CN107660220A - 超支化聚合物和多聚复合物及包含其的dna或rna递送系统 - Google Patents

超支化聚合物和多聚复合物及包含其的dna或rna递送系统 Download PDF

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Abstract

超支化聚合物包括超支化疏水性分子核心，连接到超支化疏水性分子核心的至少三个分支的各个低分子量聚乙烯亚胺链，和连接到超支化疏水性分子核心的至少两个其它分支的各个聚乙二醇链。超支化聚合物的实例可用于形成超支化多聚复合物，并且可包含在DNA或RNA递送系统内。

Description

超支化聚合物和多聚复合物及包含其的DNA或RNA递送系统
与相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年4月2日提交的美国临时申请序列号62/142,433的权益，其通过引用以其整体结合到本文中。
关于联邦赞助的研究或开发的声明
本发明在政府支持下在美国国立卫生研究院(NIH)和国家口腔和颅面研究所(NIDCR)授予的资助号DE015384、DE017689和DE022327下和在国家科学基金(NSF)授予的资助号DMR-1206575下做出。政府在本发明中具有一定的权利。
发明背景
已发现一些DNA和RNA (例如，微小RNA或miRNA、信使RNA或mRNA以及小干扰RNA或siRNA)在一些人类疾病例如癌症、糖尿病、心脏病和纤维化椎间盘变性(fibrotic discdegeneration)(其中TGF-β信号传导途径起核心作用)中具有令人惊讶的作用。然而，体内DNA或RNA的递送可能具有挑战，这是由于DNA或RNA或者用于DNA或RNA的载体系统的特性。
例如，由于相似电荷的库伦斥力，miRNA和其模拟物或抑制剂(均为带负电荷的)不能轻易跨过细胞膜(也带负电荷)进入细胞和完成靶基因调控。miRNA还在体内迅速降解。虽然病毒载体可有效地递送miRNA至细胞内，但可能存在对病毒因子不良的免疫应答。一些非病毒载体形成脂质体囊泡，其由脂质双层组成以将RNA包封在内部(称为脂多聚复合物(lipoplex))，在体外有效地将RNA转运至细胞内。然而，脂多聚复合物在体内的转染效率低。化学修饰可改善miRNA模拟物或其抑制性反义寡核糖核苷酸(miRNA抑制剂)的稳定性和转染效率。然而，每一miRNA或其抑制剂需要特异性地修饰以形成所谓的“agomir(miRNA激动剂)”或“antagomir(miRNA拮抗剂)”，导致低可用性和高成本。也已经研究聚合物载体用于DNA和siRNA的载体。例如，聚乙烯亚胺(PEI)和其线性共聚物可用于介导miR-145和/或miR-33a的递送。然而，已发现具有高分子量(例如, 25000 g/mol)的PEI对细胞有毒，即便其对转染有效，并且具有低分子量的PEI毒性低，但转染效率也低。如本文所使用的，“低分子量”意指2000 g/mol或更低。低分子PEI的一些具体实例包括1000 g/mol或800 g/mol。
再例如，可给予孤儿核受体4A1 (NR4A1，也称为NUR77)以治疗各种疾病，包括纤维化。然而，口服给予NR4A1可导致抑制正常细胞(以及受纤维化影响的细胞)中的TGF-β信号传导，这可导致非特异性的毒性(即，对非预期细胞的副作用)。
附图简述
本公开内容的实例的特征将通过参考下列详细描述和附图变得明显，其中相似的参考数字对应于相似的，尽管可能不同一的，组分。为了简洁起见，具有先前描述的功能的参考数字或特征可能或可能不关于所述参考数字或特征出现的其它附图而描述。
图1为线性聚合物和超支化聚合物的实例、DNA或RNA与线性聚合物和超支化聚合物的相互作用以形成复合体，和复合体自组装以形成各自的多聚复合物的图解说明；
图2说明合成本文所公开的线性聚合物的实例(PEG-PE-PEI)的一个实例；
图3A-3C一起说明合成本文所公开的超支化聚合物的实例(PEG-H20-PEI)的一个实例；
图4说明合成PEI-炔的一个实例;
图5为从固定化在纳米纤维支架上的多聚复合物-包埋的聚(丙交酯共乙交酯) (PLGA)微球的两阶段递送miRNA的图解说明；
图6为描绘对于高分子量聚乙烯亚胺(PEI)、低分子量PEI和本文所公开的线性和超支化聚合物的几个实例的细胞活力(%)的图；
图7A和7B分别为由线性聚合物和miRNA的自组装复合体形成的多聚复合物和由超支化聚合物和miRNA的自组装复合体形成的多聚复合物的透射电镜(TEM)图像；
图8为由超支化聚合物(PEG-H40-PEI)与钨(W)-掺入的miRNA形成的多聚复合物的实例的TEM图像，其中显示多聚复合物层/截面的厚度；
图9为线性聚合物多聚复合物(左侧三个图像)和超支化聚合物多聚复合物(右侧三个图像)的几个实例的UV可见(254 nm) RNA条带的照片，其在包含GelRed的0.7%琼脂糖凝胶上用Tris-乙酸盐(TAE)运行缓冲液(pH 8)在80 V下电泳45分钟；
图10A和10B为超声之前(10A)和超声之后(10B)通过动态光散射(DLS)测定的lipofectamine/miRNA脂多聚复合物的尺寸分布概况；
图10C和10D为超声之前(10C)和超声之后(10D)的lipofectamine/miRNA脂多聚复合物的形态学图像，如通过TEM表征的(比例尺，200 nm)；
图11A和11B为超声之前(11A)和超声之后(11B)通过动态光散射(DLS)测定的HP3/miRNA多聚复合物的尺寸分布概况；
图11C和11D为超声之前(11C)和超声之后(11D)的HP3/miRNA多聚复合物的形态学图像，如通过TEM表征的(比例尺，100 nm)；
图12A和12B为描绘高分子量聚乙烯亚胺(PEI)、低分子量PEI和N/P比率10 (聚合物的N氮原子相对于RNA的P磷酸基)的线性聚合物/RNA多聚复合物和超支化聚合物/RNA多聚复合物的几个实例的颗粒尺寸(12A)和ζ电势(12B)的图，如通过DLS测量的；
图13为描绘用裸miRNA、lipofectamine/miRNA脂多聚复合物、argomir miRNA、线性聚合物/miRNA多聚复合物和超支化聚合物/miRNA多聚复合物，PLGA微球的RNA包封效率的图；
图14A-14D为附着具有HP3/miRNA多聚复合物包埋在其中的PLGA微球的实例的聚(L-乳酸) (PLLA)支架的扫描电镜(SEM)图像，黑色轮廓标识随后的图中示出的增强部分；
图15为描绘从PLIA支架和PLGA微球释放之前和之后HP3/miRNA多聚复合物的直径的图，* P<0.05和** P<0.01；
图16为描绘从包含LP3/miRNA多聚复合物或HP3/miRNA多聚复合物的PLGA 6.5k或64k微球的miRNA的释放概况的图；
图17A、17B和17C说明体外细胞和多聚复合物复合体以及细胞和脂多聚复合物复合体的黑白共焦激光扫描显微镜图像(17A)、定量荧光强度(17B)和miRNA表达水平(17C)；
图18A、18B和18C说明包含体外从PLGA微球释放的细胞和多聚复合物复合体以及细胞和脂多聚复合物复合体的释放介质的黑白共焦激光扫描显微镜图像(18A)、定量荧光强度(18B)和miRNA表达水平(18C)；
图19A、19B和19C说明在体内检验的细胞和多聚复合物复合体以及细胞和脂多聚复合物复合体的黑白共焦激光扫描显微镜图像(19A)、定量荧光强度(19B)和miRNA表达水平(19C)；
图20A-20C为具有直接附着的HP3/miR-26a或阴性对照多聚复合物的无细胞PLLA支架(20A)、具有附着的负载到PLGA 6.5k微球的HP3/miR-26a或阴性对照多聚复合物的无细胞PLLA支架(20B)和具有附着的负载到PLGA 64k微球的HP3/miR-26a或阴性对照多聚复合物的无细胞PLLA支架的黑白显微CT图像和H&E染色图像；
图20D和20E为分别描绘显示来自图20A-20C所使用的组的骨形成量和骨矿物质密度的定量分析的图，其中* P<0.05；** P<0.01；# P<0.05；## P<0.01 (对于图20A-20E，所有实验一式三份进行；每组n=5；数据为平均值±标准误差。比例尺5 mm (图20A-20C的显微CT图像中)、2.0 mm (图20A-20C右侧H&E图像中)以及200 μm (图20A-20C最右侧较高放大率的H&E图像中)；
图21为说明对于各个聚合物/pDNA N/P比率的线性聚合物(左)和超支化聚合物(右)的DNA多聚复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞测定的图；
图22为以黑白显示的模拟对照和用miR-140转染并接种到多孔NF PLLA支架上的细胞的染色图像，其中细胞/支架构建体用软骨形成培养基培养5周；
图23A-23D为描绘Foxp3 + T细胞百分比的图，如用流式细胞术分析的，说明miR-10a促进Tregs分化，分别在0μM (23A)、20μM (23B)、40μM (23C)和80μM (23D)时在CD4+ T细胞中从11.81 ± 0.19% (23A)至16.02 ± 0.01% (23B)、15.96 ± 0.21% (23C)和15.74 ±0.21% (23D)，其中P < 0.01；
图24为一起说明图23A-23D的结果的图；
图25A-25E为具有聚合物/NR4A1多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球(25A)、纳米纤维海绵微球(NF-SMS) (25B以1000x放大率和25C以5000x放大率)以及附着具有聚合物/NR4A1多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球的NF-SMS (25D以2000x放大率和25E以5000x放大率)的SEM图像；
图26A-26F说明用聚合物/NR4A1多聚复合物转染的髓核(NP)细胞在转染后48h (图26A-26C)、用超支化聚合物空白载体转染的NP细胞(图26D-26F)的黑白共焦激光扫描显微图像，其中NR4A1 (初始绿色)和核(初始蓝色)分别通过异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的抗体和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色；
图26G为描绘转染后NP细胞中NR4A1表达的实时PCR的图(误差线代表平均值的标准误差，*P < 0.05)；
图26H为描绘转染后NP细胞中NR4A1表达的蛋白质印迹测定的图；
图27为描绘健康NP组织和变性NP组织中NR4A1 mRNA表达的倍数变化的图；
图28A和28B为分别描绘用TGF-β1 (10 ng·ml-1)以及聚合物/NR4A1多聚复合物或超支化聚合物空白载体孵育的人NP细胞中α-平滑肌肌动蛋白表达和应力纤维形成的倍数变化的图；
图29A-29D为正常对照大鼠尾椎(29A)、穿刺和未处理的大鼠尾椎(变性模型组)(29B)、穿刺和用附着超支化聚合物空白载体的NF-SMS处理的大鼠尾椎(29C)以及穿刺和用附着具有聚合物/NR4A1多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球的NF-SMS处理的大鼠尾椎(29D)的代表性的肉眼外观；
图29E-29H为正常对照大鼠尾椎(29E)、穿刺和未处理的大鼠尾椎(变性模型组)(29F)、穿刺和用附着超支化聚合物空白载体的NF-SMS处理的大鼠尾椎(29G)以及穿刺和用附着具有聚合物/NR4A1多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球的NF-SMS处理的大鼠尾椎(29H)的微型计算机断层扫描(µCT)图像；
图30A-30H为正常对照大鼠尾椎 (30A、30E)、穿刺和未处理的大鼠尾椎(变性模型组)(30B、30F)、穿刺和用附着超支化聚合物空白载体的NF-SMS处理的大鼠尾椎(30C、30G)以及穿刺和用附着具有聚合物/NR4A1多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球的NF-SMS处理的大鼠尾椎(30D、30H)的苏木精和伊红(H&E)染色的椎间盘(disc)图像(以4x和20x放大率) (比例尺：30A-30D = 250 µm和30E-30H = 100 µm)；
图30I-30L为正常对照大鼠尾椎(30I)、穿刺和未处理的大鼠尾椎(变性模型组)(30J)、穿刺和用附着超支化聚合物空白载体的NF-SMS处理的大鼠尾椎(30K)以及穿刺和用附着具有聚合物/NR4A1多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球的NF-SMS处理的大鼠尾椎(30L)的Safranin-O染色的椎间盘图像(以4x放大率) (比例尺：30I-30L = 250 µm)；
图31A-31H为正常对照大鼠尾椎 (31A、31E)、穿刺和未处理的大鼠尾椎(变性模型组)(31B、31F)、穿刺和用附着超支化聚合物空白载体的NF-SMS处理的大鼠尾椎(31C、31G)以及穿刺和用附着具有聚合物/NR4A1多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球的NF-SMS处理的大鼠尾椎(31D、31H)的Masson Trichrome染色的椎间盘图像(以4x和20x放大率) (比例尺：31A-31D = 150 µm和31E-31H = 60 µm)；
图31I到31L为正常对照大鼠尾椎(31I)、穿刺和未处理的大鼠尾椎(变性模型组)(31J)、穿刺和用附着超支化聚合物空白载体的NF-SMS处理的大鼠尾椎(31K)以及穿刺和用附着具有聚合物/NR4A1多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球的NF-SMS处理的大鼠尾椎(31L)的免疫组织化学染色(对于胶原I)的椎间盘图像(以20x放大率) (比例尺：31I-31L =60 µm)；
图31M-31P为正常对照大鼠尾椎(31M)、穿刺和未处理的大鼠尾椎(变性模型组)(31N)、穿刺和用附着超支化聚合物空白载体的NF-SMS处理的大鼠尾椎(31O)以及穿刺和用附着具有聚合物/NR4A1多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球的NF-SMS处理的大鼠尾椎(31P)的免疫组织化学染色(对于α-SMA)的椎间盘图像(以20x放大率) (比例尺：31M-31P =60 µm)；
图32A-32F为细胞接种之前(图32A)和之后(图32D) 24小时的纳米纤维海绵微球、细胞接种之前(图32B)和之后(图32E) 24小时的纳米纤维微球、细胞接种之前(图32C)和之后(图32F) 24小时的固体微球的SEM图像(球直径30-60 µm；比例尺：32A-32C = 20 µm和32D-32F = 10 µm)；
图33A-33I为皮下移植之后8周第一对照组(图33A、33D和33G)、第二对照组(图33B、33E和33H)以及细胞/PLGA NS/NF-SMS构建体(图33C、33F和 33I)的H&E染色图像(图33A-33C)、Safranin-O染色图像(图33D-33F)和VonKonssa染色图像(图33G-33I) (比例尺：50 µm)；
图34A-34D为正常对照兔腰椎(34A)、穿刺和未处理的兔腰椎(假手术组) (34B)、穿刺并用NF-SMS和超支化聚合物空白载体处理的兔腰椎(34C)以及穿刺并用NF-SMS和具有聚合物/抗-miR199a多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球处理的兔腰椎(34D)的代表性肉眼外观；
图34E到34H为正常对照兔腰椎(34E)、穿刺和未处理的兔腰椎(假手术组) (34F)、穿刺并用NF-SMS和超支化聚合物空白载体处理的兔腰椎(34G)以及穿刺并用NF-SMS和具有聚合物/抗-miR199a多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球处理的兔腰椎(34H)的微型计算机断层扫描(µCT)图像；
图35为描绘正常对照兔腰椎、穿刺和未处理的兔腰椎(假手术组)、穿刺并用NF-SMS和超支化聚合物空白载体处理的兔腰椎以及穿刺并用NF-SMS和具有聚合物/抗-miR199a多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球处理的兔腰椎的骨赘骨体积的图；和
图36A-36P为正常对照兔腰椎(图36A、36E、36I和36M)、穿刺和未处理的兔腰椎(图36B、36F、36J和36N)、穿刺并用NF-SMS和超支化聚合物空白载体处理的兔腰椎(图36C、36G、36K和36O)以及穿刺并用NF-SMS和具有聚合物/抗-miR199a多聚复合物包埋在其中的PLGA纳米球处理的兔腰椎(图36D、36H、36L和36P)的H&E染色图像(图36A-36D和图36M-36P)和Safranin-O染色图像(图36E-36L)。
发明详述
本文所公开的为线性和超支化聚合物，其能够充当用于在体内和体外将DNA或RNA递送至细胞的聚合物载体。线性和超支化聚合物二者均为共聚物，其组合低分子量的阳离子PEI、线性或超支化聚酯以及聚乙二醇(PEG)链。线性和超支化聚合物二者均能够与DNA或RNA复合，以及自组装成球形结构(即，多聚复合物)。球形结构可包埋在生物可降解的聚合物中以形成生物可降解的微球或纳米球，其显示受控的DNA或RNA释放。包埋的微球或纳米球提供两阶段基因递送策略，其中在第一阶段期间多聚复合物从球释放和在第二阶段期间多聚复合物进入细胞。该两阶段基因递送策略使可控的持续时间和高转染效率二者成为可能。
生物可降解的微球或纳米球也可混合或固定在生物可降解的或易受侵蚀的支持系统或结构(例如，纳米纤维支架、纳米纤维海绵微球、其它多孔材料或水凝胶)上。将生物可降解的微球或纳米球局部化在生物可降解的支持系统或结构上可以以空间和时间控制的方式活化内源性细胞以再生骨骼、组织等，而不引入外源性细胞。这可有利于防止脱靶细胞上非预期的DNA或RNA递送。
现在提及图1，描绘对线性聚合物10和超支化聚合物10’，以及从其形成的多聚复合物20、20’的图解说明。线性聚合物10包括亲水性PEG链12、连接到亲水性PEG链12的线性、疏水性链14和连接到线性、疏水性链14的低分子量PEI链16。超支化聚合物10’包括超支化、疏水性分子核心14’、连接到超支化、疏水性分子核心14’的两个或更多个分支的各个低分子量PEI链16和连接到超支化、疏水性分子核心14’的两个或更多个其它分支的各个亲水性PEG链12。
亲水性PEG链12可包括2-50,000个重复的环氧乙烷单元。在实例中，亲水性PEG链12可包括2-1,000个重复的环氧乙烷单元。
线性、疏水性链14为生物可降解的聚酯。一些生物可降解的聚酯的实例包括聚交酯、聚己酸内酯、聚碳酸酯、聚(磷酸酯)、聚酸酐类和聚乙醇酸。
超支化、疏水性分子核心14’为包括至少4个末端羟基的超支化脂肪族聚酯。超支化、疏水性分子核心14’的一些实例在下面示出：
超支化双-MPA聚酯-16-羟基，2代，
超支化双-MPA聚酯-32-羟基，3代，和
超支化双-MPA聚酯-64-羟基，4代。
超支化、疏水性分子核心14’的另一个实例为超支化双-MPA聚酯-8-羟基，1代。
低分子量PEI (聚乙烯亚胺)链16具有约400 g/mol-约5,000 g/mol的分子量。在实例中，低分子量PEI链16为约800 Da (即，800 g/mol)。
用于形成线性聚合物10的方法的实例在图2中示出。在该实例中，PEG-P(N3CL-CL)(其中CL为己内酯)通过用PEG作引发剂和Sn(Oct)2作催化剂，α-N3-ε-CL与ε-CL的开环聚合作用(ROP)而大批量合成。然后，PEG-P(N3CL-CL)通过点击化学(Click)与PEI-炔(连接到腈末端基团的PEI)缀合以获得PEG-PE-PEI (线性聚合物10的一个实例)。在图2中，r = 2-50,000，p = 2-20,000，q = 2-20,000，s = 1-20,000，t = 1-20,000，m = 2-200和n = 2-200。
用于形成超支化聚合物10’的方法的实例在图3A-3C中示出。在该实例中，将超支化双-MPA聚酯 (H20:16羟基)的羟基在室温下通过与琥珀酸酐的反应转变为羧基(图3A)。然后，将叠氮基(即，叠氮化物)和PEG链在室温(例如，约18℃-约25℃)下通过(在N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和对二甲基氨基吡啶(DMAP)中) H20-COOH的羧基与2,2-双(叠氮甲基)丙烷-1,3-二醇和PEG的羟基的缩合反应与修饰的H20 (H-20-COOH)连接。这形成PEG-H20-N3，如图3B中所示。PEI-炔通过点击化学(Click)与PEG-H20-N3缀合以获得PEG-H20-PEI (超支化聚合物10’的一个实例)，如图3C中所示。在图3A-3C中，r = 2-50,000，m = 2-200和n =2-200。所形成的超支化聚合物10’可由约20%-约80%，或约30%-约70%的亲水性PEG链12构成。
合成线性聚合物10或者超支化聚合物10’中所使用的PEI-炔可通过图4中所示的方法形成。在该实例中，炔丙醇与1,1’-羰基二咪唑(CDI)在室温下反应以获得羰基咪唑的炔丙基酯(PPA-CI)。然后，聚乙烯亚胺(PEI，Mw 800 Da)与PPA-CI反应以产生PEI-炔。应理解的是在本文所提供的范围内的其它分子量的聚乙烯亚胺也可使用。
聚酯不稳定并且如果与氨基化合物PEI反应可降解，因此图4和2以及图4和3显示的组合合成已使用温和的反应条件通过点击化学设计。温和的条件包括室温和搅拌。温和的反应条件使阳离子聚合物PEI与聚酯能够缀合而无不期需的聚合物降解。
重新提及图1，线性聚合物10或超支化聚合物10’可与DNA或RNA 18复合。RNA的实例包括miRNA、mRNA和/或siRNA。DNA的实例包括pDNA、cDNA、cpDNA、gDNA、msDNA、mtDNA和/或rDNA。DNA或RNA 18通过静电相互作用连接到线性聚合物10或超支化聚合物10’的低分子量PEI 16。
如图1中所描绘的，线性聚合物多聚复合物20和超支化聚合物多聚复合物20’可通过线性聚合物10或超支化聚合物10’与DNA或RNA 18的自组装形成。多聚复合物20、20’可通过将线性聚合物10或超支化聚合物10’的溶液添加至DNA或RNA 18的溶液中形成。两种溶液都可为水基溶液。让合并的混合物在室温(例如，约18℃-约25℃)下孵育预定的时间(例如，至少约30分钟)。如图1中所说明的，多聚复合物20、20’可为球形式。多聚复合物20可为由PEG链12包围的实心球，而多聚复合物20’可为夹在内部和外部PEG链12之间的球中心部分。
更特别地，当线性聚合物10和DNA或RNA 18自组装时，生物相容性、亲水性PEG链12可形成防护壳(sheathing shell)以保护多聚复合物20的内部部分。多聚复合物20的内部部分包括线性疏水性(例如，聚酯)链14、低分子量PEI链16和复合的DNA或RNA 18。另外，当超支化聚合物10’和DNA或RNA 18自组装时，超支化疏水性分子核心14’、低分子量PEI链16和复合的DNA或RNA 18形成中心部分22，其夹在第一个多个亲水性PEG链12 (其构成多聚复合物20’的亲水性内部部分)和第二个多个亲水性PEG链12 (其构成多聚复合物20’的亲水性外部部分)之间。
自组装的超支化聚合物10’形成双壳样的电荷分布，其可降低毒性(电荷密度)和增加对DNA或RNA 18的电荷可及性。正因如此，超支化聚合物10’ (以多聚复合物20’的形式)可有利地充当DNA或RNA 18的递送载体。
多聚复合物20、20’可包封在生物可降解的聚合物基质中以形成生物可降解的球。包封可克服当前的DNA或RNA递送系统不受控的持续时间的缺点，部分因为包封材料使受控的释放持续时间成为可能。
这些生物可降解的球可具有纳米级尺寸(1 nm直至1000 nm)或微米级尺寸(例如，1 µm-约100 µm)。包封可通过双乳化技术，例如水包油包水双乳化进行。包封也可例如，通过简单的乳化技术、挤压、相分离、喷雾干燥等进行。
任何合适的生物可降解的或易受侵蚀的材料均可用作生物可降解的聚合物基质，例如，聚(乳酸共乙醇酸)(也称为聚(乙丙交酯)) (PLGA))。生物可降解聚合物的其它合适的实例包括但不限于聚(L-乳酸)(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚酸酐类、聚(原醚)(poly(orthoethers))、聚己酸内酯、聚(羟基丁酸酯)、聚(磷酸酯)、聚(丙烯延胡索酸酯)、聚磷腈、聚碳酸酯、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、胶原、明胶、藻酸盐、几丁质、壳聚糖、果胶、其共聚物和其组合。
生物可降解的球可原样使用，或其可混合或固定化在支持结构上。支持结构的实例包括由聚集在一起的多个纳米纤维和在至少一些纳米纤维之间界定的孔形成的支架。纳米纤维模拟细胞外基质(ECM)的结构，因此可促进组织再生。另外，支架很可能增加基因递送载体荷载效率、减少降解产物的量、促进细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，并且提供容易的途径用于营养物和代谢废物的转移，其一起协同增强组织再生和与宿主的整合。
支架的一个具体实例称为纳米纤维支架。纳米纤维支架的特征为具有规则球形宏观尺度的孔(直径约250 μm-约425 μm)、约100 μm的微观尺度孔间空隙(即，连接一个宏观尺度孔与另一个宏观尺度孔的空隙)和纳米纤维之间的空间(直径小于2 μm)的多层次多孔结构。尽管支架的孔为宏观尺度或更小，但支架本身具有较大的尺寸。例如，支架的厚度可为1 mm或更大，支架的长度和/或宽度可为3 mm或更大。
支架的另一个具体实例称为纳米纤维空心微球(NF-HMS)。纳米纤维空心微球的特征为具有纳米纤维壳包围的单一空心核心的空心结构和在纳米纤维壳中形成的一个或多个空隙。整个空心结构具有约5 μm-约1000 μm的直径，并且空隙的直径约5 μm-约50 μm。纳米纤维壳还包括纳米纤维之间存在的空间(直径小于2 μm)。
支架的又一个具体实例称为纳米纤维海绵微球(NF-SMS)。NF-SMS与纳米纤维支架和纳米纤维空心微球相似，因为它们也包括纳米纤维架构或部分纳米纤维架构，并且具有约5 μm-约1000 μm的直径。然而，NF-SMS不像纳米纤维支架和纳米纤维空心微球，因为它们为海绵状的。“海绵状”意指NF-SMS具有贯穿整个微球的海绵样的架构。海绵样架构包括互连的多孔壁和在互连的多孔壁之间形成的微观尺度孔。
海绵样架构包括延伸通过NF-SMS的内部并且还界定NF-SMS的外部的多孔壁。多孔壁由互连的纳米纤维和在互连的纳米纤维之间形成的空间(直径小于2 μm)组成。海绵样架构还包括多个微观尺度孔(直径约1 μm-约100 μm)、孔间空隙(即，连接一个微观尺度孔20到另一个微观尺度孔20的空隙)和如前文提及的纳米纤维之间的空间。
微观尺度的孔至少部分上由多孔壁界定，并且在整个NF-SMS中形成。正因如此，一些微观尺度的孔位于NF-SMS的外部，其它的位于NF-SMS的内部。每一微观尺度的孔具有至少一个孔间空隙。孔间空隙连接两个临近的微观尺度孔。换言之，孔间空隙向一个微观尺度孔打开另一个微观尺度孔。NF-SMS的每一孔间空隙直径约2 μm-约80 μm。一些微观尺度孔还具有额外的空隙，其向NF-SMS周围的环境打开微观尺度孔。应理解的是位于NF-SMS内部的微观尺度孔包括孔间空隙，但不包括额外的空隙。
支架可由任何前述生物可降解的聚合物基质材料形成，并且可通过任何合适的技术形成。作为实例，纳米纤维支架和NF-HMS可通过组合相分离和糖浸出形成。NF-SMS的实例可通过反乳化技术使用高度亲甘油的聚合物形成，例如i) 具有X数目的羟基和具有1/Y的原始羟基密度的星形聚(L-乳酸)，其中X ≥ 4，其中Y为用于形成聚合物的单体与用于形成聚合物的引发剂上的羟基数目的进料比并且其中Y≥ 100；或ii) 具有大于或等于5%的氨基酸(例如，赖氨酸)含量或肽(例如，RGD (Arg-Gly-Asp))含量的星形聚(L-乳酸)-嵌段-聚(L-氨基酸)；或iii) 与聚(L-乳酸)的接枝共聚物(例如，聚((羟乙基)甲基丙烯酸酯)-接枝-聚(L-乳酸) (PHEMA-g-PLLA)、聚((羟乙基)丙基甲基丙烯酸丙酯)-接枝-聚(L-乳酸)、聚((羟乙基)丙烯酸丁酯)-接枝-聚(L-乳酸)等)。NF-SMS的其它实例可通过传统的乳化技术使用具有X数目的羟基和约1/150-1/100的原始羟基密度1/Y的星形聚(L-乳酸)形成，其中X > 16。
其它合适的用于支架或其它支持结构的材料包括无机材料或聚合物/无机材料复合材料。支持结构也可为另一种高度多孔的(例如，具有约80%-约99%的孔)结构或水凝胶。
生物可降解的球可与支持结构混合。生物可降解的球与支持材料的重量比为0.01% (1:10000)-100% (1:1)。作为一个实例，生物可降解的球与支持材料的重量比可为1% (1:100)。
将生物可降解的球固定在支架上可通过后接种(post seeding)的方法完成。在实施方案中，将生物可降解的球分散在生物可降解的球和支架两者的非溶剂或不良溶剂中。可将分散液逐滴接种在支架上。接种的支架可暴露于混合的溶剂蒸气中持续预定的时间以使生物可降解的球坚固地粘附到支架上。一般而言，混合的溶剂蒸气不溶解支架或生物可降解的球，而是通过部分溶解一种或两种支架或生物可降解的球引起它们粘附。混合的溶剂蒸气可包括体积比0:1-1:0的己烷/四氢呋喃(THF)的蒸气。作为一个实例，己烷/四氢呋喃的比率可为按体积计约9:1。然后将支架干燥以去除任何溶剂。将生物可降解的球固定在支架上的其它实例包括高温处理、(部分)溶剂暴露或其组合。
将生物可降解的球固定或局部化在支架上可帮助防止非预期递送DNA或RNA到脱靶细胞。
图5图解描绘固定在聚合物支架26上和贯穿聚合物支架26的生物可降解的球24(包括多个包封在其中的多聚复合物20’)的实例。图5还说明在体外和体内从固定化在PLLA纳米纤维支架26上的PLGA微球24，两阶段递送miRNA(RNA 18的一个实例)至细胞内。本文公开的阳离子多聚复合物可用于保护miRNA (或者其它RNA或DNA)在进入细胞的漫长过程中免受细胞外降解。如图5所示，PLGA微球-掺入的PLLA支架可皮下植入小鼠或大鼠。在实例中，微球-掺入的支架可注射到小鼠或大鼠尾巴的髓核区域。从PLGA微球24 (在PLLA支架26上)释放的多聚复合物20’可通过胞吞作用摄入细胞中。多聚复合物20’被吞入内体中。ATP-介导的质子累积使内体的酸性增加至pH约5.0-约6.2，其显著低于胞质溶胶或细胞内空间的pH值(pH 7.4)。多聚复合物10’具有通过PEI的质子缓冲作用缓冲内体囊泡的能力。换言之，在聚合物/miRNA多聚复合物20’穿过细胞膜并被包围在内体中后，阳离子PEI组分可缓冲内体囊泡中的酸性环境，保存miRNA的生物活性并引起内体的溶胀和溶解，因此将多聚复合物20’释放到细胞质中。聚合物降解之后胞质溶胶中DNA或RNA 18 (在图5中作为miR-26a显示)的细胞内释放允许其调节基因表达。
为了进一步说明本公开内容，本文给出实施例。应理解的是这些实施例为了说明性的目的提供，并且不应解释为限制本公开内容的范围。
实施例
实施例1
材料
聚乙烯亚胺(PEI，Mw 800 Da和25 kDa)、聚乙二醇甲醚(PEG，Mw 2000、5000、10000和20000 Da)和超支化双-MPA聚酯(本实施例中称为Hx，其中Hx为H20:16羟基、H30:32羟基或H40:64羟基)购自Sigma-Aldrich并按原样使用。荧光类似物，NBD胆固醇为定位在膜内部的探针并且可用于研究脂质转运过程以及脂质-蛋白质相互作用。该类似物购自lifetechnologies。α-叠氮基-ε-己内酯(α-N3-ε-CL)如Fuhrmann, K.,等人“PEG nanocages asnon-sheddable stabilizers for drug nanocrystals (作为用于药物纳米结晶物的不可脱落的稳定剂的PEG纳米笼)” ACS nano 6, 1667-1676 (2012)中所述合成。市售miR-26a模拟物用作本实施例中的miRNA。
PEI-炔的合成
将1,1’-羰基二咪唑(CDI，7.30 g，45 mmol)溶于50 mL二氯甲烷中。将炔丙醇(1.50mL，26 mmol)逐滴加入。将反应混合物在室温下搅拌约1小时并用40 mL水洗涤三次。有机相通过无水硫酸镁干燥，并将滤液在减压下浓缩以获得羰基咪唑的炔丙基酯(PPA-CI)，为白色固体。产率：89%。1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): 8.17 (s, 1H, NCHN), 7.46 (s, 1H,NCHCHN), 7.10 (s, 1H, NCHCHN), 5.01 (s, 2H, OCH 2C), 2.65 (s, 1H, C≡CH)。
将聚乙烯亚胺(PEI，Mw 800 Da，2.40 g，3.0 mmol)溶于氯仿(25 mL)和甲醇(5mL)的混合物中。将PPA-CI (0.45 g，3.0 mmol)在4.5 mL氯仿中的溶液在冰冷温度下在30分钟的时间段内逐滴加入。混合物回流约6小时后，溶剂通过旋蒸去除。将残余物溶于10 mL水中。然后，溶液通过1 M盐酸标准溶液中和并用5 mL氯仿洗涤三次。将水相冻干以获得黄色固体的PEI-炔。产率：85%。FT-IR (KBr, cm-1): 2130 (vC≡CH). 1H NMR (400 MHz,D2O, ppm): 4.68 (s, 2H, OCH2C), 3.81–2.60 (m, 74H, NCH2), 2.47 (s, 1H, C≡CH)。
PEG-Hx-N 3 的合成
将Hx (2.00 g)和三乙胺(0.5 mL)溶于50 mL THF中。加入琥珀酸酐(3.50 g，两倍摩尔过量)。将反应混合物在室温下搅拌24小时并将从溶液中沉淀获得的絮状固体用THF和乙醚洗涤以去除残留的琥珀酸酐。残余物在真空下干燥以得到白色固体Hx-COOH。产率：62-73%。FT-IR (KBr, cm-1): 1740 (v C=O). 1H NMR (400 MHz, D2O, ppm): 4.29 (br s, CH 2O),2.84–2.51 (m, CH 2CH 2COOH), 1.27 (s, CH 3)。
将Hx-COOH (3.2 mmol羧基)、N,N'-二环己基碳二亚胺(0.990 g，4.8 mmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.586 g，4.8 mmol)溶于50 mL二甲基甲酰胺中。加入2,2-双(叠氮基甲基)丙烷-1,3-二醇(0.300 g，1.6 mmol)和PEG (Mw 2000 Da，3.200 g，1.6 mmol)。将反应物在室温下搅拌24小时。将反应混合物过滤并浓缩。然后将残余物转移至透析袋(MWCO3500 Da)中并用连续流动的去离子水透析2天，期间每8小时更换水。产物通过冻干获得，得到絮状固体。产率：34-46%。FT-IR (KBr, cm-1): 2105 (v N3), 1742 (v C=O). 1H NMR (400MHz, CDCl3, ppm): 4.22 (br s, Hx的CH 2O), 4.06 (br s, CCH 2OH和CCH 2OOC), 3.88–3.56 (m, PEG的OCH 2CH 2), 3.46 (br s, CH 2N3), 3.38 (s, PEG的CH 3), 2.78–2.56 (m,Hx的CH 2CH 2COO), 1.25 (s, Hx的CH 3)。
通过点击化学合成PEG-Hx-PEI (超支化聚合物10’)
将PEG-Hx-N3 (1当量N3)、PEI-炔(2当量炔基)、溴化亚铜(2当量)和三乙胺(2当量)溶于THF-水混合物(按体积计1:1)中。将混合物在35℃下搅拌约3小时。然后将溶液转移至透析袋(MWCO 3500 Da)中并用连续流动的去离子水透析2天，期间每8小时更换水。产物通过冻干获得，得到絮状固体。产率：44-60%。FT-IR (KBr, cm-1): 2106 (v N3), 1743 (v C=O),1635 (v 三唑)。1H NMR (400 MHz, D2O, ppm): 3.79–3.58 (m, PEG的OCH 2CH 2), 3.58–2.60(m, PEI的NCH 2)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6, ppm): 4.15 (br s, Hx的CH 2O), 3.99 (brs, CCH 2OH和CCH 2OOC), 3.73–3.46 (m, PEG的OCH 2CH 2), 2.72–2.54 (m, Hx的CH 2CH 2COO),1.18 (s, Hx的CH 3)。
通过开环聚合合成PEG-P(N 3 CL-CL)
向预先用三甲基氯硅烷处理的圆底烧瓶装入1.0 g PEG (Mw 5000, 10000或20000Da)并在减压(油泵)下在100℃加热约4小时。加入α-N3-ε-CL (0.33 g，2.0 mmol)、ε-己内酯 (ε-CL，0.456 g，4.0 mmol)和60 μL 0.1 M Sn(Oct)2在无水甲苯中的溶液。将烧瓶排空并填充氮气三次，然后在真空下密封，内部具有磁力搅拌棒。将混合物在130°C搅拌约24小时后，聚合通过将烧瓶浸入冷水浴中猝灭。产物通过用冷的甲醇-乙醚混合物(按体积计1:1)从氯仿中沉淀三次纯化并在真空下干燥，得到白色固体。产率：84-88%。FT-IR (KBr, cm-1): 2111 (v N3), 1749 (v C=O). 1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): 4.22–4.11 (t, OCOCH(N3)CH2CH2CH2CH 2), 4.08–3.96 (t, OCOCH2CH2CH2CH2CH 2), 3.88–3.80 (t, OCOCH(N3)CH2CH2CH2CH2), 3.74–3.58 (br s, PEG的OCH 2CH 2), 3.38 (s, PEG的CH 3), 2.38–2.22(t, OCOCH 2CH2CH2CH2CH2), 1.83–1.58 (m, N3CL和CL的CH 2CH2CH 2CH2O), 1.45-1.28 (m,N3CL和CL的CH2CH 2CH2CH2O)。
通过点击化学合成PEG-PE-PEI (线性聚合物10)
将PEG-P(N3CL-CL) (0.16 mmol的N3)、PEI-炔(0.162 g，0.55 mmol的炔基)、溴化亚铜(0.066 g，0.46 mmol)和三乙胺(0.047 g，0.46 mmol) 溶于THF-水混合物(按体积计1:1)中。将混合物在35℃下搅拌约3小时。然后将溶液转移至透析袋(MWCO 3500 Da)中并用连续流动的去离子水透析2天，期间每8小时更换水。产物通过冻干获得，得到絮状固体。产率：68-75%. FT-IR (KBr, cm-1): 2109 (v N3), 1750 (v C=O), 1637 (v 三唑). 1H NMR (400 MHz,D2O, ppm): 3.88–3.60 (m, PEG的OCH 2CH 2), 3.60– 2.72 (m, PEI的NCH 2). 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6, ppm): 4.14–4.03 (m, OCOCH2CH2CH2CH2CH 2), 3.62 (br s, PEG的OCH 2CH 2), 2.35–2.20 (t, OCOCH 2CH2CH2CH2CH2), 1.84–1.56 (m, N3CL和CL的CH 2CH2CH 2CH2O), 1.47-1.30 (m, N3CL和CL的CH2CH 2CH2CH2O)。
聚合物表征
FT-IR光谱在Perkin Elmer BX光谱仪上记录。1H NMR分析在室温下操作的VarianINOVA-400光谱仪上进行。分子量和分子量分布通过Waters 440凝胶渗透色谱(GPC)在35℃下测定。THF用作洗脱液，以1.0 mL/min的流速。窄分布的聚苯乙烯标准品用于产生校准曲线。元素分析由Atlantic Microlab Inc进行。聚合物中的PEI含量从使用元素分析测定的氮含量计算。然后，聚合物的分子量使用核磁共振(NMR)估算，其与使用凝胶渗透色谱(GPC)测定的一致。
表1说明产生的三种线性聚合物(LP)和产生的三种超支化聚合物(HP)的性质。
表1
聚合物的细胞毒性测定
细胞毒性测定在成骨细胞上基于MTT测定进行。将成骨细胞在200 μL DMEM完全培养基中以5000细胞/孔的初始密度接种在96-孔板中。让细胞生长24小时。原始培养基用100 μL新鲜培养基代替。将PEG-PE-PEI、PEG-Hx-PEI、PEI 800 Da或PEI 25 kDa溶液以在培养基中10 μg/mL的氮原子浓度加入培养基中。每一剂量在4个孔中重复。将处理的细胞于37°C在95%空气和5% CO2的潮湿气氛下孵育24小时。将MTT试剂(20 μL在PBS中，5 mg/mL)加入每一孔中，并将细胞在37°C再孵育4小时。将100 μL DMSO加入每一孔中直至所有晶体溶解。
每一孔中溶液在570 nm的吸光度使用Varioskan Flash Spectral ScanningMicroplate Reader记录。细胞活力根据下列等式计算：细胞活力(%) = (OD样品- OD空白)/(OD对照- OD空白) × 100，其中OD样品为用聚合物或PEI培养的细胞溶液的吸光度；OD空白为培养基的吸光度；和OD对照为仅用培养基培养的细胞溶液的吸光度。结果在图6中示出。如所描绘的，PEI 25 kDa具有非常高的毒性而PEI 800为无毒的。PEI缀合后，线性聚合物和超支化聚合物二者均具有非常低的细胞毒性。超支化阳离子聚合物可通过其酯键水解而降解。
聚合物/RNA多聚复合物的通用制备
将设计的聚合物溶液(1.0 mg/mL)缓慢加入包含60 pmol RNA的RNA溶液中。所加入的聚合物的量基于所选择的聚合物/RNA的N/P比率(聚合物的N氮原子相对于RNA的P磷酸基)计算。将混合物在室温下孵育30分钟用于复合体形成。
聚合物/miRNA多聚复合物的制备和表征
将miRNA使用miRNA中的磷(P)原子与钨酸中的钨(W)原子之间的耦合相互作用，用新鲜制备的钨酸标记。W为重元素并且可用作用于TEM成像的负染色试剂。将10 mL钨酸钠水溶液(0.15 mol/L)在室温下逐滴加入6 mL HCl水溶液(0.8 mol/L)中。收集沉淀并洗涤以获得活化的钨酸。活化的钨酸以W/P摩尔比率3加入miRNA水溶液中。将W-掺入的miRNA溶液通过离心纯化并储存在-80 °C。
W-掺入的miRNA溶液用于制备与线性聚合物(LP)和超支化聚合物(HP)二者的聚合物/miRNA多聚复合物。N/P比率为10的多聚复合物通过将适当体积的W-掺入的miRNA溶液加入适当体积的聚合物溶液(1.0 mg/mL)中并在室温下孵育30分钟制备。将一滴聚合物/miRNA多聚复合物溶液加至碳涂覆的铜载网上。让网在环境条件下干燥。JEOL JEM-3011透射电镜用于表征聚合物/miRNA多聚复合物的形态学。
图7A和7B分别说明线性聚合物(LP3)/miRNA和超支化聚合物(HP3)/miRNA的TEM图像。TEM图像显示LP/miRNA多聚复合物和HP/miRNA多聚复合物之间的明显差异。TEM图像中的黑色域为W-标记的miRNA并且白色区域为聚合物(PEG和聚酯)。LP/miRNA多聚复合物中的miRNA聚集在球形核心中，其在TEM下呈现为黑色球(图7A)。然而，对于HP，miRNA首先与在超支化聚酯核心的外壳上的PEI复合。HP分子核心和PEI/miRNA壳一起组装成3层纳米球的外部PEG链和内部PEG核心之间的疏水性壳。HP分子核心和PEI/miRNA壳在TEM下一起呈现为黑色空心球形的圆圈(图7B)。
发现外层/截面的厚度和内部核心/截面的半径在同一数量级上，大约为PEG链的理论长度。来自具有W-掺入的miRNA的HP3的TEM成像的不同层的厚度在图8中示出。在每一重复的PEG单元中有两个C-O (143 pm)和C-C (154 pm)键。C-C-O和C-O-C的键角均为约110º。因此，PEG (Mw 2000)的长度根据下列等式计算：L = (2 ∙143 ∙ sin55 + 154 ∙ sin55)∙ 45 = 16 nm。
如图8中所描绘的，外部部分和内部部分的厚度为约16 nm (±2)，表明外部部分和内部部分二者均为PEG构成的亲水性部分。疏水性聚酯和多聚复合物在外部部分和内部部分之间。这些结果表明具有miRNA的HP3形成3层纳米颗粒。
琼脂糖凝胶阻滞
双壳样电荷(PEI)分布可具有降低的局部电荷密度(与高分子量PEI相比)，因此获得较低的细胞毒性，并且也可赋予较高的PEI对miRNA结合的可及性，因此达到比线性聚合物中阳离子基团更高的复合效率。为了检验该假设，这些阳离子聚合物与RNA的复合能力使用琼脂糖凝胶电泳检查。当阳离子聚合物和RNA形成具有正表面电势的稳定多聚复合物时，RNA条带将会在电泳后保持在原位，即，阳离子聚合物阻滞RNA迁移。
将与4 μL 1×上样缓冲液混合的10 μL多聚复合物溶液样品上样至琼脂糖凝胶。多聚复合物在包含GelRed的0.7%琼脂糖凝胶上用Tris-乙酸盐(TAE)运行缓冲液(pH 8)在80 V下电泳45分钟。RNA条带通过UV (254 nm)照明器可视化，并用BioSpectrum成像系统(USA)拍照。图像在图9中示出。当它们具有相似分子量和氮含量时，发现超支化聚合物(HP1、HP2、HP3)以比线性聚合物小的聚合物量阻滞RNA迁移。
HP多聚复合物与脂多聚复合物和与LP多聚复合物的比较
HP/miRNA多聚复合物与市售产品lipofectamine 2000/miRNA脂多聚复合物的稳定性使用动态光散射(DLS)和TEM并行检查。lipofectamine 2000/miRNA脂多聚复合物的结果在图10A-10D中示出，HP/miRNA多聚复合物的结果在图11A-11D中示出。
超声之前和超声之后通过DLS测定的lipofectamine/miRNA脂多聚复合物的尺寸分布概况分别在图10A和10B中示出。超声之前的lipofectamine/miRNA脂多聚复合物的形态学图像(通过TEM表征(比例尺，200 nm))在图10C中示出，超声之后的形态学图像在图10D中示出。脂多聚复合物在超声后变得更大且更宽，这表明脂多聚复合物在超声下不稳定。更特别地，脂多聚复合物在尺寸上较大，平均直径约653 nm，在超声下不稳定，导致更宽的尺寸分布，并且由于碎片化和聚集，尺寸增加至1341 nm。
超声之前和超声之后通过DLS测定的HP/miRNA多聚复合物的尺寸分布概况分别在图11A和11B中示出。超声之前的HP/miRNA多聚复合物的形态学图像(通过TEM表征(比例尺，100 nm))在图11C中示出，超声之后的形态学图像在图11D中示出。与脂多聚复合物相反，HP3/miRNA多聚复合物的尺寸和PDI在超声下几乎无可分辨的变化，表明HP3/miRNA多聚复合物非常稳定。更特别地，HP/miRNA多聚复合物在尺寸上更小，初始平均直径约224 nm，在超声下稳定，导致较窄的尺寸分布并且可能由于机械诱发的更致密堆积，平均尺寸轻微减少至152 nm。
HP/miRNA多聚复合物和LP/miRNA多聚复合物也进行了比较。具体地，多聚复合物的颗粒尺寸和ζ电势通过动态光散射(DLS)在Beckman Coulter DelsaNano C SubmicronParticle Size Analyzer上于室温下测量。如上所述，N/P比率为10的多聚复合物通过将适当体积的RNA溶液加入适当体积的聚合物溶液(1.0 mg/mL)中并在室温下孵育30分钟制备。对于这些测量，然后将多聚复合物在测量前用无RNA酶的水稀释至1.0 mL的体积。也测试了高分子量PEI 25 kDa和低分子量PEI 800 Da。
颗粒尺寸结果在图12A中示出。颗粒尺寸结果表明HP/miRNA多聚复合物的直径比线性聚合物/miRNA多聚复合物的小(当各自的聚合物中PEG/聚酯的比率保持相同时)。这可能是由于HP高度集中的树枝状结构和更短的PEG链。
ζ电势结果在图12B中示出。HP/miRNA和LP/miRNA多聚复合物的ζ电势比低PEI(PEI 800 Da)高，但是比高分子量PEI (PEI 25 kDa)低，随聚酯分子量和分支程度增加而增加。
图12A和图12B中的结果共同表明PEI 25 kDa可与RNA在高电势下形成约100 nm的稳定纳米颗粒并且PEI 800在低电势下具有大尺寸。线性或超支化聚合物/RNA多聚复合物的直径和ζ电势在PEI 25 kDa和PEI 800 Da的直径和ζ电势之间。
包含聚合物/miRNA多聚复合物的PLGA微球(MS)和MS-掺入的PLLA纳米纤维支架 (MS-支架)的制备
包含LP (LP1、LP2或LP3)或HP (HP1、HP2、HP3)聚合物/miRNA多聚复合物的PLGA (聚(丙交酯共乙交酯)聚)微球(MS)使用改进的水包油包水(w/o/w)双乳化方法制造。简言之，将30 mg PLGA溶解于1 mL二氯甲烷中。将100 μL包含1.8 nmol荧光miRNA的N/P为10的聚合物/miRNA多聚复合物的水溶液加入上述溶液中并用探头超声仪(Virsonic 100，Gardiner，NY)在50W乳化。然后将该初级w/o乳液在90W超声下乳化至10 mL PVA溶液(1% wt/vol)中以形成w/o/w乳液。将所得的二级乳液在室温下磁力搅拌约12小时以蒸发溶剂。将PLGA微球通过离心收集，用水洗涤三次并冻干。
为了比较，具有非荧光miRNA多聚复合物的PLGA微球、包含荧光miRNA (即，裸的)的PLGA微球、包含荧光argomir miRNA的PLGA微球和包含lipofectamine/miRNA脂多聚复合物的PLGA微球以与包含LP或HP聚合物/miRNA多聚复合物的PLGA微球类似的方式制备。
应指出的是离心后，具有非荧光miRNA多聚复合物的PLGA微球形成非常透明的溶液。荧光miRNA (即，裸的)和荧光argomir miRNA以低效率包埋到PLGA微球中，如离心后各自的沉淀中非常浅的红色所证明的。相比之下，HP3/miRNA多聚复合物以高效率包埋到PLGA微球中，如离心后沉淀中非常强的红色所证明的。
miRNA的负载量和包封效率通过UV分光光度分析测定。首先，将1.0 mg的各PLGA微球溶解于1.0 mL二氯甲烷中。然后，将0.5 mL无RNA酶的水加入以提取miRNA。提取过程重复数次。miRNA浓度使用ThermoElectron 3001 Varioskan Flash Spectral ScanningMicroplate Reader测量。比较性和实例PLGA微球的RNA包埋效率在图13中示出。具体地，图13显示裸miRNA、lipofectamine/miRNA脂多聚复合物、argomir miRNA、线性和超支化聚合物/miRNA多聚复合物至PLGA微球中的RNA包埋效率。裸miRNA、lipofectamine/miRNA脂多聚复合物和argomir miRNA的效率非常低(< 10%)。相比之下，线性聚合物/miRNA多聚复合物和超支化聚合物/miRNA多聚复合物具有高RNA包埋效率。此外，具有超支化聚合物(特别是HP2和HP3)的miRNA多聚复合物的效率比具有线性聚合物的那些显著更高。
具有直径5 mm以及厚度2 mm的尺寸的PLLA (聚(L-乳酸))纳米纤维支架通过组合相分离和糖浸出技术预制备。将PLGA MS使用后接种方法掺入PLLA NF-支架上。简言之，将PLGA MS分散在具有0.1%司盘80的己烷中并逐滴接种到NF-支架上。然后，支架经受己烷/THF的混合溶剂(按体积计9:1)蒸气持续30分钟。将支架在真空下干燥3天以去除溶剂。
MS掺入之前和之后支架的形态学和尺寸通过扫描电镜(Philips XL30 FEG SEM)表征。将支架使用溅射镀膜仪(DeskII, Denton vacuum Inc)在表面镀金。在镀金过程期间，气压为50豪托，电流为40 mA。涂覆时间为120秒。样品在15 kV下分析。
附着包含HP3/miRNA多聚复合物的PLGA微球的PLLA纳米纤维支架的SEM图像在14A-14D中示出，其中图14B为图14A中概述部分的更高放大倍数的图像，图14C为图14B中概述部分的更高放大倍数的图像，以及图14D为图14C中概述部分的更高放大倍数的图像。PLLA纳米纤维支架的直径为5 mm并且孔尺寸为约250 μm-约425 μm。PLGA微球为约3 μm。PLGA微球分散在PLLA支架的表面上和孔中。
SEM图像显示有利于细胞接种和迁移的支架中孔之间的互连性，以及有利于组织再生的纳米纤维形态在PLGA MS固定化程序后保留。此外，这些图像证实PLGA MS良好地分布于整个支架。
体外miRNA释放
负载HP3/miRNA多聚复合物的PLGA MS-支架的释放概况在PBS (pH 7.4，0.1 M)中研究。将支架放置于0.2 mL PBS中并在50 rpm于37°C摇动。以预定的时间间隔，除去释放介质并替换为预热的新鲜PBS。miRNA从支架上的微球的释放量使用ThermoElectron 3001Varioskan Flash Spectral Scanning Microplate Reader分析。
从支架释放前后HP3/miRNA多聚复合物的直径在图15中示出。释放后，HP3/miRNA多聚复合物保持纳米颗粒形状，并且直径几乎无可辨别的改变。发现释放的HP3/miRNA多聚复合物具有约200 nm的平均直径，大于最初掺入的多聚复合物(152 nm)。这些结果表明多聚复合物相当稳定，即使当包埋入至PLGA微球中并从其释放。
负载LP3/miRNA多聚复合物的PLGA微球和负载HP3/miRNA多聚复合物的PLGA微球的释放概况用不同分子量的PLGA，即6.5k PLGA和64k PLGA研究。释放概况如上所述在PBS(pH 7.4, 0.1 M, 37°C)中研究。结果在图16中示出。如所描绘的，由具有分子量6.5k的PLGA制成的MS取得较短期的释放，而由具有分子量64k的PLGA制成的MS取得较长期的释放。第一天期间存在LP/miRNA或HP/miRNA多聚复合物从PLGA 6.5k MS约60%的爆发释放，接着多聚复合物以实质性水平持续释放约2周。相比之下，第一天期间存在LP/miRNA或HP/miRNA多聚复合物从PLGA 64k MS约25%-30%的爆发释放，接着多聚复合物以实质性水平持续释放一个月以上。
体外和/或体内细胞摄入和miRNA表达
对于体外miRNA/聚合物复合体和lipofectamine 2000/miRNA脂多聚复合物的细胞摄入和miRNA表达分析，将各自的组分首先按照标准方案标记。miRNA和agomir通过Cy3 (橙色)标记，聚合物(载体)通过FITC (绿色)标记，和细胞(成骨细胞)核用DAPI (蓝色)染色。作为实例，将FITC (2.0 mg)和聚合物 (16.0 mg)于甲醇 (2 mL)中在室温下搅拌过夜。然后将溶液转移至透析袋(MWCO 3500 Da)中并用连续流动的去离子水透析2天，期间每8小时更换水。产物通过冻干获得，得到絮状固体FITC-聚合物。成骨细胞用DAPI类似地染色以显示其核。为了标记lipofectamine 2000，将NBD胆固醇(按重量计10%)加入脂多聚复合物溶液中。
多聚复合物和脂多聚复合物的体外转染效率在成骨细胞中评估。将染色的成骨细胞以4000细胞/孔的密度接种于8格盖玻片(Nunc，USA)中并于37°C在95%空气和5% CO2的潮湿气氛下孵育直至细胞达到约70%汇合。转染时，将每一孔中的培养基用400 μL新鲜的DMEM培养基替换。将FITC-标记的聚合物或NBD胆固醇标记的脂质体与Cy3-标记的miRNA合并以形成多聚复合物或脂多聚复合物(以前述相同的方式)，然后加入细胞并与细胞在37°C孵育。阴性对照为无生物学活性的杂乱miRNA。
转染后48小时，细胞使用共焦激光扫描显微镜(Nikon C1-si TE2000，Japan)观察(在图17A中以黑白显示)并提取RNA用于进一步实时RT-PCR检验。多聚复合物和脂多聚复合物在体外的生物功能性转染效率通过定量荧光强度(图17B)和miRNA表达水平(图17C)测定。为了定量多聚复合物或脂多聚复合物进入细胞的量，将FITC/NBD/miRNA-衍生的荧光捕获并通过Image-pro plus 6.0图像分析软件分析以测量与核中表达DAPI-衍生的荧光的区域相比的细胞中FITC/NBD/miRNA-衍生的荧光的强度。这些结果在图17B中示出。HP具有比LP或lipofectamine 2000高得多的转染效率，如使用共焦激光扫描显微镜观察细胞内存在最大量的miRNA多聚复合物(图17A)和使用实时PCR (图17C)定量的更高水平的miRNA表达所证明的。在这些图中，MIM指miRNA-26a模拟物并且NC指mi-RNA-26a的阴性对照。
将标记的多聚复合物和脂多聚复合物如前所述掺入PLGA微球中，并将包埋的PLGA微球如前所述固定在PLLA纳米纤维支架上。将支架放置于0.2 mL PBS中并在50 rpm于37°C摇动。2天后，收集释放介质并在上述条件下与成骨细胞共培养。
转染后48小时，细胞使用共焦激光扫描显微镜(Nikon C1-si TE2000，Japan)观察(在图18A中以黑白显示)并提取RNA用于进一步实时RT-PCR检验。释放的多聚复合物和脂多聚复合物在体外的生物功能性转染效率通过如上所述定量荧光强度(结果在图18B中示出)和miRNA表达水平(结果在图18C中示出)测定。共焦图像(图18A)、荧光强度定量(图18B)和使用实时PCR定量的miRNA表达(图18C)显示HP/miRNA多聚复合物具有比LP/miRNA多聚复合物和lipofectamine 2000更高的转染效率并导致细胞中更高的miRNA表达。
对于Cy3-标记的多聚复合物或Cy3-标记的agomir在体内的细胞摄入和miRNA表达分析，将具有包含FITC-标记的多聚复合物或Cy3-标记的agomir的PLGA微球固定在其上的PLLA支架植入裸鼠的皮下袋中。术后2周，采集植入物用于荧光图像观察和RNA提取。
提取的细胞使用共焦激光扫描显微镜(Nikon C1-si TE2000，Japan)观察(在图19A中以黑白显示)并提取RNA用于进一步实时RT-PCR检验。释放的多聚复合物和脂质体在体内的生物功能性转染效率通过如上所述定量荧光强度(结果在图19B中示出)和miRNA表达水平(结果在图19C中示出)测定。共焦图像(图19A)、荧光强度定量(图19B)和使用实时PCR定量的miRNA表达(图19C)显示HP/miRNA多聚复合物具有比LP/miRNA多聚复合物和lipofectamine 2000更高的转染效率并导致细胞中更高的miRNA表达。
颅盖骨缺陷模型构建
将C57BL/6J小鼠随机分成三组。将动物用2%异氟烷吸入剂麻醉。线性头皮切口从鼻骨向枕骨部做出，使全厚瓣(flaps)隆起。将覆在颅盖骨上的骨膜完全切除。使用环锯建立集中于顶部颅盖骨上的5-mm穿颅术缺陷，并在钻孔时将伤口用Hanks平衡盐溶液大量冲洗。将颅盖盘(calvarial disk)小心移除以避免损伤下面的硬脑膜或脑。
小心止血后，将无细胞miRNA持续递送系统放置入缺陷中。这些递送系统包括具有非包埋的HP/miRNA多聚复合物固定于其上的PLLA支架，以及具有HP/miRNA多聚复合物-包埋的PLGA微球固定于其上的PLLA支架。PLGA 6.5k用于短期释放，PLGA 64k用于长期释放。支架填满整个缺陷。
切口用4-0 Braided Absorbable Suture (Covidien, USA)缝合，小鼠在加热垫上从麻醉恢复。植入8周后将所有小鼠处死并收集颅盖。
显微CT分析和骨组织学分析
对于使用显微CT胫骨近端分析，将样本包埋在1%琼脂糖中并放置在19 mm管中，使用显微CT系统(μCT100 Scanco Medical, Basserdorf, Switzerland)在整个胫骨长度之上扫描。扫描设置为：体素尺寸15 mm，70 kVp，114 mA，0.5 mm AL滤器，和积分时间500ms。显微CT分析使用制造商的评估软件进行，使用对于骨皮质28% (灰度级0-1000上280)和对于小梁骨18%的固定全局阈值分隔骨与非骨。分析生长板直接下方的0.75 mm的小梁骨区域，并分析位于胫腓关节3 mm近端的0.5 mm皮质区。对于颅盖骨分析，将顶部颅盖骨区域用固定的全局阈值20% (灰度级0-1000上200)扫描。将来自每一所选切片的所有小梁骨分段用于三维重构以计算下列参数：骨矿物质密度(BMD, 图20E)和相对骨体积(骨体积/总面积，图20D)。
对于使用显微CT的颅盖骨缺陷修复检测(Siemens AG, Germany)，将样本装配在圆筒状样品架中，颅盖骨的冠状面在水平位置上。样本以平行于颅盖骨冠状面的扫描方向以固定的同位体素尺寸12 mm扫描以覆盖整个颅盖骨厚度。分析使用制造商的评估软件和固定的全局阈值25% (灰度级0-1000上250)进行。用于分析的5 mm目的圆形区域集中在缺陷的中心。在样本的三维图像上，直接测量缺陷位点的骨体积(mm3)和BMD。
对于骨组织学分析，将样本(来自皮下植入物和颅盖骨缺陷修复模型)用4%福尔马林固定，用10% EDTA脱钙并随后包埋入石蜡中。将冠状切片(6 μm厚)用苏木精和伊红(H&E)染色。对于缺陷区域新形成组织中OCN (骨钙素)表达的免疫荧光分析，将载片脱包埋，然后在柠檬酸盐缓冲液(2.1 M柠檬酸，pH 6.0)中在120 ℃蒸煮30分钟用于抗原修复。在血清中封闭后，将切片在4℃用针对OCN的兔多克隆第一抗体(1:100, Abcam)孵育过夜。在PBS中洗涤三次后，将切片用FITC缀合的针对兔IgG的驴抗体(1:400, Santa Cruz)孵育1小时。阴性对照实验通过省略第一抗体进行。将切片用包含DAPI (Vector Laboratories)的介质固定，然后在共焦显微镜(Eclipse C1 Plus, Nikon, Japan)下检查。
显微CT分析和骨组织学分析的结果表明本文所公开的支架通过支撑成骨关键因子高水平表达持续延长的时间段显著改善临界尺寸的颅盖骨缺陷修复。
图20A说明(以黑白)具有非包埋的HP/miRNA多聚复合物的PLLA支架的低放大率和高放大率的显微CT图像和H&E染色的图像。HP/miRNA多聚复合物(标记的并且称为“miR-26a-bolus”)和阴性对照多聚复合物(标记的并且称为“NC-bolus”)二者的结果均示出。
图20B说明(以黑白)具有HP/miRNA多聚复合物-包埋的PLGA 6.5k微球的PLLA支架的低放大率和高放大率的显微CT图像和H&E染色的图像。HP/miRNA多聚复合物-包埋的PLGA6.5k微球(标记的并且称为“miR-26a-HP-short”)和阴性对照多聚复合物(标记的并且称为“NC-HP-short”)二者的结果均示出。
图20C说明(以黑白)具有HP/miRNA多聚复合物-包埋的PLGA 64k微球的PLLA支架的低放大率和高放大率的显微CT图像和H&E染色的图像。HP/miRNA多聚复合物-包埋的PLGA64k微球(标记的并且称为“miR-26a-HP-long”)和阴性对照多聚复合物(标记的并且称为“NC-HP-long”)二者的结果均示出。
如上文所指出的，图20D和20E为描绘每一样品的相对骨体积(骨体积/总面积)和骨矿物质密度(BMD, 图20E)的图。
显微CT和HE染色的组织学图像显示在所有NC递送组中在颅盖缺陷中存在非常少量的新骨形成(图20A-20E)。miR-26a bolus递送轻微改善新骨形成，但不以统计显著的水平(图20A、20D和20E)。短期持续的miR-26a递送(即，miR-26a-HP-short)以统计显著的水平增强新骨形成(图20B、20D和20E)。长期持续的miR-26a递送(即，miR-26a-HP-long)导致完全修复的缺陷(图20C)，伴随显著的骨体积增加(图20D)。
定量显微CT分析显示与显著的新骨体积增加一致，短期和长期持续的miR-26a释放组的骨矿物质密度(BMD)也增加(图20E)。
实施例1的RNA提取和实时(RT)-PCR
RNA提取和实时PCR在整个实施例1中进行几次。在每一情况下，来自收集的细胞的总miRNA使用miRNeasy Mini Kit (Qiagen, USA)提取。简言之，将细胞收集在反应管中，用700 μL QIAzol裂解并与140 μL氯仿混合。在4℃以12,000 g离心15分钟后，将上面的水相转移至2-mL收集管中的RNeasy Mini离心柱中并与100%乙醇混合。用700 μL Buffer RWT和500 μL Buffer RPE洗涤后，将总miRNA收集用于实时PCR分析。
互补DNA (cDNA)使用Geneamp PCR (Applied Biosystems)用TaqMan反转录试剂和在25℃孵育10分钟、在48℃反转录30分钟以及在95℃灭活5分钟合成。将1 μL cDNA使用Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen) PCR扩增。将2 μL合成的cDNA的1:10稀释物用于实时PCR。
实施例1中统计分析
实施例1中所有数值数据以平均值±s.d.呈现。所有的统计分析用SPSS 13.0进行。组之间的统计差异通过单向ANOVA分析。两个组之间的统计差异差通过Student t检验确定。P< 0.05被认为是统计显著的。
实施例2
HP和LP对DNA的亲和力
将来自实施例1的各个超支化和线性聚合物溶液(1.0 mg/mL)缓慢加入包含1 μg DNA(pUC18 DNA，Thermo Scientific)的DNA溶液中。加入的聚合物溶液的量基于所选的聚合物/DNA混合物的N/P比率(N/P =聚合物氮原子数目相对于DNA磷原子数目)计算。将混合物在室温孵育30分钟用于多聚复合物形成。
将与4 μL 1×上样缓冲液混合的10 μL多聚复合物溶液样品上样至琼脂糖凝胶。多聚复合物在包含GelRed的0.7%琼脂糖凝胶上用Tris-乙酸盐(TAE)运行缓冲液(pH 8)在80 V下电泳45分钟。使用UV (254 nm)照明器使DNA条带可视化，并用BioSpectrum成像系统(USA)拍照。结果在图21中示出。
超支化和线性聚合物对DNA的结合亲和力使用上述琼脂糖凝胶电泳测定检测。图21中的结果表明超支化聚合物能够以比相应的线性聚合物更低的N/P比率阻滞DNA迁移。这些结果证明超支化聚合物具有比相应的线性聚合物更高的对DNA的亲和力，允许超支化聚合物/DNA多聚复合物中DNA的高效负载。这些结果还证明较高分子量的聚合物具有比较低分子量的聚合物更高的对DNA的亲和力。这些结论与超支化聚合物比线性聚合物具有更高的结合亲和力和更高的RNA负载效率一致。
实施例3
微小RNA-140的HP递送增强干细胞的软骨形成和预防软骨内肥大
P3人BMSC (ATCC)用添加10%胎牛血清(FBS)的α-MEM在Φ 100mm皿中培养。当细胞达到90%汇合时，将其用微小RNA-140转染。具体地，将13.7 µL HP3聚合物 (1 mg/mL)与12.5 µL20 µM miR-140混合，一小时后，将转染混合物加入细胞培养物。一天后，将用miR-140和模拟对照转染的细胞胰酶消化并接种至孔尺寸150 nm-225 nm直径的多孔NF PLLA支架中。将细胞/支架构建体用软骨形成培养基(HG-DMEM，添加1% FBS、0.1 mM抗坏血酸、1x ITSPremix、0.1 µM Dex和10 ng/mL TGF-β1)再培养五周。然后构建体用4%多聚甲醛固定过夜，并进行石蜡切片以得到7-µm切片。
进行Safranin-O和固绿，以及免疫组织学(Col II、X和MMP-13)染色以评价软骨形成和肥大性改变。如图22中所示，与模拟对照相比，用miR-140预转染促进维持细胞软骨形成(Safranin-O和固绿，Col II)，并一定程度预防细胞肥大。(比例尺：在图22中100 µm)。
实施例4
通过HP聚合物递送的miR-10a增强小鼠中Foxp3 + 调节性T细胞的体外分化
Foxp3+调节性T细胞(Tregs)为T细胞亚群，其主要是可以抑制其它免疫细胞引起的免疫反应和炎症。认为Tregs在维持免疫耐受中发挥重要作用。Tregs可从CD4+ T细胞用转化生长因子-β (TGF-β)和白细胞介素-2 (IL-2)诱导分化。提高Tregs的量可为用于治疗自身免疫和炎症性疾病的新方法。微小RNA (miRNA)有助于Tregs稳定性和功能。已经报道miR-10a在Tregs中表达，但不在其它T细胞中表达。在本实施例中，假设miR-10a可增强Tregs分化。
对于这一体外研究，将小鼠脾CD4+ T细胞用正向选择的磁性微珠富集。细胞用包含10% FBS的RPMI 1640培养基在包含板-结合的抗CD3和可溶性抗CD28抗体的96孔板中培养。对于Tregs分化，将5 ng/ml TGF-β1和50 U/ml IL-2加入培养基中。
将miR-10a (20∼80 μM)用来自实施例1的HP3聚合物溶液(1.0 mg/ml)孵育30分钟，然后将多聚复合物用于转染CD4+ T细胞。诱导4天后，将细胞收集并用1μg/ml Foxp3抗体染色，Foxp3 + T细胞的百分比用流式细胞术分析。结果显示在CD4+ T细胞中20μM、40μM和80μM的miR-10a促进Tregs分化，分别从11.81 ± 0.19% (图23A)到16.02 ± 0.01% (图23B)、15.96 ± 0.21% (图23C)和15.74 ± 0.21% (图23D) (P < 0.01)。这些数据提示使用HP聚合物以剂量≥ 20 μM递送miR-10a在体外改善调节性T细胞的分化，达到与现有药物相似的水平。图23A-23D的结果在图24的图中显示。HP递送miR-10a是用于治疗自身免疫和炎症性疾病的潜在有效的备选方案。
实施例5
聚合物/NR4A1多聚复合物的制备
超支化聚合物(HP)以实施例1所述相同的方式形成。在本实施例中，使用聚乙烯亚胺(PEI，Mw 800 Da)、聚乙二醇甲基醚(PEG，Mw 2000 Da)和超支化双-MPA聚酯(H40: 64羟基)。
将设计的H40聚合物溶液(1.0 mg/mL)缓慢加入包含60 pmol NR4A的DNA溶液中。所加入的聚合物的量基于所选择的聚合物/DNA的N/P比率(聚合物的N氮原子相对于DNA的P磷酸基)计算。将混合物在室温下孵育30分钟用于多聚复合物形成。
NR4A1首先与超支化聚酯核心外壳上的PEI复合。HP分子核心和PEI/NR4A1壳一起组装成疏水性球形壳，其夹在3-层纳米球的内部PEG核心和外部PEG链之间。
包含聚合物/NR4A1多聚复合物的PLGA纳米球(NS)和NS-掺入的纳米纤维海绵微球 (NF-SMS)的制备
包含聚合物/NR4A1多聚复合物的PLGA (聚(丙交酯共乙交酯)，平均分子量64,000)纳米球(NS)使用改进的水包油包水(w/o/w)双乳化方法制造。简言之，将30 mg PLGA溶解于1mL二氯甲烷中。将100 μL N/P为8的聚合物/NR4A1多聚复合物的水溶液加入上述溶液中并用探头超声仪(Virsonic 100，Gardiner，NY)在50W乳化。然后将该初级w/o乳液在90W超声下乳化至10 mL PVA溶液(1% wt/vol)中以形成w/o/w乳液。产生的二级乳液在室温下磁力搅拌约12小时以蒸发溶剂。PLGA NS (平均直径300 nm)通过离心收集，用水洗涤三次并冻干。
尽管数据没有示出，用PLGA64k形成的PLGA NS显示聚合物/NR4A1多聚复合物在第一天爆发释放后持续释放超过一个月。
合成星形聚(L-乳酸)-共-聚HEMA (SS-PLLA-共-聚HEMA)并使用乳化和相分离技术组装成纳米纤维海绵微球(NF-SMS)。更具体地，将聚合物(0.4 g)以2% w/v的浓度在50℃溶于THF中。在严格的机械搅拌(速度9，Fisher Science Inc.)下，将星形PLLA溶液三倍体积的甘油(50℃)逐步加入聚合物溶液中。搅拌5分钟后，将混合物迅速倒入液氮中。10分钟后，加入冰水混合物(1 L)用于溶剂交换24小时。将微球筛分并用蒸馏水洗涤8次以去除球表面残留的甘油。然后将球冻干三天。
PLGA NS使用后接种的方法固定在NF-SMS上。简言之，将PLGA NS分散在具有0.1%的司盘80的己烷中并逐滴接种到NF-SMS上。然后，NF-SMS经受己烷/THF的混合溶剂(按体积计9:1)蒸气30分钟。将NF-SMS在真空下干燥3天以去除溶剂。
NS掺入之前和之后PLGA NS和NF-SMS的形态学和尺寸通过扫描电镜(PhilipsXL30 FEG SEM)表征。将PLGA NS和NF-SMS使用溅射镀膜仪(DeskII, Denton vacuum Inc)在表面镀金。镀金过程期间，气压为50豪托，电流为40 mA。涂覆时间为120秒。样品在15 kV下分析。
NS掺入之前和之后PLGA NS和NF-SMS的SEM图像在图25A-25E中示出。图25A为包含聚合物/NR4A1多聚复合物的PLGA NS的SEM。图25B和25C分别为1000x和5000x放大率的PLGANS掺入之前的NF-SMS的SEM图像。这些图像具体说明NF-SMS的互连多孔结构(图25B)和孔壁上的纳米纤维(平均直径100 nm) (图25C)。图25D和25E分别为2000x和5000x放大率的PLGANS掺入之后的NF-SMS的SEM图像。
SEM图像显示NF-SMS中有利于细胞迁移和传质的孔间空隙和孔的互连性以及有利于组织再生的纳米纤维形态在PLGA NS固定化程序后保留。此外，这些图像证实PLGA NS良好地分布于整个NF-SMS。
体外至髓核(NP)细胞的转染效率
为了检查本实施例的HP用于NR4A1基因的转染效率，将NP细胞用N/P比率为8的聚合物/NR4A1多聚复合物转染。负载无NR4A1表达的空质粒DNA的HP用作阴性对照。转染后48小时，与阴性对照中相比，用聚合物/NR4A1多聚复合物转染的细胞中存在显著更强的对NR4A1荧光染色(参见图26A-26F)。一致地，用聚合物/NR4A1多聚复合物转染的NP细胞表达比对照细胞显著更高水平的NR4A1 mRNA，如通过实时PCR所检测的(图26G)。平行地，这些NP细胞也表达比对照细胞显著更高水平的NR4A1蛋白，如蛋白质印迹所检测的(图26H)。
NR4A1在NP细胞中的抗纤维化作用
抗体用于染色健康和变性的人NP组织中NR4A1蛋白和纤维化标志，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，由基因ACTA2编码)。尽管染色的结果未示出，发现NR4A1蛋白在健康的NP组织中高度表达，但在变性组织中微弱地表达。一致地，发现NR4A1 mRNA水平在健康NP组织中比在变性NP组织中显著更高，如图27的图中所示。
为了验证过表达NR4A1能够导致对TGF-β信号传导途径诱发的纤维化反应的保护作用，α-SMA表达和应力纤维形成在用TGF-β1 (10 ng·ml−1)以及聚合物/NR4A1多聚复合物或超支化聚合物空载体孵育的人NP细胞中检查。尽管免疫荧光染色结果未示出，发现与空白pDNA组(负载空白质粒DNA的HP)中相比，聚合物/NR4A1多聚复合物转染组(负载NR4A1pDNA的HP)中对α-SMA和应力纤维的免疫荧光染色显著减少。对α-SMA表达的作用在图28A的图中示出，对应力纤维形成的作用在图28B的图中示出。这些结果表明通过NR4A1的过表达，TGF-β的纤维化作用减少。
体内基因治疗功效
大鼠尾中针穿刺用于诱导尾椎中椎间盘变性(椎间盘纤维化)。一组保持未处理(称为变性模型组)，另一组用NS-掺入的NF-SMS (即，HP-NR4A1/NF-SMS)处理，并且另一组用掺入超支化聚合物空载体的NF-SMS (即，HP-空白/NF-SMS)处理。正常对照组不穿刺或处理。更具体地，初始针穿刺后4周，对于处理组，将NS-掺入的NF-SMS或空白载体-掺入的NF-SMS注射入初始针穿刺附近的大鼠尾。注射后，孔用颗粒状明胶泡沫填充以防止注射的悬浮液溢出。
处理4周或未处理8周后，将来自各组的样品首先关于肉眼外观和使用µCT成像评估。这些结果在图29A-29H中示出。如图29B和29F中所示，在变性模型组中，NP几乎完全消失并且最严重的纤维化发生在NP组织的中心区域。µCT图像表明，与变性模型组(图29F)和空白载体-掺入的NF-SMS组(图29G)相比，具有较大椎间盘高度的NS-掺入的NF-SMS处理组中(图29H)椎间盘再生的特征。值得注意地，NS-掺入的NF-SMS组在肉眼外观中也显示更大的半透明椎间盘基质区域和更少的纤维组织(图29D)。基于肉眼外观和µCT成像数据，空白载体-掺入的NF-SMS组中的椎间盘与有狭窄的椎间盘空间和纤维组织侵入的变性模型组相似(比较图29C和29G与图29B和29F)。
治疗功效在注射NS-掺入的NF-SMS 4周后使用组织学分析进一步评估(参见图30A-30L)。在正常对照组的完整椎间盘中，椭圆形的NP在正中矢状横截面中占据大体积的椎间盘空间，如由HE染色所证实的(图30A和30E)。NP区域由Safranin-O强染色，表明高糖胺聚糖(GAG)含量(图30I)。变性模型组中，椎间盘空间皱缩，伴随明显的纤维组织侵入(图30B、30F和30J)。虽然在NS-掺入的NF-SMS (HP-NR4A1/NF-SMS)组中椎间盘仍然显示一定程度的变性特征(图30D、30H和30L)，但是与变性模型组(图30B、30F和30J)或空白载体-掺入的NF-SMS (HP-空白/NF-SMS)组(图30C、30G和30K)相比，存在明显的治疗功效。NS-掺入的NF-SMS组中的NP区域与正常对照相似并且用Safranin-O阳性染色(图30L)。在空白载体-掺入的NF-SMS组中，存在不均一的纤维组织，并且NP区域对Safranin-O为阴性染色(图30C、30G和30K)。
对细胞外基质中胶原的Masson’s Trichrome染色以及对胶原I型和α-SMA的免疫组织化学染色用于评估体内纤维组织形成(图31A-31P)。在正常对照组的完整椎间盘中，NP区域对于Masson’s Trichrome (胶原)、I型胶原和α-SMA染色阴性(图31A、31E、31I和31M)。在变性模型组中，NP区域对于Masson’s Trichrome、I型胶原和α-SMA染色阳性(图31B、31F、31J和31N)。在空白载体-掺入的NF-SMS (HP-空白/NF-SMS)组中NP区域对Masson’sTrichrome、胶原I型和α-SMA也为染色阳性(图31C、31G、31K和31O)。这些纤维组织染色在NS-掺入的NF-SMS (HP-NR4A1/NF-SMS)组中微弱(图31D、31H、31L和31P)。
本实施例中的数据支持结论：可注射的两阶段NR4A1质粒DNA (pDNA)递送纳米纤维海绵微球(NF-SMS)逆转纤维化变性和促进椎间盘再生。
实施例6
支持结构的制备
合成星形聚(L-乳酸)-共-聚HEMA (SS-PLLA-共-聚HEMA)并使用乳化和相分离技术组装成纳米纤维海绵微球(NF-SMS)。更具体地，将聚合物(0.4 g)以2% w/v的浓度在50℃溶于THF中。在严格的机械搅拌(速度9，Fisher Science Inc.)下，将星形PLLA溶液三倍体积的甘油(50℃)逐步加入聚合物溶液中。搅拌5分钟后，将混合物迅速倒入液氮中。10分钟后，加入冰水混合物(1 L)用于溶剂交换24小时。将微球筛分并用蒸馏水洗涤8次以去除球表面残留的甘油。然后将球冻干三天。
在微观尺度上，NF-SMS具有贯穿整个微球的互连的孔结构(图32A)。NF-SMS中的孔具有平均直径约15 µm，其为高度互连的(孔之间的孔间空隙在尺寸上约10 µm)。在纳米尺度上，NF-SMS完全由ECM仿制纳米纤维组成。由于仿生纳米纤维和高度多孔结构的共同存在，假设NF-SMS同时促进MSC接种和附着。无多孔结构的纳米纤维微球(图32B)和无NF结构的常规平滑微球(图32C)用作对照以检验该假设。
细胞接种24小时后，兔间质干细胞(MSC)附着到NF-SMS的外部表面和内部孔二者上，具有更球形的3D形态(图32D)。MSC仅能够附着到纳米纤维微球的外部表面，也具有更球形的形态(图32E)。在平滑的微球上，表面上存在似乎较少但散布的细胞(图32F)。
聚合物/抗-miR-199a多聚复合物的制备
超支化聚合物(HP)以实施例1所述相同的方式形成。在该实施例中，使用聚乙烯亚胺(PEI，Mw 800 Da)、聚乙二醇甲基醚(PEG，Mw 2000 Da)和超支化双-MPA聚酯(H40: 64羟基)。
将设计的H40聚合物溶液(1.0 mg/mL)缓慢加入包含60 pmol抗-miR-199a的RNA溶液中。所加入的聚合物的量基于所选择的聚合物/RNA的N/P比率(聚合物的N氮原子除以RNA的P磷酸基)计算。混合物在室温下孵育30分钟用于多聚复合物形成。
抗-miR-199a首先与超支化聚酯核心外壳上的PEI复合。HP分子核心与PEI/抗-miR-199a壳一起组装成疏水性球形壳，其夹在3-层纳米球的内部PEG核心和外部PEG链之间。
包含聚合物/抗-miR-199a多聚复合物的PLGA纳米球(NS)的制备
包含聚合物/抗-miR-199a多聚复合物的PLGA (聚(丙交酯共乙交酯)，平均分子量64,000)纳米球(NS)使用改进的水包油包水(w/o/w)双乳化方法组装。简言之，将30 mg PLGA溶解于1 mL二氯甲烷中。将100 μL N/P为10的聚合物/抗-miR-199a多聚复合物的水溶液加入上述溶液中并用探头超声仪(Virsonic 100，Gardiner，NY)在50W乳化。然后将该初级w/o乳液在90W超声下乳化至10 mL PVA溶液(1% wt/vol)中以形成w/o/w乳液。将产生的二级乳液在室温下磁力搅拌约12小时以蒸发溶剂。PLGA (抗-miR-199a) NS (平均直径300 nm)通过离心收集，用水洗涤三次并冻干。
细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体的形成
将PLGA (抗-miR-199a) NS (包括包埋在其中的聚合物/抗-miR-199a多聚复合物)与具有兔间质干细胞(MSC)附着在其上的NF-SMS混合(如图32D所示)。
作为一些检验的对照，将超支化聚合物空白载体与具有兔间质干细胞(MSC)附着其上的NF-SMS混合(如图32D所示)。这些构建体在本实施例中称为细胞/空白HP/NF-SMS构建体。
细胞/PLGA (抗-miR-199a)NS/NF-SMS构建体的皮下植入
为了研究经工程改造的髓核样表型的长期稳定性，将细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体在体外用TGF-β1培养3周，然后皮下植入裸鼠。无TGF-β1诱导的细胞/PLGA(抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体用作第一对照，具有TGF-β1诱导的细胞/空白HP/NF-SMS构建体用作第二对照。
移植8周后，收集各个构建体以检查抗-miR-199a在体内对维持髓核样表型的作用。将各个构建体用H&E、Safranin-O和Von Kossa染色。第一对照的结果在图33A、33D和33G中示出。第二对照的结果在图33B、33E和33H中示出。细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体的结果在图33C、33F和33I中示出。
在具有TGF-β1诱导的细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体中观察到用Safranin-O对糖胺聚糖(GAG)强阳性染色(图33F)。这些相同的构建体对矿化(通过VonKossa方法)染色阴性(图33I)。相比之下，植入的具有TGF-β1诱导的细胞/空白HP/NF-SMS构建体(第二对照)由大区域的骨化组织组成，并对于分别使用Safranin-O (图33E)和vonKossa方法(图33H)的GAG和矿化染色阳性。植入的无TGF-β1诱导的细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体(第一对照)对于使用Safranin-O (图33D)和von Kossa方法(图33G)的GAG和矿化染色阴性。这些结果表明抗-miR-199a在皮下植入后维持髓核样表型和预防矿化中起重要作用。
经皮穿刺的变性椎间盘模型和miRNA (抗-miR-199A)递送
麻醉后，将兔以侧卧位放置在荧光镜检查成像台上。在C-臂图像的引导下，将18号穿刺针使用后外侧入路在中线棘突外侧1-2 cm的点以与脊柱30-45度的角度插入椎间盘(IVD)。将针小心推进至IVD空间的侧缘而不接触椎体以避免骨赘形成。将针轻轻地插入椎间盘空间。来自C-臂投射的前后和侧视图用于引导将针放置入IVD中央。验证针在IVD中后，吸入约0.005至0.008 g髓核以诱导椎间盘变性模型。吸入的椎间盘碎片在解剖显微镜下仔细检查以确认仅吸入髓核。
第一次手术后4周，采用相同的方法插入25G针至对侧相同的IVD。对于一个组，注射包埋在PLGA纳米颗粒中的多聚复合物(HP-抗-miR-199a)组合NF-SMS和兔MSC (即，细胞/PLGA (miRNA) NS/NF-SMS构建体)以治疗针穿刺诱导的腰椎盘变性。对于另一组，注射包埋在PLGA纳米颗粒中的超支化聚合物组合NF-SMS和兔MSC (即，细胞/空白HP/NF-SMS构建体)。在这些注射后，孔用颗粒状明胶泡沫通过插管填充以防止注射的悬浮液溢出。荧光镜检查成像用于显示针通过该经皮方法插入IVD空间中。
另一组仍然保持未处理(称为假手术组)。正常对照组未穿刺或处理。
细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体注射的体内作用
处理6周后，从正常对照、假手术组、用细胞/空白HP/NF-SMS构建体处理的组和用细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体处理的组收集样品。肉眼外观和荧光镜检查图像用于评估治疗功效(参见图34A-H)。在假手术组(穿刺但未处理)中，NP几乎完全消失，但在IVD空间周围存在异位骨形成(图34B和34F)。与假手术组(图34F)相比，在具有较大的椎间盘高度的细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体组(图34H)中存在椎间盘再生的特征。值得注意地，细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体组在肉眼外观中显示更多正常的半透明椎间盘基质(图34D)以及在荧光镜检查图像中较少的异位骨形成(图34H)。根据荧光镜检查图像和肉眼外观，在细胞/空白HP/NF-SMS构建体组中的椎间盘与细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体组相似。然而发现细胞/空白HP/NF-SMS构建体组(图34G)中的椎间盘空间比细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体组(图34H)中的狭窄。
产生了各组中兔腰椎的三维(3D)重建和横截面µCT扫描，虽然结果没有示出。使用µCT设备的软件，每一组的骨赘骨体积和结果在图35中示出。结果证实正常对照组中完全缺乏异位骨化。细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体组中的异位骨化面积显著小于假手术组和细胞/空白HP/NF-SMS构建体组。
治疗功效在注射构建体6周后使用组织学分析评估(参见图36A-36P)。H&E和Safranin-O染色在各个样品上进行。在完整椎间盘(正常)对照组中(图36A、36E、36I和36M)，椭圆形的NP在正中矢状横截面中占据大体积的椎间盘空间，如由HE染色所显示的(图36A)。NP区域显示强Safranin-O染色，表明高糖胺聚糖(GAG)含量(图36E和36I)。在假手术组(图36B、36F、36J和36N)中，椎间盘空间皱缩，伴随明显的纤维组织侵入。虽然在细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体组中椎间盘仍然显示一定程度的变性特征(图36D、36H、36L和36P)，但与假手术组(图36B、36F、36J和36N)相比治疗功效是明显的。细胞/PLGA(抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体组中的NP区域与正常对照组相似，并且用Safranin-O染色阳性(图36H和36L)。在细胞/空白HP/NF-SMS构建体组(图36C、36G、36K和36O)中，与细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体组相比，NP区域由Safranin-O染色较弱。与细胞/PLGA (抗-miR-199a) NS/NF-SMS构建体组(图36P)相比，骨终板(BEP)厚度和异常/终板钙化在假手术组和细胞/空白HP/NF-SMS构建体组中(图36O)显著较高。
总之，抗-miR-199A的持续递送基本上抑制NP纤维化和异常矿化，并显著减少NP变性。
在实施例6中，将PLGA NS (包括包埋在其中的聚合物/抗-miR-199a多聚复合物)、细胞和NF-SMS混合在一起。然而，应理解的是细胞和PLGA NS可使用后接种方法固定在NF-SMS上。作为实例，兔MSC和PLGA (抗-miR-199a) NS可分散在己烷中并逐滴接种在NF-SMS上。然后，NF-SMS可经受己烷/THF混合溶剂(按体积计9:1)蒸气30分钟。NF-SMS可在真空下干燥3天以去除溶剂。作为该类型方法的结果，细胞和PLGA NS变得固定在NF-SMS上。
在本文所公开的实施例中，已开发了基于线性聚酯的共聚物和基于超支化聚酯的共聚物。超支化共聚物显示非常高的miRNA或pDNA结合亲和力和非常低的毒性。超支化树枝状聚酯核心提供疏水性并促成共聚物的高分子量。在共聚物中，低分子量PEI (低毒性)嫁接在树枝状超支化聚酯核心的表面以分布其正电荷。低分子量PEI也由嫁接的长PEG链覆盖。
如贯穿实施例中所说明的，HP/miRNA多聚复合物自组装成3层纳米颗粒，其中HP/miRNA多聚复合物形成纳米尺寸的球形壳，夹在内部的PEG核心/段和外部的PEG层/段之间。发现双壳样电荷分布非常稳定，即使是在严格的超声下，细胞毒性可忽略不计，并且在转染细胞中高度有效。
另外，本文的实施例证明这些多聚复合物可稳定包封入生物可降解的PLGA微球中并且可以受控地释放很长的持续时间。即使当包封时，多聚复合物仍保持特定的纳米结构并保持其生物学活性。也可将多聚复合物-包埋的微球附着到PLLA纳米纤维支架(或其它支持结构)上，其中所释放的HP/miRNA多聚复合物可局部活化内源性细胞以完全再生临界尺寸的骨缺损，而无任何外部引入的细胞。
说明书全文中对“一个实例”、“另一个实例”、“一种实例”等的引用意指与该实例有关描述的具体要素(例如，特征、结构和/或特点)包含在本文所述的至少一个实例中，并且可存在或不存在于其它实例中。另外，应理解的是对于任何实例所描述的要素可以以任何合适的方式在多个不同的实例中组合，除非上下文另有清楚规定。
应理解的是本文提供的范围包括所陈述的范围和所陈述的范围内的任何值或亚范围。例如，范围约30%-约70%应解释为不仅包括明确叙述的约30%-约70%的极限，还包括个体值，例如32%、44.5%、68%等，和亚范围，例如约35%-约65%、约40%-约60%等。此外，当“约”用于描述值时，意指包含所述值的较小变更(至多+/- 10%)。
在描述和要求保护本文所公开的实例中，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数参考，除非上下文另有清楚指示。
尽管已经详细描述了几个实例，应理解的是所公开的实例可经修饰。因此，前述说明书应认为是非限制性的。

Claims (15)

1.一种超支化聚合物，包括：
超支化疏水性分子核心；
连接到超支化疏水性分子核心的两个或更多个分支的各个低分子量聚乙烯亚胺链；和
连接到超支化疏水性分子核心的两个或更多个其它分支的各个聚乙二醇链。
2.权利要求1中所定义的超支化聚合物，其中所述超支化疏水性分子核心为包含至少4个末端羟基的超支化聚酯。
3. 权利要求1中所定义的超支化聚合物，其中所述低分子量聚乙烯亚胺链各自具有约400 g/mol-约5,000 g/mol的分子量。
4.一种线性聚合物，包括：
聚乙二醇链；
连接到聚乙二醇链末端的聚酯链；和
作为侧链连接到聚酯链的各个低分子量聚乙烯亚胺链。
5.权利要求4中所定义的线性聚合物，其中所述聚酯链选自聚交酯、聚己酸内酯、聚碳酸酯、聚(磷酸酯)、聚酸酐类和聚乙醇酸。
6. 权利要求4中所定义的线性聚合物，其中所述低分子量聚乙烯亚胺链各自具有约400 g/mol-约5,000 g/mol的分子量。
7.一种超支化多聚复合物，包括：
第一个多个聚乙二醇链形成的亲水性内部部分；
第二个多个聚乙二醇链形成的亲水性外部部分；和
由以下形成的中心部分：
连接到第一个和第二个多个聚乙二醇链的各个的超支化疏水性分子核心；
连接到超支化疏水性分子核心的两个或更多个分支的各个低分子量聚乙烯亚胺链；和
与低分子量聚乙烯亚胺链复合的任何DNA或RNA生物分子。
8.权利要求7中所定义的超支化多聚复合物，其中所述NRA生物分子选自miRNA、mRNA和siRNA。
9.权利要求7中所定义的超支化多聚复合物，其中所述超支化疏水性分子核心为包含至少4个末端羟基的超支化聚酯。
10. 权利要求7中所定义的超支化多聚复合物，其中所述低分子量聚乙烯亚胺链各自具有约400 g/mol-约5,000 g/mol的分子量。
11.权利要求7中所定义的超支化多聚复合物，其中所述DNA生物分子选自pDNA、cDNA、cpDNA、gDNA、msDNA、mtDNA和rDNA。
12. 一种生物可降解的球体，包括：
生物可降解的聚合物基质；和
包埋入生物可降解的聚合物基质中的多个权利要求7的超支化多聚复合物。
13. 一种生物可降解的或易受侵蚀的结构，包括：
支架或水凝胶；和
附着到支架或水凝胶的多个权利要求12的生物可降解的球体。
14.权利要求13中所定义的生物可降解的或易受侵蚀的结构，其中所述支架由包括聚集在一起的多个纳米纤维和至少一些所述多个纳米纤维之间界定的孔的多孔材料形成。
15.用于制造超支化多聚复合物的方法，所述方法包括：
通过以下形成超支化聚合物：将超支化聚酯的羟基转化为羧基，从而形成第一修饰的超支化聚酯；将聚乙二醇链和叠氮基引入第一修饰的超支化聚酯上以形成第二修饰的超支化聚酯；和将各个低分子量聚乙烯亚胺链缀合到第二修饰的超支化聚酯；
形成超支化聚合物的溶液；
混合超支化聚合物溶液与任何DNA溶液或RNA溶液以形成混合物；和
孵育混合物，从而形成超支化多聚复合物。
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