGA載體不利於ADSC貼附生長的缺點。
Kim SE,et al揭露以PLGA多孔性微球培養 ADSC，並輔以改質肝素-多巴胺(Hep)及乳鐵蛋白(LF)促使細胞生長及分化。定量數據顯示，雖微球經修飾改質，但細胞於微球上之增生數量並不明顯。
由上述可知，目前在組織工程技術中仍有許多困難需要克服。例如，細胞培養的空間過小、產量過低、所能攜帶的細胞量過少、移植成功的機會過低等。因此，業界急需一種新穎的生醫材料載體及其製法。
有鑑於上述先前技術所存在之問題，本發明提供一種製備中空微球的方法。本發明之中空微球為中空多孔狀，可大量培養細胞，並透過多胜肽與標靶分子，以提升載體功能。
本發明係提供一種製造中空微米粒子的方法，包括(a)提供一中空微球；(b)將該中空微球浸泡在一胺類溶液中，使中空微球的表面產生胺基；(c)加入一多胜肽，使多胜肽接接枝至該中空微球表面的胺基；以及(d)加入一標靶分子，使標靶分子連接至中空微球表面的胺基。
在本發明一實施例中，生物分解材質包括聚乳酸、聚(丁二酸丁二醇酯)、聚(丁二酸丁二醇酯-共-己二酸丁二醇酯)、聚(己二酸丁二醇酯-共-對苯二甲酸酯)、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己內酯、聚乙烯醇或其混合物。
在本發明一實施例中，其中a)步驟包括：i)提供一生物分解材質乳化液；ii)提供一0.5體積%以上的PVA水溶液；iii)將該PVA水溶液冷卻後進行均質；iv)將該生物分解材質乳化液緩慢地滴入該PVA水溶液，進行乳化；以及v)冷凍乾燥。
在本發明一實施例中，其中ii)步驟中的PVA水溶液濃度為1體積%。
在本發明一實施例中，其中ii)步驟中的PVA水溶液冷卻至10-15℃。
在本發明一實施例中，其中ii)步驟中的PVA水溶液以1000rpm以下的轉速進行均質化。
在本發明一實施例中，其中ii)步驟中的PVA水溶液以1000rpm以下的轉速進行均質化。
在本發明一實施例中，其中該胺類溶液包括含有己二胺、Glycine水溶液、adipic dihydrazide(ADH)水溶液、PEG胺化水溶液、NH2-PEG-NHS或NH2-PEG-NH2的DMSO溶液。
在本發明一實施例中，在(c)步驟前，將多胜肽與一緩衝液反應以活化羧基。
在本發明一實施例中，其中緩衝液包括MES緩衝液、EDC水溶液或NHS水溶液。
在本發明一實施例中，其中多胜肽包括IKVAV、RGD、YIGSR、REDV、DGEA、VGVAPG、GRGDS、LDV、RGDV、PDSGR、RYWLPR、LGTIPG、LAG、RGDS、RGDF、HHLGGALQAGDV、VTCG、SDGD、GREDVY、GRGDY、GRGDSP、VAPG、GGGGRGDSP、GGGGRGDY、FTLCFD、Poly-Lysine或MAX-1。
在本發明一實施例中，其中標靶分子包括透明質酸、氧化透明質酸、Colleagen、Glucocorticoid、Galectin或osteopontin。
在本發明一實施例中，其中d)步驟中，標靶分子為100至150mg。
在本發明一實施例中，其中d)步驟中，標靶分子與中空微球重量比為1：1.5至1：1。
第1圖為本發明中空微米粒子之製備方法。
第2圖為製備本發明中空微米粒子之示意圖。
第3a-3d圖為本發明PLGA微球、PLGA-NH2微球、 PLGA-NH2-IKVAV、PLGA-NH2-IKVAV-oHA、實心PLGA-IKVAV微球的外部及內部形態。
第1與2圖顯示本發明中空微米粒子之製造方法。應注意的是，為了清楚描述本發明之特徵，第1與2圖僅為本發明實施例之簡單圖示，在實際應用時，此技藝人士可依不同的需求增加或修改第1與2圖之步驟。
在本發明第一範疇中，本發明係提供一種一種中空微球的製造方法，包括：a)提供一中空微球；b)將該中空微球浸泡在一胺類溶液中，使該中空微球的表面產生胺基；c)加入一多胜肽，使該多胜肽接枝至該中空微球表面的胺基；以及d)加入一標靶分子，使該標靶分子連接至該中空微球表面未鍵結的胺基。
參照第1圖，步驟S101，提供一中空微球。此中空微球係為一種微粒，顆粒的材料、形狀和尺寸並無特別限制。中空微球(第2a圖)的材料應具有生物可分解性，且中空微球可用於培養細胞以及作為細胞的載體。
本發明中空中空微球的材質包括，但不限於，生物穩定性聚合物、生物可降解聚合物、富勒烯、脂質或它們的組合。生物穩定係指在生物體內不會降解的聚合物。生物可分解係指可使用於人體的某部位中，如暴露於體液(如血液)，可逐漸地被人體所吸收及/或消除。
中空微球的材質為生物可分解聚合物。生物可分解聚合物包括脂肪族聚脂類、脂肪族共聚脂類、或脂肪族及 芳香族共聚脂類的物質。生物可分解聚合物較佳為聚乳酸(PLA)、聚(丁二酸丁二醇酯)(PBS)、聚(丁二酸丁二醇酯-共-己二酸丁二醇酯)(PBSA)、聚(己二酸丁二醇酯-共-對苯二甲酸酯)(PBAT)、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己內酯(PCL)、及聚乙烯醇(PVOH)或上述組合。
在一特定實施例中，以二次乳化法製備PLGA中空微球。將PLGA溶於二氯甲烷中進行乳化(第一次乳化)，獲得PLGA乳化物。配製0.5體積%以上的PVA水溶液，較佳為0.5至1體積%。將PVA水溶液冷卻至10-15℃，較佳為10℃，並以1000rpm以下的轉速攪拌PVA水溶液，轉速較佳為500rpm至1000rpm。在本發明中，PVA水溶液較佳為0.5至1體積%，以降低中空微球表面的孔洞尺寸。另外，將PVA水溶液控制在略低溫狀態(約10-20℃)同樣可降低中空微球表面的孔洞尺寸。攪拌轉速較佳為約500rpm。在此轉速下可獲得直徑為約120μm的中空微球。若轉速過高會使中空微球的粒徑太小。
將PLGA乳化物以滴管緩慢滴入攪拌中的1體積% PVA水溶液，進行第二次乳化，以水滴形式進行第二次乳化較容易形成球狀物，並持續以500rpm轉速攪拌，使二氯甲烷揮發。
接著，去除水溶液，以二次水清洗3次。以冷凍乾燥機，凍乾3天獲得PLGA微球，以篩網篩PLGA微球，篩出直徑約100-200μm之PLGA微球。
參照步驟S103，將中空微球浸泡在一胺類溶液中，使中空微球的表面產生胺基(第2b圖)。本發明中所使用的胺類溶液包括己二胺、Glycine水溶液、adipic dihydrazide(ADH)水溶液、PEG胺化水溶液、NH2-PEG-NHS或NH2-PEG-NH2的DMSO溶液溶液。本技術領域人士自可依據所使用的胺類溶液選擇適當的浸泡的時間及條件。
在一特定實施例中，將步驟S101的PLGA微球浸泡於10%之1,6-己二胺的異丙醇溶液中，反應3小時後，離心以獲得微球。以二次水清洗微球3次進行真空乾燥。PLGA微球表面上形成胺基(NH2)，為PLGA-NH2微球。
參照步驟S105，加入一多胜肽，使多胜肽接枝至中空微球表面的胺基(第2c圖)。在添加多胜肽前，可將多胜肽置於一緩衝液中，以活化多胜肽上的羧基。本發明中所述之緩衝液包括，但不限於MES、EDC水溶液或NHS水溶液緩衝液。接著加入中空微球，多胜肽上活化的羧基會與胺基反應而鍵結。緩衝液的pH值可介於2-10之間，較佳為3-9之間，更佳為4-8之間。本技術領域人士自可依據所使用的緩衝液來調整pH值，以活化胺基。多胜肽在反應溶液中的濃度為約0.01wt%至50wt%，較佳為1wt%至40wt%，更為10wt%至30wt%。
本發明之“多胜肽”係指2或以上胺基酸以胜肽鍵結合在一起的胜肽或蛋白質。多胜肽可為一種短鏈胜肽、寡胜肽或寡聚物。本發明多胜肽的長度一般介於2至20個胺基酸，較佳2至10個胺基酸。本發明多胜肽可包括，但不限於2、3、4、5、6、7、8或9個胺基酸。在一實施例中，多胜肽包括IKVAV、RGD、YIGSR、REDV、DGEA、VGVAPG、GRGDS、LDV、RGDV、PDSGR、RYWLPR、LGTIPG、LAG、RGDS、RGDF、HHLGGALQAGDV、VTCG、SDGD、GREDVY、GRGDY、GRGDSP、VAPG、GGGGRGDSP、GGGGRGDY、FTLCFD、Poly-Lysine或MAX-1，較佳為IKVAV。
在一特定實施例中，配製MES緩衝液(pH 5.5)，加入N，N-二甲基氨基丙基碳二亞胺(EDC)與羥基琥珀酰亞胺(NHS)(比例為1：1)，接著加入步驟S103的PLGA-NH2微球，進行反應以活化胺基。
加入IKVAV，使IKVAV：EDC：NHS的比例可為約5：5：1，反應後，形成PLGA-NH2-IKVAV微球。
參照步驟S107，加入一標靶分子，使標靶分子連接至中空微球表面未與多胜肽結合的胺基(第2d圖)。
標靶分子係指任何專一性結合至特定目標物的物質(例如，胜肽、蛋白質、核酸聚合物、適體或小分子化合物)。目標物可為一組織、細胞、細胞結構(例如，胞器)、蛋白質、胜肽、多醣類、或核酸聚合物。本發明所述之適體係指隨機地擇自於一依據與目標分子親合力所獲得的DNA或RNA分子(參照Cox and Ellington,Bioorg.Med.Chem.9：2525-2531(2001)；Lee et al,Nuc.Acids Res.32：D95-D100(2004))。適體可為核酸、蛋白質、小分子有機化合物、微生素、無機化合物、細胞及所有有機體。
標靶分子可為一透明質酸，使中空微球可專一性地與肝細胞結合。標靶分子可自行與胺基反應。例如，以氧化透明質酸(oHA)作為標靶分子，而氧化透明質酸的醛基會與中空微球上的胺基反應，藉由亞胺鍵的生成而接枝。
在一特定實施例中，將氧化透明質酸(oHA)溶於水中，並緩慢地加入酒精。接著，加入步驟S105的PLGA-NH2-IKVAV微球後，進行震盪，以形成本發明中空微球。以二次水清洗微球2次，再分別以酒精浸泡10分鐘後進行真空乾燥。
在反應中，氧化透明質酸的醛基會與步驟S105之PLGA-NH2-IKVAV微球上的胺基反應，藉由亞胺鍵的生成而接枝形成本發明之中空微球(PLGA-NH2-IKVAV-oHA)。
本發明之中空微球具有一3D中空結構，可用於培養及/或傳送細胞。由於3D細胞培養模式可模擬體內的3D結構微環境，以及提供更多的培養空間，因此可降低培養成本並增加細胞產量。
中空微球的多胜肽可被特定細胞所辨識，以提升細胞的貼附力，進而增加每單位中空微球所能攜帶的細胞量。所以相對於傳統或市售的細胞載體，本發明中空微球所 能攜帶的細胞量更多。
另一方面，在中空微球上更具有一標靶分子，可專一性地結合至所欲的目標上，例如，特定組織、器官、部位或細胞。在一實施例中，標靶分子為一透明質酸，使中空微球可專一性地與肝細胞結合。
綜上所述，本發明之中空微球利用中空結構與多胜肽增加細胞負載量，並利用標靶分子使中空微球專一性地結合至目標位置，將細胞移植至目標位置。藉由中空結構、多胜肽與標靶分子，可顯著地提升細胞移植的效力。
【實施例】
1.中空微球的製備
PLGA微球的製備
以二次乳化法製備PLGA微球。取0.9g PLGA溶於40ml二氯甲烷(2.25%)中，再加入20ml二次水後均勻震盪進行第一次乳化。取2.5g的PVA與250ml的二次水配製1% PVA水溶液，冷卻至10℃後，以500rpm攪拌1% PVA水溶液。將上述第一次乳化產物以滴管緩慢滴入攪拌中的1% PVA水溶液，以500rpm攪拌2小時使二氯甲烷揮發後停止。去除水溶液，以二次水清洗3次。以冷凍乾燥機，凍乾3天獲得PLGA微球，以篩網篩PLGA微球，篩出直徑約100-200μm之PLGA微球。參照第3a圖，以掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察PLGA微球外部及內部形態，內部呈中空多孔狀。
PLGA微球的胺基改質
將PLGA微球浸泡於10%的1,6-己二胺的異丙醇溶液中，反應3小時後，離心以獲得微球。以二次水清洗微球3次進行真空乾燥。在PLGA微球表面上形成胺基(NH2)，為PLGA-NH2微球。參照第3b圖，PLGA-NH2微球表面呈現粗糙狀。
PLGA-IKVAV接枝
配製0.1M的MES緩衝液(pH 5.5)，加入N，N-二甲基氨基丙基碳二亞胺(EDC)與羥基琥珀酰亞胺(NHS)(比例為1：1)，接著加入IKVAV胜肽，反應2小時活化羧基。加入PLHA-NH2微球，使IKVAV：EDC：NHS的比例為5：5：1，反應溶液中IKVAV重量百分濃度約14%，反應24小時後，形成PLGA-NH2-IKVAV微球。參照第3c圖，IKVAV覆蓋於PLGA-NH2微球上，表面呈現較為平滑狀態。
PLGA-oHA接枝
最後，將150mg氧化透明質酸(oHA)溶於8ml二次水，並緩慢地加入32ml的99.5%酒精。加入150mg的PLGA-NH2-IKVAV微球後，於pH11下，以150rpm震盪24小時。以二次水清洗微球2次，再分別以30%、95%酒精浸泡10分鐘後進行真空乾燥。氧化透明質酸的醛基與PLGA-NH2-IKVAV微球上胺基反應，藉由亞胺鍵的生成而接枝形成本發明之中空微球(PLGA-NH2-IKVAV-oHA)，如第3d圖所示。
2.比較例1
PLGA微球的製備
PVA水溶液的濃度為0.5%，均質機的轉速提升至1000rpm，且非以水滴形式進行二次乳化。結果如表一所示。
3.比較例2
PLGA-oHA接枝
氧化透明質酸的使用量由150mg提升至300mg，PLGA-NH2-IKVAV微球的使用量由150mg提升至300mg，且反應時的轉速由150rpm調整至180rpm。結果如表二所示。
所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。
由上述可知，熟習此技藝者能輕易地了解本發明之必要特徵，在不脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變與調整以應用於不同用途與條件。

Claims (14)

  1. 一種製造中空微米粒子的方法，包括a)提供一中空微球；b)將該中空微球浸泡在一胺類溶液中，使該中空微球的表面產生胺基；c)加入一多胜肽，且該多胜肽接枝至該中空微球表面的胺基；以及d)加入一標靶分子，且該標靶分子連接至該中空微球表面未鍵結的胺基。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之中空微球，其中該生物分解材質包括聚乳酸、聚(丁二酸丁二醇酯)、聚(丁二酸丁二醇酯-共-己二酸丁二醇酯)、聚(己二酸丁二醇酯-共-對苯二甲酸酯)、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己內酯、聚乙烯醇或其混合物。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之中空微球，其中a)步驟包括：i)提供一生物分解材質乳化液；ii)提供一0.5體積%以上的PVA水溶液；iii)將該PVA水溶液冷卻後進行均質；iv)將該生物分解材質乳化液緩慢地滴入該PVA水溶液，以進行乳化；以及v)冷凍乾燥。
  4. 如申請範圍第1所述之中空微球的製造方法，其中該ii)步驟中的PVA水溶液濃度為1體積%。
  5. 如申請範圍第1所述之中空微球的製造方法，其中該ii)步驟中的PVA水溶液冷卻至10-15℃。
  6. 如申請範圍第1所述之中空微球的製造方法，其中該ii)步驟中的PVA水溶液以1000rpm以下的轉速進行均質化。
  7. 如申請範圍第1所述之中空微球的製造方法，其中該胺類溶液包括含有己二胺、Glycine水溶液、adipic dihydrazide(ADH)水溶液、PEG胺化水溶液、NH2-PEG-NHS或NH2-PEG-NH2的DMSO溶液。
  8. 如申請範圍第1所述之中空微球的製造方法，在該(c)步驟前，將多胜肽與一緩衝液反應以活化羧基。
  9. 如申請範圍第8所述之中空微球的製造方法，其中該緩衝液包括MES緩衝液、EDC水溶液或NHS水溶液。
  10. 如申請範圍第8所述之中空微球的製造方法，其中該緩衝液的pH值介於約5-6。
  11. 如申請範圍第1所述之中空微球的製造方法，其中該多胜肽包括IKVAV、RGD、YIGSR、REDV、DGEA、VGVAPG、GRGDS、LDV、RGDV、PDSGR、RYWLPR、LGTIPG、LAG、RGDS、RGDF、HHLGGALQAGDV、VTCG、SDGD、GREDVY、GRGDY、GRGDSP、VAPG、GGGGRGDSP、GGGGRGDY、FTLCFD、Poly-Lysine或MAX-1。
  12. 如申請範圍第1所述之中空微球的製造方法，其中該標靶分子包括透明質酸、氧化透明質酸、Colleagen、Glucocorticoid、Galectin或osteopontin。
  13. 如申請範圍第1所述之中空微球的製造方法，其中該d)步驟中，標靶分子的濃度為0.38%至0.25%。
  14. 如申請範圍第1所述之中空微球的製造方法，其中該d)步驟中，標靶分子與中空微球重量比為1：1.5至1：1。
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