CN104874026B - 一种制备中空微米粒子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备中空微米粒子的方法，包括：(a)提供中空微球；(b)将所述中空微球浸泡在胺类溶液中，使中空微球的表面产生氨基；(c)加入多肽，且多肽接枝至所述中空微球表面的氨基；以及(d)加入标靶分子，且标靶分子连接至所述中空微球表面未键结的氨基。

Description

一种制备中空微米粒子的方法
技术领域
本发明涉及一种中空微球，且特别有关于中空微球的制备方法。
背景技术
目前，已有针对人工组织移植及再生医学进行各种基础研究和技术开发，例如，干细胞增生与分化的研究、细胞可接受且生物可降解支架的开发、以及各种组织工程工具的建立。以上皆为现今再生医学重要的课题，其中以开发可传送干细胞或组织细胞的支架最为重要。
组织再生的支架材料为一平台，其可吸附细胞以形成组织。支架材料可作为移植细胞与宿主细胞间的暂时性屏障，其无毒且具生物兼容性。此外，当所欲移植的细胞已在特定位置上充足地生长时，支架材料可在个体内降解。
一般来说，支架可由合成、天然聚合物或其复合材料制备。支架可制造成有各种形态和功能的结构。最常使用的生物可降解聚合物包括，乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)及其衍生物与聚合物。天然的生物可降解材料包括胶原蛋白、藻酸盐、透明质酸、明胶、脱乙酰壳多醣与纤维素等。在支架的制造中，可添加各种不同形式的材料，如海绵、凝胶、纤维素或微珠等。
Wang,M.,et al揭露以PLGA支架培养ADSC，并辅以诱导分化的培养 基促使干细胞分化。ADSC于PLGA支架上培养，一般的培养基无法促使大量增生。显示PLGA载体不利于ADSC贴附生长的缺点。
Kim SE,et al揭露以PLGA多孔性微球培养ADSC，并辅以改质肝素-多巴胺(Hep)及乳铁蛋白(LF)促使细胞生长及分化。定量数据显示，虽微球经修饰改质，但细胞于微球上之增生数量并不明显。
由上述可知，目前在组织工程技术中仍有许多困难需要克服。例如，细胞培养的空间过小、产量过低、所能携带的细胞量过少、移植成功的机会过低等。因此，业界急需一种新颖的生医材料载体及其制法。
发明内容
有鉴于上述先前技术所存在的问题，本发明提供一种制备中空微球的方法。本发明的中空微球为中空多孔状，可大量培养细胞，并透过多肽与标靶分子，以提升载体功能。
本发明提供一种制造中空微米粒子的方法，包括(a)提供中空微球；(b)将所述中空微球浸泡在胺类溶液中，使中空微球的表面产生氨基；(c)加入多肽，使多肽接枝至所述中空微球表面的氨基；以及(d)加入标靶分子，使标靶分子连接至中空微球表面的氨基。
在本发明实施例中，中空微球材质包括聚乳酸、聚(丁二酸丁二醇酯)、聚(丁二酸丁二醇酯-共-己二酸丁二醇酯)、聚(己二酸丁二醇酯-共-对苯二甲酸酯)、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯、聚乙烯醇或其混合物。
在本发明实施例中，其中a)步骤包括：i)提供生物分解材质乳化液； ii)提供0.5％(V/V)以上的PVA水溶液；iii)将所述PVA水溶液冷却后进行均质；iv)将所述生物分解材质乳化液缓慢地滴入所述PVA水溶液，进行乳化；以及v)冷冻干燥。
在本发明实施例中，所述ii)步骤中的PVA水溶液浓度为1％(V/V)。
在本发明实施例中，所述ⅲ)步骤中的PVA水溶液冷却至10-15℃。
在本发明实施例中，所述ⅲ)步骤中的PVA水溶液以1000rpm以下的转速进行均质化。
在本发明实施例中，a)步骤中所述胺类溶液包括含有己二胺、甘氨酸(Glycine)水溶液、己二酸二酰肼(adipic dihydrazide(ADH))水溶液、聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)胺化水溶液、双氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NHS)或双氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)的DMSO溶液。
在本发明实施例中，在(c)步骤前，将多肽与缓冲液反应以活化羧基。
在本发明实施例中，所述缓冲液包括2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(2-(N-morpholino)ethanesulphonic acid,MES)缓冲液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC)水溶液或N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)水溶液。
在本发明实施例中，所述多肽包括IKVAV、RGD、YIGSR、REDV、DGEA、VGVAPG、GRGDS、LDV、RGDV、PDSGR、RYWLPR、LGTIPG、 LAG、RGDS、RGDF、HHLGGALQAGDV、VTCG、SDGD、GREDVY、GRGDY、GRGDSP、VAPG、GGGGRGDSP、GGGGRGDY、FTLCFD、Poly-Lysine或MAX-1。
在本发明实施例中，所述标靶分子包括透明质酸、氧化透明质酸、胶原蛋白(Colleagen)、糖皮质激素(Glucocorticoid)、半乳糖凝集素(Galectin)或骨桥蛋白(osteopontin)。
在本发明实施例中，所述d)步骤中，标靶分子为100至150mg。
在本发明实施例中，d)步骤中，所述标靶分子与中空微球重量比为1:1.5至1:1。
附图说明
图1为本发明中空微米粒子的制备方法流程图。
图2为制备本发明中空微米粒子的示意图。
图3a-3e为本发明PLGA微球、PLGA-NH2微球、PLGA-NH2-IKVAV、PLGA-NH2-IKVAV-oHA、实心PLGA-IKVAV微球的外部及内部形态。
具体实施方式
图1、2显示本发明中空微米粒子的制造方法。应注意的是，为了清楚描述本发明的特征，图1与图2仅为本发明实施例的简单图示，在实际应用时，此技艺人士可依不同的需求增加或修改图1、2的步骤。
在本发明第范畴中，本发明提供一种中空微球的制造方法，包括：
a)提供中空微球；
b)将所述中空微球浸泡在胺类溶液中，使所述中空微球的表面产生氨基；
c)加入多肽，使所述多肽接枝至所述中空微球表面的氨基，以及
d)加入靶标分子，使所述靶标分子连接至所述中空微球表面未键合的氨基。
参照图1，步骤S101，提供中空微球。此中空微球为一种微粒，颗粒的材料、形状和尺寸并无特别限制。中空微球(如图a所示)的材料应具有生物可分解性，且中空微球可用于培养细胞以及作为细胞的载体。
本发明中空中空微球的材质包括，但不限于，生物稳定性聚合物、生物可降解聚合物、富勒烯、脂质或它们的组合。生物稳定系指在生物体内不会降解的聚合物。生物可分解系指可使用于人体的某部位中，如暴露于体液(如血液)，可逐渐地被人体所吸收及/或消除。
中空微球的材质为生物可分解聚合物。生物可分解聚合物包括脂肪族聚脂类、脂肪族共聚脂类、或脂肪族及芳香族共聚脂类的物质。生物可分解聚合物较佳为聚乳酸(PLA)、聚(丁二酸丁二醇酯)(PBS)、聚(丁二酸丁二醇酯-共-己二酸丁二醇酯)(PBSA)、聚(己二酸丁二醇酯-共-对苯二甲酸酯)(PBAT)、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、及聚乙烯醇(PVOH)或上述组合。
在特定实施例中，以二次乳化法制备PLGA中空微球。将PLGA溶于二氯甲烷中进行乳化(第一次乳化)，获得PLGA乳化物。配制0.5体积％ 以上的PVA水溶液，较佳为0.5至1％(V/V)。将PVA水溶液冷却至10-15℃，较佳为10℃，并以1000rpm以下的转速搅拌PVA水溶液，转速较佳为500rpm至1000rpm。在本发明中，PVA水溶液较佳为0.5至1％(V/V)，以降低中空微球表面的孔洞尺寸。另外，将PVA水溶液控制在略低温状态(约10-20℃)同样可降低中空微球表面的孔洞尺寸。搅拌转速较佳为约500rpm。在此转速下可获得直径为约120μm的中空微球。若转速过高会使中空微球的粒径太小。
将PLGA乳化物以滴管缓慢滴入搅拌中的1％(V/V)PVA水溶液，进行第二次乳化，以水滴形式进行第二次乳化较容易形成球状物，并持续以500rpm转速搅拌，使二氯甲烷挥发。
接着，去除水溶液，以二次水清洗3次。以冷冻干燥机，冻干3天获得PLGA微球，以筛网筛PLGA微球，筛出直径约100-200μm之PLGA微球。
参照步骤S103，将中空微球浸泡在胺类溶液中，使中空微球的表面产生氨基(如图2b)。本发明中所使用的胺类溶液包括己二胺、Glycine水溶液、adipic dihydrazide(ADH)水溶液、PEG胺化水溶液、NH2-PEG-NHS或NH2-PEG-NH2的DMSO溶液溶液。本技术领域人士自可依据所使用的胺类溶液选择适当的浸泡的时间及条件。
在特定实施例中，将步骤S101的PLGA微球浸泡于10％之1,6-己二胺的异丙醇溶液中，反应3小时后，离心以获得微球。以二次水清洗微球3次进行真空干燥。PLGA微球表面上形成氨基(NH2)，为PLGA-NH2微球。
参照步骤S105，加入多肽，使多肽接枝至中空微球表面的氨基(如图2c)。在添加多肽前，可将多肽置于缓冲液中，以活化多肽上的羧基。本发明中所述的缓冲液包括，但不限于MES、EDC水溶液或NHS水溶液缓冲液。接着加入中空微球，多肽上活化的羧基会与氨基反应而键结。缓冲液的pH值可介于2-10之间，较佳为3-9之间，更佳为4-8之间。本技术领域人士自可依据所使用的缓冲液来调整pH值，以活化氨基。多肽在反应溶液中的浓度为约0.01wt％至50wt％，较佳为1wt％至40wt％，更为10wt％至30wt％。
本发明的“多肽”系指2或以上氨基酸以肽键结合在一起的多肽或蛋白质。多肽可为一种短链肽、寡胜肽或寡聚物。本发明多肽的长度一般介于2至20个氨基酸，较佳2至10个氨基酸。本发明多肽可包括，但不限于2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在实施例中，多肽包括IKVAV、RGD、YIGSR、REDV、DGEA、VGVAPG、GRGDS、LDV、RGDV、PDSGR、RYWLPR、LGTIPG、LAG、RGDS、RGDF、HHLGGALQAGDV、VTCG、SDGD、GREDVY、GRGDY、GRGDSP、VAPG、GGGGRGDSP、GGGGRGDY、FTLCFD、Poly-Lysine或MAX-1，较佳为IKVAV。
在特定实施例中，配制MES缓冲液(pH 5.5)，加入N，N-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)与羟基琥珀酰亚胺(NHS)(比例为1：1)，接着加入步骤S103的PLGA-NH2微球，进行反应以活化氨基。
加入IKVAV，使IKVAV：EDC：NHS的比例可为约5：5：1，反应 后，形成PLGA-NH2-IKVAV微球。
参照步骤S107，加入标靶分子，使标靶分子连接至中空微球表面未与多肽结合的氨基(如图2d)。
标靶分子是指任何专一性结合至特定目标物的物质(例如，肽、蛋白质、核酸聚合物、适体或小分子化合物)。目标物可为组织、细胞、细胞结构(例如胞器)、蛋白质、胜肽、多醣类、或核酸聚合物。本发明所述的适体是指随机地择自于依据与目标分子亲合力所获得的DNA或RNA分子(参照Cox and Ellington,Bioorg.Med.Chem.9:2525-2531(2001)；Lee etal,Nuc.Acids Res.32:D95-D100(2004))。适体可为核酸、蛋白质、小分子有机化合物、微生素、无机化合物、细胞及所有有机体。
标靶分子可为透明质酸，使中空微球可专一性地与肝细胞结合。标靶分子可自行与氨基反应。例如，以氧化透明质酸(oHA)作为标靶分子，而氧化透明质酸的醛基会与中空微球上的氨基反应，藉由亚胺键的生成而接枝。
在特定实施例中，将氧化透明质酸(oHA)溶于水中，并缓慢地加入酒精。接着，加入步骤S105的PLGA-NH2-IKVAV微球后，进行震荡，以形成本发明中空微球。以二次水清洗微球2次，再分别以酒精浸泡10分钟后进行真空干燥。
在反应中，氧化透明质酸的醛基会与步骤S105的PLGA-NH2-IKVAV微球上的氨基反应，藉由亚胺键的生成而接枝形成本发明的中空微球(PLGA-NH2-IKVAV-oHA)。
本发明的中空微球具有3D(三维)中空结构，可用于培养及/或传送细胞。由于3D细胞培养模式可仿真体内的3D结构微环境，以及提供更多的培养空间，因此可降低培养成本并增加细胞产量。
中空微球的多肽可被特定细胞所辨识，以提升细胞的贴附力，进而增加每单位中空微球所能携带的细胞量。所以相对于传统或市售的细胞载体，本发明中空微球所能携带的细胞量更多。
另一方面，在中空微球上更具有标靶分子，可专一性地结合至所欲的目标上，例如，特定组织、器官、部位或细胞。在实施例中，标靶分子为透明质酸，使中空微球可专一性地与肝细胞结合。
综上所述，本发明的中空微球利用中空结构与多肽增加细胞负载量，并利用标靶分子使中空微球专一性地结合至目标位置，将细胞移植至目标位置。藉由中空结构、多肽与标靶分子，可显著地提升细胞移植的效力。
实施例
1.中空微球的制备
1-1、PLGA微球的制备
以二次乳化法制备PLGA微球。取0.9g PLGA溶于40ml二氯甲烷(2.25％)中，再加入20ml二次水后均匀震荡进行第一次乳化。取2.5g的PVA与250ml的二次水配制1％PVA水溶液，冷却至10℃后，以500rpm搅拌1％PVA水溶液。将上述第一次乳化产物以滴管缓慢滴入搅拌中的1％PVA水溶液，以500rpm搅拌2小时使二氯甲烷挥发后停止。去除水 溶液，以二次水清洗3次。以冷冻干燥机，冻干3天获得PLGA微球，以筛网筛PLGA微球，筛出直径约100-200μm之PLGA微球。参照第3a图，以扫描式电子显微镜(SEM)观察PLGA微球外部及内部形态，内部呈中空多孔状。
1-2、PLGA微球的氨基改质
将PLGA微球浸泡于10％的1,6-己二胺的异丙醇溶液中，反应3小时后，离心以获得微球。以二次水清洗微球3次进行真空干燥。在PLGA微球表面上形成氨基(NH2)，为PLGA-NH2微球。参照第3b图，PLGA-NH2微球表面呈现粗糙状。
1-3、PLGA-IKVAV接枝
配制0.1M的MES缓冲液(pH 5.5)，加入N，N-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)与羟基琥珀酰亚胺(NHS)(比例为1：1)，接着加入IKVAV胜肽，反应2小时活化羧基。加入PLHA-NH2微球，使IKVAV：EDC：NHS的比例为5：5：1，反应溶液中IKVAV重量百分浓度约14％，反应24小时后，形成PLGA-NH2-IKVAV微球。参照第3c图，IKVAV覆盖于PLGA-NH2微球上，表面呈现较为平滑状态。
1-4、PLGA-oHA接枝
最后，将150mg氧化透明质酸(oHA)溶于8ml二次水，并缓慢地加入32ml的99.5％酒精。加入150mg的PLGA-NH2-IKVAV微球后，于pH11下，以150rpm震荡24小时。以二次水清洗微球2次，再分别以30％、95％酒精浸泡10分钟后进行真空干燥。氧化透明质酸的醛基与PLGA-NH2-IKVAV微球上氨基反应，藉由亚胺键的生成而接枝形成本发明之中空微球(PLGA-NH2-IKVAV-oHA)，如第3d图所示。
2.比较例1
2-1、PLGA微球的制备
PVA水溶液的浓度为0.5％，均质机的转速提升至1000rpm，且非以水滴形式进行二次乳化。结果如表1所示。
表1、实施例1与比较例1的比较
3.比较例2
3-1、PLGA-oHA接枝
氧化透明质酸的使用量由150mg提升至300mg，PLGA-NH2-IKVAV微球的使用量由150mg提升至300mg，且反应时的转速由150rpm调整至180rpm。结果如表2所示。
表2、实施例1与比较例2的比较
方法 结果
实施例1 150mg的透明质酸 不易发生微球交联
比较例1 300mg的透明质酸 容易发生微球交联
实施例1 150mg的微球 不易发生微球交联
比较例1 300mg的微球 容易发生微球交联
实施例1 150rpm的震荡转速 不易发生微球交联
比较例1 180rpm的震荡转速 容易发生微球交联
所有说明书中所揭示的发明技术特点可以任意方式组合。说明书中揭示的每一技术特点可以提供相同、等同或相似目的的其他方式替换。因此，除非另有特别说明，文中所有揭示的特点均只是等同或相似特点的一般系列的实例。
由上述可知，熟习此技艺者能轻易地了解本发明的必要特征，在不脱离其精神与范围之下能就本发明做许多改变与调整以应用于不同用途与条件。

Claims (12)

1.一种制备中空微米粒子的方法，其特征是，包括
a)提供中空微球；
b)将所述中空微球浸泡在胺类溶液中，使所述中空微球的表面产生氨基；
c)加入多肽，且所述多肽接枝到所述中空微球表面的氨基上；以及
d)加入靶标分子，且所述靶标分子连接至所述中空微球表面未键合的氨基上；
所述a)步骤包括：
ⅰ)提供一生物分解材质乳化液；
ⅱ)提供0.5％(V/V)以上的PVA水溶液；
ⅲ)将所述PVA水溶液冷却后进行均质；
ⅳ)将所述生物分解材质乳化液缓慢地滴入所述PVA水溶液，以进行乳化；以及
ⅴ)冷冻干燥；
所述ⅲ)步骤中的PVA水溶液以1000rpm以下的转速进行均质化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述中空微球材质包括聚乳酸、聚(丁二酸丁二醇酯)、聚(丁二酸丁二醇酯-共-己二酸丁二醇酯)、聚(己二酸丁二醇酯-共-对苯二甲酸酯)、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯或其混合物。
3.如权利要求1所述的制备中空微球粒子方法，其特征是，ii)步骤中的PVA水溶液浓度为1％(V/V)。
4.如权利要求1所述的制备中空微球粒子方法，其特征是，ⅲ)步骤中的PVA水溶液冷却至10-15℃。
5.如权利要求1所述的制备中空微球粒子方法，其特征是，b)步骤中所述胺类溶液包括含有己二胺、Glycine水溶液、adipic dihydrazide(ADH)水溶液、PEG胺化水溶液、NH2-PEG-NHS或NH2-PEG-NH2的DMSO溶液。
6.如权利要求1所述的制备中空微球粒子方法，其特征是，还包括在c)步骤前，将多肽与缓冲液反应以活化羧基。
7.如权利要求6所述的制备中空微球粒子方法，其特征是，所述缓冲液包括MES缓冲液、EDC水溶液或NHS水溶液。
8.如权利要求6所述的制备中空微球粒子方法，其特征是，所述缓冲液的pH值介于5-6。
9.如权利要求1所述的制备中空微球粒子方法，其特征是，c)步骤中所述多肽包括IKVAV、RGD、YIGSR、REDV、DGEA、VGVAPG、GRGDS、LDV、RGDV、PDSGR、RYWLPR、LGTIPG、LAG、RGDS、RGDF、HHLGGALQAGDV、VTCG、SDGD、GREDVY、GRGDY、GRGDSP、VAPG、GGGGRGDSP、GGGGRGDY、FTLCFD、Poly-Lysine或MAX-1。
10.如权利要求1所述的制备中空微球粒子方法，其特征是，d)步骤中所述标靶分子包括透明质酸、氧化透明质酸、Colleagen、Glucocorticoid、Galectin或osteopontin。
11.如权利要求1所述的制备中空微球粒子方法，其特征是，d)步骤中所述标靶分子的浓度为0.38wt％至0.25wt％。
12.如权利要求1所述的制备中空微球粒子方法，其特征是，d)步骤中所述标靶分子与中空微球重量比为1:1.5至1:1。
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