CN110882233A - 一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球及其制备方法和应用，属于生物医用材料技术领域。该方法以可降解高分子为原料，制备负载有活性因子的高分子微球；以生物医用高分子为原料，制备负载有抗癌药物的微纳米粒子；将负载有活性因子的高分子微球和负载有抗癌药物的微纳米粒子复合，得到同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球。本发明利用微纳米粒子修饰可降解微球，一方面通过微球表面的微纳米尺度拓扑形貌改善细胞和组织在微球上的生长；另一方面通过微球和微纳米粒子对药物和活性因子的差异性和顺序性可控释放充分发挥其持久协同治疗的效果，对于缺损组织和器官的治疗修复具有重要的意义。

Description

一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降 解微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球及其制备方法和应用。
背景技术
目前，恶性肿瘤(俗称癌症)在国际上已成为仅次于心血管疾病的第二大死因。手术治疗癌症，即通过手术直接把肿瘤切除是临床中常用的一种癌症治疗方法，是早、中期癌症病人的最主要治疗手段之一。然而这种方法却具有一定局限性，这是因为受癌细胞的浸润性生长以及肿瘤生长特殊位置的限制，外科手术有时很难做到甚至不能做到将肿瘤组织切除干净。此外，多数手术不仅切除肿瘤本身，还会切除肿瘤所在器官或组织，由此影响患者生活质量，甚至造成一定程度的残疾。针对这种情况，研究一种能够在填充修复病损组织的同时还能杀死周围癌细胞的材料将是十分有意义的。
以可降解高分子为原料制备的微球由于具有形状结构的特殊性、良好的生物相容性、降解性以及可调节的物理化学性质，因此在生物医学领域具有广泛的应用前景。一方面，由于可以通过微创注射的方式植入体内，并且大的比表面积有利于细胞和组织的黏附生长，可降解高分子微球常被用于缺损组织的填充和修复。另一方面，可降解高分子微球是缓释控制给药研究领域的一种重要材料，利用微球能够成功实现对抗癌药物的包埋保护、缓释和定向给药。
专利CN102895191B公开了一种纳米颗粒混悬液包油-油包固(S/O/S)制备微球的方法。具体是先将药物颗粒(如肿瘤化疗类、抗生素类小分子药物，或蛋白大分子药物、疫苗、抗体、核酸或脂质体药物等)加到可降解聚合物有机溶液中进行乳化，进一步将上述乳液在纳米颗粒(如聚苯乙烯、交联葡萄糖、二氧化硅、二氧化钛、羟基磷灰石、四氧化三铁、银等纳米颗粒)混悬液中乳化，最后在大量外水相中固化得到表面具有纳米颗粒的可降解高分子微球。微球表面的纳米粒子可起到增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。该方法制备的微球是应用于药物缓释或控释微球的制备及疾病治疗中。专利中虽然也提及了增强细胞粘附，但是并没有列出实际的细胞实验结果。此外该专利中并没有指明所用微球和纳米颗粒在形貌结构上的特殊性。并且该方法中只利用可降解高分子微球包埋了药物。
Keun-Hong Park课题组报导了一系列以微纳米粒子修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球对骨组织修复的研究(Journal of the American Chemical Society 129(2007)5788-5789)(small 2008,4,No.11,1950–1955)(Biomacromolecules 2008,9,2162–2169)(Biomaterials 29(2008)2490–2500)(Biomaterials 30(2009)4796–4805)。在这些研究中，作者以PLGA微球包埋能够诱导干细胞向成骨细胞分化的药物地塞米松，以微纳米粒子包埋能够诱导干细胞向成骨细胞分化的生物活性因子，构建了能够顺序释放药物/活性因子的微纳米粒子复合PLGA微球。体外细胞实验和动物体内实验结果表明这种微球可以有效的促进干细胞的黏附、增殖、分化以及新骨组织的生成。然而该方法中微球和微纳米粒子所包埋的药物和蛋白质均起到促进骨组织修复的作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球及其制备方法和应用。本发明提供的可降解微球具有良好的生物相容性和降解性，制备方法简便易行，利于其对药物的包埋和释放。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：以可降解高分子为原料，制备负载有活性因子的高分子微球；所述的可降解高分子包括脂肪族聚酯或聚酯聚醚共聚物；
步骤二：以生物医用高分子为原料，制备负载有抗癌药物的微纳米粒子；所述的生物医用高分子包括脂肪族聚酯、聚酯聚醚共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈或聚异丁烯中的至少一种；
步骤三：将负载有活性因子的高分子微球和负载有抗癌药物的微纳米粒子复合，使高分子微球上负载微纳米粒子，得到同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球。
优选的是，所述的步骤一或步骤二所述的脂肪族聚酯包括聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)中的一种或几种。
优选的是，所述的步骤一或步骤二所述的聚酯聚醚共聚物包括聚酯-聚醚-官能团两嵌段共聚物PLm-POn-FG、官能团-聚酯-聚醚-聚酯-官能团三嵌段共聚物FG-PLm-POn-PLm-FG，其中：PL代表脂肪族聚酯，PO代表脂肪族聚醚，FG代表端基官能团，m、n为单体的重复单元数。
优选的是，PO包括PEO或PPO中的一种或两种；FG包括氨基—NH2，羧基-COOH，磺酸基-SO3H，羟基-OH，甲氧基-OCH3；m的取值范围为50～5000，n的取值范围为0～500。
优选的是，所述的步骤一中的活性因子包括促进细胞生长和组织愈合的多肽和蛋白质，具体包括特异性粘附多肽RGD、REDV、成骨生长肽(OGP)、血清蛋白(BSA)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)中的一种。
优选的是，所述的步骤二中的抗癌药物包括紫杉醇及其衍生物、喜树碱及其衍生物、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、丝裂霉素、伊立替康、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、卡铂、顺铂、长春碱或长春新碱中的一种。
优选的是，所述的制备负载有活性因子的高分子微球或负载有抗癌药物的微纳米粒子，是在制备高分子微球或微纳米粒子过程中直接包埋活性因子或药物；或者通过偶联剂连接活性因子或药物；或者先制备得到高分子微球或微纳米粒子，然后再通过浸泡活性因子或药物的方式得到的。
优选的是，所述的步骤三中的复合是将负载有活性因子的高分子微球和负载有抗癌药物的微纳米粒子分别分散于溶剂中再混合，或分别经过水解、胺解、酶降解、磺化处理后再混合，或在可降解微球表面涂覆偶联剂后再混合。
本发明还提供上述制备方法得到的同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球，所述的负载有活性因子的高分子微球或负载有抗癌药物的微纳米粒子为实心、中空或多孔结构，负载有活性因子的高分子微球尺寸为10～2,000μm，负载有抗癌药物的微纳米粒子尺寸为1～10,000nm。
本发明还提供上述同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球在组织修复和填充领域上的应用。
本发明的有益效果
本发明提供一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球及其制备方法和应用，该方法是先以可降解高分子为原料，制备负载有活性因子的高分子微球；以生物医用高分子为原料，制备负载有抗癌药物的微纳米粒子；最后将负载有活性因子的高分子微球和负载有抗癌药物的微纳米粒子复合，使高分子微球上负载微纳米粒子，得到同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球。本发明所用的微纳米粒子或具有良好的生物相容性和降解性，或具有特殊的中空多孔结构，从而利于其对抗癌药物的包埋和释放。
本发明所制备的顺序释放药物/活性因子的微纳米结构的可降解微球，通过微球和微纳米粒子对药物和活性因子的差异性和顺序性可控释放充分发挥其持久协同治疗的效果，能够在填充修复病损组织的同时杀死周围癌细胞，从而减缓病灶的扩散，改善患者因手术切除造成的生活质量下降，降低手术后放疗化疗的副作用。
附图说明
图1为实施例1的负载紫杉醇和RGD的微纳米结构多孔PLGA微球表面的SEM照片；
图2为实施例4的负载阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球的药物累计释放曲线。
图3为实施例5的多孔PLA微球、微纳米结构多孔PLA微球、负载阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球的成骨肉瘤细胞增殖抑制实验结果。
图4为实施例6的成骨细胞MC3T3在多孔PLA微球、微纳米结构多孔PLA微球、负载阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球上生长7天的荧光显微镜照片。
具体实施方式
本发明首先提供一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：以可降解高分子为原料，制备负载有活性因子的高分子微球；所述的可降解高分子包括脂肪族聚酯或聚酯聚醚共聚物；
步骤二：以生物医用高分子为原料，制备负载有抗癌药物的微纳米粒子；所述的生物医用高分子包括脂肪族聚酯、聚酯聚醚共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈或聚异丁烯中的至少一种；
步骤三：将负载有活性因子的高分子微球和负载有抗癌药物的微纳米粒子复合，使高分子微球上负载微纳米粒子，得到同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球。
按照本发明，所述的步骤一或步骤二所述的脂肪族聚酯包括聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)中的一种或几种。
按照本发明，所述的步骤一或步骤二所述的聚酯聚醚共聚物优选包括聚酯-聚醚-官能团两嵌段共聚物(PLm-POn-FG)、官能团-聚酯-聚醚-聚酯-官能团三嵌段共聚物(FG-PLm-POn-PLm-FG))，其中：PL代表脂肪族聚酯，PO代表脂肪族聚醚，FG代表端基官能团，m、n为单体的重复单元数。优选的是，PO包括PEO或PPO中的一种或两种；FG包括氨基—NH2，羧基—COOH，磺酸基—SO3H，羟基—OH，甲氧基—OCH3；m的取值范围为50～5000，n的取值范围为0～500。更优选的是所述的聚酯聚醚共聚物有PCL-PEG-OH、PCL-PEG-NH2、PCL-PEG-COOH、PLA-PEG-OH、PLA-PEG-NH2、PLA-PEG-COOH、HO-PCL-PEG-PCL-OH、H2N-PCL-PEG-PCL-NH2、HOOC-PCL-PEG-PCL-COOH、HO-PLA-PEG-PLA-OH、H2N-PLA-PEG-PLA-NH2或HOOC-PLA-PEG-PLA-COOH。
按照本发明，所述的步骤一中的活性因子包括促进细胞生长和组织愈合的多肽和蛋白质，具体包括特异性粘附多肽RGD、REDV、成骨生长肽(OGP)、血清蛋白(BSA)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)中的一种，优选为RGD、REDV或血清蛋白(BSA)。
按照本发明，所述的步骤二中的抗癌药物包括紫杉醇及其衍生物、喜树碱及其衍生物、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、丝裂霉素、伊立替康、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、卡铂、顺铂、长春碱或长春新碱中的一种。优选为紫杉醇、喜树碱或阿霉素。
按照本发明，以可降解高分子为原料，制备负载有活性因子的高分子微球，是指通过乳液溶剂挥发法、双乳液溶剂挥发法、或改进的双乳液溶剂挥发法在制备高分子微球的过程中直接包埋或通过偶联剂连接活性因子得到的，或者先制备得到高分子微球，然后再通过在活性因子中浸泡的方式得到的。
具体的说，当在制备过程中直接包埋时，是将活性因子根据溶解性分散在微球制备过程中的水相或油相溶液中，活性因子浓度优选为0.001-10g/mL，然后通过乳化—固化法制备高分子微球，最终待有机溶剂挥发掉后离心洗涤，得到负载活性因子的高分子微球。
或通过偶联剂连接活性因子时，首先将制备好的高分子微球浸泡在偶联剂的水性溶液中1分钟到3天，其中偶联剂为聚苯乙烯磺酸钠、聚赖氨酸或聚多巴胺，偶联剂溶液浓度优选为0.001-5g/mL，反复离心洗涤去除多余的没有与微球连接的偶联剂，然后浸泡在活性因子的水性溶液中30分钟到3天，活性因子浓度优选为0.001-10g/mL，经过反复离心洗涤去除多余的没有与微球连接的活性因子，最后得到负载活性因子的高分子微球。
或者先通过乳液溶剂挥发法、双乳液溶剂挥发法、或改进的双乳液溶剂挥发法制备高分子微球，然后再通过浸泡的方式获得，具体包括：将制备好的高分子微球浸泡在活性因子的溶液中30分钟到3天，活性因子浓度优选为0.001-10g/mL，经过反复离心洗涤去除多余的没有与微球连接的活性因子，最后得到负载活性因子的高分子微球。
所述的乳液溶剂挥发法制备高分子微球时，制备过程优选如下：将聚合物或聚合物的混合物溶解于有机溶剂中，所述的有机溶剂优选为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或甲苯，制备成油相(O)，其中聚合物浓度优选为0.1～30％(g/mL)，然后将油相O滴加到聚乙烯醇的水溶液(水相(W))中，搅拌速度优选为100～50000rpm，PVA水溶液的浓度优选为0.1～5％(g/mL)，有机相O与水相W的体积比为1:2～1:50，搅拌挥发掉有机溶剂后离心洗涤微球，得到高分子微球。
所述的双乳液溶剂挥发法制备高分子微球时，制备过程优选如下：配制一定浓度的内水相(W1)和油相(O)，W1相浓度优选为0～30％(g/mL)的PVA水溶液；O相为聚合物或聚合物混合物的二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或甲苯溶液，溶液浓度优选为0～30％(g/mL)，将W1相加入到O相，同时按照设定好的参数乳化成乳液E1，乳化机转速优选为2,000～30,000rpm，乳化时间优选为0.1～15min，W1相与O相体积之比优选为1:5～1:100；将E1加入到机械搅拌的外水相W2中，所述的W2相为0～10％(g/mL)的PVA水溶液，W1相与W2相体积之比为1:100～1:10,000，搅拌挥发掉有机溶剂后离心洗涤微球，所用机械搅拌速率优选为50～2000rpm，得到高分子微球。
所述的改进的双乳液溶剂挥发法制备多孔或空心高分子微球时，制备过程优选如下：配制一定浓度的内水相(W1相)和油相(O相)。W1相优选为0～30％(g/mL)的碳酸氢铵(NH4HCO3)水溶液；O相为聚合物或聚合物混合物的二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或甲苯溶液，溶液浓度优选为0～30％(g/mL)，将W1相加入到O相，同时按照设定好的参数乳化成白色乳液E1，乳化机转速优选为2,000～30,000rpm，乳化时间优选为0.1～15min，将E1倒至机械搅拌的外水相W2中，W2相优选为0～10％(g/mL)的PVA水溶液，搅拌挥发掉有机溶剂后离心洗涤微球，所用机械搅拌速率优选为50～2000rpm，得到高分子微球；W1相与O相的体积比优选为1:5～1:100，W1相与W2相的体积比优选为1:100～1:10,000。
当通过上述几种方法制备完高分子微球后，将所述的高分子微球浸泡在活性因子的溶液中，浸泡时间优选为10分钟-2天，得到负载有活性因子的高分子微球。
按照本发明，所述的负载抗癌药物的微纳米粒子的制备方法根据原料的种类而选择，当原料为可降解高分子时，如脂肪族聚酯、聚酯聚醚共聚物，可以采用上述制备负载活性因子的高分子微球的方法即可，当原料为不可降解高分子材料如选自聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈或聚异丁烯时，可采用聚合法制备，所述聚合法包括悬浮聚合法或乳液聚合法，具体制备过程可参考现有文献“中国科学：技术科学，2010年，40卷11期：1383-1388”；“US Patent 4427836,1984./或CN1040333C”；“US Patent 5527613,1996”。
按照本发明，所述的复合是将负载有活性因子的高分子微球和负载有抗癌药物的微纳米粒子分别分散于溶剂中再混合，或分别经过水解、胺解、酶降解、磺化处理后再混合，或在可降解微球表面涂覆偶联剂后再混合。
按照本发明，所述的将负载有活性因子的高分子微球和负载有抗癌药物的微纳米粒子分别经过水解、胺解、酶降解、磺化处理后再混合，其中水解是在碱性溶液中进行的，所述碱性溶液包括但不仅限于KOH或NaOH的水溶液。所述KOH或NaOH水溶液的浓度为0.0001～15M，优选为0.001～10M，更优选为0.01～5M。根据本发明，所述的胺解是在胺的水溶液中进行的，所述胺包括但不仅限于甲胺、乙二胺或三乙胺。所述胺的水溶液浓度为0.0001～20M，优选0.01～15M，更优选0.1～10M。根据本发明，所述的酶降解中选用的酶选自对所选生物可降解聚合物具有专一性的酶，优选为蛋白酶K、假单胞菌脂肪酶，所述酶以酶的缓冲溶液或水溶液的形式使用，所述缓冲溶液例如是磷酸盐缓冲溶液。所述的磺化处理是在浓硫酸中进行。
按照本发明，所述将负载有活性因子的高分子微球和负载有抗癌药物的微纳米粒子表面涂覆偶联剂后再混合，所述偶联剂包括但不仅限于聚苯乙烯磺酸钠、聚赖氨酸、或聚多巴胺。
按照本发明，所述复合优选是先将表面处理的负载有抗癌药物的微纳米粒子分散于水中，得到水溶液，然后将处理后的负载有活性因子的高分子微球浸泡在过量的上述水溶液中；所述的负载有抗癌药物的微纳米粒子的浓度优选为2-10mg/ml。
本发明还提供上述制备方法得到的同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球，所述的负载有活性因子的高分子微球或负载有抗癌药物的微纳米粒子为实心、中空或多孔结构，负载有活性因子的高分子微球尺寸为10～2,000μm，负载有抗癌药物的微纳米粒子尺寸为1～10,000nm。
本发明还提供上述同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球在组织修复和填充领域上的应用。
下面通过实例对本发明做进一步描述，其目的是更好的理解本发明的内容。因此，所举实例并不限制本发明的保护范围。
实施例1负载紫杉醇和RGD的微纳米结构多孔PLGA微球的制备
配制2.5mL，10％(g/mL)的PCL/CHCl3溶液，然后加入100μg紫杉醇，将上述溶液和5ml，0.5％(g/mL)的PVA水溶液在200w下超声1min得到乳液，将上述乳液加入100ml 0.5％(g/mL)的PVA水溶液中，700rpm下继续搅拌5h待CHCl3挥发干净后得到包埋紫杉醇的PCL微纳米粒子，洗涤并收集。进一步将制备得到的PCL纳米粒子浸泡于过量0.1M的NaOH溶液中30min，反复洗涤过滤除去纳米粒子表面多余NaOH。
配制PLGA/CH2Cl2溶液作为油相(O)，将该溶液放置于匀浆机下并浸于冰水浴中保持温度，向油相中加入配制好的内水相(W1)，同时按照设定的参数进行乳化得到乳液(E1)，然后于室温下将E1迅速倒入正在机械搅拌的外水相(W2)中，继续搅拌4h待CH2Cl2挥发干净后得到共聚物微球，洗涤并收集。其中W1相为含有100μg RGD的1.25ml，5％(g/mL)的NH4HCO3水溶液；O相为4ml，6.25％(g/mL)的PLGA/CH2Cl2溶液；W2相为150mL，0.1％(g/mL)的PVA水溶液。匀浆机乳化时的转速为21,000rpm，乳化时间为3min。外水相机械搅拌的转速为400rpm。进一步将制备得到的PLGA多孔微球浸泡于过量2M的乙二胺溶液中10min，反复洗涤过滤除去微球表面多余乙二胺。
最后将水解的PCL纳米粒子以6mg/mL浓度分散在水中，将胺解的PLGA多孔微球浸泡于过量上述溶液中12h，所得产物反复过滤洗涤，除去未结合的纳米粒子，最后得到负载紫杉醇和RGD的微纳米结构多孔PLGA微球，复合微球表面的SEM放大照片见图1。
实施例2负载喜树碱和REDV的微纳米结构PCL-PEG微球的制备
首先配制2.5mL，10％(g/mL)的PCL-PEG-NH2/CHCl3溶液，然后加入100μg喜树碱，将上述溶液和5ml，0.5％(g/mL)的PVA水溶液在200w下超声1min得到乳液，将上述乳液加入100ml 0.5％(g/mL)的PVA水溶液中，700rpm下继续搅拌5h待CHCl3挥发干净后得到PCL-PEG-NH2微纳米粒子，洗涤并收集。
配制PCL-PEG-COOH/CH2Cl2溶液作为油相(O)，将该溶液放置于超声探头下并浸于冰水浴中保持温度，向油相中注入配制好的内水相(W1)，同时按照设定的参数进行超声乳化得到乳液(E1)，然后于室温下将E1逐滴加到正在机械搅拌的外水相(W2)中，滴加完毕后继续搅拌2h，待CH2Cl2挥发干净后得到PCL-PEG-COOH的微球，洗涤并收集。其中W1相为0.5ml，0.1％(g/mL)的PVA水溶液；O相为7.5ml，5％(g/mL)的PCL-PEG/CH2Cl2溶液；W2相为160mL，0.25％(g/mL)的PVA水溶液。超声功率为200W，超声时间为4s，间隔时间为4s，共超声30s。外水相机械搅拌的转速为400rpm，所用共聚物为PCL200-PEG25-COOH。
将上述PCL-PEG-COOH微球浸泡在盐酸多巴胺的tris-HCl溶液(tris-HCl溶液的浓度为10mmol/L，pH为8.5)中，其中盐酸多巴胺与tris-HCl溶液的用量比为2mg/mL，浸泡3h后取出，用tris-HCl溶液(浓度为10mmol/L，pH＝8.5)清洗3次，然后浸泡于过量0.5mg/mL的REDV的PBS(pH＝7.5)溶液中12h，得到带有REDV的PCL-PEG-COOH微球。
将PCL-PEG-NH2纳米粒子以6mg/mL浓度分散在水中，将带有REDV的PCL-PEG-COOH微球浸泡于过量上述溶液中6h，所得产物反复过滤洗涤，除去未结合的纳米粒子，最后得到负载喜树碱和多肽REDV的微纳米结构PCL-PEG微球。
实施例3负载阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球的制备
将1g聚苯乙烯(PS)纳米粒子置于20ml浓硫酸中，40℃下磁力搅拌0.5h，离心洗涤除去大部分的酸，最后透析至上清液pH大于6，冷冻干燥得到磺化PS纳米粒子。进一步将磺化PS纳米粒子配制成10ml的100mg/mL的水溶液，向该溶液中加入100mg的盐酸阿霉素，搅拌分散过夜，经过滤洗涤干燥后得到载有阿霉素的磺化PS纳米粒子。
配制PLA/乙酸乙酯溶液作为油相(O)，将该溶液放置于匀浆机下并浸于冰水浴中保持温度，向油相中加入配制好的内水相(W1)，同时按照设定的参数进行乳化得到乳液(E1)，然后于室温下将E1迅速倒入正在机械搅拌的外水相(W2)中，继续搅拌4h，待乙酸乙酯挥发干净后得到共聚物的微球，洗涤并收集。其中W1相为1.25ml，含50mg BSA的5％(g/mL)的NH4HCO3水溶液；O相为4ml，3.13％(g/mL)的PLA/乙酸乙酯溶液；W2相为150mL，0.1％(g/mL)的PVA水溶液。匀浆机乳化时的转速为21,000rpm，乳化时间为3min。外水相机械搅拌的转速为400rpm。所用PLA分子量为75,000～120,000。所制得的微球内部为空心结构，并且壳层上有微孔存在。进一步将3ml的PLA多孔中空微球浸泡于过量0.1M氢氧化钠水溶液中20min，过滤洗涤后浸泡在2mg/ml的聚赖氨酸水溶液中10min，过滤洗涤得到聚赖氨酸涂覆的PLA多孔中空微球。
将聚赖氨酸涂覆的PLA多孔中空微球浸泡于载有阿霉素的磺化PS纳米粒子的溶液中(100mg/mL)，浸泡30min后过滤洗涤得到同时载有阿霉素和BSA的微纳米结构的PLA微球。
实施例4负载阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球的药物释放
将30mg实施例3制备得到的负载阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球分散到5mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1mol/L，pH＝7.4)中，于37℃下摇床中振荡。共进行3组平行实验，在特定时间下取出3mL上清液用于测试，然后补充3mL新鲜PBS溶液继续放置于摇床中振荡。取出的上清液用紫外可见光谱仪测试280nm处的紫外光吸收值。通过标准曲线计算得到微球的累积释放曲线(见图2)。
实施例5负载阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球的人成骨肉瘤细胞MG63增殖抑制实验
材料的细胞增殖抑制实验通过MTT实验表征。首先将MG63细胞以8000个/孔的密度种于96孔培养板中(180μL DMEM)，孵育24h使之贴壁。除去培养基，每孔加入20μL微纳米结构多孔PLA微球(PLA-PS)、负载实施例3制备的阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球(PLA/BSA-PS/DOX)、阿霉素溶液(DOX)，共培养24h、48h和72h后，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h后移除上清，然后加入150μL DMSO，充分震荡后，利用酶标仪测量每个孔在570nm处的吸光度值。细胞存活率计算公式如下所示：
细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100％
其中，Asample和Acontrol分别是指样品孔和对照孔的吸收值。
实验结果如图3所示，微纳米结构多孔PLA微球具有良好的细胞相容性但是不能抑制癌细胞的增殖，而负载阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球和阿霉素溶液一样，能够对成骨肉瘤细胞MG63的增殖产生明显的抑制作用。
实施例6负载阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球的成骨细胞MC3T3增殖实验
将一定量的多孔PLA微球(PLA)、微纳米结构多孔PLA微球(PLA-PS)、实施例3制备的负载阿霉素和牛血清蛋白BSA的微纳米结构多孔PLA微球(PLA/BSA-PS/DOX)转入二十四孔板，向每个培养孔内加入1mL的MC3T3细胞，浓度为8×104/mL的细胞悬液，在37℃，5％CO2气氛下进行培养。于细胞培养的第7天，向培养孔内加入2ml FDA工作液(FDA浓度为2mg/ml)对细胞进行染色，然后转移到载玻片上用荧光显微镜观察，结果见图4。图4说明在细胞培养7天后，三组微球表面细胞数目依次增多，即PLA<PLA-PS<PLA/BSA-PS/DOX，微纳米结构使微球表面生长的细胞数目明显增多，进一步微球中蛋白质BSA的包埋和释放能够进一步提高微球表面成骨细胞的数目。

Claims (10)

1.一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：以可降解高分子为原料，制备负载有活性因子的高分子微球；所述的可降解高分子包括脂肪族聚酯或聚酯聚醚共聚物；
步骤二：以生物医用高分子为原料，制备负载有抗癌药物的微纳米粒子；所述的生物医用高分子包括脂肪族聚酯、聚酯聚醚共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈或聚异丁烯中的至少一种；
步骤三：将负载有活性因子的高分子微球和负载有抗癌药物的微纳米粒子复合，使高分子微球上负载微纳米粒子，得到同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球。
2.根据权利要求1所述的一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球的制备方法，其特征在于，所述的步骤一或步骤二所述的脂肪族聚酯包括聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球的制备方法，其特征在于，所述的步骤一或步骤二所述的聚酯聚醚共聚物包括聚酯-聚醚-官能团两嵌段共聚物PLm-POn-FG、官能团-聚酯-聚醚-聚酯-官能团三嵌段共聚物FG-PLm-POn-PLm-FG，其中：PL代表脂肪族聚酯，PO代表脂肪族聚醚，FG代表端基官能团，m、n为单体的重复单元数。
4.根据权利要求3所述的一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球的制备方法，其特征在于，PO包括PEO或PPO中的一种或两种；FG包括氨基-NH2，羧基-COOH，磺酸基-SO3H，羟基-OH，甲氧基-OCH3；m的取值范围为50～5000，n的取值范围为0～500。
5.根据权利要求1所述的一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球的制备方法，其特征在于，所述的步骤一中的活性因子包括特异性粘附多肽RGD、REDV、成骨生长肽、血清蛋白、骨形态发生蛋白、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球的制备方法，其特征在于，所述的步骤二中的抗癌药物包括紫杉醇及其衍生物、喜树碱及其衍生物、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、丝裂霉素、伊立替康、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、卡铂、顺铂、长春碱或长春新碱中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球的制备方法，其特征在于，所述的制备负载有活性因子的高分子微球或负载有抗癌药物的微纳米粒子，是在制备高分子微球或微纳米粒子过程中直接包埋活性因子或药物；或者通过偶联剂连接活性因子或药物；或者先制备得到高分子微球或微纳米粒子，然后再通过浸泡活性因子或药物的方式得到的。
8.根据权利要求1所述的一种同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球的制备方法，其特征在于，所述的步骤三中的复合是将负载有活性因子的高分子微球和负载有抗癌药物的微纳米粒子分别分散于溶剂中再混合，或分别经过水解、胺解、酶降解、磺化处理后再混合，或在可降解微球表面涂覆偶联剂后再混合。
9.权利要求1所述的制备方法得到的同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球，其特征在于，所述的负载有活性因子的高分子微球或负载有抗癌药物的微纳米粒子为实心、中空或多孔结构，负载有活性因子的高分子微球尺寸为10～2,000μm，负载有抗癌药物的微纳米粒子尺寸为1～10,000nm。
10.权利要求9所述的同时负载抗癌药物和活性因子的具有微纳米结构的可降解微球在组织修复和填充领域上的应用。
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Application publication date: 20200317

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